專利名稱：一種口蹄疫dna疫苗的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領域，是一種口蹄疫DNA疫苗。
背景技術(shù)：
口蹄疫是一種分布廣、嚴重危害偶蹄獸，威脅人類健康，對畜牧業(yè)生產(chǎn)及畜產(chǎn)品貿(mào)易影響極大的疾病，被列為A類烈性傳染病?？谔阋咭呙缡穷A防口蹄疫的重要手段，目前應用的口蹄疫滅活疫苗雖然具有很好的預防同型口蹄疫感染的效果，但不能有效地預防多種不同血清型口蹄疫的感染，而且免疫持續(xù)時間短，導致保護效果不甚理想。DNA疫苗，是近年興起的新型疫苗，具有抗體效價維持時間長和交叉保護效果好等優(yōu)點。此外DNA疫苗還具有以下突出優(yōu)點(1)能誘發(fā)體液及細胞全方位免疫應答，起到預防作用；(2)能將免疫佐劑CpG序列整合入DNA疫苗內(nèi)，提高機體的免疫應答水平而無需另加佐劑；(3)生產(chǎn)工藝簡單、成本低廉、穩(wěn)定性好且貯運方便。
DNA疫苗的作用機理為將合成的口蹄疫抗原基因重組入真核表達質(zhì)粒載體，注射于肌肉組織，使其在肌細胞中表達口蹄疫抗原表位，經(jīng)過抗原提呈過程，可激活體內(nèi)的體液免疫系統(tǒng)和細胞免疫系統(tǒng)。激活的體液免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生特異的抗體，消除游離在血液中的病毒，預防口蹄疫的入侵；而激活的細胞免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生細胞毒淋巴細胞(CTL)，攻擊已被感染的細胞，消除隱藏的口蹄疫病毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用O型口蹄疫病毒中和抗原表位基因構(gòu)建口蹄疫DNA疫苗。
口蹄疫病毒的中和抗原表位是刺激機體產(chǎn)生中和抗體的重要保護性抗原成分，位于口蹄疫病毒衣殼。本發(fā)明所采用的是豬特有的O型口蹄疫病毒，將中和表位基因進行設計并合成，再將其插入真核表達載體pVAX1，構(gòu)建成口蹄疫DNA疫苗pVAX-SG。
本發(fā)明用以構(gòu)建真核表達載體的基本骨架為pVAX1(購自Invitrogen公司，序列和物理圖譜見該公司的產(chǎn)品目錄)；構(gòu)建過程以及制備過程中，質(zhì)粒擴增所用的宿主菌為DH5α(購自GIBCO公司)；插入的外源基因為豬特有的O型口蹄疫病毒衣殼蛋白中和抗原表位基因，其結(jié)構(gòu)描述如下(1)O型口蹄疫的中和抗原表位基因a)序列特征長度501bp類型核酸鏈數(shù)雙鏈幾何結(jié)構(gòu)線性b)分子類型DNAc)來源基因合成。
d)序列描述SGATGGTCACCA GTGACTCATT CGGACGTTGC GGTGGAGGTG GCTCTATCCA AAAGGGCGGT GGAGGATCCCGCTTCGAGGG TGGCGGTGGA TCCGGCGAAA CACAGATCCA GAGGCGCCAA CACACGGACG TCTCGTTCATCATGGACAGA TTTGTGAAGG TGACACCGCA AAACCAAATT AACATTTTGG ACCTCATGCA GATTCCATCACACACTGGGG GTGGAGGCTC GAGTAAGTAC TCCGCAGGTG GTATGGGCAG ACGGGGCGAC CTAGAGCCTCTCGCGGCGAG GGTCGCCGCT CAGCTTCCTA CTTCTTTCAA CTTTGGTGCA ATTGGTGGCG GAGGCTCGAGTAGACACAAA CAGAAAATTG TGGCACCGGT GAAACAGACT TTGGGAGGCG GTGGGAGCTC CAGGTACAACAGAAATGCTG TGCCCAACTT GAGAGGTGAC CTTCAGGTGT TGGCTCAAAA GGTGGCACGG ACGCTGCCTGGGAGCTCCTA A口蹄疫的表位基因采用PCR全基因合成的方式進行，該方法的大致流程為根據(jù)設計的基因序列合成單鏈并設計相應PCR引物，然后以單鏈DNA為模板，PCR擴增相應的基因片段，再將擴增產(chǎn)物克隆測序即可。具體方法及其反應體系參見《分子克隆》(科學出版社，1992年出版)相關章節(jié)。


