專利名稱：連續(xù)灌流式培養(yǎng)雜交瘤、cho細(xì)胞制備抗體的工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是屬于生物工程技術(shù)，動(dòng)物細(xì)胞(這里指雜交瘤、CHO細(xì)胞)大規(guī)模培養(yǎng)及動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白的制備工藝背景技術(shù)工程抗體在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究、臨床診斷和治療，以及免疫預(yù)防等領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，大大促進(jìn)了產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。原始的單克隆抗體生產(chǎn)方法，是將雜交瘤細(xì)胞注射小鼠腹腔體內(nèi)，收集腹水經(jīng)過純化獲得單克隆抗體。這種生產(chǎn)方法主要用于實(shí)驗(yàn)室研究和臨床前研究，無法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，并且不可避免鼠類動(dòng)物感染疾病污染物的污染，因此很難滿足臨床應(yīng)用的需要。目前工業(yè)化生產(chǎn)單克隆抗體的主要方法是通過微載體的發(fā)酵罐、中空纖維和固定床式等生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)，以及微包囊法在體外大規(guī)模高密度培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，或工程抗體表達(dá)的CHO細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和微生物等，再通過相關(guān)的純化手段濃縮純化制備抗體。目前，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的有關(guān)研究內(nèi)容主要包括高密度和高表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境及條件，促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞的基因合成和產(chǎn)物表達(dá)，改進(jìn)培養(yǎng)系統(tǒng)的氧傳遞方式，以及減少剪切力和降低生產(chǎn)成本的培養(yǎng)條件等。此外，還包括采用灌注(灌流)系統(tǒng)連續(xù)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，同時(shí)開發(fā)無血清培養(yǎng)基和貼壁依賴性細(xì)胞的有效載體系統(tǒng)，和動(dòng)物細(xì)胞生長性質(zhì)的馴化等。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)無論是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞，就操作方式而言，主要分為分批式(batch)，流加式(fed-batch)和灌流式(perfusion)三種操作方式。連續(xù)灌注(灌流)培養(yǎng)法是近年來用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)分泌型重組治療性藥物如單克隆抗體、嵌合抗體以及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種操作方式。連續(xù)灌注式培養(yǎng)法是指把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它最大的優(yōu)點(diǎn)是①細(xì)胞可處在營養(yǎng)的培養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度較低；②細(xì)胞密度較高，一般可達(dá)107-108cells/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量；③由于其培養(yǎng)細(xì)胞的密度大，且存活時(shí)間長，因此目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；④產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。