專利名稱：CpG島甲基化檢測試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因檢測技術，具體是指用于腫瘤診斷、去甲基化藥物篩選的CpG島甲基化檢測試劑盒及其應用。
目前測定5′-CpG島甲基化的方法有Southern blot，原理是利用對甲基化敏感的限制性內切酶不能切開含有一個或幾個甲基化的CpG位點的序列，這種方法提供了估計CpG島總體甲基化情況，要求大量DNA成分，它能提供甲基化敏感的限制性內切酶所能識別序列之內CpG位點的甲基化信息；另一種方法是利用甲基化敏感的限制性內切酶結合PCR的方法，酶消化后的DNA被覆蓋著限制性位點的引物擴增，只有CpG位點甲基化的才能提供完整的模板。這種方法也只能提供限制性內切酶識別范圍內的CpG位點甲基化信息，非甲基化的DNA必須完全限制，消化不完全的DNA可產生假陽性。
人們?yōu)閷ふ覚z測CpG島甲基化，開展了長期深入的研究，得出了一些CpG島的高甲基化的基因失活與腫瘤和白血病的關系，為診斷與治療癌癥提供了新途徑。但目前在國內外均未見有關檢測腫瘤基因甲基化和去甲基化試劑盒生產、銷售、使用方面的報道。
CpG島甲基化檢測試劑盒包含有下列藥物
(1)引物利用人類基因組的基因序列，根據堿基錯配原理，引物選自細胞周期上二個基因即P15INK4B，P16INK4A基因，胰癌基因CPG，蛋白激酶相關蛋白基因CPG，乳腺癌基因2CPG，急性白血病相關基因，基因調節(jié)因子3基因，基因調節(jié)因子27基因，GTP激酶相關蛋白27基因，GTP激酶相關蛋白基因27B，GTP激酶相關蛋白基因2L引物中的任何一種；(2)提取模板DNA的藥物①內含200～400μg/ml的蛋白酶K的DNA提取液，②飽和酚/氯仿/異戊醇體系，它們的體積比為20～25∶20～25∶1，③醋酸鈉，④淋巴細胞分層液；(3)基因組修飾用藥物①硅精，②氫醌，③亞硫酸氫鈉，④礦物油；(4)基因組修飾后的DNA純化用藥物①DNA純化用DEAE樹脂，②異丙醇；(5)特異性MSP-PCR反應體系①甲基化PCR緩沖液，10×buffer，②四種核苷酸即dNTP，③MgCl2，④耐高溫聚合酶即Taq酶；(6)陽性和陰性對照標本①陽性標本甲基化Raji細胞，②陰性標本非甲基化HL60細胞。
提取模板DNA的藥物中飽和酚是指用50mmol/L的三羥甲基氨基甲烷飽和的酚；飽和酚/氯仿/異戊醇體積比為24∶24∶1。
基因修飾用藥物中硅精是指用常規(guī)DNA純化方法純化過的硅精，氫醌和亞硫酸氫鈉采用分析純干粉。
CpG島甲基化檢測試劑盒的應用，包括常規(guī)標本的收集；基因組DNA提取、修飾和純化，其特征在于(1)基因組修飾中①純化硅精DNA用量為0.51～2μg/份，②氫醌的新鮮配制將10～13mg的氫醌定容在10ml超凈水中，③亞硫酸氫鈉的新鮮配制將2.9～3.2g的亞硫酸氫鈉定容在10ml超凈水中，④修飾的溫度為50～60℃，⑤孵育時間為12～18小時；(2)修飾后模板DNA純化中①DEAE樹脂加入量為0.5～1.5mg，②用異丙醇洗滌并過濾后離心，③干燥樹脂，④加入50～60μl的預熱至55～75℃超凈水中，并離心，⑤加入1mol/L的氫氧化鈉，使其終濃度達0.2～0.4mmol/L、置室溫保存，⑥加無水乙醇并在-20℃下過夜，⑦0℃離心，⑧70％乙醇洗滌后干燥，⑨超凈水溶解后，-20℃保存；(3)特異性PCR即MSP反應體系配制如下①反應體積50μlPM PU10×buffer 5μl 5μldNTP5～8μl 5～8μlMgCl210～15μl10～15μlPM或PU 2～4μlMoDNA 8～10μl 8～10μlTaq酶 1～4u1～4u加H2O至50ml，加50ml石蠟油②反應條件
