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      用于產(chǎn)生有旋光力的化合物的方法

      文檔序號(hào):577162閱讀:364來源:國知局
      專利名稱:用于產(chǎn)生有旋光力的化合物的方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生(S)-4-羥基-2-酮戊二酸的方法和用于產(chǎn)生可以由前體(S)-4-羥基-2-酮戊二酸形成的化合物(例如,(2S,4S)-4-羥基-L-谷氨酸和(2S,4S)-4-羥基-L-脯氨酸等化合物)的方法。(2S,4S)-4-羥基-L-脯氨酸具有包括抗癌細(xì)胞活性[癌癥研究48.,2483(1988)]和抗肥大細(xì)胞活性(日本未審查專利出版物,No.63-218621)在內(nèi)的生物學(xué)活性。(S)-4-羥基-2-酮戊二酸和(2S,4S)-4-羥基-L-谷氨酸對(duì)于產(chǎn)生(2S,4S)-4-羥基-L-脯氨酸是有用的。
      人們知道許多產(chǎn)生(S)-4-羥基-2-酮戊二酸的常規(guī)方法,包括蘇型-4-羥基-L-脯氨酸的化學(xué)脫氨作用[酶學(xué)方法,17部分B,275]。
      本發(fā)明的發(fā)明人以前曾報(bào)導(dǎo)過產(chǎn)生(S)-4-羥基-2-酮戊二酸的方法(日本未審查專利出版物No.7-289284),該方法包括使(例如,提供)生物催化劑(其具有由丙酮酸產(chǎn)生(S)-4-羥基-2-酮戊二酸的活性)作用于水合乙醛酸和丙酮酸或通過生物催化劑作用能轉(zhuǎn)變?yōu)楸岬幕衔?。與已知的常規(guī)方法比較,該方法更有工業(yè)產(chǎn)生優(yōu)勢,但該方法的劣勢在于,如果用廉價(jià)的葡萄糖作為底物則(S)-4-羥基-2-酮戊二酸的積累較少,而必須用昂貴的丙酮酸作為底物才能使(S)-4-羥基-2-酮戊二酸的積累水平高于20mM。
      下列產(chǎn)生(2S,4S)-4-羥基-L-谷氨酸的方法是已知的;一種是包括使谷氨酸脫氫酶在氨和NADPH存在時(shí)作用于化學(xué)合成的DL-4-羥基-2-酮戊二酸,并用離子交換層析分離最終的4(R)-和4S-4-羥基-谷氨酸的方法。一種是從植物中提取(2S,4S)-4-羥基-L-谷氨酸(Phlox decussata)[酶學(xué)方法,17部分B,277]的方法;和一種允許轉(zhuǎn)氨酶同時(shí)作用于L-4-羥基-2-酮戊二酸和半胱氨酸亞磺酸[四面體通訊,28,1277(1987)]的方法。
      本發(fā)明的發(fā)明人以前曾報(bào)道過產(chǎn)生(2S,4S)-4-羥基-L-谷氨酸的方法,該方法使(例如,提供)生物催化劑(其具有在氨基供體存在時(shí)由丙酮酸和水合乙醛酸產(chǎn)生(2S,4S)-4-羥基-L-谷氨酸的活性)作用于水合乙醛酸和丙酮酸或能轉(zhuǎn)化為丙酮酸的化合物(日本未審查專利出版物No.8-80198)。該方法僅在產(chǎn)生4(S)形式時(shí)有工業(yè)優(yōu)勢;然而,該方法費(fèi)力和劣勢在于其需要進(jìn)一步將(S)-4-羥基-L-酮基谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)?2S,4S)-4-羥基-L-谷氨酸,其通過在合成(S)-4-羥基-2-酮戊二酸的步驟后向(S)-4-羥基-2-酮戊二酸中加入另一種細(xì)菌,以便由此方法產(chǎn)生大量(2S,4S)-4-羥基-L-谷氨酸。
      下列方法是已知的產(chǎn)生(2S,4S)-4-羥基-L-脯氨酸的常規(guī)方法;一種是通過培養(yǎng)卷角霉屬或頂柱霉屬的微生物以從培養(yǎng)菌中提取脯氨酸的方法(日本未審查專利出版物No.5-111388);和一種使(例如,提供)微生物(其具有將4-羥基-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基-L-脯氨酸的活性)作用于4-羥基-2-酮戊二酸的方法(日本未審查專利出版物No.3-266996);及其類似方法。然而,這些方法的工業(yè)應(yīng)用是困難的,因?yàn)榍耙环N方法的產(chǎn)率低而后一種方法需要分離和純化同時(shí)產(chǎn)生的4(S)和4(R)形式的耗費(fèi)勞動(dòng)的工序。
      本發(fā)明的目的是提供一種有利于工業(yè)上產(chǎn)生(S)-4-羥基-2-酮戊二酸和由前體(S)-4-羥基-2-酮戊二酸制得的化合物的方法,所說的化合物例如(2S,4S)-4-羥基-L-谷氨酸和(2S,4S)-4-羥基-L-脯氨酸。
      本發(fā)明涉及產(chǎn)生有旋光力的化合物的方法,該方法使(例如,提供)重組微生物(其攜帶包括編碼(S)-4-羥基-2-酮戊二酸醛縮酶DNA片段(以下簡寫為"KAL基因")的重組DNA),在液體培養(yǎng)基中具有或缺乏氨基供體時(shí)作用于糖和水合乙醛酸,并收集在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生的有光學(xué)活性的(S)-4-羥基-2-酮戊二酸或由前體(S)-4-羥基-2-酮戊二酸產(chǎn)生的化合物(以下簡寫為"4(S)KHG")。
      圖.1描述了質(zhì)粒pKSR101及其限制性酶切圖;圖.2描述了質(zhì)粒pKSR601及其限制性酶切圖;圖.3描述了質(zhì)粒pKSR125的構(gòu)建過程及該質(zhì)粒的限制性酶切圖;和圖.4描述了質(zhì)粒pKSR50及其限制性酶切圖。
      本發(fā)明涉及產(chǎn)生(S)-4-羥基-2-酮戊二酸(4(S)KHG)的方法或產(chǎn)生可由前體4(S)KHG形成的化合物的方法。
      所說的化合物(其可由前體(S)-4-羥基-2-酮戊二酸產(chǎn)生)包括(2S,4S)-4-羥基-L-谷氨酸〔以下簡寫為“4(S)HG”〕,(2S,4S)-4-羥基-L-脯氨酸[以下簡寫為"4(S)HYP"],(S)-4-羥基-L-谷氨酰胺,(S)-4-羥基-L-精氨酸,(S)-4-羥基-L-鳥氨酸及其類似物。(S)-4-羥基-L-谷氨酰胺,(S)-4-羥基-L-精氨酸,(S)-4-羥基-L-鳥氨酸可用作動(dòng)物的飼料添加劑。
      根據(jù)本發(fā)明,通過利用攜帶含有KAL基因的重組DNA的微生物,可直接(即前體4(S)KHG不必作為中間體形成)形成所說的化合物。或者,可將微生物用作生物催化劑把前體4(S)KHG轉(zhuǎn)化成為化合物。此處提到來自前體4(S)KHG的化合物時(shí),指的是形成該化合物的任一種技術(shù)。
      使用攜帶含有KAL基因的重組DNA的微生物產(chǎn)生4(S)KHG,4(S)HG和4(S)HYP的方法描述如下。
      KAL基因包括來源于埃希氏菌屬、假單胞菌屬、副球菌屬、普羅威登斯菌屬、根瘤菌屬或摩根氏菌屬微生物的這種基因;KAL基因優(yōu)選地是來源于埃希氏菌屬的基因。例如,從埃希氏菌屬回收KAL基因的方法是現(xiàn)在具體描述的。
      從具有4-羥基-2-酮戊二酸醛縮酶活性的微生物(例如大腸桿菌菌株W3110(ATCC14948)),其染色體DNA由常規(guī)方法產(chǎn)生[生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào),72,619(1963)]。根據(jù)在參考文獻(xiàn)中公布的核苷酸序列[R.V.Patil和E.E.Dekker,細(xì)菌學(xué)雜志174,102(1992)]合成寡核苷酸引物。其后,將所得染色體DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(在下文簡稱"PCR")[R.F.Saiki等,科學(xué)230,1350(1985)]以獲得上述基因。