但由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的復(fù)雜性，常會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞維持時(shí)間短、密度及活性低等問題，限制了細(xì)胞產(chǎn)品產(chǎn)量、質(zhì)量的提高和生產(chǎn)成本的降低。目前世界眾多的研究領(lǐng)域?qū)⒀芯繜狳c(diǎn)集中于動(dòng)物細(xì)胞代謝調(diào)控、反應(yīng)器操作模式和控制策略上，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間延長、細(xì)胞密度提高和細(xì)胞比生產(chǎn)率的提高。Foltshd于1999年對雜交瘤細(xì)胞CRL-1606進(jìn)行的連續(xù)培養(yǎng)中，應(yīng)用限制培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的方法，觀察到了兩種不同的生理穩(wěn)態(tài)。在谷氨酰胺限制的高效穩(wěn)定狀態(tài)中，丙酮酸代謝中的碳源流向TCA循環(huán)，營養(yǎng)成分的代謝流量分布更為有效，同低效的穩(wěn)定狀態(tài)比較，細(xì)胞密度升高進(jìn)2倍(從7.36×105cells/ml至1.36×105cells/ml)，而細(xì)胞生長速率和活性相似。1999年Siegwart對HEK-293細(xì)胞的連續(xù)灌流培養(yǎng)中，維持葡萄糖和谷氨酰按濃度在較低水平，營養(yǎng)成分利用率提高，有害產(chǎn)物積累減少，細(xì)胞可達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。
通過發(fā)酵罐、中空纖維和固定床等生物反應(yīng)器系統(tǒng)制備單克隆抗體，其特點(diǎn)和優(yōu)勢之一就是回收液中目標(biāo)產(chǎn)品明確，減少了鼠源病毒異種蛋白的污染，在無血清或低血清培養(yǎng)基其污染成分更少，易于純化；但其回收體積較大，含有細(xì)胞和細(xì)胞碎片，如何保持蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，分離純化出高純度、一致性的單克隆抗體是下游工藝的關(guān)鍵。目前單抗產(chǎn)品濃縮純化工藝多采用鹽析、超濾、離心，色譜分離等方法，新型下游純化設(shè)備——Streamline，是專為大規(guī)模培養(yǎng)下游產(chǎn)品純化而開發(fā)的擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)，從含有一些有形成份(如細(xì)胞和細(xì)胞碎片)的粗制樣品中捕獲目標(biāo)蛋白，省去預(yù)先超濾、離心等步驟。單一操作單元可同時(shí)起到澄清、濃縮和粗純化三方面的作用，因而能在短時(shí)間內(nèi)獲得高的產(chǎn)品回收率，而且很容易放大規(guī)模。用擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)純化單抗類產(chǎn)品，國外文獻(xiàn)已有報(bào)道。Fahrner等人用Streamlineprotein A純化回收一株重組人源化單抗，以Streamline 2.5cm內(nèi)徑柱作小試，并放大到生產(chǎn)規(guī)模的streamline 60及80cm內(nèi)經(jīng)柱，其單抗回收率為97％±，抗體濃度為9.6g/L±。Streamliner Protein A是一種親合層析介質(zhì)，因而用其一步純化即可達(dá)到較高的純度和回收率，但這種介質(zhì)的壽命較短，價(jià)格相對于streamline SP高出近16倍，且對鼠IgG亞類的單抗吸附效率較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了使培養(yǎng)雜交瘤、CHO細(xì)胞生產(chǎn)抗體過程進(jìn)一步優(yōu)化，而提供一種用連續(xù)灌流式培養(yǎng)雜交瘤、CHO細(xì)胞制備抗體的工藝方法，達(dá)到提高細(xì)胞密度，促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞的產(chǎn)率，實(shí)現(xiàn)高密度、高產(chǎn)量的長期培養(yǎng)；同時(shí)一步回收培養(yǎng)上清中的抗體。