將上述體系放入PCR機中進行如下反應首先93～95℃變性5～10min，然后按93～95℃ 30～45S→55～65℃30～45S→70～72℃ 30～45S的次序做24～34個循環(huán)，再70～72℃延伸5～10min，產物4℃下保存?zhèn)溆茫?4)陰陽性對照MSP反應中放Raji和HL60細胞株分別做陽性和陰性對照，設不加模板DNA即MODNA作空白對照；除上述之外的其他應用過程均為常規(guī)技術，所用藥物均為分析純。
特異性PCR即MSP反應優(yōu)選條件為按94℃ 35S→58℃ 35S→71℃ 35S做25個循環(huán)。
應用過程中所用離心均選9000～12000rpm。
本發(fā)明具有如下突出的優(yōu)點本發(fā)明開發(fā)的CpG島甲基化檢測試劑盒在陽性與陰性細胞混合為1∶104時可以測到甲基化陽性細胞，靈敏度高，準確，該試劑盒的生產和應用，將可達到如下使用目的(1)檢測臨床患者基因是否甲基化，在CpG島基因甲基化說明該患者已有癌變的可能；(2)測定腫瘤病人在治療過程中的CpG島基因甲基化的情況、從而可改變治療方案，用去甲基化藥物去甲基化后再化療，療效高；(3)檢測和篩選去甲基化的藥物；(4)檢測腫瘤患者應用去甲基化藥物治療的結果。
廣泛應用于癌癥的診斷和相關藥物的篩選，將會產生巨大經濟效益和社會效益。
(2)提取模板DNA藥物①內含濃度為200μg/ml或300μg/ml或400μg/ml蛋白酶K的DNA提取液10ml，②用50mmol/L的三羥甲基氨基甲烷飽和的酚/氯仿/異戊醇比例為24∶24∶1，10ml，③濃度范圍為2.5～4.6ml/L，PH范圍為4.6～5.2的醋酸鈉，10ml，④淋巴細胞分層液35ml；(3)基因組的修飾所用藥物①用常規(guī)DNA純化方法純化過的硅精12μg，②分析純的粉末狀氫醌13mg，③分析純的粉末狀亞硫酸氫鈉3.5mg，④礦物油1.5ml；(4)基因組修飾后的DNA純化用藥物①DNA純化用DEAE52樹脂1g，②分析純的異丙醇20ml；(5)特異性PCR-MSP反應體系①甲基化PCR緩沖液，10×buffer含硫酸銨10mg、三羥甲基氨基甲烷10mg、PH8.8β-巰基乙醇10ml，②濃度為25mol/L的dNTP即dTTP、dATP、dCTP、dGTP四種核苷酸各10μl，③濃度為2.5mmol/L的MgCl21.5ml；(6)陽性和陰性對照標本甲基化的陽性標本DNA 15μg，非甲基化陰性標本DNA 15μg；將上述藥物總裝于試劑盒。應用實施例應用實施例1不成熟B系細胞株Raji為P15基因甲基化陽性的細胞株(中山醫(yī)腫瘤醫(yī)院研究所贈)；HL60為P15基因非甲基化陽性的髓系細胞株；K562為P15基因純合缺失的紅-巨核系細胞株由本室提供。本實施例中1.細胞培養(yǎng)取傳代用HL60、K562、Raji細胞株分別轉入RPMI1640100ml培養(yǎng)瓶中，RPMI1640，加5％滅活小牛血清，青霉素100U/ml，1％(v/v)谷酰胺。5％CO2培養(yǎng)箱，37℃，培養(yǎng)72小時。
2.收集細胞細胞混懸液轉入10ml離心管，LXJ-II離心1800rpm，棄上清，1×PBS洗二遍，1×107細胞轉入2ml離心管。
3.消化把含有107個細胞體積的混懸液轉入2ml小管離心沉淀，去凈上清。