      為向宿主(例如大腸桿菌)中導(dǎo)入KAL基因,可以利用任何載體包括噬菌體載體,質(zhì)粒載體和類似物,只要載體可以自動(dòng)復(fù)制或向宿主微生物的染色體中摻入基因。適合于大腸桿菌宿主的載體包括攜帶trp啟動(dòng)子的pBR322,pUC119,pACY184和pTrS33(日本未審查專利出版物No.2-227075)。適合于棒桿菌屬的微生物宿主的載體包括pCG1載體。
      來自KAL基因和載體DNA的重組DNA可以與各種重組體混合物一起產(chǎn)生,通過在體外用具有相同限制酶切位點(diǎn)的限制酶消化兩個(gè)DNA并用DNA連接酶與酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)。利用所得的重組體混合物,轉(zhuǎn)化宿主微生物并篩選出能催化由丙酮酸和水合乙醛酸產(chǎn)生4(S)KHG反應(yīng)的轉(zhuǎn)化體菌株(重組DNA可由該菌株獲得)。該重組DNA具體地包括pKSR101,pKSR125和pKSR601。根據(jù)已知方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化,例如,按分子克隆(T.Maniatis等,冷泉港實(shí)驗(yàn)室,1982)一書中描述的分子克隆方法。
      產(chǎn)生攜帶含有KAL基因的重組DNA的重組微生物,通過摻入帶有遺傳信息的DNA片段到載體DNA中產(chǎn)生重組DNA,其后用所得的重組DNA轉(zhuǎn)化宿主微生物。任何微生物均可以用作這樣的宿主微生物,只要該微生物可以結(jié)合重組DNA并能在遺傳信息基礎(chǔ)上表達(dá)酶活性以催化由丙酮酸和水合乙醛酸產(chǎn)生4(S)KHG的反應(yīng)。這樣的微生物包括,例如,埃希氏菌屬或棒桿菌屬的微生物。更具體地說,這樣的微生物包括例如大腸桿菌K-12的ATCC 33625菌株,谷氨酸棒桿菌ATCC13032,和嗜乙酰乙酸棒桿菌FERM P-4962。
      通過攜帶含有KAL基因重組DNA的重組微生物產(chǎn)生4(S)KHG,4(S)HG或4(S)HYP,至少具有硫辛酸要求或蘋果酸合酶活性減弱或缺乏一種特性的微生物可作為優(yōu)選地宿主微生物。
      任何能結(jié)合重組DNA并能在遺傳信息基礎(chǔ)上表達(dá)酶活性以催化由丙酮酸和水合乙醛酸產(chǎn)生4(S)KHG反應(yīng)的微生物可用作為所需的微生物,包括例如屬埃希氏菌屬或棒桿菌屬的微生物。更具體地說,這樣的微生物包括如大腸桿菌K-12的ATCC33625菌株,谷氨酸棒桿菌ATCC13032,以及嗜乙酰乙酸棒桿菌FERM P-4962。
      更具體地說,可以運(yùn)用大腸桿菌K-12的亞菌株NHK40[硫辛酸需要(lip),4KAL缺失(eda)]。NHK40菌株于1997年4月16日按照布達(dá)佩斯條約存放在日本生物科學(xué)與人類技術(shù)國家研究所的工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu),作為FERM BP-5919。
      去除烯醇丙酮酸磷酸羧化酶活性的微生物作為優(yōu)選的宿主微生物,用來產(chǎn)生4(S)HG。
      任何能結(jié)合重組DNA并能在遺傳信息基礎(chǔ)上表達(dá)酶活性以催化由丙酮酸和水合乙醛酸產(chǎn)生4(S)KHG反應(yīng)的微生物可用作為所需的微生物,包括例如埃希氏菌屬或棒桿菌屬的微生物。更具體地說,這樣的微生物包括如大腸桿菌K-12的ATCC33625菌株,谷氨酸棒桿菌ATCC13032菌株,以及嗜乙酰乙酸棒桿菌FERM P-4962。
      更具體地說,可以運(yùn)用大腸桿菌K-12的亞菌株NHK46[lip,eda,缺乏蘋果酸合酶(glc),缺乏烯醇丙酮酸磷酸羧化酶(ppc)]。大腸桿菌K-12NHK46于1997年4月16日按照布達(dá)佩斯條約保藏在日本生物科學(xué)與人類技術(shù)國家研究所的工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu),作為FERM BP-5920。
      為了產(chǎn)生4(S)HYP,更優(yōu)選的是使用具有硫辛酸需要,蘋果酸合酶活性減弱或缺乏及缺乏烯醇丙酮酸磷酸羧化酶活性和對(duì)脯氨酸類似物具有抗性中至少一種特性的微生物。該脯氨酸類似物包括鈴蘭氨酸,3,4-脫氫脯氨酸和硫代脯氨酸。
      任何能結(jié)合重組DNA并能在遺傳信息基礎(chǔ)上表達(dá)酶活性以催化由丙酮酸和水合乙醛酸產(chǎn)生4(S)KHG反應(yīng)的微生物都可用作為所需的微生物,包括例如埃希氏菌屬或棒桿菌屬的微生物。更具體地說,這樣的微生物包括如大腸桿菌K-12的ATCC33625菌株,谷氨酸棒桿菌ATCC13032菌株,以及嗜乙酰乙酸棒桿菌FERM P-4962。
      更具體地說,論及的是大腸桿菌K-12的亞菌株NHK47[具有l(wèi)ip,eda,glc,ppc,以及具有抗鈴蘭氨酸抗性]。大腸桿菌菌株NHK47于1997年4月16日按照布達(dá)佩斯條約保藏在日本生物科學(xué)與人類技術(shù)國家研究所的工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu),作為FERM BP-5921。
      以上提到的各種缺失菌株或抗性菌株可以是具有上述特性的野生型菌株,或通過將其不具有此特性的親本菌株經(jīng)常規(guī)突變過程而獲得的菌株,該常規(guī)突變過程諸如用誘變劑,例如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG),紫外光照射或者γ輻射處理,將所得菌株涂到合適的瓊脂平板培養(yǎng)基上,收獲在平板上生長的突變菌株,并篩選帶有缺失的菌株或與親本菌株相比較酶活性相對(duì)減弱的菌株或收獲比親本菌株類似物更具抗性的菌株。從具有客觀缺失或抗性突變的菌株轉(zhuǎn)導(dǎo)缺失突變(轉(zhuǎn)導(dǎo))到所需的菌株中(運(yùn)用噬菌體P1),使可以回收大腸桿菌K-12菌株[J.H.Miller,分子遺傳實(shí)驗(yàn),冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1972)]的各種缺失突變和抗性突變菌株。
