專利名稱：用于體外腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)的組合套件的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)用的器材，它是由標(biāo)本洗滌與保存套盒、細(xì)胞分離與純化套盒、細(xì)胞接種培養(yǎng)套盒、多種微量抗癌藥物藥盒、多梯度微量藥物稀釋盤套盒和終點(diǎn)檢測試劑藥盒組成的體外腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)用組合套件。
化學(xué)藥物治療是治療惡性腫瘤的常用方法之一，但由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和多藥耐藥性，使腫瘤常常產(chǎn)生對化療耐藥，使腫瘤化療的總體療效很不理想。一般來講，每種化療藥物的有效性，大概在20％左右，采用體外腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)(TumorChemosensitivity Assay，簡稱TCA)篩選抗癌藥物以指導(dǎo)臨床腫瘤化療，選用化療敏感藥物可以提高化療效果，同時(shí)又避免無效藥物(化療耐藥藥物)的毒副作用對機(jī)體的損害，對病人起到雙重有利效果，這是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。體外TCA即將腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外的有藥培養(yǎng)，然后通過檢測細(xì)胞活性的有關(guān)指標(biāo)，判斷不同藥物的抑制腫瘤生長的效果(藥物敏感性和耐藥性)，在一定程度上可以預(yù)測化療藥物在體內(nèi)的抗癌作用，從而確定針對個(gè)體腫瘤具有較好療效的化療藥物或藥物組合，目前已有多種方法報(bào)道(韓銳主編，腫瘤化學(xué)預(yù)防及藥物治療。北京醫(yī)科大學(xué)、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社.1993417-426)，但是均存在一定的局限性(DeVita VT.et al.CancerPrinciples andPractice of Oncology.6th Edition.Lippincott-Raven Publishers.Philadelphia. 2001302-304)。噻唑藍(lán)(四甲基偶氮唑鹽)比色法(MTT法)是10余年來在實(shí)驗(yàn)研究中廣泛應(yīng)用的TCA方法之一，此處簡稱MTT-TCA，已有用于指導(dǎo)臨床腫瘤化療的報(bào)道(蔣芹，等.MTT法體外檢測癌細(xì)胞藥敏試驗(yàn)及臨床相關(guān)性研究。實(shí)用癌癥雜志。2001，1657-59.Xu JM，et al.Breast Cancer Research & Treatment.1998，49251-259.)，但是應(yīng)用并不廣泛。三磷酸腺苷檢測法(ATP法)是一種近幾年報(bào)道的TCA方法，此處簡稱ATP-TCA，也有指導(dǎo)臨床化療的報(bào)道(Konecny G，et al.Gynecology Oncology.2000，77258-263.)，但這種方法的操作比較復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備和材料的成本較貴重，不容易推廣。
目前常用的體外TCA方法，如MTT-TCA和ATP-TCA，一般是在獲得腫瘤標(biāo)本后先分離腫瘤細(xì)胞呈單細(xì)胞懸液，在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，暴露于呈梯度稀釋的多種抗癌藥物中一定時(shí)間后，測定腫瘤細(xì)胞生長(或活性)抑制率，繪制藥物劑量-抑制曲線，再由此曲線求得50％腫瘤生長抑制藥物濃度(IC50)來判斷不同藥物的抗癌效果。這類TCA方法是比較復(fù)雜、精細(xì)而又繁重的工作，目前尚無規(guī)范化的統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)方案，尤其是獲得充足的數(shù)據(jù)繪制精確可靠的藥物劑量-抑制曲線是其技術(shù)難點(diǎn)之一，常需要較高水平的專業(yè)技術(shù)人員來操作，者也是不能廣泛推廣應(yīng)用的原因之一。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)MTT-TCA的資料，無論在實(shí)驗(yàn)研究或臨床應(yīng)用中都存在多種問題。