專利名稱：一種建立人/山羊造血干細(xì)胞異種移植模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種建立造血干細(xì)胞異種移植模型的方法。
人類和哺乳動物的HSC移植實驗表明，只有在宿主處于免疫耐受或免疫屏障尚未被激活時，移植方能成功。在胎兒發(fā)育的早期，免疫器官尚未發(fā)育成熟，處于免疫幼稚期，故是HSC移植的合適受體。Zanjani等成功地將從人胎肝分離的HSC移植于胎綿羊，獲得人HSC在綿羊體內(nèi)長期存活。
本發(fā)明從人臍血分離獲得人HSC，注射到胎山羊體內(nèi)，成功地建立了人/山羊造血干細(xì)胞異種移植模型。在實驗組的50頭移植山羊中，35頭山羊移植成功，并顯示人HSC擴增至1000-10000倍，更有意義的是，移植于山羊體內(nèi)的人造血細(xì)胞已穩(wěn)定保持其表型達10個月以上，并處于不完全分化狀態(tài)。而對照組40頭非移植山羊的血液中卻沒有人造血干細(xì)胞所特有的CD34+細(xì)胞，兩者之間的差異極顯著[P＜0.01]。本發(fā)明方法技術(shù)方案及步驟如下1、移植模型構(gòu)建的基本路線首先收集新鮮人臍血，然后分離出人HSC，將分離的HSC移植入胎山羊腹腔中。整個過程在8-16小時內(nèi)完成。待胎羊分娩后3個月、6個月、10個月分別抽取靜脈血進行檢測，驗證山羊體內(nèi)是否嵌合有人HSC及其含量和分化程度。
2、移植模型構(gòu)建的具體步驟(1)獲得新鮮的人臍血。
(2)所得人新鮮臍血首先用NycoPrepTM(1.077g/mL，Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway)梯度離心分離臍血中單個核細(xì)胞，然后用“人原始祖細(xì)胞富集雞尾酒”(Human PrimitiveProgenitor Enrichment Cocktail，Stemcell Technologies，Vancouver，Canada)試劑盒進一步分離獲得人HSC(CD34+CD38-Lin-細(xì)胞)。
(3)將分離獲得的人HSC移植于胎山羊，胎齡為55-65天。術(shù)前母山羊需禁食24小時，然后肌肉注射麻醉劑“846”(0.01mL/kg，中國軍需大學(xué)產(chǎn)品)，剖腹暴露子宮后，通過子宮壁直接向胎羊腹腔內(nèi)注射人HSC，注射劑量為每頭HSC1-5×105。關(guān)閉母體腹腔后，靜脈推注“清醒劑”(中國軍需大學(xué)產(chǎn)品)促使山羊恢復(fù)知覺。
3、檢測構(gòu)建模型在50頭移植的胎山羊中活產(chǎn)39頭。待胎羊分娩后3個月、6個月、10個月分別抽取靜脈血進行檢測，測定山羊體內(nèi)是否成功移植入人HSC即是否嵌合有人HSC，并檢測山羊體內(nèi)人HSC的量及其HSC的分化程度。
(1)進行FACS分析在鑒定人/山羊造血干細(xì)胞移植模型的體內(nèi)是否嵌入人的HSC以前，比較分析正常山羊和人兩者的細(xì)胞對鼠抗人單抗結(jié)合能力的差異，以找出對人細(xì)胞特異而對山羊細(xì)胞不特異的鼠抗人單抗用于人/山羊模型的FACS比較分析。
本發(fā)明采用材料來源PE(phycoerythrin)和FITC共價標(biāo)記的鼠抗人CD抗原，GPA和HLA抗原的單克隆抗體購自美國B.D.公司，流式細(xì)胞儀為美國B.D.公司產(chǎn)品。本發(fā)明中FACS的分析步驟按美國B.D.公司的操作指南進行，通過鼠抗人單抗對正常山羊和人兩者之間的細(xì)胞結(jié)合能力的比較分析。
FACS測定方法如下每組單抗10μL加入50μL山羊全血標(biāo)本，徹底混勻后在室溫下孵育30分鐘，然后加入1mL1×FACSTM裂解液(B.D.公司，San Jose，CA，USA)，混勻，室溫下15分鐘后用含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％疊氮鈉的PBS洗滌二次，再離心1,500rpm孵育15分鐘，丟棄上清液，取1-2×105細(xì)胞進行單抗的染色后在室溫下進行細(xì)胞流式儀分析。本發(fā)明分析結(jié)果顯示出特異于CD3，CD4，CD5，CD7，CD8，CD10，CD13，CD14，CD15，CD19，CD20，CD22，CD33，CD34，CD38，CD42a，CD45，CD56，CD62和CD71的鼠抗人單抗對山羊細(xì)胞不敏感，在此基礎(chǔ)上，常規(guī)選擇CD20/CD7；GPA/CD45；D34/CD15；CD14/38(PE/FITC標(biāo)記)以及CD3，CD4，CD8，CD56等單抗進行FACS測定。
(2)DNA分析①抽提DNA；②設(shè)計PCR引物通過Genbank分別查詢?nèi)薈D34、血型糖蛋白A(Glycophorin A，Gly A)和SRY基因的序列，與山羊的序列進行同源性比對，選取非同源的部分設(shè)計引物；表1為具體引物表.