      根據(jù)本發(fā)明所要用到的微生物可以通過常規(guī)培養(yǎng)程序培養(yǎng)。進(jìn)行培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基可以是任何天然培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基,只要該培養(yǎng)基中含有碳源、氮源、無機(jī)鹽及類似物等所用微生物能同化的物質(zhì),由此可以有效地培養(yǎng)微生物。所用的微生物能夠同化的任何碳源都是可用的,其包括糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、淀粉水解產(chǎn)物以及糖蜜;有機(jī)酸如醋酸、乳酸以及葡糖酸;或者醇如乙醇和丙醇。所用的微生物能夠同化的任何氮源都是可用的,其包括無機(jī)鹽如氨、硫酸銨、氯化銨、以及磷酸銨;有機(jī)酸的銨鹽、蛋白胨、酪蛋白水解物、肉膏、酵母提取物、玉米漿、大豆麩、大豆麩水解物、各種發(fā)酵細(xì)菌及細(xì)菌的消化產(chǎn)物。所用的微生物能夠同化的任何無機(jī)鹽都是可用的,其包括磷酸鉀、硫酸銨、氯化銨、氯化鈉、硫酸鎂、硫酸亞鐵和硫酸錳。另外,還可加入鈣、鋅、硼、銅、鈷和鉬鹽作為痕量元素。如果需要,培養(yǎng)基中還可含有維生素諸如維生素B1和生物素、氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸、以及與核酸有關(guān)的物質(zhì)如腺嘌呤和鳥嘌呤。通過振蕩培養(yǎng)或浸沒通氣振蕩培養(yǎng)方法,在有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)優(yōu)選地在pH5.0至9.0和20至45℃下進(jìn)行10至96小時(shí)。用無機(jī)酸或有機(jī)酸、堿性溶液、尿素、碳酸鈣及氨調(diào)節(jié)pH值。由此產(chǎn)生的培養(yǎng)物可用于客觀反應(yīng);在可供選擇的方法中,可以處理培養(yǎng)物,并將所得處理產(chǎn)物用于后續(xù)反應(yīng)。處理產(chǎn)物包括各種形式培養(yǎng)物的凝聚和干燥產(chǎn)物,凍干產(chǎn)物,表面活性劑處理產(chǎn)物,有機(jī)溶劑處理產(chǎn)物,熱處理產(chǎn)物,酶處理產(chǎn)物,超聲處理產(chǎn)物和機(jī)械破碎產(chǎn)物;以及細(xì)菌的固定產(chǎn)物或細(xì)菌的處理產(chǎn)物。
      用于本發(fā)明的液體培養(yǎng)基的例子包括水;緩沖液如磷酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽、硼酸鹽,檸檬酸鹽和Tris;及含有包括醇類如甲醇和乙醇;酯類如乙酸乙酯;酮類如丙酮;和酰胺如乙酰胺有機(jī)溶劑的水溶液。此外,如果必要,可以將表面活性劑諸如Triton X-100(Nacalai Tesque,Inc.)和Nonion HS204(NOF公司),以及有機(jī)溶劑如甲苯和二甲苯等以每升約0.1~20克的濃度加入培養(yǎng)基中。
      根據(jù)本發(fā)明所用的氨基供體包括氨;無機(jī)銨鹽如硫酸銨、氯化銨、以及尿素;還有各種氨基酸如谷氨酸。氨基供體的濃度是每升0.1至100克,優(yōu)選濃度為每升1至50克。
      通過使攜帶含有KAL基因的重組DNA的重組微生物作用于糖和水合乙醛酸產(chǎn)生的4(S)KHG的濃度一般是每升5至100克。糖和水合乙醛酸的濃度都是每升1至200克,優(yōu)選濃度為每升20至200克。任何糖(其能被重組菌株同化)都可以使用,這些糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、淀粉水解產(chǎn)物以及糖蜜。該反應(yīng)在15至80℃(優(yōu)選溫度為25至60℃),和pH3至11(優(yōu)選pH5至9)條件下進(jìn)行1至96小時(shí)。
      在上述過程中,按上述提及的濃度在攜帶含有KAL基因的重組DNA的微生物的培養(yǎng)起點(diǎn)或培養(yǎng)過程中通過加入水合乙醛酸來產(chǎn)生4(S)KHG。糖可提前作為培養(yǎng)底物加入或與水合乙醛酸一同加入。
      可以按照有機(jī)酸的常規(guī)純化方法分離和純化所得的4(S)KHG。例如用離心機(jī)去除反應(yīng)中的固體物質(zhì)而得到反應(yīng)上清液,并借助于離子交換樹脂和薄膜法結(jié)合分離和純化4(S)KHG。
      在液體培養(yǎng)基中存在氨基供體條件下,通過使攜帶含有KAL基因的重組DNA的重組微生物作用于糖和水合乙醛酸產(chǎn)生4(S)HG或4(S)HYP,其中所用的糖可以是任何重組菌株能同化的糖,包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉、淀粉水解產(chǎn)物、以及糖蜜。進(jìn)行反應(yīng)的細(xì)菌濃度一般是每升5至100克。糖和水合乙醛酸的濃度都是每升1至200克,優(yōu)選濃度為每升10至200克。反應(yīng)在15至80℃(優(yōu)選溫度為25至60℃),和pH3至11(優(yōu)選pH5至9)條件下進(jìn)行1至96小時(shí)。在此過程中,可以按上述濃度在攜帶含有KAL基因的重組DNA的微生物的培養(yǎng)起點(diǎn)或培養(yǎng)過程中加入水合乙醛酸產(chǎn)生4(S)HG或4(S)HYP。
      另外,通過向液體培養(yǎng)基中加入具有把4(S)KHG轉(zhuǎn)化為4(S)HYP活性的生物催化劑,在氨基供體存在條件下用4(S)KHG也能產(chǎn)生4(S)HYP。
      運(yùn)用4(S)KHG產(chǎn)生4(S)HYP的例子包括分離和純化的4(S)KHG,其中不含有4(R)KHG或4(R)HG的粗樣品,和包含4(S)KHG的反應(yīng)溶液,可通過生物催化劑的反應(yīng)形成。4(S)KHG的濃度是每升1至200克,其優(yōu)選濃度為每升20至200克。
      在氨基供體存在的條件下具有把4(S)KHG轉(zhuǎn)化成為4(S)HYP活性的生物催化劑的例子包括具有把4(S)KHG轉(zhuǎn)化成為4(S)HYP活性的微生物細(xì)胞,培養(yǎng)物,和加工的細(xì)胞。這樣的微生物包括埃希氏菌屬和棒桿菌屬的微生物。更具體而言,包括大腸桿菌K-12之ATCC33625菌株的微生物,其通過修飾編碼在大腸桿菌中合成脯氨酸的酶的proBA基因(編碼proB和proA)產(chǎn)生,并產(chǎn)生質(zhì)粒pKSR25,其攜帶所得的突變proBA基因,具減弱的反饋抑制作用,接著,把質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌菌株。論及的需要谷氨酸的突變菌株是更優(yōu)選的。可以通過常規(guī)誘變技術(shù)(例如,N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(NTG),紫外輻射或γ輻射)從其親本菌株產(chǎn)生該突變菌株,將所得菌株涂在適當(dāng)?shù)沫傊桨迮囵B(yǎng)基上,收獲在平板上生長的突變菌株,并篩選需谷氨酸才能生長的菌株。此外,在大腸桿菌K-12微生物例中,缺失突變菌株也可以由轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生。這樣的微生物包括NHK3/pKSR25菌株,其產(chǎn)生通過,首先獲得大腸桿菌K-12之ATCC33625菌株的異檸檬酸脫氫酶缺失突變(icd)菌株以獲得NHK3菌株,然后,把pKSR25導(dǎo)入菌株NHK3;這樣的微生物也包括(NHK3/pKSR25+pKSR50)的菌株,pKSR50質(zhì)粒還含有谷氨酸脫氫酶和導(dǎo)入其中的6-磷酸葡萄糖脫氫酶,需谷氨酸的和具鈴蘭氨酸及脯氨酸類似物如3,4-脫氫脯氨酸和硫代脯氨酸抗性的宿主微生物被更有利地利用。通過對(duì)其親本菌株進(jìn)行誘變和轉(zhuǎn)導(dǎo)可獲得該微生物;另外,可通過將具有脯氨酸類似物抗性的質(zhì)粒導(dǎo)入親本菌株而獲得此微生物。更具體地說,我們將論及大腸桿菌菌株NHK23/pKSR25+pKSR50。大腸桿菌NHK23/pKSR25+pKSR50菌株和大腸桿菌NHK3/pKSR25+pKSR50菌株于1997年4月16日按照布達(dá)佩斯條約保藏在日本生物科學(xué)與人類技術(shù)國家研究所的工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu),分別作為FERM BP-5922和FERMBP-5923。
