專(zhuān)利名稱(chēng)：一種高效表達(dá)生產(chǎn)肽抗生素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)高效表達(dá)肽抗生素及其融合體的方法。
細(xì)菌感染性疾病嚴(yán)重影響人類(lèi)健康。人類(lèi)對(duì)抗細(xì)菌感染的最有力武器是抗生素，傳統(tǒng)的抗生素是由霉菌或放線菌產(chǎn)生的，故稱(chēng)為青霉素，鏈霉素，土霉素，卡那霉素等，霉菌或放線菌是尋找抗生素的傳統(tǒng)領(lǐng)域，人類(lèi)通過(guò)培養(yǎng)能產(chǎn)生抗生素的霉菌或放線菌來(lái)獲得抗生素。但隨著傳統(tǒng)抗生素的廣泛和長(zhǎng)期使用，耐藥菌株的不斷出現(xiàn)給抗生素使用帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)，人類(lèi)不得不斷地去尋找新型抗生素(Sobel JD.Curr Infect Dis Rep，3(6)546-549，2001)。
由于病原微生物對(duì)各種常規(guī)抗生素逐漸產(chǎn)生耐藥性，并且由于耐藥性的存在，臨床上通過(guò)加大抗生素使用劑量來(lái)控制感染，抗生素對(duì)動(dòng)物或人體的毒副作用也日益顯現(xiàn)。因此，長(zhǎng)期以來(lái)人們一直在不斷開(kāi)發(fā)新型抗生素，或?qū)⑴f有的抗生素改造成耐藥菌敏感的新一代抗生素，例如不斷出現(xiàn)的新一代青霉素，新一代頭孢類(lèi)抗生素等。20世紀(jì)80年代以來(lái)的科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲(chóng)、動(dòng)物、植物和人體基因組中也存在編碼能直接抑制或殺滅微生物的生物活性物質(zhì)的基因，這些基因編碼的產(chǎn)物為短肽，相對(duì)分子質(zhì)量通常在1×104以下，具有抗菌活性，稱(chēng)之為肽抗生素(peptide antibiotics)。1980年，Boman等人從美國(guó)天蠶蛹中分離得到了具有抗菌活性的肽抗生素——cecropins，并于次年在《Nature》上公布了其氨基酸序列；同在1980年，Lehrer等(Infect Immun，30180-192，1980)從兔的巨噬細(xì)胞中分離到了另一種肽抗生素——defensins，并于3年后公布了其氨基酸序列。此后，人們相繼從兩棲類(lèi)、昆蟲(chóng)、高等植物、哺乳動(dòng)物、直至人類(lèi)體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了肽抗生素。目前發(fā)現(xiàn)，僅昆蟲(chóng)來(lái)源的肽抗生素，就達(dá)170余種(Welnberg A，et al.Crit Rev Oral Med，9(4)399-414，1998)。
肽抗生素具有很強(qiáng)的抗菌活性，如純化的小鼠mBD-3對(duì)D31株大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為16μg/ml，對(duì)PA01株銅綠假單胞菌之MIC為8μg/ml；通過(guò)基因工程重組的人HD-5對(duì)傷寒桿菌野生株的MIC僅為1μg/ml，對(duì)李斯特氏菌MIC為10μg/ml。肽抗生素除了具有抗細(xì)菌的活性外，還具有抗真菌的作用，如來(lái)源于蛙類(lèi)的PGQ，dermaseptin和哺乳動(dòng)物的defensins對(duì)能引起人類(lèi)疾病的白色念珠菌具有殺傷作用，其中兔defensin NP-1對(duì)玉米的致病真菌也有作用。再者，肽抗生素可以殺滅寄生于人類(lèi)或動(dòng)物的寄生蟲(chóng)，如Shiva-I(一種昆蟲(chóng)肽抗生素cecropin的類(lèi)似物)可以殺死瘧原蟲(chóng)(Jaynes JM.et al，F(xiàn)ASEB J.22878-2883，1989)。此外，肽抗生素還具有抗病毒和抗腫瘤的作用(Andreu D，etal.Biopolymers，47413～33，1999)。
研究表明肽抗生素對(duì)熱穩(wěn)定，且不易引起細(xì)菌的耐藥反應(yīng)，故在醫(yī)藥及食品工業(yè)中有很好的應(yīng)用前景。目前獲得肽抗生素的方法主要有以下幾種1、化學(xué)合成法 為了研究肽抗生素的活性、作用機(jī)制，許多天然肽抗生素及其類(lèi)似物可通過(guò)固相合成的方法得到。例如，為了尋找具有更高抗菌活性或更廣抗菌譜的肽抗生素，一些雜合肽相繼被合成，如由cecropin和melititn的前13個(gè)氨基酸組成的雜合肽CN(1～13)MN(1～13)具有很強(qiáng)的抗菌活性而無(wú)溶血活性(Boman HG，et al.FEBS Letters，259103～106，1989)?；瘜W(xué)合成法可以方便地在合成過(guò)程中改變多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)，加入特殊氨基酸，對(duì)多肽末端進(jìn)行修飾，但是隨著合成肽鏈的延長(zhǎng)，昂貴的化學(xué)合成成本是限制該方法工業(yè)化應(yīng)用的最大障礙。