圖1含SG抗原基因的質(zhì)粒圖譜圖2DNA疫苗pVAX-SG的構(gòu)建流程3DNA疫苗pVAX-SG在BALB/c小鼠體內(nèi)的表達量曲線圖4DNA疫苗pVAX-SG誘發(fā)小鼠血清抗體效價的時間曲線
具體實施例方式下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的制備方法及作用進行詳細描述。
一、DNA疫苗pVAX-SG的結(jié)構(gòu)、構(gòu)建及制備本DNA疫苗的結(jié)構(gòu)是以真核表達載體——PVAX1為骨架的重組質(zhì)粒DNA分子，大體結(jié)構(gòu)見圖1。全長3.5kb(千堿基對)，除含有pMB1 ori質(zhì)粒復制起始位點、卡那霉素抗性基因Kanamycin等元件外，還包含了一個完整的真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元。真核轉(zhuǎn)錄翻譯單元含有真核轉(zhuǎn)錄翻譯所必需的元件真核巨細胞病毒啟動子Pcmv、相應的編碼基因SG及3′端的多聚腺苷酸BGH pA?？傮w上說，本疫苗是一個可在真核細胞中表達SG抗原并可激活淋巴細胞的重組質(zhì)粒DNA。
1、構(gòu)建工程菌DH5α(pVAX-SG)(見圖2)對O型口蹄疫合成基因SG用EcoR I/Xba I雙酶切，電泳回收519bp的目的片段(含酶切位點)。同時以EcoR I/Xba I雙酶切載體pVAX1，電泳回收載體大片段，將以上兩片段連接成pVAX-SG質(zhì)粒。用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選獲得陽性重組子，即獲含有重組質(zhì)粒pVAX-SG的工程菌DH5α(pVAX-SG)。(具體反應體系及實驗方案參見前述《分子克隆》相關內(nèi)容)2、制備DNA疫苗pVAX-SG本發(fā)明DNA疫苗用上述工程菌株DH5α(pVAX-SG)制備。培養(yǎng)擴增及精制可通過常規(guī)的細菌培養(yǎng)、質(zhì)粒擴增和純化方法進行(詳見前述《分子克隆》相關內(nèi)容)。
培養(yǎng)方式一般為液體培養(yǎng)。少量擴增時可用空氣搖床振蕩培養(yǎng)；工業(yè)性生產(chǎn)時需用細菌發(fā)酵罐行高密度懸浮通氣培養(yǎng)。對培養(yǎng)基中的培養(yǎng)源無特殊的要求，一般用LB液體培養(yǎng)基，如需高密度培養(yǎng)，則可選用2×YT(含1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物和0.5％氯化鈉，pH7.0)或SOC液體培養(yǎng)基(含2％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.05％氯化鈉、20mmol/L葡萄糖、2.5mmol/L KCl、10mmol/L MgCl2、pH7.0)。必要時也可添加動、植、礦物油等作為消泡劑。培養(yǎng)溫度一般為37℃，培養(yǎng)時間及收集細菌的時機決定于培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式以及通氣量條件的設置。
從擴增后的工程菌中分離純化質(zhì)粒DNA，可采用一些常規(guī)的方法。例如可用去垢劑SDS裂解菌體，利用質(zhì)粒DNA和染色體DNA變復性特征的差異，通過對DNA的變性和復性的處理，將質(zhì)粒DNA和染色體DNA分開；再利用質(zhì)粒DNA與雜質(zhì)在溶解度、離子結(jié)合力、吸附親和力等方面的區(qū)別進行進一步的純化，并去除內(nèi)毒素。具體地說，存在于復性液中的質(zhì)粒DNA經(jīng)過脫鹽處理后，可用陰離子交換樹脂(如DEAESepharose)進行交換，然后用TE(含10mmol/L Tris和1mmol/L EDTA、pH8.0)緩沖液洗脫，即可制得高純度的質(zhì)粒DNA(具體見實施例)。經(jīng)PBS稀釋分裝，即可獲得透明澄清的本發(fā)明DNA疫苗純品。本品理化性質(zhì)十分穩(wěn)定，可于常溫下保存與運輸，使用前，用注射用水溶解即可。