如不同的實(shí)驗(yàn)人員對同一細(xì)胞系或同一標(biāo)本的測試結(jié)果存在明顯的差異，使得研究結(jié)果的可重復(fù)性和可比性較差。分析其原因可見，要開展此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)室要在具有一定的儀器、設(shè)備的基礎(chǔ)上，如超凈工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備和分光光度儀(或酶標(biāo)儀)等，根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案分別準(zhǔn)備各種實(shí)驗(yàn)用原材料，如各種細(xì)胞分離純化試劑、檢測藥物和MTT終點(diǎn)顯示相關(guān)試劑等。由于不同實(shí)驗(yàn)室、不同研究人員，不論實(shí)驗(yàn)規(guī)模大小，開展此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均要分別購買、準(zhǔn)備各項(xiàng)基本試劑以及各種消耗性材料，使這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)勞動(dòng)強(qiáng)度較大，工作效率低，容易造成浪費(fèi)。更重要的是由于實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，操作過程中技術(shù)環(huán)節(jié)多，導(dǎo)致出現(xiàn)各種誤差的因素和機(jī)會增多，各種微小影響因素的積累，容易造成多種實(shí)驗(yàn)誤差的積累，導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)人員所測得的最終結(jié)果間的可比性較差，對其結(jié)果的真實(shí)性和可靠性提出質(zhì)疑。目前，這仍是未獲得徹底解決的問題。
ATP-TCA被認(rèn)為是具有較高靈敏度的方法之一，市場上有銷售的相關(guān)的試劑盒，如德國DCS公司原裝試劑盒，該公司的ATP-TCA試劑盒有多種不同的類型，其中完全檢測試劑盒(TCA-100 Kit)可以提供實(shí)驗(yàn)所需的多種試劑和原材料，能夠方便實(shí)驗(yàn)，但是其實(shí)驗(yàn)成本費(fèi)用很高。而對于MTT-TCA，CHEMICON INTERNATIONAL INC.銷售的MTT藥盒，只包括了MTT試劑、磷酸緩沖液(PBS)和相關(guān)溶劑(鹽酸異丙醇)，可滿足多次實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn)顯示測定，但這只是整個(gè)MTT-TCA過程中所需原材料的一小部分。市場上尚未見適用于MTT-TCA的比較全面而方便適用的試劑盒，也未見有關(guān)類似的產(chǎn)品和用法的報(bào)道。
本發(fā)明的目的是為了解決在MTT-TCA中存在的一些問題，如操作復(fù)雜、工作量大而效率低、缺乏規(guī)范化的指導(dǎo)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性和可比性較差、以及不便于推廣應(yīng)用等問題，根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程中各個(gè)步驟的特點(diǎn)，研制了一種適用于體外腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)用的組合套件。文獻(xiàn)報(bào)道的典型的實(shí)體腫瘤MTT-TCA的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ街饕ㄒ韵赂黜?xiàng)步驟標(biāo)本取材與保存、細(xì)胞分離與純化、細(xì)胞接種培養(yǎng)、抗癌藥物的配制與添加、持續(xù)培養(yǎng)與藥物反應(yīng)過程、MTT法終點(diǎn)顯示、數(shù)據(jù)處理與計(jì)算腫瘤生長抑制率、評價(jià)結(jié)果推導(dǎo)“抗瘤譜”等。當(dāng)應(yīng)用這種相對固定的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綍r(shí)，對于每例試驗(yàn)在每個(gè)步驟使用的特殊的消耗性原材料和試劑，可做有機(jī)的加工、配套組合、集中供給，相當(dāng)于做了一部分MTT-TCA的前期工作，與實(shí)驗(yàn)室固有的儀器設(shè)備和批量應(yīng)用的物品形成較好的配合應(yīng)用，可提高實(shí)驗(yàn)效率和結(jié)果的可靠性。