      用于反應(yīng)的生物催化劑的濃度一般是每升5至100克。反應(yīng)在15至80℃(優(yōu)選溫度25至60℃),pH3至11(優(yōu)選pH5至9)條件下進(jìn)行1至96小時(shí)。在氨基供體存在時(shí)向具有將4(S)KHG轉(zhuǎn)化成為4(S)HYP活性的微生物中于培養(yǎng)起點(diǎn)或培養(yǎng)過程中加入4(S)KHG產(chǎn)生4(S)HYP。
      由此產(chǎn)生的4(S)HG或4(S)HYP可通過氨基酸的常規(guī)純化方法分離。例如,通過離子交換樹脂和薄膜法結(jié)合,可從通過離心預(yù)先去除固體物的反應(yīng)上清液中分離4(S)HG或4(S)HYP。
      實(shí)施例本發(fā)明將在下列實(shí)施例中更詳細(xì)地描述。除非特別指出,關(guān)于重組DNA的一般過程根據(jù)在分子克隆(實(shí)驗(yàn)室手冊(cè),T.Maniatis等,冷泉港實(shí)驗(yàn)室,1982)中描述的方法。
      實(shí)施例1含有KAL基因的質(zhì)粒的產(chǎn)生將一鉑環(huán)的大腸桿菌K-12之菌株W3110(ATCC14948)接種到10毫升LB液體培養(yǎng)基中[每升水中含細(xì)菌用胰蛋白胨(10克;由Difco公司制造),酵母提取物(5克;由Difco公司制造)和NaCl(5克),并調(diào)節(jié)至pH7.2],并在30℃培養(yǎng)1小時(shí)。用已知方法從培養(yǎng)的微生物中分離染色體DNA[H.Saito &amp; K.I.Miura,生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào),72,619(1963)]。
      根據(jù)所報(bào)告的KAL基因的核苷酸序列[R.V.Patil和E.E.Dekker,J.Bacteriol.174,102(1992)],基因產(chǎn)物N末端相應(yīng)序列No.1的DNA序列的寡核苷酸和KAL基因C末端相應(yīng)序列No.2的DNA序列的寡核苷酸用常規(guī)方法分別合成。用這些寡核苷酸作為引物,通過PCR擴(kuò)增KAL基因[R.F.Saiki等,科學(xué)230,1350(1985)]。用大腸桿菌W3110(ATCC 14948)分離的染色體DNA作為模板,擴(kuò)增用基因AmpTM試劑盒(Perkin Elmer制造,日本)和用同一家公司生產(chǎn)的DNA熱循環(huán)器進(jìn)行,共30個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)是94℃30秒,52℃30秒及72℃一分鐘,反應(yīng)末一步為72℃5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后,用氯仿提取約630bps的擴(kuò)增DNA片段并通過乙醇沉淀純化。DNA片段(2μg)和攜帶trp啟動(dòng)子的載體質(zhì)粒pTrS33(1μg)(日本未審查專利出版物No.2-227075)用HindIII和BamHI以雙重方式獨(dú)立消化,并接著用瓊脂糖凝膠電泳純化。先用乙醇沉淀,并混合純化的兩個(gè)片段,將所得的混合物溶解在蒸餾水(5μl)中,接著進(jìn)行連接,以產(chǎn)生重組DNA。
      通過Maniatis等的方法用所獲得的重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌ATCC33625[分子克隆,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè),冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1982)],將所得菌株涂于含100μg/ml氨芐青霉素LB瓊脂培養(yǎng)基上,于37℃培育24小時(shí)。檢驗(yàn)所得的八個(gè)抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化體菌落由丙酮酸和水合乙醛酸合成4-羥基-2-酮戊二酸的活性。更具體地說,將每一轉(zhuǎn)化體菌株在含100μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(3ml)中于30℃培養(yǎng)20小時(shí),其后向培養(yǎng)液中加入二甲苯(30μl)、2M丙酮酸鈉(150μl)和2M水合乙醛酸溶液(150μl;用NaOH調(diào)節(jié)至pH6.4),在37℃搖動(dòng)30分鐘。用高效液相色譜(HPLC)檢驗(yàn)反應(yīng)溶液離心后的上清液,測量4(R)-和4(S)-4-羥基-2-酮戊二酸的產(chǎn)率。HPLC測定條件柱;SUMICHIRAL OA-5000柱,Sumitomo化學(xué)測定中心公司制造。
      流動(dòng)相;一對(duì)1mM硫酸銅(II)和0.1mM乙酸銨水溶液(pH4.5)和異丙醇按85∶15的比例依此順序混合的混合物溶液。
      流速;1ml/分鐘溫度;40℃
      檢測;在210nm紫外光下的吸收度結(jié)果是,在任何轉(zhuǎn)化體中觀察到活躍合成4(S)KHG的能力。另外,這些菌株加入LB液體培養(yǎng)基(3ml)(含100μg/ml氨芐青霉素)中,預(yù)先離心后于37℃攪拌培養(yǎng)16小時(shí),根據(jù)已知方法[分子克隆,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè),冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1982)]從所得的微生物中分離質(zhì)粒,并用各種限制酶消化以確定結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)所有這些質(zhì)粒具有相同的結(jié)構(gòu)。由此產(chǎn)生的質(zhì)粒定義為pKSR101。pKSR101的限制性酶切圖在

      圖1中顯示。關(guān)于pKSR101,攜帶pKSR101的大腸桿菌NHK46/pKSR101于1998年6月2日按照布達(dá)佩斯條約保藏在日本生物科學(xué)與人類技術(shù)國家研究所的工業(yè)科學(xué)和技術(shù)機(jī)構(gòu),作為FERM BP-6382。