本發(fā)明的目的是以下列技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)該連續(xù)灌流式培養(yǎng)雜交瘤、CHO細(xì)胞制備抗體的工藝方法，主要由接種細(xì)胞——連續(xù)灌流式培養(yǎng)——檢測方法——細(xì)胞代謝、生長速率、產(chǎn)物合成平衡調(diào)控分析——產(chǎn)物回收純化的過程完成。其中，接種細(xì)胞是采用固定床填充巨載體，接種細(xì)胞密度應(yīng)大于2-3×105/ml；細(xì)胞代謝、生長速率、產(chǎn)物合成平衡調(diào)控是通過在線監(jiān)測葡萄糖、乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、耗氧速率(OUR)以及pH值等指標(biāo)獲得，同時(shí)監(jiān)測細(xì)胞比生長速率和抗體比生成速率；在細(xì)胞由對數(shù)生長期進(jìn)入衰退期之前，添加相應(yīng)的氨基酸，并降低葡萄糖和血清濃度，以及控制灌流量，使細(xì)胞由以生長代謝為主轉(zhuǎn)為以產(chǎn)物合成為主，進(jìn)入穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)。上述方法的反復(fù)應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)穩(wěn)態(tài)，達(dá)到高密度、高產(chǎn)量的長期培養(yǎng)；產(chǎn)物回收純是采用Streamline SP介質(zhì)，一步回收培養(yǎng)上清中的抗體，DEAE-Sepharose FF陰離子交換劑去除純化后抗體產(chǎn)品中的熱源質(zhì)，抗體成品凍干保存。細(xì)胞生長進(jìn)入衰退期之前的主要指標(biāo)是ΔOUR≤0、葡萄糖消耗大于50％。添加的相應(yīng)氨基酸包括必需氨基酸和非必需氨基酸，添加氨基酸的量由相應(yīng)細(xì)胞和產(chǎn)物所消耗氨基酸的量而補(bǔ)加。逐漸遞減降低葡萄糖和血清的濃度。穩(wěn)態(tài)的指標(biāo)是指乳酸生成速率與葡萄糖消耗速率比值保持較低水平，細(xì)胞比生長速率(μ)相對恒定。培養(yǎng)上清中的抗體包括單克隆抗體、基因工程抗體?？贵w產(chǎn)物培養(yǎng)上清調(diào)解pH值是4-7，電導(dǎo)值是2-5mS/cm；平衡液(A液)是pH4-7；洗脫液(B液)是A液+1M NaCl。產(chǎn)物回收純中的DEAE-SepharoseFF陰離子交換劑去除純化后抗體產(chǎn)品中的熱源質(zhì)，在pH4～7的條件下，熱源吸附于柱上，抗體在穿過峰中流出；再以1M NaCl和0.5M NaOH去除吸附于柱上的熱源，柱子可重復(fù)使用。
我們的研究證實(shí)(1)在雜交瘤細(xì)胞和CHO細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中，葡萄糖和谷氨酰胺消耗處于低水平時(shí)，氨基酸成為限制細(xì)胞密度提高的重要因素，氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭亦是引起凋亡的主要原因。(2)在培養(yǎng)初期和對數(shù)生長期要注重培養(yǎng)條件對細(xì)胞的生長刺激作用，維持細(xì)胞高密度增長提高產(chǎn)率；進(jìn)入一定的穩(wěn)定期后要維持細(xì)胞正常生長，在培養(yǎng)基中添加合適的氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，抑制細(xì)胞凋亡，延長培養(yǎng)時(shí)期，增加單克隆抗體的產(chǎn)率。(3)灌流式生物反應(yīng)器的操縱上，大量補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基未必能刺激細(xì)胞增殖提高細(xì)胞的生產(chǎn)力。