2、基因工程法 利用基因工程的方法生產(chǎn)肽抗生素是降低生產(chǎn)成本的一條有效途徑。真核表達(dá)系統(tǒng)的較低表達(dá)效率限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用；而用原核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)肽抗生素又面臨兩大難題一是肽抗生素本身對(duì)原核宿主細(xì)胞具有抑殺作用，難以通過(guò)構(gòu)建工程菌直接生產(chǎn)；二是肽抗生素為短肽分子，分子量多在4000Da左右，目前用基因工程法生產(chǎn)這種小肽分子不穩(wěn)定、產(chǎn)率低。為了克服肽抗生素對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的毒性，人們采用融合表達(dá)。最早Jaynes于1989年在大腸桿菌中融合表達(dá)了Shiva-I基因；Piers等(Gene 1347～13，1993)將defensin，HNP-1，cecropin/melittin雜合肽基因分別與4個(gè)不同的承載蛋白(Carrier protein)相融合，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果表明不同的承載蛋白對(duì)肽抗生素的表達(dá)效率不同；Lee等(Biochemical and BiophysicalResearch，277575-580，2000)將肽抗生素MSI-344融合于大腸桿菌截短的Purf承載蛋白上，結(jié)果使融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)量提高到占細(xì)菌總蛋白的30％。由此可見(jiàn)，通過(guò)設(shè)計(jì)和篩選不同的承載蛋白分子，構(gòu)建肽抗生素融合蛋白表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化微生物宿主細(xì)胞，既可實(shí)現(xiàn)肽抗生素在原核細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)，還可進(jìn)一步提高表達(dá)效率。
3、選擇對(duì)肽抗生素具有抗性的株系進(jìn)行原核表達(dá)1993年，Maen等(Biosci Biotechnol Biochem，571206～1207，1993)利用鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)了肽抗生素apidaecin的融合蛋白，裂解后得到了有活性的產(chǎn)物。
中國(guó)專(zhuān)利(專(zhuān)利號(hào)87106483)，公開(kāi)了用東方諾卡氏菌株NRRL-18098，NRRL-18099和NRRL-18100生產(chǎn)新型糖肽抗生素A82846，包括A82846A，A82846B和A82846C的方法。
中國(guó)專(zhuān)利(專(zhuān)利號(hào)86105469)，通過(guò)培養(yǎng)新微生物Dolyangium brachysporum，制備了具有抗生素和抗腫瘤活性的結(jié)構(gòu)式為新的肽抗生素。
這種通過(guò)篩選對(duì)肽抗生素具有抗性的株系，不僅工作量大，而且要篩選到高產(chǎn)率的株系更加困難。
因而，探索和研究既經(jīng)濟(jì)又能高效生產(chǎn)肽抗生素的方法具有現(xiàn)實(shí)意義。
本發(fā)明的發(fā)明人致力于解決肽抗生素生產(chǎn)過(guò)程中的低產(chǎn)率和高成本問(wèn)題，成功地通過(guò)DNA重組技術(shù)實(shí)現(xiàn)了肽抗生素在原核微生物宿主細(xì)胞中的高效表達(dá)，從而大量生產(chǎn)肽抗生素。
本發(fā)明涉及的高效表達(dá)生產(chǎn)肽抗生素的方法包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)一個(gè)編碼承載蛋白(carrier protein)的DNA序列，并克隆該DNA序列；(2)構(gòu)建含有承載蛋白編碼序列的表達(dá)載體，使這段編碼序列處于表達(dá)載體啟動(dòng)子的控制之下；(3)將構(gòu)建了承載蛋白編碼序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化微生物宿主細(xì)胞，篩選并鑒定陽(yáng)性重組子；(4))克隆編碼肽抗生素(peptide antibiotics)的基因，將之插入到上述表達(dá)載體，使肽抗生素的編碼產(chǎn)物處于承載蛋白的羧基端，使兩者成為一個(gè)融合基因，處于表達(dá)載體啟動(dòng)子的控制之下；(5)將含融合基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化微生物宿主細(xì)胞；(6)培養(yǎng)含上述融合基因表達(dá)載體的微生物細(xì)胞并進(jìn)行融合蛋白表達(dá)；(7)收集表達(dá)產(chǎn)物，純化肽抗生素。