4.基因組DNA提取加入1ml內含200～400μg/ml的蛋白酶K的DNA抽提液，使其終濃度達300μg/ml，充分攪動混勻，呈粘稠狀，置37℃溫箱過夜。加1ml酚/氯仿/異戊醇混合液于DNA抽提液中，用力震振蕩并顛倒混勻至乳白色，放置3分鐘后，室溫下離心10000rpm，在TGL-16G離心機中離心20分鐘，吸取上清，轉入新管重復抽提1次；取上清約0.6ml，加醋酸鈉0.6ml，2倍體積-20℃預冷的無水乙醇，輕輕顛倒，可見白色絮狀DNA。然后室溫離心10000rpm 10分鐘，棄上清，沉淀用70％乙醇洗二次，離心去盡上清和管壁液體，室溫干燥，加超凈水約500μl溶解DNA，并檢測DNA的濃度和質量。
5.基因組DNA質檢和濃度測定取DNA溶液50μl，加水稀釋10倍。用7521-紫外分光光度計測定OD260的值，并計算OD260/OD280之比值，若比值在1.70-1.90之間，則樣品較純，(＜1.7則污染有蛋白質，需重復抽提過程)。樣品DNA含量＝OD260×稀釋倍數×50μg/ml(1OD260相當于50μg/ml雙鏈DNA)。
6.基因組亞硫酸氫鹽修飾取含有2μg的DNA溶液樣本，加1mol/L氫氧化鈉，使其終濃度達0.15mol/L，DNA在濃堿液中變性，變性溫度為37℃，變性時間5分鐘。然后加0.5μg的純化硅精，再加入新鮮配制的10mol/L分析純氫醌10μl和2mol/L亞硫酸氫鈉400μl，充分混勻后，加礦物油覆蓋液面，放入調至50℃溫箱，孵育12小時。
7.修飾后模板DNA純化吸棄礦物油，底物體積約0.5ml，加1.5mg/lDEAE52樹脂，顛倒數次混勻，推筒連接濾過頭，把樹脂混合物轉入推筒，輕柔地插入推動推頭，使混合物通過過濾頭，DNA被吸附在樹脂上，滯溜于過濾頭，同法用異丙醇洗滌過濾頭，并把過濾頭接到1.5ml離心機管口，離心10000rpm，室溫3分鐘，干燥樹脂，然后把過濾頭接到新的離心管。加50μl預熱至55℃超純水，室溫下放置1分鐘，離心10000rpm，30秒離心洗脫DNA后，加1mol/L氫氧化鈉，使其終濃度達0.2mol/L室溫下5分鐘后終止還原反應。加2倍體積-20℃預冷無水乙醇并在-20℃下過夜，沉淀DNA，0℃下12000rpm，離心13分鐘，棄上清，1ml 70％乙醇洗滌2次去鹽，每次于4℃ 12000rpm，離心5-10分鐘，去凈管壁液體，自然干燥，加20μl超凈水溶解，-20℃保存。
8.MSP反應體系 終體積50μl的PCR反應體系含1×MSPbuffer，1.5mmol/L的四種核苷酸dTTP、dATP、dCTP、dGTP共5μl，7mmol/L MgCl2，300ng primer(單個)，修飾后模板DNA(MoDNA)1μg，Taq酶2u，具體配制如下P15M P15U10×buffer(甲基化PCR) 5μl 5μldNTP 5μl 5μlMgCl210μl10μlP15M1，P15M22μl(單個)P15U1，P15U22μl(單個)MoDNA 10μl10μlTaq酶 2u 2uMSP反應條件加H2O至50μl，混勻后30μl消毒石臘油覆蓋，輕微離心收集，并按下列條件做三次第一次首先93℃變性10min，再按93℃ 45S→55℃ 45S→70℃ 45S做30個循環(huán)，然后70℃延伸10min，第二次94℃變性8min，再按94℃ 40S→55℃40S→71℃ 40S做28個循環(huán)，然后71℃延伸10min，第三次95℃變性5min，再按95℃ 35S→55℃ 35S→72℃ 35S做25個循環(huán)，然后72℃延伸5min，產物4℃下保存。