在細(xì)胞進(jìn)入一定的穩(wěn)態(tài)后，要逐漸降低血清、糖、谷氨酸的濃度，使細(xì)胞生長停滯或緩慢，大部分細(xì)胞由再增殖而轉(zhuǎn)為生產(chǎn)蛋白，因而提高抗體和異源蛋白產(chǎn)量。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是對連續(xù)灌流式培養(yǎng)雜交瘤、CHO細(xì)胞制備抗體的整個(gè)制備工藝進(jìn)行過程優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多個(gè)穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)，雜交瘤、CHO細(xì)胞在低/無血清培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)20-40天，最大細(xì)胞密度可達(dá)3-9×107/ml，抗體產(chǎn)量200-800mg/L/d。這種成本低、易于操作的細(xì)胞能量代謝轉(zhuǎn)移研究，為實(shí)現(xiàn)高密度、高產(chǎn)率的細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化工藝展開了廣闊的應(yīng)用前景。選擇Streamline SP介質(zhì)，在適宜的條件下，同樣取得了理想的效果，抗體回收率大于90％，大大降低了工藝成本。本發(fā)明采用DEAE-Sepharose FF陰離子交換劑，在pH 4-7的條件下，使熱原吸附于柱上，而抗體在穿過峰中流出，有效去除了熱源污染。再以1M NaCl和0.5M NaOH去除吸附于柱上的熱原，柱子可重復(fù)使用。該方法操作簡便，除熱原效果理想。


圖1是未生長細(xì)胞的載體Disk的結(jié)構(gòu)圖。
圖2是雜交瘤細(xì)胞貼附生長在載體Disk上視圖。
圖3是連續(xù)培養(yǎng)中抗體分泌量與細(xì)胞活性關(guān)系圖。
圖4是葡萄糖消耗量與灌流體量關(guān)系圖。
圖5連續(xù)培養(yǎng)中抗體分泌量與細(xì)胞耗氧速率關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的目標(biāo)產(chǎn)品是雜交瘤細(xì)胞(HAb18)分泌的鼠源性單克隆抗體。31I-HAb18 F(ab’)2肝癌單抗注射液現(xiàn)已進(jìn)入II、III期臨床驗(yàn)證。肝癌單抗HAb18 IgG1和F(ab’)2片段抗體對原發(fā)性肝細(xì)胞癌有高度的特異性和親合性。本發(fā)明的制備工藝和技術(shù)路線可應(yīng)用與單克隆抗體和人源化抗體的中試研究與大規(guī)模生產(chǎn)。其步驟如下一、雜交瘤細(xì)胞(HAb18)的大規(guī)模培養(yǎng)1、種子細(xì)胞的制備(1)種子細(xì)胞的擴(kuò)增HAB18雜交瘤細(xì)胞是用新鮮肝癌手術(shù)標(biāo)本的細(xì)胞懸液免疫BABL/c小鼠取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP/20細(xì)胞融合制備獲得。1987年8月建株，至今一直穩(wěn)定分泌抗人肝細(xì)胞癌的抗體。HAb18雜交瘤細(xì)胞種子細(xì)胞株的保管分原始細(xì)胞庫和生產(chǎn)細(xì)胞庫，原始細(xì)胞庫只用于保存細(xì)胞建株時(shí)較為原始的細(xì)胞株，以免在發(fā)生意外時(shí)進(jìn)一步進(jìn)行檢測或擴(kuò)增培養(yǎng)；生產(chǎn)細(xì)胞庫保存的細(xì)胞株經(jīng)質(zhì)量控制后大量培養(yǎng)凍存，每次生產(chǎn)時(shí)取出一管進(jìn)行復(fù)蘇、擴(kuò)增及生產(chǎn)，不再回凍。培養(yǎng)擴(kuò)增用100ml玻璃培養(yǎng)瓶置于37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，然后轉(zhuǎn)入850ml羅氏瓶中進(jìn)一步擴(kuò)增，待細(xì)胞生長到一定密度時(shí)接種到生物反應(yīng)器中。