根據(jù)本發(fā)明這一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案，所述的承載蛋白為一弱酸性多肽，該弱酸性多肽的長(zhǎng)度不受?chē)?yán)格限制，但應(yīng)長(zhǎng)于要表達(dá)的肽抗生素，且承載蛋白之負(fù)電荷可以有效中和肽抗生素的正電荷，以利于肽抗生素在原核細(xì)胞中的高效、穩(wěn)定表達(dá)。
在本發(fā)明這方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案中，設(shè)計(jì)的適用于高效表達(dá)肽抗生素的承載蛋白符合以下原則(1)鑒于肽抗生素的分子量多在4000道爾頓(Da)左右，系小分子多肽，故承載蛋白分子要大于目的肽分子2倍以上，便于獲得穩(wěn)定的表達(dá)及在生產(chǎn)過(guò)程中利用層析方法分離承載蛋白和目的肽。(2)設(shè)計(jì)中使承載蛋白的等電點(diǎn)遠(yuǎn)離要表達(dá)的目的肽抗生素等電點(diǎn)，如設(shè)計(jì)承載蛋白的等電點(diǎn)pI在5.0-6.5之間，則該承載蛋白在中性(pH7.0)條件下帶負(fù)電荷，可有效中和肽抗生素的正電荷，從而使融合蛋白的等電點(diǎn)趨于中性，便于其在宿主菌體內(nèi)穩(wěn)定存在，以及在隨后的純化過(guò)程中利用離子交換層析分離承載蛋白和目標(biāo)肽。(3)設(shè)計(jì)中要使承載蛋白的親水性好，以使融合蛋白有更好的水溶性，便于隨后的蛋白復(fù)性、純化等操作。(4)在承載蛋白與目的肽的連接處加上適當(dāng)?shù)牡鞍酌该盖谢蚧瘜W(xué)裂解位點(diǎn)，以便在產(chǎn)物純化階段能方便地切割和分離出目的肽。例如，要用化學(xué)試劑CNBr(識(shí)別位點(diǎn)為蛋氨酸)作為裂解融合蛋白的方法，則除了要生產(chǎn)的目的肽分子內(nèi)不能含蛋氨酸外，在承載蛋白的分子內(nèi)也不能有(起始密碼子編碼的蛋氨酸除外)，只能在承載蛋白與肽抗生素的連接處含有一個(gè)唯一的蛋氨酸。
根據(jù)本發(fā)明這一方面的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方案，承載蛋白的編碼序列可以用合成法或用分子生物學(xué)方法克隆獲得。對(duì)于一個(gè)符合上述設(shè)計(jì)原則而在現(xiàn)有的DNA序列庫(kù)(如GenBank)中不存在的承載蛋白編碼序列而言，化學(xué)合成法是很好的選擇，利用合成法可以方便地加入特定的識(shí)別位點(diǎn)；而對(duì)于一個(gè)用上述設(shè)計(jì)原則從已知序列庫(kù)中篩選出的承載蛋白編碼序列而言，在編碼序列較長(zhǎng)及易于獲得承載蛋白編碼序列所在的DNA模板時(shí)，用分子生物學(xué)方法克隆為好，例如，用PCR方法擴(kuò)增獲得。利用PCR的引物設(shè)計(jì)可方便地在承載蛋白編碼序列的3’-端加上一蛋白酶或化學(xué)裂解劑位點(diǎn)的編碼序列。例如，在承載蛋白序列的3’-端加上CNBr識(shí)別位點(diǎn)蛋氨酸的編碼序列ATG。
根據(jù)本發(fā)明這一方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案，承載蛋白與目的肽之間的蛋白酶或化學(xué)裂解劑識(shí)別位點(diǎn)除上述方法中加在所設(shè)計(jì)的承載蛋白的羧基端外，還可以在克隆目的肽編碼基因時(shí)加在目標(biāo)肽的氨基端。例如，在克隆肽抗生素編碼基因時(shí)在其5’-端加入CNBr的識(shí)別位點(diǎn)ATG。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方案中，用于構(gòu)建承載蛋白編碼序列或承載蛋白與目的肽抗生素融合基因的表達(dá)載體選自pinponint Xa-3、pET-16、pQE-32、pFAST Hta、pYEAST-2。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方案中，將承載蛋白的編碼序列克隆進(jìn)表達(dá)載體時(shí)可以采用直接連接到載體(閱讀框正確)或通過(guò)一個(gè)Linker連接，以保證閱讀框的正確。這是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。
根據(jù)本發(fā)明這一方面的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方案，融合蛋白的羧基端為肽抗生素，該肽抗生素編碼基因可以單拷貝存在，也可以多拷貝串聯(lián)存在，在各拷貝間含有與承載蛋白和肽抗生素間相同的蛋白酶或化學(xué)裂解劑的識(shí)別位點(diǎn)的編碼序列，這樣在表達(dá)的一個(gè)融合蛋白分子中可以切割出多個(gè)目的肽抗生素分子，提高生產(chǎn)效率。
在本發(fā)明這一方面的這一個(gè)優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方案中，所說(shuō)的單拷貝或多拷貝肽抗生素基因可以用合成法或用分子生物學(xué)方法獲得。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方案中，將目的肽抗生素基因插入已含承載蛋白編碼序列的表達(dá)載體構(gòu)建融合基因時(shí)，目的基因可以直接連接到承載蛋白序列的下游(閱讀框正確)或通過(guò)一個(gè)Linker連接，以保證閱讀框的正確。