設(shè)計(jì)本發(fā)明遵從了以下原則(1)經(jīng)濟(jì)充分發(fā)揮實(shí)驗(yàn)室固有儀器設(shè)備和非一次性物品的使用價(jià)值，而批量應(yīng)用的物品由實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一購置比較經(jīng)濟(jì)；(2)高效組合套件的各部分根據(jù)實(shí)驗(yàn)流程合理組合，對各部分原材料經(jīng)過初步加工、分裝處理，使各部分處于臨用狀態(tài)，適于流水作業(yè)，既提高工作效率，又減小勞動(dòng)強(qiáng)度；(3)精確按照相對統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)流程，依照一定標(biāo)準(zhǔn)提供各種試劑和原材料，以使實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好、可比性強(qiáng)、誤差較??；(4)環(huán)保在MTT-TCA過程中，腫瘤標(biāo)本具有一定的污染性，很多種類的試劑具有一定的毒性，所以采用一次性器皿，便于用后處理，既要保證實(shí)驗(yàn)成功，又要保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境。
本發(fā)明的目的可采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)，由標(biāo)本洗滌與保存套盒、細(xì)胞分離與純化套盒、細(xì)胞接種培養(yǎng)套盒、多種微量抗癌藥物藥盒、多梯度微量藥物稀釋盤套盒和終點(diǎn)檢測試劑藥盒組成的體外腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)用組合套件，器各個(gè)部分的組成特點(diǎn)及作用原理和用途如下1.標(biāo)本洗滌與保存套盒由培養(yǎng)皿、標(biāo)本套杯、洗滌液和保存液等組成，均需做無菌處理，利用此套盒可方便地到不同單位取材。培養(yǎng)皿用于做洗滌標(biāo)本的容器，選用有蓋的中等以上大小者易于操作。標(biāo)本套杯是由大、小兩個(gè)帶蓋杯組成的，小杯容積在50ml左右，用于保存標(biāo)本，大杯的直徑和高度應(yīng)比小杯大，便于使用時(shí)將小杯(標(biāo)本杯)放入大杯內(nèi)，在小杯周圍加碎冰塊，起到冰浴、低溫保存、便于運(yùn)輸?shù)淖饔谩Ｏ礈煲哼x用平衡鹽溶液適量裝于輸液瓶中，用于洗滌標(biāo)本。保存液選用普通培養(yǎng)基(MEM、DMEM或RPMI1640等)適量裝于輸液瓶中，低溫保存，其中加入抗菌素(青霉素100單位/毫升、鏈霉素100μg/毫升和卡那霉素100μg/毫升)，用于臨時(shí)保存標(biāo)本，抗菌素具有抗污染的作用。
2.細(xì)胞分離與純化套盒由培養(yǎng)皿、消化酶溶液、過濾網(wǎng)篩和Ficoll-Hypaque溶液組成，均需做無菌處理，可方便地進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的分離與純化。培養(yǎng)皿選用2個(gè)中等以上大小有蓋者，分別用于剪切標(biāo)本和濾過腫瘤組織的消化液。消化酶溶液選用由D-Hanks溶液配制的0.1％～0.5％的胰蛋白酶或0.1～0.3mg/ml的膠元酶，適量分裝于小瓶中，低溫保存，用于消化組織。過濾網(wǎng)篩選用20～50μm不銹綱網(wǎng)篩或尼龍網(wǎng)篩，用于過濾細(xì)胞懸液。選用Ficoll-Hypaque(Ficoll聚蔗糖400；Hypaque3，5-二乙酰胺基-2，4，6-三碘苯甲酸鈉)溶液(1.077g/ml)適量裝于小瓶中，用于梯度分離細(xì)胞懸液。
3.細(xì)胞接種培養(yǎng)套盒由節(jié)用型配液池和細(xì)胞培養(yǎng)板組成。分離所得細(xì)胞非常寶貴，有時(shí)所得細(xì)胞量較少，如何充分利用很重要，為此設(shè)計(jì)了節(jié)用型配液池。節(jié)用型配液池的基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用原理如下