二、DNA疫苗pVAX-SG的功能檢測1、本DNA疫苗的體外表達及檢測，是將所構(gòu)建的DNA疫苗通過電穿孔法轉(zhuǎn)染COS7細胞，72小時后收獲細胞，以間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清及細胞破碎液中SG抗原的表達水平，結(jié)果表明有表達，說明本發(fā)明DNA疫苗確可在哺乳動物細胞中表達。(詳見后面的實驗1)2、本DNA疫苗的體內(nèi)表達及檢測，是將獲得的DNA疫苗純品免疫小鼠后，用ELISA法檢測血清中的抗原水平(見圖3)。結(jié)果表明本DNA疫苗免疫動物后，可表達SG抗原。(詳見后面的實驗2)3、本DNA疫苗誘發(fā)機體產(chǎn)生體液免疫應答水平的檢測，是將獲得的DNA疫苗純品免疫小鼠后，以ELISA法檢測血清中抗口蹄疫抗體的水平。結(jié)果DNA疫苗組可以在很長時間內(nèi)維持較高水平的抗體效價，而作為對照組的滅活疫苗(購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所)抗體效價自3月起則下降，亞單位疫苗組抗體效價比DNA疫苗高，但是抗體效價從3月起即開始下降(見圖4)。(詳見后面的實驗3)本發(fā)明能有效地誘發(fā)小鼠的免疫應答反應，說明其對動物的口蹄疫病毒感染有一定免疫保護作用；且生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，理化性質(zhì)穩(wěn)定、便于儲存和運輸。
使用本發(fā)明的工程菌制備口蹄疫DNA疫苗的實施例從-80℃冰箱中取出凍存的工程菌株——DH5α(pVAX-SG)，于室溫融化后，用接種環(huán)蘸取少量菌液劃線接種于1.5％的LB瓊脂平板(含卡那霉素50μg/ml)上，37℃培養(yǎng)過夜后，取單克隆接種于50ml LB液體培養(yǎng)基(含1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％氯化鈉，卡那霉素50μg/ml，pH7.0)中，37℃振蕩培養(yǎng)40小時，作為種子液。按1∶20的比例將種子液接種于1升SOC液體培養(yǎng)基中(在前述成分的基礎上，另含卡那霉素50μg/ml)，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時；加氯霉素至終濃度為170μg/ml，于37℃劇烈振搖繼續(xù)培養(yǎng)16小時。將菌液于4℃以6000rpm離心10分鐘；去上清，將菌體重懸于30ml的堿裂解法的溶液I(含50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris.Cl、10mmol/L EDTA pH8.0)中加溶菌酶40mg，加60ml溶液II(0.2mol/L NaOH和I％SDS)，緩慢顛倒5次混勻，室溫放置5分鐘。加45ml冰預冷的溶液III(含鉀離子3mol/L、乙酸根5mol/L)，緩慢顛倒數(shù)次混勻，冰浴10分鐘；于4℃以10000r/m離心10分鐘，取上清，過500ml G25柱除鹽后，上20ml DEAE Sepharose陰離子交換柱，待結(jié)合吸附完畢后，按鹽離子(Cl-)濃度從低到高(0～1mol/L)漸進的梯度洗脫法，用10個柱體積的PBS(pH8.0)和氯化鈉溶液緩慢清洗陰離子交換柱，收集260nm處吸收峰的洗脫液，得到DNA疫苗的粗品。然后進一步純化，加2倍體積的無水乙醇沉淀，12000rpm 4℃離心10分鐘，去上清，用70％的乙醇漂洗涼干后，溶于PBS(pH8.0)溶液中，即得本發(fā)明DNA疫苗的純品；用紫外分光光度法定量后，再按每份200μg/ml分裝制成成品。
本發(fā)明的預防接種方案是用成品1ml肌肉注射即可，劑量為每頭仔豬200μg。10天后追加免疫一次，即可獲得較強免疫應答反應。如與亞單位疫苗聯(lián)合治療則效果更佳。