根據(jù)本發(fā)明這一方面的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)方案，將構(gòu)建好的含承載蛋白與目的肽抗生素融合基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入微生物宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌。培養(yǎng)所說(shuō)的含融合基因表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，表達(dá)融合蛋白，進(jìn)一步用蛋白酶或化學(xué)裂解劑，例如CNBr處理融合蛋白，分離承載蛋白和肽抗生素。當(dāng)設(shè)計(jì)了肽抗生素的多拷貝序列時(shí)則在融合蛋白裂解的同時(shí)被分割成單體。最后用離子交換柱或凝膠層析純化目標(biāo)肽抗生素。
本發(fā)明將通過(guò)下列實(shí)例作進(jìn)一步說(shuō)明，但不是以此來(lái)限制本發(fā)明。實(shí)例1承載蛋白的設(shè)計(jì)及其同源序列檢索。
根據(jù)上述承載蛋白的設(shè)計(jì)原則，利用DNAStar軟件包的Editseq和Protean軟件設(shè)計(jì)一489bp的承載蛋白編碼序列(序列編號(hào)7)，該序列編碼163個(gè)氨基酸組成的承載蛋白(序列編號(hào)8)，分子量17668.80Da，等電點(diǎn)為5.621，含103個(gè)親水性氨基酸，60個(gè)疏水性氨基酸，用Protean軟件觀察，承載蛋白的親水性良好。
將設(shè)計(jì)的序列編號(hào)7送入GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)序列庫(kù)用blastn進(jìn)行DNA同源序列檢索，結(jié)果檢索到8段均為19bp的序列與序列編號(hào)7有同源性，檢索結(jié)果附后。Distribution of 8 Blast Hits on the Query Sequence ScoreESequences producing significant alignments (bits) Valuegi|15292278|gb|AY051984.1|Drosophila melanogaster LD45365... 38 7.1gi|14280141|gb|AC008004.5|AC008004 Drosophila melanogaster，... 38 7.1gi|13270541|gb|AC007697.5|AC007697 Drosophila melanogaster，... 38 7.1gi|6679091|ref|NM_008714.1| Mus musculus Notch gene homolog...38 7.1gi|10727480|gb|AE003802.2|AE003802 Drosophila melanogaster... 38 7.1gi|7141240|gb|AF220364.1|AF220364 Drosophila melanogaster P...38 7.1gi|13488747|dbj|AP000639.4|AP000639 Homo sapiens genomic DN...38 7.1gi|288502|emb|Z11886.1|MMNOTCHA M.musculus notch-1 mRNA 38 7.1Alignments＞gi|15292278|gb|AY051984.1|Drosophila melanogaster LD45365 full length cDNALength＝3149Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝19/19(100％)Strand＝Plus/MinusQuery107tgtagctgcatctaatgat 125|||||||||||||||||||Sbjct2361 tgtagctgcatctaatgat 2343＞gi|14280141|gb|AC008004.5|AC008004 Drosophila melanogaster，chromosome 2R，region54B-54C，BAC clone，BACR21A09，complete sequenceLength＝175506Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝19/19(100％)Strand＝Plus/MinusQuery107tgtagctgcatctaatgat 125|||||||||||||||||||Sbjct162991 tgtagctgcatctaatgat 162973＞gi|13270541|gb|AC007697.5|AC007697 Drosophila melanogaster，chromosome 2R，region54D4-54E7，BAC clone，BACR12C23，complete sequenceLength＝194897Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝19/19(100％)Strand＝Plus/MinusQuery107 