③檢測引物特異性將合成的各對引物分別擴增人基因組，檢測DNA和對照組羊DNA的特異性；④PCR檢測人/山羊造血干細(xì)胞嵌合模型的巢式CD34基因的PCR擴增將抽提的DNA作為模板，以HCl/HC作第一次擴增，擴增條件為94℃×5′→(94℃×1′→61℃×45′′→72×1′)×15cycles→72℃×10′，擴增體積為15μL。取5μL擴增產(chǎn)物再以HC2/HC3作第二次擴增，擴增條件為94℃×5′→(94℃×1′→61C×45′′→72℃×1′)×28cycles→72℃×10′，擴增體積為25μL。其中陽性的可擴增出437bp的特異性條帶。
Gly A基因的PGR擴增將抽提的DNA作為模板，以GA2/GA3作第一次擴增，擴增條件為94℃×5′→(94℃×1′→61℃×45′′→72℃×1′)×15cycles→72℃×10′，擴增體積為15μL。取5μL擴增產(chǎn)物再以GA1/GA4作第二次擴增，擴增條件為94℃×5′→(94℃×1′→61℃×45′′→72℃×1′)×28cycles→72℃×10′，擴增體積為25μL。其中陽性的可擴增出479bp的特異性條帶。
SRY基因的PCR擴增將抽提的DNA作為模板，以HS1/HS4作第一次擴增，擴增條件為94℃×5′→(94℃×1′→56℃×45′′→72℃×1′)×15cycles→72℃×10′，擴增體積為15μL。取5μL擴增產(chǎn)物再以HS2/HS3作第二次擴增，擴增條件為94℃×5′→(94℃×1′→58℃×45′′→72℃×1′)×28cycles→72℃×10′，擴增體積為25μL。陽性的可擴增出302bp的特異性條帶。
⑤檢測PCR-Sothern blot將擴增CD34基因得到的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，用從人DNA上擴增到的437bp片段作為探針進行雜交。
⑥RT-PCR檢測人/山羊造血干細(xì)胞嵌合模型抽提總RNA使用QIAGEN公司的QIAampRNA Blood Kit從羊外周血中抽提總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA使用BRL公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
PCR擴增CD34基因、Gly A基因以逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板，具體擴增過程同上。
⑦對移植流產(chǎn)的胎羊進行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查。
⑧對被移植胎羊的母體血液行血液學(xué)檢查。四、本發(fā)明實驗結(jié)果如下1、人臍血HSC移植于50頭胎山羊后，其中11頭因手術(shù)創(chuàng)傷或急性免疫反應(yīng)等原因而流產(chǎn)，其它39頭胎羊妊娠至足月后分娩，經(jīng)FACS和DNA分析，證實35頭存在人造血細(xì)胞的鑲嵌，并穩(wěn)定地持續(xù)至出生后10個月以后而無免疫排斥反應(yīng)。表2為人HSC宮內(nèi)移植于胎羊后的結(jié)果。
FACS分析結(jié)果顯示，35頭人干/祖細(xì)胞移植存活的山羊血液中均有人CD34+細(xì)胞(2.58±0.54％)，而40頭非移植對照山羊的血液中卻沒有人CD34+細(xì)胞，兩者之間存在極顯著的差異(P＜0.01)，不同移植羊個體間人CD34+細(xì)胞的數(shù)量具有差異，但與受體山羊的性別和母羊的年齡無關(guān)。此外，移植存活羊的血液中還存在表達CD14，CD20和GPA等的陽性細(xì)胞，但未檢測出表達CD3，CD4，CD8和CD56的細(xì)胞。
2、山羊血液中人造血細(xì)胞各亞群的頻率(％)以平均值±SE表示。移植存活組和對照組之間具有顯著差異{P＜0.01}。表3為移植組和對照組山羊FACS分析的結(jié)果。
胎羊出生后，在不同時期通過FACS動態(tài)監(jiān)測其體內(nèi)人造血細(xì)胞的存在狀況，結(jié)果表明，人造血細(xì)胞在山羊體內(nèi)能較穩(wěn)定地表達多種表面抗原，其數(shù)量也保持到出生后10個月以上。