MSP反應中放入Raji和HL60細胞株，分別做陽性和陰性對照。同時，設不加模板MoDNA作空白對照。
9.MSP特異度和靈敏度測定以野生型DNA，MoDNA兩種類型模板測定Raji，HL60，K562的P15M和P15U PCR擴增，了解其特異性。將Raji和HL60按1∶10，1∶102，1∶103，1∶104，1∶105，1∶106混合后進行P15甲基化的MSP，測定其靈敏度。
10.檢測樣本結果可選以下二種方法中的一種①產物加1.8％的瓊脂糖加溴乙錠，在1.5～2.5v/cm下電泳45～60分鐘，在紫外檢測儀下觀察結果，并照像；在凝膠電泳分析系統(tǒng)上分析結果，②將產物用熒光試劑標記，做等電聚焦定量PCR檢測。
應用實施例2～10不成熟B系細胞株Raji為P15基因甲基化陽性的細胞株，均為中山醫(yī)腫瘤醫(yī)院研究所贈HL60為P15基因非甲基化陽性的髓系細胞株；K562為P15基因純合缺失的紅-巨核系細胞株由本室提供。除以下部分不一樣之外，與應用實施例1相同。
(一)基因組亞硫酸氫鹽修飾應用實施例序號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10加氫氧化鈉終濃度(mol/L) 0.15 0.15 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.25 0.2537℃下變性時間(分鐘)5 6 7 8 9 105 8 1015硅精加入量μg 0.51 0.6 070.8 0.9 1.0 1.2 1.4 1.6 2.0氫醌加入量μl 10121520253035202530亞硫酸氫鈉加入量μl 400 420 440 460 490 520 550 580 500 480修飾溫度℃ 50515253545556575860孵育時間小時12131415151616171718(二)修飾后模板DNA純化DEAE52樹脂(mg) 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.2 1.3 1.4 1.5加純水的溫度(℃)55586265687072756065加氫氧化鈉終濃度mmol/L 0.2 0.2 0.25 0.25 0.3 0.30 0.35 035 0.4 0.4(三)MSP反應體系dNTP(μl) 5 5.5 5.75 6.0 6.25 6.5 6.75 7.0 7.5 8.0MgCl(μl) 10111213141516171819P15U1，P15U2(μl) 10111213141516171819P15M1，P15M2(μl) 10111213141516171819MoDNA(μl) 8 8 9 9 101011111212Taq酶(u)1.0 1.5 2.0 2.0 2.5 2.5 3.0 3.0 3.5 4.0
(四)MSP反應條件加H2O至50μl，混勻加30μl石臘油，離心收集，并按下列條件做三次應用實施例2和7第一次首先93℃變性10min，再按93℃ 45S→58℃ 45S→70℃ 45S做30個循環(huán)，然后70℃延伸10min；第二次94℃變性8min，再按94℃ 40S→58℃ 40S→71℃ 40S做28個循環(huán)，然后71℃延伸8min；第三次95℃變性5min，再按95℃ 35S→58℃ 35S→72℃ 35S做25個循環(huán)，然后72℃延伸5min，產物4℃下保存。