tgtagctgcatctaatgat 125|||||||||||||||||||Sbjct19971 tgtagctgcatctaatgat 19953＞gi|6679091|ref|NM_008714.1|Mus musculus Notch gene homolog 1，(Drosophila)(Notch1)，mRNALength＝8064Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝22/23(95％)Strand＝Plus/MinusQuery94 gagtggtaagttctgtagctgca 116||||||||||||||| ||||||Sbjct7221 gagtggtaagttctgtggctgca 7199＞gi|10727480|gb|AE003802.2|AE003802 Drosophila melanogaster genomic scaffold142000013386047 section 41 of 52，complete sequenceLength＝262395Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝19/19(100％)Strand＝Plus/MinusQuery107 tgtagctgcatctaatgat 125|||||||||||||||||||Sbjct32424 tgtagctgcatctaatgat 32406＞gi|7141240|gb|AF220364.1|AF220364 Drosophila melanogaster Plenty of SH3s(POSH)mRNA，complete cds，Length＝3123Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝19/19(100％)Strand＝Plus/MinusQuery107 tgtagctgcatctaatgat 125|||||||||||||||||||Sbjct2362 tgtagctgcatctaatgat 2344＞gi|13488747|dbj|AP000639.4|AP000639 Homo sapiens genomic DNA，chromosome 11q，cloneCMB9-26D11，complete sequences，Length＝103758Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝19/19(100％)Strand＝Plus/MinusQuery69gactatgagagaatttggg 87|||||||||||||||||||Sbjct40122 gactatgagagaatttggg 40104＞gi|288502|emb|Z11886.1|MMNOTCHA M.musculus notch-1 mRNALength＝8064Score＝38.2bits(19)，Expect＝7.1Identities＝22/23(95％)Strand＝Plus/MinusQuery94 gagtggtaagttctgtagctgca 116|||||||||||||||| ||||||Sbjct7221 gagtggtaagttctgtggctgca 7199DatabaseAll GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences(but no EST，STS，GSS，or phase 0，1or 2 HTGS sequences).Posted dateNov 28，2001 339AMNumber of letters in database60,694,059Number of sequences in database1,029,146實(shí)例2承載蛋白編碼序列的合成根據(jù)實(shí)例1設(shè)計(jì)的承載蛋白編碼序列及其DNA同源性檢測(cè)結(jié)果，表明序列編號(hào)7為目前GenBank序列庫(kù)中沒(méi)有收錄的新序列。由于目前的合成法尚無(wú)法一次性合成長(zhǎng)度達(dá)489bp的DNA序列，故為獲得所設(shè)計(jì)的序列，我們將序列編號(hào)7分成5段來(lái)合成，這5段寡核苷酸序列分別稱(chēng)為序列編號(hào)1、2、3、4和5，簡(jiǎn)稱(chēng)Seq1～5，相鄰序列的3’-端或5’-端有15bp的互補(bǔ)序列，其中序列編號(hào)1的5’-端除3個(gè)保護(hù)性堿基(ccg)及一個(gè)SmaI限制性酶切位點(diǎn)(cccggg)外，其余序列與序列編號(hào)7的5’-端相同；序列編號(hào)2和序列編號(hào)4與序列編號(hào)7的對(duì)應(yīng)序列反向互補(bǔ)；序列編號(hào)3與序列編號(hào)7的對(duì)應(yīng)序列相同；序列編號(hào)5除3’-端有一KpnI酶切位點(diǎn)(ggtacc)及3個(gè)保護(hù)堿基(gcg)外，其余序列與序列編號(hào)7的3’-端相同，各寡核苷酸的對(duì)應(yīng)關(guān)系見(jiàn)附

圖1。
為用引物延伸法(Lee JH，et al.Geneticanalysisbiomolecularengineering，13139-145，1996)生成承載蛋白編碼序列(序列編號(hào)7)，則還需合成一條與序列編號(hào)5的3’-端互補(bǔ)的引物P(序列編號(hào)6)。