      為將4(S)KAL基因?qū)氚魲U菌屬的微生物,將pKSR101連接到可自動(dòng)復(fù)制的載體質(zhì)粒pCS116(日本未審查專利出版物No.6-277082)上。pCS116(1μg)和pKSR101(1μg)溶解于H緩沖液(45μl;Takara Brewery制造)中,并加入10個(gè)單位的Bgl II于37℃消化3小時(shí),其后用酚抽提和乙醇沉淀。所得物質(zhì)在蒸餾水(5μL)中溶解以連接,產(chǎn)生重組DNA。用Maniatis等的方法[分子克隆,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè),冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1982)]運(yùn)用重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌ATCC33625。將所得菌株涂在含100μg/ml氨芐青霉素和100μg/ml壯觀霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上于37℃培育24小時(shí)。從所得抗氨芐青霉素和壯觀霉素的菌落中,以上述相同的方式分離質(zhì)粒,用已知方法(日本未審查專利出版物No.6-277082)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌ATCC13032。然后將轉(zhuǎn)化體涂在含100μg/ml谷氨酸的BY瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)[培養(yǎng)基每升水含肉湯(20g;Kyokuto公司制造)和酵母提取物(5g;Kyokuto公司制造),并預(yù)先調(diào)節(jié)至pH7.2,并用2%的瓊脂固化]在30℃培育48小時(shí)。用已知方法(日本未審查專利出版物No.57-183799),從所得的八個(gè)抗壯觀霉素的菌落中分離質(zhì)粒以確定結(jié)構(gòu)。結(jié)果是發(fā)現(xiàn)所有這些質(zhì)粒具有相同的結(jié)構(gòu)。產(chǎn)生的該質(zhì)粒定義為pKSR601。pKSR601的限制性酶切圖在圖.2中顯示。
      實(shí)施例2用大腸桿菌突變菌株產(chǎn)生4(S)KHG通過Pi噬菌體從大腸桿菌K-12菌株的具有ppc突變的菌株DV21A05[細(xì)菌學(xué)雜志.132,832(1977)]轉(zhuǎn)導(dǎo),得到大腸桿菌K-12菌株WA802[J.Mol.Biol.16,118(1966)]的ppc突變。進(jìn)一步借助于P1噬菌體,通過轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,得到菌株的lip突變和其后的eda突變,來產(chǎn)生具有ppc、lip和eda三重缺失突變的菌株NHK42。從菌株NHK42,誘導(dǎo)出具有減弱蘋果酸合酶活性的菌株。NHK42菌株的微生物在含2g/l谷氨酸與100μg/l硫辛酸的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,離心并收獲,再在0.05M Tris-馬來酸鹽緩沖液(pH6.0)中沖洗,并懸浮在緩沖液中達(dá)終細(xì)菌濃度每升109個(gè)細(xì)胞。向懸浮液中加入NTG至終濃度為600mg/l,將所得混合物在室溫保持20分鐘進(jìn)行誘變。在誘變后,將微生物涂在M9基本瓊脂培養(yǎng)基上(加入0.5%葡萄糖,0.05g/l谷氨酸,100μg/l硫辛酸,以及30mM水合乙醛酸[分子克隆,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè),冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1982)])。在37℃溫育兩天后,收集產(chǎn)生菌落中的小菌落到另加2g/l谷氨酸和100μg/l硫辛酸的LB瓊脂培養(yǎng)基中。將所收集的突變菌株在加入0.5%的葡萄糖,0.5g/l谷氨酸,100μg/l硫辛酸的M9基本瓊脂培養(yǎng)基中,和在加入0.5%的葡萄糖,100μg/l硫辛酸和30mM水合乙醛酸的M9基本瓊脂培養(yǎng)基中復(fù)制。接著,篩選在前一培養(yǎng)基中生長而不在后一培養(yǎng)基中生長的菌株。所選的菌株在MS培養(yǎng)基中于37℃攪拌培養(yǎng)[該培養(yǎng)基每升水含3g葡萄糖,4gKH2PO4,10g(NH4)2SO4,1g MgSO4,100μg維生素B1鹽酸鹽,1g酵母提取物,1g蛋白胨,50μg硫辛酸,20g CaCO3,以及2g谷氨酸,并調(diào)節(jié)至pH7.2]。在對(duì)數(shù)生長后期,收獲微生物并在50mM Tris-鹽酸的緩沖液(pH7.0)中沖洗,該微生物用超聲破碎機(jī)破碎并在離心機(jī)中以15,000rpm離心45分鐘,獲得上清液(定義其為細(xì)胞抽提物溶液)。利用細(xì)胞抽提物溶液,根據(jù)已知參考文獻(xiàn)[酶學(xué)方法5,633(1962)]測定蘋果酸合酶活性。檢測的不具有活性的NHK46菌株被選作對(duì)照突變菌株。
      運(yùn)用P1噬菌體通過轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,將lip+基因從大腸桿菌W3110(ATCC14948)引入NHK46菌株,以產(chǎn)生不需要硫辛酸的NHK48菌株。
      利用Maniatis等方法[分子克隆,實(shí)驗(yàn)室手冊(cè),冷泉港實(shí)驗(yàn)室(1982)],將pKSR101導(dǎo)入到菌株NHK 42,NHK 46和NHK 48(只要在培養(yǎng)基中加入100μg/l硫辛酸和2g/l谷氨酸后進(jìn)行培養(yǎng)),利用氨芐青霉素抗性作為標(biāo)記來獲得轉(zhuǎn)化體。
      將每個(gè)轉(zhuǎn)化體在包含1%葡萄糖,2%碳酸鈣,100μg/l硫辛酸,以及2g/l谷氨酸的LB培養(yǎng)基中,28℃攪拌培養(yǎng)16小時(shí)。將每一培養(yǎng)肉湯加至5ml滅菌T培養(yǎng)基[該培養(yǎng)基每升水中包含50g葡萄糖,4g KH2PO4,10g(NH4)2SO4,1g MgSO4,10μg硫胺素鹽酸鹽,0.2g酵母提取物,3g KCl,50μg硫辛酸,250mg色氨酸,20g CaCO3,以及2g谷氨酸,并且調(diào)整其pH為7.2],30℃培養(yǎng)24小時(shí),接著在另一個(gè)37℃24小時(shí)攪拌培養(yǎng)之前,加入0.25ml 2M水合乙醛酸溶液(用NaOH調(diào)整pH為6.4)。將所獲得的培養(yǎng)肉湯進(jìn)行離心分離,通過HPLC分析產(chǎn)生的培養(yǎng)上清液以便測定4(R)KHG和4(S)KHG的產(chǎn)量。結(jié)果如表1顯示。4(S)KHG產(chǎn)量明顯表明,硫辛酸需要性的突變和蘋果酸合成酶活性減弱的突變有助于4(S)KHG的產(chǎn)量。
      表1
      實(shí)施例3用谷氨酸棒桿菌產(chǎn)生4(S)KHG將導(dǎo)入了pKSR601的谷氨酸棒桿菌菌株ATCC 13032在LB培養(yǎng)基中攪拌培養(yǎng)16小時(shí)。加該培養(yǎng)肉湯(0.5ml)至滅菌的TC培養(yǎng)基(5ml)[該培養(yǎng)基每升水中包含10g葡萄糖,0.5g KH2PO4,0.5g K2HPO4,20g(NH4)2SO4,0.25g MgSO4,3g尿素,100μg生物素,5g玉米漿,10mg FeSO4·7aq,5mg MnSO4·4-6aq,20g CaCO3,并且調(diào)整pH為7.2]中,30℃攪拌培養(yǎng)24小時(shí)。然后,往那里加入2M水合乙醛酸溶液(0.25ml;用NaOH調(diào)整pH為6.4),將混合物在37℃進(jìn)一步攪拌培養(yǎng)24小時(shí)。用HPLC以與實(shí)施例2中相同的方式分析培養(yǎng)上清液。4(S)KHG的產(chǎn)量為34.7mM,沒有產(chǎn)生4(R)KHG。