(2)培養(yǎng)液的配制用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基都是商品化的干粉合成培養(yǎng)基。用去離子(18兆歐姆)的無熱原水，無菌過濾配制。HAb18雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)用HYCLONE公司的CCMI無血清培養(yǎng)基，根據(jù)需要加入一定量的血清、氨基酸、添加劑等，然后調(diào)pH為7.2。
2、接種細(xì)胞(1)生物反應(yīng)器5L CELLIGEN生物反應(yīng)器(美國NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC公司)，工作容積3.5L，罐體中間固定床填裝200g的巨載體(美國NBS公司)，比表面積120cm2/cm3(見圖一)。采用連續(xù)灌流式培養(yǎng)，攪拌與通氣在固定床的上方，在攪拌中產(chǎn)生負(fù)壓，使雜交瘤細(xì)胞固定吸附于栽體上(見圖二)，培養(yǎng)基不段流經(jīng)中間巨載體，有利于營養(yǎng)物質(zhì)和氣體的傳遞。
(2)接種細(xì)胞生物反應(yīng)器填充載體，注入0.01M pH7.2 PBS高壓消毒120℃ 80分種；接種細(xì)胞前需將反應(yīng)器中的PBS放出并加入新培養(yǎng)基；開機(jī)后將溫度、攪拌速度、pH、溶氧等各項(xiàng)參數(shù)按具體要求設(shè)置好后，并觀察1～2天無異常變化時(shí)再接種細(xì)胞。一般接種細(xì)胞密度應(yīng)為2-3×105/ml，嚴(yán)格的無菌操作以防污染。
(3)各種參數(shù)的設(shè)定與監(jiān)控雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)溫度設(shè)定為37℃，pH為7.2～7.4；溶氧為40～50％，攪拌速度60～110轉(zhuǎn)/分，氣體(氧氣、空氣、二氧化碳、氮?dú)?的比例由生物反應(yīng)器自動(dòng)化控制。細(xì)胞接種前、后即時(shí)取樣測定實(shí)際的細(xì)胞數(shù)和葡萄糖含量，以后按時(shí)間點(diǎn)取樣測定耗氧速率(OUR)、葡萄糖、氨基酸、分泌產(chǎn)物定量、乳酸和谷氨酸的濃度。連接Biocommard程序控制軟件，通過計(jì)算機(jī)在線監(jiān)控，根據(jù)測定的參數(shù)變化調(diào)整其培養(yǎng)基配比、灌流量、攪拌速度和溶氧等參數(shù)。
3、連續(xù)灌流培養(yǎng)接種細(xì)胞后根據(jù)在線監(jiān)測耗氧速率(OUR)、葡萄糖、氨基酸、分泌產(chǎn)物定量、乳酸和谷氨酸的量的變化，當(dāng)葡萄糖含量≤50％，ΔOUR＜0.1mmol/L/h時(shí)，開始灌流培養(yǎng)液，流量0.5個(gè)罐體積，連續(xù)灌流培養(yǎng)；當(dāng)葡萄糖含量≤50％，ΔOUR＜0.1mmol/L/h時(shí)，再增大灌流量(見圖四)。
4、檢測方法(1)生化指標(biāo)檢測分析用生化分析儀2730(AMPLE公司)檢測葡萄糖、乳糖、半乳糖、乳酸、谷氨酸等，測定不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的營養(yǎng)消耗與代謝產(chǎn)物生成。
(2)氨基酸分析檢測取原始培養(yǎng)液和不同時(shí)間點(diǎn)的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，在美國惠普1100高效液相色譜，用磷苯二甲醛(OPA)標(biāo)前衍生化外標(biāo)定量測定法測定氨基酸含量。
(3)抗體檢測酶聯(lián)免疫吸咐試驗(yàn)ELIAS夾心法，羊抗鼠IgG和酶標(biāo)羊抗鼠IgG均購自SIGMA公司。純化小鼠IgG本室自制，送檢中國生物制品檢定所其純度大于98％。設(shè)嚴(yán)格的陰陽性對照，每塊板用純化小鼠IgG做標(biāo)準(zhǔn)曲線，陰性對照為稀釋樣品用的稀釋液，待測孔O.D.值大于陰性對照孔兩倍以上為陽性孔，根據(jù)同一條件標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠IgG的含量。
(4)活細(xì)胞計(jì)數(shù)用胎盼藍(lán)染色法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行死活細(xì)胞計(jì)數(shù)。