將合成的5段寡核苷酸(Seq1～5)和引物P分別溶解于pH8.0的TE緩沖液中，取等摩爾各寡核苷酸分子混合，加水至14μl，70℃溫育5分鐘，加2μl 10×Klenow buffer，降溫至50℃并保持60分鐘(退火)，再加2μl 4×dNTP，5μl Klenow酶，30℃3小時(shí)，繼續(xù)補(bǔ)加T4 DNA連接酶2μl，22℃2小時(shí)，最后加2μl 0.5M EDTA終止反應(yīng)，獲得承載蛋白編碼序列。實(shí)例3承載蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建將表達(dá)質(zhì)粒pQE-32用BamHI酶切后用大腸桿菌Klenow酶補(bǔ)平，回收線性化產(chǎn)物，再用KpnI酶切，回收備用。
用SmaI和KpnI酶切實(shí)例2所生成的承載蛋白編碼序列、回收，進(jìn)一步將酶切產(chǎn)物與線性化的pQE-32質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性重組子，其構(gòu)建策略見(jiàn)附圖2，將陽(yáng)性重組子命名為pQE-CP。實(shí)例4肽抗生素基因的準(zhǔn)備為利用所設(shè)計(jì)的承載蛋白來(lái)表達(dá)肽抗生素，合成了小鼠肽抗生素mBD-1(序列編號(hào)9，Bals R，et al.Infect Immuno 161225-32；1998)的成熟肽基因(序列編號(hào)10)，在該肽抗生素基因的5’-端加有平端EheI酶切位點(diǎn)及一個(gè)蛋氨酸的編碼子ATG，在3’-端加有粘端HindIII酶切位點(diǎn)及終止密碼子TGA。
將合成的兩段寡核苷酸(3’-端有20bp的互補(bǔ)序列)溶解于pH8.0的TE緩沖液中，利用實(shí)例3所述的引物延伸法生成mBD-1全基因。
為進(jìn)一步證實(shí)所設(shè)計(jì)的承載蛋白在高效表達(dá)肽抗生素分子中的作用，我們用上述同樣的方法合成了大鼠肽抗生素rBD-1(序列編號(hào)11)的成熟肽(序列編號(hào)12)編碼序列以及人肽抗生素hNP-4(序列編號(hào)13)的成熟肽(序列編號(hào)14)編碼序列。實(shí)例5肽抗生素融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建為構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體，分別將合成的肽抗生素rBD-1，mBD-1和hNP-4之成熟肽基因插入實(shí)例3所構(gòu)建表達(dá)載體之承載蛋白的C-端，并確保閱讀框的正確。
以構(gòu)建小鼠mBD-1融合蛋白表達(dá)載體為例，先將陽(yáng)性重組子pQE-CP(實(shí)例3)分別用SmaI和HindIII酶切，合成的小鼠mBD-1成熟肽基因(實(shí)例4)則分別用EheI和HindIII酶切，回收兩組酶切產(chǎn)物并用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性重組子。融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建策略見(jiàn)附圖3，并將篩選到的陽(yáng)性重組子命名為pQE-CM。實(shí)例6肽抗生素的表達(dá)為利用實(shí)例5構(gòu)建的表達(dá)載體表達(dá)承載蛋白與肽抗生素的融合蛋白，將質(zhì)粒pQE-CM純化后轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，挑取具有氨芐青霉素(AMP)抗性菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)于2ml含100μg/ml AMP的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜(16-18小時(shí))，次日取50μl過(guò)夜菌培養(yǎng)于5ml LB培養(yǎng)基中(1％，V/V)，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5～0.6時(shí)，加IPTG(終濃度為1mM/L)誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)，用SDS-PAGE分析融合蛋白的表達(dá)情況(見(jiàn)附圖4)，融合蛋白的表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的40～45％。
以上這些實(shí)例展示了本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用，這些技術(shù)也是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟悉的。正如上所述，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一個(gè)承載蛋白編碼序列，提供了含該承載蛋白編碼序列的表達(dá)載體，利用該表達(dá)載體可進(jìn)行肽抗生素的高效表達(dá)生產(chǎn)，生產(chǎn)的融合蛋白占菌體總蛋白的40～45％。由此可見(jiàn)，本發(fā)明通過(guò)將肽抗生素融合到所設(shè)計(jì)的承載蛋白分子上，從而將肽抗生素對(duì)原核微生物宿主細(xì)胞的毒性降到最低限度，實(shí)現(xiàn)了肽抗生素的高效表達(dá)；此外，本發(fā)明設(shè)計(jì)的承載蛋白也適用于表達(dá)其它具有生物學(xué)活性的短肽。