應用實施例3和8第一次首先93℃變性10min，再按93℃ 45S→60℃ 45S→70℃ 45S做30個循環(huán)，然后70℃延伸10min；第二次94℃變性8min，再按94℃ 40S→60℃ 40S→71℃ 40S做28個循環(huán)，然后71℃延伸10min；第三次95℃變性5min，再按95℃ 35S→60℃35S→72℃ 35S做25個循環(huán)，然后72℃延伸5min，產物4℃下保存。
應用實施例4和9第一次首先93℃變性10min，再按93℃ 45S→62℃ 45S→70℃ 45S做30個循環(huán)，然后70℃延伸10min；第二次94℃變性8min，再按94℃ 40S→62℃ 40S→71℃ 40S做28個循環(huán)，然后71℃延伸10min；第三次95℃變性5min，再按95℃ 35S→60℃ 35S→72℃ 35S做25個循環(huán)，然后72℃延伸5min，產物4℃下保存。
應用實施例5和10第一次首先93℃變性10min，再按93℃ 45S→65℃ 45S→70℃ 45S做30個循環(huán)，然后70℃延伸10min；第二次94℃變性8min，再按94℃ 40S→65℃ 40S→71℃ 40S做30個循環(huán)，然后71℃延伸8min；第三次95℃變性5min，再按95℃ 35S→65℃ 35S→72℃ 35S做30個循環(huán)，然后72℃延伸5min，產物4℃下保存。
實施例6的MSP反應條件同實施例1。
權利要求
1.CpG島甲基化檢測試劑盒，其特征在于它包含有下列藥物(1)引物利用人類基因組的基因序列，根據堿基錯配原理，引物選自細胞周期上二個基因即P15INK4B，P16INK4A基因，胰癌基因CPG，蛋白激酶相關蛋白基因CPG，乳腺癌基因2CPG，急性白血病相關基因，基因調節(jié)因子3基因，基因調節(jié)因子27基因，GTP激酶相關蛋白27基因，GTP激酶相關蛋白基因27B，GTP激酶相關蛋白基因2L引物中的任何一種；(2)提取模板DNA的藥物①內含200～400μg/ml的蛋白酶K的DNA提取液，②飽和酚/氯仿/異戊醇體系，它們的體積比為20～25∶20～25∶1，③醋酸鈉，④淋巴細胞分層液；(3)基因組修飾用藥物①硅精，②氫醌，③亞硫酸氫鈉，④礦物油；(4)基因組修飾后的DNA純化用藥物①DNA純化用DEAE樹脂，②異丙醇；(5)特異性MSP-PCR反應體系①甲基化PCR緩沖液，10×buffer，②四種核苷酸即dNTP，③MgCl2，④耐高溫聚合酶即Taq酶；(6)陽性和陰性對照標本①陽性標本甲基化Raji細胞，②陰性標本非甲基化HL60細胞。
2.根據權利要求1所述的CpG島甲基化檢測試劑盒，其特征在于引物是下列引物中的一種胰癌基因CPG引物AGTGGAGGACAAGTCAGGGGGGGCTTCGAGAGGACAGAG蛋白激酶相關蛋白基因CPG引物TCTATGCCACTGTTGGGGTTAAGGGAGCTCCAAAATCTCCT乳腺癌基因2CPG引物TCCGTCAGATACTGACGGTTGGCAGAGACAAAAGGGCAAGAAG急性白血病相關基因引物TCACMACACTTGCCCTCTCTAGGAAGACAGTGACGAAGACC基因調節(jié)因子3基因引物CTCTGACCTCCACTCACTCATAGCCTGTGCTCCTCCTGTGAG基因調節(jié)因子27基因引物ATAGCCCTGGACATCACTGCCGAGAGAGTGTGTTTCTCACTGGTP激酶相關蛋白27基因引物GTCTTCTTTGCAAGGATTTCTGCATACCTGGTACGCTGCTGATTGTP激酶相關蛋白基因27B引物TTTGAAAGGGTCAGTCCTCCTCATCCAAAGATACAGCATCTAAGTP激酶相關蛋白基因2L引物AAAACAGCGTAGAGCCTGAGAAGAAAGATAAACATCCAAGCTCTTCCP16基因引物M1GAGTACTTGGGGTGTGGCACTM2GATAACGATTCACAGACATTCP15引物M1CGTTCGTATTTTGCGGTTM2GTACAATAACCGAACGACCGA