      實(shí)施例4擴(kuò)大產(chǎn)生4(S)KHG在實(shí)施例2結(jié)果的基礎(chǔ)上,將pKSR101如實(shí)施例2導(dǎo)入到菌株NHK40(該菌株在大腸桿菌K-12的這些菌株中具lip和eda雙缺失突變),來產(chǎn)生菌株以產(chǎn)生4(S)KHG。將該轉(zhuǎn)化體在包含1%葡萄糖,2%碳酸鈣以及100μg/l硫辛酸的LB培養(yǎng)基中,28℃下攪拌培養(yǎng)13小時(shí)。加入該培養(yǎng)肉湯(10ml)至滅菌的1升錐形瓶中的200ml相同培養(yǎng)基中,28℃攪拌培養(yǎng)13小時(shí)。將全部的培養(yǎng)肉湯加至滅菌的5升廣口瓶中的這些組成(如表2所示)的J1培養(yǎng)基中,在33℃、2升/分鐘的通氣下以500rpm進(jìn)行攪拌培養(yǎng),同時(shí)用氨水使該培養(yǎng)基的pH保持在6.8。二十小時(shí)后,將二甲苯(20ml)和2M水合乙醛酸溶液(用NaOH調(diào)整pH為6.4)加至廣口瓶中,37℃進(jìn)一步培養(yǎng)12小時(shí)。用HPLC分析該培養(yǎng)上清液,并觀察到4(S)KHG的產(chǎn)量是305mM。
      表2J1培養(yǎng)基的組成(每一升;調(diào)整pH為6.8)葡萄糖 30gKH2PO42gK2HPO42g(NH4)2SO410gMgSO41gFeSO4·7aq 10mgMnSO4·4-6aq10mgCoCl21.5mgCaCl215mgNiCl21.5mg鉬酸銨 1.5mg硫胺素鹽酸鹽 100μg酵母提取物 0.5gKCl 3g硫辛酸 75μg色氨酸 250mg實(shí)施例5用各種菌株產(chǎn)生4(S)KHG通過使用P1噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[J.H.Miller,分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn),冷泉港實(shí)驗(yàn)室,(1972)],將ppc+基因從大腸桿菌W3110(ATCC 14948)導(dǎo)入到菌株NHK42中,以產(chǎn)生不需要谷氨酸的菌株NHK45。以與實(shí)施例2中相同的方式將pKSR101導(dǎo)入到該菌株中。
      將這些菌株NHK42,NHK 46,NHK 48和NHK45(所有這些菌株以pKSR101進(jìn)行了導(dǎo)入)以與實(shí)施例2中以相同的方式進(jìn)行培養(yǎng),并用HPLC測定結(jié)果產(chǎn)生的培養(yǎng)上清液以便測量4(R)HG和4(S)HG的產(chǎn)量。HPLC測定條件柱;Lichrospher(C18)柱,Merck,公司制造流動(dòng)相;包含10mM檸檬酸鈉,10mM無水硫酸鈉(pH2.2),0.4%正丙醇,以及0.03%SDS的溶液。流速;0.8ml/分鐘溫度;40℃檢測;通過柱標(biāo)記檢測經(jīng)鄰苯二甲醛處理的洗脫液。Ex=350nm,Em=448nm。
      結(jié)果如表3顯示。根據(jù)每種菌株的4(S)HG的產(chǎn)量,這些是明顯的,即硫辛酸需要性的突變,蘋果酸合酶活性減弱的突變,以及烯醇丙酮酸磷酸羧化酶缺失的突變可有助于4(S)HG的產(chǎn)生。
      將導(dǎo)入了pKSR601的谷氨酸棒桿菌ATCC 13032在LB培養(yǎng)基中攪拌培養(yǎng)16小時(shí)。加該培養(yǎng)肉湯(0.5ml)至滅菌的TC培養(yǎng)基(5ml)中[該培養(yǎng)基每升水中包含100g葡萄糖,0.5g KH2PO4,0.5g K2HPO4,20g(NH4)2SO4,0.25g MgSO4,3g尿素,100μg生物素,5g玉米漿,10mg FeSO4·7aq,5mg MnSO4·4-6aq,20g CaCO3,并且調(diào)整pH為7.2],30℃攪拌培養(yǎng)24小時(shí)。然后,加入2M水合乙醛酸溶液(0.25ml;用NaOH調(diào)整pH為6.4),將混合物在37℃進(jìn)一步攪拌培養(yǎng)24小時(shí)。用HPLC以與上述相同的方式分析培養(yǎng)上清液以測定4(R)HG和4(S)HG的產(chǎn)量。
      結(jié)果如表3顯示。
      表3
      實(shí)施例6擴(kuò)大產(chǎn)生4(S)HG將導(dǎo)入了pKSR101的大腸桿菌NHK46菌株在包含1%葡萄糖,2%碳酸鈣,100μg/l硫辛酸以及2g/l谷氨酸的LB培養(yǎng)基中,28℃下攪拌培養(yǎng)13小時(shí)。加入該培養(yǎng)肉湯(10ml)至滅菌的1升錐形瓶中的200ml相同培養(yǎng)基中,28℃攪拌培養(yǎng)13小時(shí)。將全部培養(yǎng)肉湯加至滅菌的5升廣口瓶中的這些組成(如表4所示)的J2培養(yǎng)基中,在33℃、2升/分鐘的通氣下以500rpm進(jìn)行攪拌培養(yǎng),同時(shí)用氨水使該培養(yǎng)基的pH保持在6.8。14小時(shí)后,將2M水合乙醛酸溶液(350ml;用NaOH調(diào)整pH為6.4)加至廣口瓶中,37℃進(jìn)一步培養(yǎng)60小時(shí)并適當(dāng)?shù)卦黾悠咸烟?。用HPLC以與實(shí)施例5相同的方式分析該培養(yǎng)上清液,并觀察到4(S)HG的產(chǎn)量為141.7mM及4(R)HG的產(chǎn)量為6mM。
      表4J2培養(yǎng)基的組成(每一升;調(diào)整pH為6.8)葡萄糖 30gKH2PO42gK2HPO42g(NH4)2SO410gMgSO41gFeS04·7aq 10mgMnSO4·4-6aq 10mgCoCl21.5mg
      CaCl215mgNiCl21.5mg鉬酸銨 1.5mg硫胺素鹽酸鹽 100μg酵母提取物 0.5gKCl3g硫辛酸 75μg色氨酸 250mg谷氨酸 12g異亮氨酸 20mg甲硫氨酸 10mg實(shí)施例7純化4(S)HG利用離心,從培養(yǎng)肉湯(一升)中分離出這些如實(shí)施例6獲得的,包含4(S)HG和4(R)HG的微生物,同時(shí)使所產(chǎn)生的培養(yǎng)上清液流過裝有陽離子交換樹脂SK1B(500ml)的柱(H+類型,Mitsubishi化學(xué)公司制造)。在以水沖洗之后,使1N氨水流過該柱以分餾HG洗脫物組分。通過活性炭使該分餾溶液進(jìn)行脫色過程,并將此產(chǎn)生的溶液的一半流過裝有陰離子交換樹脂PA316(400ml)柱(OH類型,Mitsubishi化學(xué)公司制造)。在以水沖洗之后,使0.5N鹽酸流過柱以分餾HG洗脫物組分。通過蒸發(fā),使鹽酸從分餾溶液中分離出,并將所產(chǎn)生的溶液濃縮至50ml,然后在4℃處放置2天。將液體中所產(chǎn)生的晶體過濾以回收4(S)HG(7g)。通過NMR分析,質(zhì)譜以及旋光性測定,證實(shí)出該晶體為4(S)HG,沒有4(R)HG的存在。因此,利用菌株NHK46,可以從沒有4(R)HG污染的一步反應(yīng)中收集4(S)HG。
      實(shí)施例8將脯氨酸合酶基因連接到KAL基因上首先,以下列方式,通過修飾proBA(編碼proB和proA)基因(該基因編碼脯氨酸生物合成酶)產(chǎn)生對(duì)脯氨酸反饋抑制作用不敏感的突變體proBA基因。