實驗1 DNA疫苗的體外表達及檢測用電穿孔的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入COS7細胞，穿孔條件為電容960μF，電壓為250V，質(zhì)粒40μg，COS7細胞濃度為1×107/ml，時間為16.7 同時設空載體pVAX1的對照，72小時后收獲細胞。以間接ELISA法檢測SG抗原在COS7細胞上清和細胞裂解液中的表達情況，將細胞培養(yǎng)上清和細胞裂解液分別包被96孔酶聯(lián)板，一抗為小鼠抗口蹄疫血清(以購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所的口蹄疫疫苗按照常規(guī)方法免疫小鼠制得)，二抗為羊抗鼠-HRP(購自華美生物工程有限公司)。顯色后，以P/N比值大于1.8為陽性，結(jié)果SG抗原在COS7細胞中得到了表達，培養(yǎng)上清和細胞裂解液均為陽性。說明本DNA疫苗在COS7細胞中可以表達。
實驗2 免疫接種后體內(nèi)的抗原水平檢測試驗4～6周齡的雌性BALB/c小鼠40只，隨機分成4組，每組10只，第1組免疫本發(fā)明DNA疫苗(每只接種200μg)，第2、3組為PBS或pVAX1陰性對照。將DNA 200μg經(jīng)脛前肌注射給1組小鼠，2組小鼠則接種等體積PBS或pVAX1。于注射當日注射前和注射后第2、4、6、8、10天經(jīng)眼眶取血，分離血清后一并檢測DNA在血清中的表達情況。
以間接ELISA法檢測血清中SG的水平，將小鼠血清1∶10稀釋后包被96孔酶聯(lián)板，一抗為豬抗口蹄疫血清(購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所)，二抗為兔抗豬-HRP(購自華美生物工程有限公司)。陰性對照為未注射疫苗的空白小鼠血清。顯色后，以l、2、3組檢測孔分別與空白小鼠檢測孔的OD450比值P/N＞1.5為陽性。結(jié)果見圖3。
從圖中可以看出，疫苗在小鼠體內(nèi)所檢測到的抗原水平在第2天最高，以后逐漸下降，到第10天時，為弱陽性。
實驗3 DNA疫苗誘發(fā)機體產(chǎn)生體液免疫應答水平的檢測為比較DNA疫苗pVAX-SG體液免疫應答的維持時間，將BALB/c小鼠隨機分為5組，每組10只，第1組為DNA疫苗組，每只小鼠注射pVAX-SG疫苗200μg，第2組為滅活疫苗組(購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所)，每只小鼠皮下注射滅活苗10μl，第3組為亞單位疫苗組，每只小鼠注射蛋白10μg(亞單位疫苗制備方法含融合表達質(zhì)粒GST-SG的菌種，經(jīng)IPTG誘導后超聲破碎，用GST純化融合蛋白，溶于PBS。)，第4組為PBS對照組。在注射的當天和注射后的兩個月內(nèi)每2周取血1次，2個月以后每月取血一次，眼眶取血。觀察至1年。以間接ELISA法檢測血清中抗口蹄疫的抗體水平，以純化的GST-SG包被酶聯(lián)板，加入待檢的血清后，再加入HRP標記的兔抗小鼠IgG二抗(購自華美生物工程有限公司)，顯色反應后在450nm波長下測定光密度值，以P/N大于2為陽性。
結(jié)果DNA疫苗組可以在很長時間內(nèi)維持較高水平的抗體效價，滅活疫苗抗體效價自3月起則明顯下降；亞單位疫苗組抗體效價比DNA疫苗高，但是抗體效價從3月起即開始下降。(見圖4)以上實驗結(jié)果可以證明，本發(fā)明DNA疫苗pVAX-SG能有效地誘發(fā)小鼠的免疫應答反應，說明其對動物的口蹄疫病毒感染有一定免疫保護作用；且生產(chǎn)工藝簡單，成本低廉，理化性質(zhì)穩(wěn)定、便于儲存和運輸。