3、引物特異性的檢測結(jié)果人基因組DNA中均可擴增出CD34、GPA和SRY三種基因中特定的條帶，羊基因組DNA中沒有擴出相應(yīng)的條帶，本發(fā)明證合成的引物特異性較好，可用于隨后的分子檢測。
4、人/山羊造血干細(xì)胞嵌合模型的巢式PCR檢測結(jié)果CD34基因的PCR擴增圖2的結(jié)果證實有8個從小羊外周血中提取的DNA中可擴增出437bp的特異性片段，證明其外周血中存在人HSC。
GPA基因的PCR擴增圖3的結(jié)果可以看出1-8為陽性。共有8只小羊外周血DNA中可擴增出人GPA基因。
SRY基因的PCR擴增圖4的結(jié)果可以看出2、3、5、8、10為陽性，移植于這幾只小羊體內(nèi)的HSC均來自于男性，結(jié)果與實際情況相符。
5、人/山羊造血干細(xì)胞嵌合模型的RT-PCR檢測結(jié)果CD34基因的RT-PCR擴增從圖5可以看出1、2、4、5、6、7、8為陽性。共有1只羊外周血中有人CD34基因的表達。
GPA基因的RT-PCR擴增從圖6可以看出1-8均為陽性。共有1只羊外周血中有人GPA基因的表達。
6、PCR-Sothern blot雜交證實以上PCR結(jié)果。
7、移植流產(chǎn)的胎羊進行了組織學(xué)和免疫組織化學(xué)的檢查顯示不僅血管內(nèi)含有人造血干細(xì)胞而且部分臟器組織內(nèi)，特別在肝臟組織內(nèi)有較大量人的肝細(xì)胞的聚集。
8、移植胎羊的母體血液檢查中發(fā)現(xiàn)人的造血干細(xì)胞。
本發(fā)明結(jié)果顯示，從人臍血分離獲得的HSC也能成功地移植于山羊體內(nèi)，其技術(shù)方案、檢測完整性及良好的結(jié)果國內(nèi)外未見報道。如根據(jù)每頭移植存活的山羊體內(nèi)人造血細(xì)胞占山羊外周血單個核細(xì)胞總數(shù)(1011-1012)的1-3％計算，那么人HSC在山羊體內(nèi)已擴增至103-104倍，換言之，如將1×105的人HSC移植于山羊，將有108-109的人造血細(xì)胞循環(huán)于山羊體內(nèi)，因此本發(fā)明所建立的人/山羊HSC移植模型可為貯存和擴增人造血干/祖細(xì)胞提供潛在的活體倉庫，可成為人造血干/祖細(xì)胞一種方便的來源。
本發(fā)明結(jié)果進一步支持以下觀點妊娠早期的胎兒因處于免疫反應(yīng)幼稚期，因而是HSC移植的理想受體。它的獨到之處在于正常HSC能移植成功并長期存活，而毋需進行造血組織的摧毀和免疫抑制治療。本發(fā)明的人/山羊HSC移植模型為通過宮內(nèi)HSC移植途徑來治療疾病提供了理論和技術(shù)依據(jù)。
研究結(jié)果清楚表明，自胎山羊腹腔內(nèi)注射了人造血干細(xì)胞后，人造血干細(xì)胞不僅存在于胎羊的血液中，并顯示人的組織細(xì)胞存在于胎羊相應(yīng)組織中，如胎山羊肝臟中存在人的肝細(xì)胞。表1；實驗中所用PCR引物一覽表

表2.人臍血HSC宮內(nèi)移植于胎山羊的結(jié)果

表3.FACS分析人造血干/祖細(xì)胞移植山羊后的結(jié)果



圖1為FACS分析移植山羊血液中含有人CD34和GPA抗原的造血細(xì)胞。其中N非移植山羊；T移植山羊圖2為羊外周血DNA中人CD34基因的PCR擴增結(jié)果其中M100bp DNA ladder；1-9實驗羊外周血DNA的PCR擴增結(jié)果；10空白對照11對照羊外周血DNA的PCR擴增結(jié)果(陰性對照)；12人外周血DNA的PCR擴增結(jié)果(陽性對照)。
圖3為應(yīng)用PCR檢測移植山羊血中人GPA DNA片段，2％瓊脂糖凝膠電泳，其中M100bp梯度分子質(zhì)量標(biāo)記1-1111頭移植山羊，具有特異于人GPA基因的479bp擴增片段，12陰性對照，13空白對照，14陽性對照(人DNA)。
圖4為羊外周血DNA中人SRY基因的PCR擴增結(jié)果其中M100bp DNA ladder；1-11實驗羊外周血DNA的PCR擴增結(jié)果；12男人外周血DNA的PCR擴增結(jié)果(陽性對照)；13對照羊外周血DNA的PCR擴增結(jié)果(陰性對照)。