本發(fā)明有關(guān)的序列表1、為合成序列編號(hào)7所設(shè)計(jì)的5段寡核苷酸及引物P5’-ccgcccgggctcctatctaagagcctagaggatcatgaggcgggggtatgccctttgggctgcccctactgcttagctgactatgagagaatttggggtgtacgagtggtaagttctgt-3’ (序列編號(hào)1，簡(jiǎn)稱(chēng)Seq1)5’-tcgaagatgattccaacatccaccttgcccttatcgagcttagcccccggatctcctgctttgattccattgggatccacctctaccttatcattagatgcagctacagaacttaccact-3’(序列編號(hào)2，簡(jiǎn)稱(chēng)Seq2)5’-tggaatcatcttcgaagcgttcccgagagctctttatgcggtggcacaagttgctaacttcggagcaagcaaatatagtcgcgggggttggaggttcgtcgagaacggaatacagcgata-3’(序列編號(hào)3，簡(jiǎn)稱(chēng)Seq3)5’-gctagggcgttccaaacttcgtgataccggtggggtaaactactttgggggtccaaaacctcacccttgtgtcgctcaaggaggtgtcgtccgaaggcagcatcatatcgctgtattccg-3’(序列編號(hào)4，簡(jiǎn)稱(chēng)Seq4)5’-ttggaacgccctagcagccctagagctggtaatccaacaagaggagggttctaatggaacttctactggatccgagggcggtaccgcg-3’(序列編號(hào)5，簡(jiǎn)稱(chēng)Seq5)5’-cgcggtaccgccctcg-3’(序列編號(hào)6，簡(jiǎn)稱(chēng)引物P)2、本發(fā)明設(shè)計(jì)的承載蛋白編碼序列(489bp)ctcctatctaagagcctagaggatcatgaggcgggggtatgccctttgggctgcccctactgcttagctgactatgagagaatttggggtgtacgagtggtaagttctgtagctgcatctaatgataaggtagaggtggatcccaatggaatcaaagcaggagatccgggggctaagctcgataagggcaaggtggatgttggaatcatcttcgaagcgttcccgagagctctttatgcggtggcacaagttgctaacttcggagcaagcaaatatagtcgcgggggttggaggttcgtcgagaacggaatacagcgatatgatgctgccttcggacgacacctccttgagcgacacaagggtgaggttttggacccccaaagtagtttaccccaccggtatcacgaagtttggaacgccctagcagccctagagctggtaatccaacaagaggagggttctaatggaacttctactggatccgagggc(序列編號(hào)7)3、承載蛋白的氨基酸序列LLSKSLEDHEAGVCPLGCPYCLADYERIWGVRVVSSVAASNDKVEVDPNGIKAGDPGAKLDKGKVDVGIIFEAFPRALYAVAQVANFGASKYSRGGWRFVENGIQRYDAAFGRHLLERHKGEVLDPQSSLPHRYHEVWNALAALELVIQQEEGSNGTSTGSEG(序列編號(hào)8)4、小鼠肽抗生素mBD-1基因序列atgaaaactcattactttctcctggtgatgatatgttttcttttctcccagatggagccaggtgttggcattctcacaagtcttggacgaagaacagatcaatacaaatgccttcaacatggaggattctgtctccgctccagctgcccatctaataccaaactacagggaacctgtaaaccagataagcccaactgttgtaagagctgacagtag(序列編號(hào)9)5、小鼠肽抗生素mBD-1成熟肽序列GILTSLGRRTDQYKCLQHGGFCLRSSCPSNTKLQGTCKPDKPNCCKS(序列編號(hào)10)6、大鼠肽抗生素rBD-1基因序列atgaaaac tcattacttt ctcctggtga tgttattttt tctcttctcc cagatggagc tgggtgctgg cattctcacaagtcttggac gcagaacaga tcaataccga tgcctccaaa atggaggatt ctgtctccgc tccagctgcccatctcatac caaactacaa ggaacatgta aaccagataa gcccaactgt tgcaggagtt