口蹄疫DNA疫苗pVAX-SG的抗原基因SG核苷酸序列如下ATGGTCACCA GTGACTCATT CGGACGTTGC GGTGGAGGTG GCTCTATCCA AAAGGGCGGT GGAGGATCCCGCTTCGAGGG TGGCGGTGGA TCCGGCGAAA CACAGATCCA GAGGCGCCAA CACACGGACG TCTCGTTCATCATGGACAGA TTTGTGAAGG TGACACCGCA AAACCAAATT AACATTTTGG ACCTCATGCA GATTCCATCACACACTGGGG GTGGAGGCTC GAGTAAGTAC TCCGCAGGTG GTATGGGCAG ACGGGGCGAC CTAGAGCCTCTCGCGGCGAG GGTCGCCGCT CAGCTTCCTA CTTCTTTCAA CTTTGGTGCA ATTGGTGGCG GAGGCTCGAGTAGACACAAA CAGAAAATTG TGGCACCGGT GAAACAGACT TTGGGAGGCG GTGGGAGCTC CAGGTACAACAGAAATGCTG TGCCCAACTT GAGAGGTGAC CTTCAGGTGT TGGCTCAAAA GGTGGCACGG ACGCTGCCTGGGAGCTCCTA A
權(quán)利要求
1.一種口蹄疫DNA疫苗，包括真核表達載體和抗原基因SG，其特征在于所用的抗原基因SG來源于豬特有的O型口蹄疫病毒，其核苷酸序列如下ATGGTCACCA GTGACTCATT CGGACGTTGC GGTGGAGGTG GCTCTATCCA AAAGGGCGGTGGAGGATCCC GCTTCGAGGG TGGCGGTGGA TCCGGCGAAA CACAGATCCA GAGGCGCCAACACACGGACG TCTCGTTCAT CATGGACAGA TTTGTGAAGG TGACACCGCA AAACCAAATTAACATTTTGG ACCTCATGCA GATTCCATCA CACACTGGGG GTGGAGGCTC GAGTAAGTACTCCGCAGGTG GTATGGGCAG ACGGGGCGAC CTAGAGCCTC TCGCGGCGAG GGTCGCCGCTCAGCTTCCTA CTTCTTTCAA CTTTGGTGCA ATTGGTGGCG GAGGCTCGAG TAGACACAAACAGAAAATTG TGGCACCGGT GAAACAGACT TTGGGAGGCG GTGGGAGCTC CAGGTACAACAGAAATGCTG TGCCCAACTT GAGAGGTGAC CTTCAGGTGT TGGCTCAAAA GGTGGCACGGACGCTGCCTG GGAGCTCCTA A
2.按權(quán)利要求1所述的口蹄疫DNA疫苗，其特征在于所說的真核表達載體為pVAX1。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領域,是一種口蹄疫DNA疫苗。它是采用豬特有的O型口蹄疫的合成表位基因SG為抗原基因,以pVAX1為表達載體構(gòu)建的。SG序列為:ATGGTCACCA GTGACTCATT CGGACGTTGCGGTGGAGGTG GCTCTATCCA AAAGGGCGGTGGAGGATCCC GCTTCGAGGG TGGCGGTGGA TCCGGCGAAACACAGATCCA GAGGCGCCAA CACACGGACG TCTCGTTCATCATGGACAGA TTTGTGAAGG TGACACCGCA AAACCAAATTAACATTTTGG ACCTCATGCA GATTCCATCA CACACTGGGGGTGGAGGCTC GAGTAAGTAC TCCGCAGGTG GTATGGGCAGACGGGGCGAC CTAGAGCCTC TCGCGGCGAG GGTCGCCGCTCAGCTTCCTA CTTCTTTCAA CTTTGGTGCA ATTGGTGGCGGAGGCTCGAG TAGACACAAA CAGAAAATTG TGGCACCGGTGAAACAGACT TTGGGAGGCG GTGGGAGCTC CAGGTACAACAGAAATGCTG TGCCCAACTT GAGAGGTGAC CTTCAGGTGTTGGCTCAAAA GGTGGCACGG ACGCTGCCTG GGAGCTCCTAA
文檔編號C12N15/79GK1367021SQ01132249
公開日2002年9月4日 申請日期2001年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月20日
發(fā)明者孫樹漢, 張洪英, 郭瀛軍, 陳祖歡 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學