圖5應(yīng)用PCR檢測移植山羊血中人CD34 DNA片段，2％瓊脂糖凝膠電泳，其中M100bp梯度分子質(zhì)量標(biāo)記1-66頭移植山羊，具有特異于人CD34基因的437bp擴增片段7陰性對照(非移植山羊)8空白對照9陽性對照(人DNA)圖6為羊外周血總RNA中Gly A基因的RT-PCR擴增結(jié)果其中M100bp DNA ladder；1-8實驗羊外周血總RNA的RT-PCR擴增結(jié)果；9對照羊外周血總RNA的RT-PCR擴增結(jié)果(陰性對照)；10人外周血總RNA的RT-PCR擴增結(jié)果(陽性對照)；11空白對照；圖7為PCR-Southern檢測移植山羊的人CD34基因，擴增的CD34 DNA片段轉(zhuǎn)移至S & S尼龍膜上，然后與(α-32P)dCTP標(biāo)記的人CD34基因探針雜交并行放射自顯影，1，2，4，5，7，8，9移植山羊，顯示陽性雜交帶3，6母羊，無雜交帶 10陰性對照(非移植山羊)11空白對照 12陽性對照(人DNA)圖8為應(yīng)用FACS動態(tài)分析移植山羊(#3)出生后不同時期人造血細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達比較出生后3個月至10個月，CD34，CD20，CD14，CD7，CD38，CD15，CD45和GPA的頻率幾乎相似。
權(quán)利要求
1.一種建立人/山羊造血干細(xì)胞異種移植模型的方法，其特征在于首先收集新鮮人臍血，然后分離人造血干細(xì)胞HSC后，將其移植入胎山羊腹腔中，抽取分娩后胎山羊靜脈血檢測后，得體內(nèi)嵌合有人HSC其含量擴增至1000-10000倍，穩(wěn)定保持其表型10個月以上，處于不完全分化狀態(tài)的人/山羊造血干細(xì)胞異種移植模型。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于從收集人臍血到移植人HSC入胎山羊腹腔中的整個過程在8-16小時內(nèi)完成。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的靜脈血檢測是胎羊分娩后3個月、6個月、10個月分別抽取。
4.一種權(quán)利要求1所述的方法，其步驟如下1)分離新鮮人臍血其中單個核細(xì)胞和離心分離獲得人HSC；2)將分離獲得的人HSC移植于胎山羊，檢測構(gòu)建模型山羊體內(nèi)人HSC的量及其HSC的分化程度，包括FACS分析、DNA分析及對移植流產(chǎn)的胎羊的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查和對被移植胎羊的母體血液學(xué)檢查。
5.按權(quán)利要求4所述的方法，其中DNA分析包括抽提DNA、設(shè)計PCR引物、檢測引物特異性、和PCR檢測人/山羊造血干細(xì)胞嵌合模型的巢式及RT-PCR檢測人/山羊造血干細(xì)胞嵌合模型。
全文摘要
本發(fā)明屬生物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種建立造血干細(xì)胞異種移植模型的方法。本發(fā)明從人臍血分離獲得人HSC,移植入胎山羊體內(nèi),建立了人/山羊造血干細(xì)胞異種移植模型,實驗證實移植山羊靜脈血中,顯示人HSC擴增至1000－10000倍,穩(wěn)定保持人HSC表型達10個月以上,并處于不完全分化狀態(tài)。本發(fā)明所建立的移植模型可為貯存和擴增人造血干/祖細(xì)胞提供潛在的活體倉庫,可成為人造血干/祖細(xì)胞方便來源,為通過宮內(nèi)HSC移植途徑治療疾病提供了理論和技術(shù)依據(jù)。
文檔編號C12N5/00GK1353994SQ0113223
公開日2002年6月19日 申請日期2001年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月19日
發(fā)明者曾凡一, 黃淑幀, 曾溢滔 申請人:上海凡華生物技術(shù)有限公司