專利名稱：定量測(cè)定骨形成蛋白(bmp)活性細(xì)胞株的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)中的細(xì)胞因子活性的檢測(cè)方法，進(jìn)一步涉及一種定量測(cè)定骨形成蛋白(BMP)活性細(xì)胞株的建立方法。
現(xiàn)有的骨形成蛋白(BMP)活性測(cè)定方法，即動(dòng)物體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)，存在周期長(zhǎng)、不能定量，且受動(dòng)物品種、植入部位等多種因素影響的缺點(diǎn)。至今尚無(wú)專門用于定量測(cè)定骨形成蛋白的細(xì)胞株或細(xì)胞學(xué)方法。
骨鈣素是骨形成過(guò)程中成骨細(xì)胞分泌的一種必需的基質(zhì)蛋白，它正是骨形成蛋白(BMP)作用的重要靶分子之一。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是首先合成串聯(lián)6個(gè)BMP作用關(guān)鍵元件的骨鈣素部分啟動(dòng)子(6OCP)，(序列為5’-CCAAC CACA CCAAC CACA CCAACCACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA GCC GAT ATA AAT GCTACT GGA TGC TGG AGG GTG CAG AAC AGA CAA GTC-3’)連接上熒光素酶報(bào)告基因，克隆、構(gòu)建其真核表達(dá)載體，使熒光素酶報(bào)告基因處于該啟動(dòng)子(6OCP)控制之下。然后將上述載體轉(zhuǎn)入成肌細(xì)胞C2C12中，利用表達(dá)載體本身的抗性基因用抗生素進(jìn)行壓力篩選，獲得可受BMP誘導(dǎo)、穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的單克隆細(xì)胞株。熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物為熒光素酶，熒光素酶的活性可通過(guò)檢測(cè)其分解底物產(chǎn)生熒光量測(cè)得。具體檢測(cè)方法為收集BMP刺激、培養(yǎng)2天的單克隆細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，待細(xì)胞完全裂解后高速離心5分鐘，然后取部分離心上清，加入到一定量的熒光素酶作用底物液中，在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上測(cè)定產(chǎn)生熒光量。通過(guò)檢測(cè)各單克隆細(xì)胞株對(duì)BMP作用的反應(yīng)性；最終挑選到對(duì)BMP刺激反應(yīng)強(qiáng)度高、檢測(cè)指標(biāo)(熒光素酶產(chǎn)生熒光量)靈敏的細(xì)胞株。
本發(fā)明的方法經(jīng)過(guò)特異性、穩(wěn)定性等檢驗(yàn)證實(shí)，該細(xì)胞株穩(wěn)定可靠，適用于BMP活性的定量測(cè)定。
利用本發(fā)明測(cè)定BMP的活性僅需要2天時(shí)間，且操作簡(jiǎn)便，所測(cè)指標(biāo)敏感，可以進(jìn)行量化分析。
a.首先合成串聯(lián)6個(gè)BMP作用關(guān)鍵元件的骨鈣素部分啟動(dòng)子(6OCP)，序列為5’-CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACACCAAC CACA CCAAC CACA GCC GAT ATA AAT GCT ACT GGA TGC TGGAGG GTG CAG AAC AGA CAA GTC-3’，連接上熒光素酶報(bào)告基因，克隆、構(gòu)建其真核表達(dá)載體，使熒光素酶報(bào)告基因處于該啟動(dòng)子(6OCP)控制之下；b.然后轉(zhuǎn)入成肌細(xì)胞C2C12中，利用載體本身的抗性基因用抗生素進(jìn)行壓力篩選，獲得可受BMP誘導(dǎo)、穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的單克隆細(xì)胞株；上述真核表達(dá)載體也可轉(zhuǎn)入其它細(xì)胞系，如NIH3T3、C3H10T1/2細(xì)胞中；c.通過(guò)檢測(cè)各細(xì)胞株對(duì)BMP作用的反應(yīng)性具體檢測(cè)方法為收集BMP刺激、培養(yǎng)2天的單克隆細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，待細(xì)胞完全裂解后高速離心5分鐘，然后取部分離心上清，加入到一定量的熒光素酶作用底物液中，在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上測(cè)定產(chǎn)生熒光量；d.