      將來源于大腸桿菌,含proBA基因的質(zhì)粒pPRO-1(日本未審查專利出版物No.3-266995)以EcoRV來進(jìn)行消化,然后將所消化的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上電泳,并利用prep-A-Gene DNA純化系統(tǒng)(Bio-Rad公司制造)分離和純化包含部分proB基因的DNA片段。將該片段連接到通過以SmaI消化pUS119(Takara Brewery公司制造)所獲得的消化產(chǎn)物上。將所產(chǎn)生的連接產(chǎn)物用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌ATCC 33625以產(chǎn)生抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化體。用限制性分析的常規(guī)方法從這些轉(zhuǎn)化體之一提取質(zhì)粒。鑒定出,該質(zhì)粒在pUC119的SmaI位點(diǎn)處插入了包含部分proB基因的約1kb的DNA片段。定義該質(zhì)粒為pBAB51。
      在已知脫敏感proB酶基因(proB74突變)[A.M.Dandekar和S.L.Uratsu,J.Bacteriol.170,5943(1988)]的核苷酸序列基礎(chǔ)上,用常規(guī)方法合成產(chǎn)生No.3序列的序列的寡核苷酸Al和No.4序列的序列的寡核苷酸A2。通過其后分別利用一對(duì)寡核苷酸Al和M13引物M3(TakaraBrewery公司制造)作為引物,一對(duì)寡核苷酸A2和M13引物RV(TakaraBrewery公司制造)作為另一個(gè)引物,按與實(shí)施例1相同的方式,由PCR利用pBAB51作為模板擴(kuò)增突變體proB基因的部分的序列。將所擴(kuò)增的DNA在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,并利用Prep-A-Gene DNA純化系統(tǒng)(Bio-Rad,公司)純化。以純化后這兩個(gè)DNA片段的混合物作為模板,利用M13引物M3與M13引物RV作為引物再一次進(jìn)行PCR,擴(kuò)增包含突變體proB基因序列的約1kb的DNA片段。在以Ec00651和SacII消化后,將該DNA片段連接到約6.8kb的DNA片段上(其通過以Eco0651和SacII將pPRO-1消化后,接著利用Prep-A-Gene DNA純化系統(tǒng)(Bio-Rad公司)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、分離和純化來回收)。利用該連接產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化大腸桿菌ATCC 33625以產(chǎn)生抗四環(huán)素的轉(zhuǎn)化體。將這些轉(zhuǎn)化體和攜帶pPRO-1的大腸桿菌ATCC 33625中的幾個(gè)在加入了3,4-脫氫脯氨酸(100mg)的M9基本瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)制。所有轉(zhuǎn)化體均能生長,但是攜帶pPRO-1的大腸桿菌ATCC 33625不能生長。這證實(shí)了已構(gòu)建出使其中pPRO-1的proB基因修飾成脫敏感類型的質(zhì)粒。利用常規(guī)方法,從這些轉(zhuǎn)化體提取出這些質(zhì)粒來進(jìn)行限制酶切分析,這表明所有該質(zhì)粒有相同的結(jié)構(gòu)。該質(zhì)粒被定義為pKSR24。
      將這樣產(chǎn)生的pKSR24以PstI和BglII進(jìn)行酶切,并利用DNA平端化試劑盒(Takara Brewery,公司制造)使其平端化。利用瓊脂糖凝膠電泳和Prep-A-Gene DNA純化系統(tǒng)(Bio-Rad公司),分離出并純化包含突變體proBA基因約2.9kb的DNA片段。將具圖3中所顯示的高溫誘導(dǎo)類型啟動(dòng)子和限制酶切位點(diǎn)的pPAC1質(zhì)粒的ClaI酶切物,在借助于DNA平端化試劑盒使該片段平末端化后,連接到該DNA片段上。利用連接產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化大腸桿菌ATCC 33625,從這些轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒以回收pKSR25,其中pKSR25具有突變體proBA插入在pPAC1的高溫誘導(dǎo)類型啟動(dòng)子的下游的結(jié)構(gòu),因此該突變體的轉(zhuǎn)錄方向可能是一種有順序的方向。
      將實(shí)施例1中所產(chǎn)生的pKSR101以EcoRI和BdlII消化,并用DNA平端化試劑盒使其平端化,通過利用瓊脂糖凝膠電泳和Prep-A-Gene DNA純化系統(tǒng)(Bio-Rad公司制造)分離并純化包含約1.2kb KAL基因的DNA片段。將約1.2kb的該DNA片段與通過以XhoI消化pKSR25,并用DNA平端化試劑盒使所消化的產(chǎn)物平端化而回收的DNA片段相連接。利用連接產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化大腸桿菌ATCC 33625,從這些轉(zhuǎn)化體中回收抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)化體。對(duì)幾個(gè)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行3,4-脫氫脯氨酸抗性和KAL活性測定。證實(shí)所有轉(zhuǎn)化體均有3,4-脫氫脯氨酸抗性和KAL活性。用常規(guī)方法,從八個(gè)這樣的轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒以作限制酶切分析,這表明所有這些質(zhì)粒有相同的結(jié)構(gòu)。該質(zhì)粒被定義為pKSR125。在圖3中顯示了質(zhì)粒構(gòu)建過程和pKSR125的限制酶圖譜。
      實(shí)施例9通過加入水合乙醛酸的培養(yǎng)法產(chǎn)生4(S)HYP在實(shí)施例2中所產(chǎn)生的菌株NHK46中,如下誘導(dǎo)具抗脯氨酸類似物鈴蘭氨酸的突變菌株。將通過與實(shí)施例2相同的方式培養(yǎng)的菌株NHK46,以與實(shí)施例2中相同的方式進(jìn)行誘變,然后涂布在M9基本瓊脂培養(yǎng)基上(該培養(yǎng)基中加入了0.5%葡萄糖,0.5g/l谷氨酸,100μg/l硫辛酸,100mg/l鈴蘭氨酸),37℃下培育2天。在所產(chǎn)生的菌落中,收獲較大的菌落,以獲得抗鈴蘭氨酸突變菌株NHK 47。
      將實(shí)施例8中所產(chǎn)生的pKSR125導(dǎo)入菌株NHK46與NHK47,利用氨芐青霉素抗性作為標(biāo)記來獲得轉(zhuǎn)化體。將這些轉(zhuǎn)化體的個(gè)體和攜帶pKSR101的菌株NHK46(如實(shí)施例2中產(chǎn)生)以與實(shí)施例2中相同的方式進(jìn)行培養(yǎng),并用HPLC測定這些培養(yǎng)上清液以檢測4(S)HYP。HPLC測定條件柱;Shiseido CapcellPak-C18(4.6×150mm)流動(dòng)相;A;10mM檸檬酸鈉(pH4),B;相等體積的A和甲醇的混合溶液流速;1.5ml/分鐘溫度;50℃流動(dòng)相的梯度時(shí)間表時(shí)間(分鐘)B(體積%)0-10 0-810-20 8-8020-21 80-10021-23 10023-24 0檢測;在Ex=470nm和Em=530nm時(shí)的熒光檢測表5中顯示該結(jié)果。
      表5