5、細(xì)胞代謝、生長速率、產(chǎn)物合成平衡調(diào)控分析要實(shí)現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞的高密度長期培養(yǎng)，首先要掌握細(xì)胞代謝規(guī)律、生長速率和產(chǎn)物合成的關(guān)系，以尋求最佳的培養(yǎng)工藝。
所采用的技術(shù)路線(以雜交瘤細(xì)胞HAb18的培養(yǎng)工藝為例)雜交瘤細(xì)胞HAb18接種生物反應(yīng)器↓細(xì)胞密度2-3×105/mlCCMI無血清培養(yǎng)基(1％牛血清)↓在線檢測3天↓ ↓細(xì)胞密度活性 生化指標(biāo)OUR抗體分泌速率(當(dāng)ΔOUR＜0.1mmol/L/h，葡萄糖＜50％)↓(0.5-1v)開始灌流培養(yǎng)基(0.5％血清)↓第一個(gè)穩(wěn)定期(2-3天)(當(dāng)ΔOUR＜0.1mmol/L/h，葡萄糖＜50％)↓有目的添加氨基酸，0.5％血清培養(yǎng)基灌流量(1v)(亮、苯丙、、蛋、蘇氨酸)↓(8-24μmol/L)第二個(gè)穩(wěn)定期(3-5天)當(dāng)ΔOUR＜0.1mmol/L/h，葡萄糖＜50％ ↓補(bǔ)加濃縮氨基酸，無血清培養(yǎng)基，灌流量(1-2v)(亮、苯丙、、蛋、蘇、異亮、賴、色氨酸)↓(20-40μmol/L)ΔOUR≤0細(xì)胞生長速率 抗體比生長速率Δ＝0 氨↑乳酸↑葡萄糖↓↓增加灌流量細(xì)胞生長與抗體生成的第三穩(wěn)態(tài)↓在線檢測調(diào)整培養(yǎng)基組分降低糖的濃度，補(bǔ)加濃縮營養(yǎng)成分↓增加灌流量新的穩(wěn)態(tài)出現(xiàn)
↓收獲抗體連續(xù)培養(yǎng)中抗體分泌量與細(xì)胞活性的關(guān)系見圖3；連續(xù)培養(yǎng)中葡萄糖消耗量與灌流量的關(guān)系見圖4；連續(xù)培養(yǎng)中抗體分泌量與細(xì)胞耗氧速率的關(guān)系見圖5。
二、產(chǎn)物的回收與純化Streamline擴(kuò)張床(Amersham pharmacia公司)是專為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)下游產(chǎn)物回收純化而開發(fā)的流化床吸附技術(shù)。我們采用Streamline流化床SP陽離子交換介質(zhì)，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清直接上柱捕獲目標(biāo)蛋白。單一操作單元可同時(shí)起到澄清、濃縮和粗純化三方面的作用，因而能在短時(shí)間內(nèi)獲得高的產(chǎn)品回收率，而且，很容易根據(jù)需要放大規(guī)模。
1、抗體回收與純化工藝流程培養(yǎng)上清0.01-1M HCl調(diào)節(jié)pH至6，電導(dǎo)值2-5mS/cm↓10-20mM的檸檬酸、PH6平衡、擴(kuò)張Streamline50流化床↓上樣(流速200-400cm/h)↓pH6、10-20mm檸檬酸(A液)沖洗↓A液+1M NaCl(B液)洗脫，流速50-150cm/h↓收集洗脫峰，0.291g/ml硫到銨鹽析，靜置↓離心10000rpm×10’↓pharyl-sepharose HP疏水柱純化↓收集第一洗脫峰IgG，2、抗體產(chǎn)品除熱源
0.291g/ml的硫酸銨鹽析↓靜置離心10000rpm×10pH5、10-20mM的NaAc緩沖液(A液)溶解，透析↓A液平衡DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱↓上樣、收集穿過峰IgG↓0.01M pH7.4、PBS溶解、透析↓分裝、凍干3、產(chǎn)品的凍干純化后HAb18 IgG溶液調(diào)整濃度至8-10mg/ml↓按10％(w/v)添加蔗糖，過0.2μm除菌濾膜按5mg/瓶分裝至2ml西林瓶中，半加塞↓凍干
權(quán)利要求