最終挑選到對(duì)BMP刺激反應(yīng)強(qiáng)度高、檢測(cè)指標(biāo)靈敏的細(xì)胞株；e.經(jīng)過(guò)特異性、穩(wěn)定性等檢驗(yàn)證實(shí)，該細(xì)胞株穩(wěn)定可靠，適用于BMP活性的定量測(cè)定；采用不同來(lái)源、不同批次的BMP刺激該細(xì)胞株后，檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果顯示BMP的作用劑量與熒光素酶活性呈線性正相關(guān)。
權(quán)利要求
1.定量測(cè)定骨形成蛋白(BMP)活性細(xì)胞株的建立方法，包括以下步驟a.首先將串聯(lián)6個(gè)BMP作用關(guān)鍵元件的骨鈣素部分啟動(dòng)子連接上熒光素酶報(bào)告基因，克隆、構(gòu)建其真核表達(dá)載體；該啟動(dòng)子序列為5’-CCAAC CACACCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACAGCC GAT ATA AAT GCT ACT GGA TGC TGG AGG GTG CAG AAC AGA CAAGTC-3’；b.然后轉(zhuǎn)入成肌細(xì)胞C2C12中，利用載體本身的抗性基因用抗生素進(jìn)行壓力篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的單克隆細(xì)胞株；熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物為熒光素酶，熒光素酶的活性可通過(guò)檢測(cè)其分解底物產(chǎn)生熒光量測(cè)得；上述真核表達(dá)載體也可轉(zhuǎn)入其它細(xì)胞系，如NIH3T3、C3H10T1/2細(xì)胞中；具體檢測(cè)方法為收集BMP刺激、培養(yǎng)2天的單克隆細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，待細(xì)胞完全裂解后高速離心5分鐘，然后取部分離心上清，加入到一定量的熒光素酶作用底物液中，在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上測(cè)定產(chǎn)生熒光量；c.通過(guò)檢測(cè)各細(xì)胞株對(duì)BMP作用的反應(yīng)性，最終挑選到對(duì)BMP刺激反應(yīng)強(qiáng)度高、檢測(cè)指標(biāo)—熒光素酶分解產(chǎn)生熒光量靈敏的細(xì)胞株；d.經(jīng)過(guò)特異性、穩(wěn)定性等檢驗(yàn)證實(shí)，該細(xì)胞株穩(wěn)定可靠，適用于BMP活性的定量測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定量測(cè)定骨形成蛋白(BMP)活性細(xì)胞株的建立方法,利用分子生物學(xué)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將BMP作用靶分子骨鈣素的部分啟動(dòng)子(串聯(lián)6個(gè)關(guān)鍵作用元件)連同熒光素酶報(bào)告基因,轉(zhuǎn)入成肌細(xì)胞C2C12中,經(jīng)過(guò)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的單克隆細(xì)胞株,并檢測(cè)各細(xì)胞株對(duì)BMP作用的反應(yīng)性;最終挑選到對(duì)BMP刺激反應(yīng)強(qiáng)度高、檢測(cè)指標(biāo)(熒光素酶)靈敏的細(xì)胞株。經(jīng)過(guò)特異性、穩(wěn)定性等檢驗(yàn),證實(shí)該細(xì)胞株穩(wěn)定可靠;通過(guò)檢測(cè)多批BMP樣品結(jié)果顯示,BMP的作用劑量大小與熒光素酶活性高低呈良好的線性正相關(guān)。本發(fā)明所建立的細(xì)胞株適用于BMP活性的定量測(cè)定。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK1357621SQ0113181
公開日2002年7月10日 申請(qǐng)日期2001年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月7日
發(fā)明者朱幫福, 陳蘇民, 陳南春 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)