3.根據權利要求1所述的CpG島甲基化檢測試劑盒，其特征在于提取模板DNA的藥物中飽和酚是指用50mmol/L的三羥甲基氨基甲烷飽和的酚；飽和酚/氯仿/異戊醇體積比為24∶24∶1。
4.根據權利要求1所述的CpG島甲基化檢測試劑盒，其特征在于基因修飾用藥物中硅精是指用常規(guī)DNA純化方法純化過的硅精，氫醌和亞硫酸氫鈉均采用分析純干粉。
5.CpG島甲基化檢測試劑盒的應用，包括常規(guī)標本的收集；基因組DNA提取、修飾和純化，其特征在于(1)基因組修飾中①純化硅精DNA用量為0.51～2μg/份，②氫醌的新鮮配制將10～13mg的氫醌定容在10ml超凈水中，③亞硫酸氫鈉的新鮮配制將2.9～3.2g的亞硫酸氫鈉定容在10ml超凈水中，④修飾的溫度50～60℃，⑤孵育時間為12～18小時；(2)修飾后模板DNA純化中①DEAE樹脂加入量為0.5～1.5mg，②用異丙醇洗滌并過濾后離心，③干燥樹脂，④加入50～60μl的預熱至55～75℃超凈水中，并離心，⑤加入1mol/L的氫氧化鈉，使其終濃度達0.2～0.4mmol/L、置室溫保存，⑥加無水乙醇并在-20℃下過夜，⑦0℃離心，⑧70％乙醇洗滌后干燥，⑨超凈水溶解后，-20℃保存；(3)特異性PCR即MSP反應體系配制如下①反應體積50μlPM PU10×buffer 5μl 5μlDNTP5～8μl 5～8μlMgCl210～15μl10～15μlPM或PU 2～4μlMoDNA 8～10μl 8～10μlTaq酶 1～4u1～4u加H2O至50ml，加50ml石蠟油②反應條件將上述體系放入PCR機中進行如下反應首先93～95℃變性5～10min，然后按93～95℃ 30～45S→55～65℃ 30～45S→70～72℃ 30～45S的次序做24～34個循環(huán)，70～72℃延伸5～10min，產物4℃下保存?zhèn)溆茫?4)陰陽性對照MSP反應中放Raji和HL60細胞株分別做陽性和陰性對照，設不加模板DNA即MODNA作空白對照；除上述之外的其他應用過程均為常規(guī)技術，所用藥物均為分析純。
6.根據權利要求5所述的CpG島甲基化檢測試劑盒的應用，其特征在于特異性PCR即MSP反應條件為按94℃ 35S→58℃ 35S→71℃ 35S做25個循環(huán)。
7.根據權利要求6所述的CpG島甲基化檢測試劑盒的應用，其特征在于應用過程中所用離心均選9000～12000rpm。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因檢測技術,具體是指用于腫瘤診斷、去甲基化藥物篩選的CpG島甲基化檢測試劑盒及其應用。本試劑盒主要包含引物、提取模板DNA的藥物、基因組修飾用藥物、DNA純化用藥物、特異性MSP－PCR反應體系和陽性和陰性對照標本。本發(fā)明利用人類基因的基因序列,根據堿基錯配原理設計引物,它們可選自細胞周期上二個基因即P
文檔編號C12Q1/68GK1357636SQ0112996
公開日2002年7月10日 申請日期2001年11月27日 優(yōu)先權日2001年11月27日
發(fā)明者郭秀枝 申請人:暨南大學