      實(shí)施例10通過兩步反應(yīng)產(chǎn)生4(S)HYP通過P1噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法,將異檸檬酸脫氫酶缺失突變(icd)從具異檸檬酸脫氫酶缺失的大腸桿菌突變菌株EB106[由美國Ct.,New Haven,耶魯大學(xué),大腸桿菌基因儲(chǔ)備中心提供]導(dǎo)入到大腸桿菌ATCC 33625中,以產(chǎn)生菌株NHK3。由于icd突變,該突變菌株表達(dá)谷氨酸需要性。
      利用實(shí)施例8中產(chǎn)生的pKSR25,個(gè)別地轉(zhuǎn)化大腸桿菌ATCC 33625和NHK3,以氨芐青霉素抗性作為標(biāo)記來獲得個(gè)別的轉(zhuǎn)化體。此外,利用來源于pACYC177的質(zhì)粒pKSR50(圖.4)[該質(zhì)粒攜有一個(gè)攜帶插入在PstI和ClaI兩位點(diǎn)之間的大腸桿菌谷氨酸脫氫酶基因(gdh)的4.2-kbDNA片段]和約3-kb DNA片段[該片段攜帶插入在BamHI和SphI兩位點(diǎn)之間的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因(zwf)],轉(zhuǎn)化攜帶pKSR25的大腸桿菌NHK3(NHK3/pKSR25菌株),并利用對(duì)氨芐青霉素和氯霉素的抗性作為標(biāo)記來獲得攜帶pKSR50和pKSR25的菌株NHK3(NHK3/pKSR50+pKSR25)。同樣將pKSR50和pKSR25導(dǎo)入到大腸桿菌K-12菌株突變類型(icd,sucA,putA,eda)的突變菌株NHK23中,以獲得菌株NHK23/pKSR50+pKSR25。
      按如實(shí)施例2中相同的方式,將所有上述所產(chǎn)生的大腸桿菌ATCC33625,NHK3,ATCC33625/pKSR25,NHK3/pKSR25,NHK3/pKSR50+pKSR25和NHK23/pKSR50+pKSR25,在T培養(yǎng)基中30℃同樣地培養(yǎng)24小時(shí)。將實(shí)施例4中產(chǎn)生的包含4(S)KHG的培養(yǎng)上清液在通過微孔濾膜過濾和滅菌之后,加至該培養(yǎng)物中直到4(S)KHG的終濃度為40mM,然后將該混合物在37℃進(jìn)一步攪拌培養(yǎng)24小時(shí)。用下列方法測定培養(yǎng)肉湯中的4(S)HYP。在80μl該培養(yǎng)上清液中加入甲醇溶液(100μl)[其包含硼酸鹽緩沖液(pH9.6;20μl)和6mg/ml NBD-C1(7-氯-4-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑氯化物)]以用于60℃、黑暗下反應(yīng)20分鐘,其后加入1N HCl(50μl)至反應(yīng)溶液中以終止反應(yīng)。使該混合物通過微孔濾膜過濾,濾液由HPLC以實(shí)施例9中相同的方式測定以檢測4(S)HYP。表6中顯示該結(jié)果。
      另外,將谷氨酸棒桿菌KY 10912在LB培養(yǎng)基中攪拌培養(yǎng)16小時(shí)。然后把該培養(yǎng)肉湯加入到5ml滅菌的TC培養(yǎng)基中,30℃攪拌培養(yǎng)24小時(shí)。將實(shí)施例4中產(chǎn)生的包含4(S)KHG的培養(yǎng)上清液在通過微孔濾膜過濾和滅菌之后,加至該培養(yǎng)物中直到4(S)KHG的終濃度為40mM,然后將該混合物在37℃進(jìn)一步攪拌培養(yǎng)24小時(shí)。如同實(shí)施例9中由HPLC分析培養(yǎng)上清液以檢測4(S)HYP。表6中顯示該結(jié)果。
      表6
      依據(jù)本發(fā)明,(S)-4-羥基-2-酮戊二酸和來自前體(S)-4-羥基-2-酮戊二酸的化合物,例如(2S,4S)-4-羥基-L-谷氨酸以及(2S,4S)-4-羥基-L-脯氨酸,可以以工業(yè)上有利的方式來產(chǎn)生。(2S,4S)-4-羥基-L-脯氨酸具有包括抗腫瘤細(xì)胞活性[癌癥研究48,2483(1988)]和抗肥大細(xì)胞活性(日本未審查專利出版物No.63-218621)的生物學(xué)作用。(S)-4-羥基-2-酮戊二酸和(2S,4S)-4-羥基-L-谷氨酸是用作為合成脯氨酸有用的原材料。
      可以構(gòu)成本發(fā)明的許多不同實(shí)施方案而不背離本發(fā)明的精神與范圍。人們知道,本發(fā)明不限于本說明書所描述的特定的實(shí)施方案。相反,本發(fā)明旨在覆蓋權(quán)利要求的精神與范圍內(nèi)所包括的各種改進(jìn)和等同的方案。
      序列表序列號(hào)1序列長度26序列類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型其它核酸,合成DNA序列描述CAAAAGCTTA TGAAAAACTG GAAAAC序列號(hào)2序列長度24序列類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型其它核酸,合成DNA序列描述TTTGGATCCT TACAGCTTAG CGCC序列號(hào)3序列長度22序列類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型其它核酸,合成DNA序列描述GACCCGTGCT AATATGGAAG AC序列號(hào)4序列長度22序列類型核酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型其它核酸,合成DNA序列描述GTCTTCCATA TTAGCACGGG TC
      權(quán)利要求
      1.一種用于產(chǎn)生(2S,4S)-4-羥基-L-脯氨酸的方法,該方法包括(a)在含水介質(zhì)中使生物催化劑與(S)-4-羥基-2-酮戊二酸反應(yīng),所說的催化劑具有將(S)-4-羥基-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)化成(2S,4S)-4-羥基-L-脯氨酸的活性,以及(b)收集在含水介質(zhì)中產(chǎn)生的(2S,4S)-4-羥基-L-脯氨酸。
      2.按照權(quán)利要求1的方法,其中所說的生物催化劑是所說微生物的培養(yǎng)物或細(xì)胞或處理產(chǎn)物。
      3.按照權(quán)利要求2的方法,其中所說的微生物屬于埃希氏菌屬或棒桿菌屬。
      4.按照權(quán)利要求2的方法,其中所說的微生物是有抗脯氨酸類似物抗性的微生物。
      5.按照權(quán)利要求2的方法,其中所說的微生物是谷氨酸需要性微生物。
      全文摘要
      本發(fā)明提供了用于工業(yè)上有利地產(chǎn)生(S)-4-羥基-2-酮戊二酸的方法,以及用于產(chǎn)生通過生物合成由前體(S)-4-羥基-2-酮戊二酸所形成的化合物的方法,例如,利用攜帶具有編碼4(S)-4-羥基-2-酮戊二酸醛縮酶基因的DNA片段的重組DNA的重組微生物,產(chǎn)生化合物(2S,4S)-4-羥基-L-谷氨酸和(2S,4S)-4-羥基-L-脯氨酸。
      文檔編號(hào)C12P13/04GK1381586SQ0113255
      公開日2002年11月27日 申請(qǐng)日期2001年9月5日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月9日
      發(fā)明者橋本信一, 勝亦瞭一 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社
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