ga(序列編號(hào)11)7、大鼠肽抗生素rBD-1成熟肽序列TDQYRCLQNGGFCLRSSCPSHTKLQGTCKPDKPNCCRS(序列編號(hào)12)8、人肽抗生素hNP-4基因序列atgaggatt atcgccctcc tcgctgctat tctcttggta gccctccagg tccgggcagg cccactccaggcaagaggtg atgaggctcc aggccaggag cagcgtgggc cagaagacca ggacatatct atttcctttgcatgggataa aagctctgct cttcaggttt caggctcaac aaggggcatg gtctgctctt gcagattagtattctgccgg cgaacagaac ttcgtgttgg gaactgcctc attggtggtg tgagtttcac atactgctgcacgcgtgtcg attaa(序列編號(hào)13)9、人肽抗生素hNP-4成熟肽序列VCSCRLVFCRRTELRVGNCLIGGVSFTYCCTRVD(序列編號(hào)14)
權(quán)利要求
1.一種高效表達(dá)生產(chǎn)肽抗生素的方法，其具體步驟為(a)設(shè)計(jì)并克隆一個(gè)承載蛋白(carrier protein)編碼序列；(b)將(a)所述的承載蛋白序列插入一表達(dá)載體，使該基因處于表達(dá)載體啟動(dòng)子的控制之下；(c)將(b)所述的構(gòu)建了承載蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化微生物宿主細(xì)胞，篩選并鑒定陽(yáng)性重組子；(d)克隆準(zhǔn)備生產(chǎn)的肽抗生素(peptide antibiotics)編碼基因；(e)將(d)所述的肽抗生素編碼基因插入(c)所述的陽(yáng)性重組子中，使肽抗生素位于承載蛋白的羧基端，并與承載蛋白編碼序列融合成為一個(gè)融合基因；(f)將(e)所述的構(gòu)建了融合基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化微生物宿主細(xì)胞，篩選并鑒定陽(yáng)性細(xì)胞克??；(g)培養(yǎng)(f)所述的陽(yáng)性微生物細(xì)胞克隆并進(jìn)行融合蛋白表達(dá)；(h)收集表達(dá)產(chǎn)物，純化肽抗生素。
2.如權(quán)利要求1所述的承載蛋白，其特征在于，它為一段弱酸性多肽，等電點(diǎn)(pI)為5.621，分子量為17668.80Da；
3.如權(quán)利要求1和2所述承載蛋白，其特征在于，它為一段不含蛋氨酸的多肽。
4.如權(quán)利要求1所述的承載蛋白的編碼序列，其特征在于，該序列編碼具有權(quán)利要求2和3所述的多肽。
5.一種表達(dá)載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的承載蛋白編碼序列或承載蛋白與肽抗生素的融合基因。該載體選自下組中的一組(a)含權(quán)利要求1所述承載蛋白編碼序列或承載蛋白與肽抗生素融合基因的pinponint Xa-3；(b)含權(quán)利要求1所述承載蛋白編碼序列或承載蛋白與肽抗生素融合基因的pET-16；(c)含權(quán)利要求1所述承載蛋白編碼序列或承載蛋白與肽抗生素融合基因的pQE-32；(d)含權(quán)利要求1所述承載蛋白編碼序列或承載蛋白與肽抗生素融合基因的pFAST HTa；(e)含權(quán)利要求1所述承載蛋白編碼序列或承載蛋白與肽抗生素融合基因的pYEAST-2。
6.如權(quán)利要求1所述的承載蛋白與肽抗生素之融合基因，它包含至少一個(gè)裂解位點(diǎn)，以利于用蛋白酶或化學(xué)裂解劑裂解融合基因編碼的融合蛋白。
7.一種遺傳工程化的微生物宿主細(xì)胞，其特征在于，它是選自下組的一種微生物細(xì)胞(a)用權(quán)利要求5所述的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的微生物細(xì)胞；(b)用權(quán)利要求1所述的融合基因轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用DNA重組技術(shù)高效表達(dá)生產(chǎn)肽抗生素(Peptideantibiotics)的方法。還提供了一個(gè)可高效融合表達(dá)肽抗生素的承載蛋白(Carrier protein)序列,通過(guò)構(gòu)建承載蛋白與肽抗生素的融合蛋白表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化微生物宿主細(xì)胞,培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆并進(jìn)行融合蛋白表達(dá),表達(dá)的融合蛋白可占微生物宿主細(xì)胞總蛋白的40～45%。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1379112SQ0113185
公開(kāi)日2002年11月13日 申請(qǐng)日期2001年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月21日
發(fā)明者饒賢才, 胡福泉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)