1.一種連續(xù)灌流式培養(yǎng)雜交瘤、CHO細(xì)胞制備抗體的工藝方法，它主要由接種細(xì)胞——連續(xù)灌流培養(yǎng)——檢測方法——細(xì)胞代謝、生長速率、產(chǎn)物合成平衡調(diào)控分析——產(chǎn)物回收純化過程完成，其特征是接種細(xì)胞是采用固定床填充巨載體，接種細(xì)胞密度應(yīng)大于2-3×105/ml；細(xì)胞代謝、生長速率、產(chǎn)物合成平衡調(diào)控是通過在線監(jiān)測葡萄糖、乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、耗氧速率(OUR)以及pH值等指標(biāo)獲得，同時(shí)監(jiān)測細(xì)胞比生長速率和抗體比生成速率，在細(xì)胞由對數(shù)生長期進(jìn)入衰退期之前(即主要指標(biāo)是ΔOUR≤0，葡萄糖消耗大于50％)，添加相應(yīng)的氨基酸，并降低葡萄糖和血清濃度，以及控制灌流量，使細(xì)胞由以生長代謝為主轉(zhuǎn)為以產(chǎn)物合成為主，進(jìn)入穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)；產(chǎn)物回收純是采用Streamline SP介質(zhì)，一步回收培養(yǎng)上清中的抗體，DEAE-Sepharose FF陰離子交換劑去除純化后抗體產(chǎn)品中的熱源質(zhì)，抗體成品凍干保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)灌流式培養(yǎng)雜交瘤、CHO細(xì)胞制備抗體的工藝方法，其特征是添加的相應(yīng)氨基酸，包括必需氨基酸和非必需氨基酸，添加氨基酸的量由相應(yīng)細(xì)胞和產(chǎn)物所消耗氨基酸的量而補(bǔ)加。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)灌流式培養(yǎng)雜交瘤、CHO細(xì)胞制備抗體的工藝方法，其特征是降低葡萄糖和血清的濃度采用逐漸遞減方式。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)灌流式培養(yǎng)雜交瘤、CHO細(xì)胞制備抗體的工藝方法，其特征是穩(wěn)態(tài)的指標(biāo)是指乳酸生成速率與葡萄糖消耗速率比值保持較低水平，細(xì)胞比生長速率(μ)相對恒定。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)灌流式培養(yǎng)雜交瘤、CHO細(xì)胞制備抗體的工藝方法，其特征是所述培養(yǎng)上清中的抗體包括單克隆抗體、基因工程抗體，其中抗體產(chǎn)物培養(yǎng)上清調(diào)解pH值是4-7，電導(dǎo)值是2-5mS/cm；平衡液(A液)是pH4-7；洗脫液(B液)是A液+1M NaCl。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的連續(xù)灌流式培養(yǎng)雜交瘤、CHO細(xì)胞制備抗體的工藝方法，其特征是所述DEAE-Sepharose FF陰離子交換劑去除純化后抗體產(chǎn)品中的熱源質(zhì)，是在pH4～7的條件下，熱源吸附于柱上，抗體在穿過峰中流出；再以1M NaCl和0.5M NaOH去除吸附于柱上的熱源，柱子可重復(fù)使用。
全文摘要
該連續(xù)灌流式培養(yǎng)雜交瘤、CHO細(xì)胞制備抗體工藝方法,由接種細(xì)胞——連續(xù)灌流培養(yǎng)——檢測方法——細(xì)胞代謝、生長速率、產(chǎn)物合成平衡調(diào)控分析——產(chǎn)物回收純化過程完成,接種細(xì)胞是采用固定床填充巨載體,細(xì)胞代謝、生長速率、產(chǎn)物合成平衡調(diào)控是對葡萄糖、乳酸以及pH值等指標(biāo)進(jìn)行分析,在細(xì)胞由對數(shù)生長期進(jìn)入衰退期之前,添加相應(yīng)的氨基酸,并降低葡萄糖和血清濃度,細(xì)胞由以生長代謝為主轉(zhuǎn)為以產(chǎn)物合成為主,進(jìn)入穩(wěn)態(tài)培養(yǎng),此方法反復(fù)應(yīng)用,實(shí)現(xiàn)多個(gè)穩(wěn)態(tài),達(dá)到高密度、高產(chǎn)量的長期培養(yǎng);產(chǎn)物回收純化是采用StreamlineSP介質(zhì),一步回收培養(yǎng)上清中的抗體,DEAE－Sepharose FF陰離子交換劑去除純化后抗體產(chǎn)品中的熱源質(zhì),成品凍干。
文檔編號C12N5/12GK1339606SQ0113173
公開日2002年3月13日 申請日期2001年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月29日
發(fā)明者米力, 李玲, 馮強(qiáng), 余曉玲 申請人:陳志南