圖1是節(jié)用型配液池的立體圖，圖2、3、4、5分別是其剖視圖、側(cè)視圖、正視圖和俯視圖，圖6是節(jié)用型配液池的實(shí)施例。每個(gè)節(jié)用型配液池(A)是由一個(gè)池槽(B)和邊框(C)構(gòu)成，池槽(B)在形狀上由匯集區(qū)(D)、過度區(qū)(E)和擴(kuò)展區(qū)(F)組成。匯集區(qū)(D)較狹長，底部呈凹弧形，用于調(diào)配液體時(shí)，能使少量溶液得到充分利用；擴(kuò)展區(qū)(F)較寬，能保障調(diào)配較多的液體；過度區(qū)(E)為斜型光滑的曲面，便于使液體由多減少時(shí)流向匯集區(qū)(D)?？梢愿鶕?jù)需要制作各種不同大小容積的節(jié)用型配液池。培養(yǎng)板選用2塊96孔平底培養(yǎng)板，用于接種培養(yǎng)細(xì)胞，采用三孔重復(fù)，每塊96孔平底培養(yǎng)板可觀察對四種藥物的反應(yīng)，故每次試驗(yàn)用2塊培養(yǎng)板，可觀察對8種藥物的反應(yīng)。
4.多種微量抗癌藥物藥盒由多種抗癌藥物的微量儲備液組成，一般選用6～8種供檢測用。根據(jù)商家提供的藥物說明書或臨床醫(yī)師的要求選擇針對某一類腫瘤的侯選藥物，按照制造商的說明書使用指定的溶劑稀釋過濾后達(dá)到儲備液的濃度，取每種藥物儲備液0.1ml，分裝于5ml小瓶中，或根據(jù)實(shí)驗(yàn)者的要求準(zhǔn)備藥物種類、濃度和劑量，均需低溫保存。便于稀釋的微量藥物劑量應(yīng)根據(jù)測試的要求，先確定標(biāo)準(zhǔn)檢測藥物濃度(Standard Test Drug Concentration，STDC)，例如以每種藥物臨床用藥時(shí)的血漿峰值濃度的10％為STDC或由實(shí)驗(yàn)人員確定STDC，再確定要檢測的最高濃度為一定倍數(shù)的STDC。預(yù)先配制的微量藥物的儲備液的濃度則為要測定的最高濃度的若干倍數(shù)(約100～1000倍比較適用)，便于儲存和保持藥物的穩(wěn)定性。
5.多梯度微量藥物稀釋盤套盒由多塊多梯度微量藥物稀釋盤和節(jié)用型配液池組成。在MTT-TCA中，將多種抗癌藥物進(jìn)行準(zhǔn)確的系列梯度稀釋是較難的技術(shù)問題。常見的藥物濃度梯度稀釋方法有兩種(1)呈倍數(shù)級稀釋每一梯度稀釋劑量遞減公比為2倍(劑量組距為2倍)，可以在培養(yǎng)板上進(jìn)行，但測定6種藥物濃度，其濃度范圍過小是其局限性。如自200單位(相對的濃度單位)稀釋至6.25單位，僅為1.5個(gè)對數(shù)級的范圍，因劑量組距較小，IC50有時(shí)在藥物劑量-抑制曲線之外，而無法準(zhǔn)確測定；(2)呈對數(shù)級稀釋每一梯度稀釋劑量遞減公比為10倍(劑量組距為10倍)，難以在培養(yǎng)板上進(jìn)行，而測定6種藥物濃度，其濃度范圍過大，也是其局限性。如自1000單位稀釋至0.01單位，為5個(gè)對數(shù)級范圍，因劑量組距較大，測定的IC50結(jié)果不夠精確。相比較可見，理想的藥物濃度的梯度稀釋方法應(yīng)介于上述兩種方法之間，兼具兩者的優(yōu)點(diǎn)，由此可見半對數(shù)級稀釋比較適用。所謂半對數(shù)級稀釋即每一梯度稀釋劑量遞減公比為100.5倍，其劑量組距約為3.16(100.5≈3.16)倍，測定6種藥物濃度，其濃度范圍適中。如自1000單位稀釋至3.16單位，為2.5個(gè)對數(shù)級范圍。半對數(shù)級稀釋法在培養(yǎng)板上是難以進(jìn)行的，也未見應(yīng)用于TCA中的報(bào)道，為此設(shè)計(jì)了多梯度微量藥物稀釋盤，其基本結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用原理如下圖7是多梯度微量藥物稀釋盤，圖8是多梯度微量藥物稀釋盤的實(shí)施例。每塊多梯度微量藥物稀釋盤(G)是由多個(gè)(6～8個(gè))小型的節(jié)用型配液池(A)排列組成的，每個(gè)池槽(B)的結(jié)構(gòu)和原理與節(jié)用型配液池的池槽相同，邊框(C)上有對每個(gè)池槽的編號(H)，便于使用。使用時(shí)可先在每一個(gè)池槽中加入等量(X)的稀釋用培養(yǎng)液，再在第一個(gè)池槽中(設(shè)為最高濃度)加入一定量(Y)的藥物原液，然后依次從上一池槽內(nèi)移等量(Y)的含藥液至下一池槽內(nèi)，直至最后一個(gè)池槽，即得系列呈等濃度梯度稀釋的藥物溶液，每一梯度稀釋劑量遞減公比為Z倍，其中Z＝(X+Y)/Y，(例如Z＝2時(shí)，Y＝X；Z＝10時(shí)，Y＝X/9；Z＝3.16時(shí)，Y＝X/2.16)，此方法應(yīng)用起來準(zhǔn)確、方便又快捷。每一塊多梯度微量藥物稀釋盤可以滿足對一種藥物6～8個(gè)濃度梯度的稀釋。選用節(jié)用型配液池1個(gè)，用于調(diào)配培養(yǎng)液。
6.終點(diǎn)檢測試劑藥盒是由MTT儲備液、鹽酸異丙醇溶液和節(jié)用型配液池組成的，用于MTT法腫瘤藥敏試驗(yàn)的終點(diǎn)顯示。MTT儲備液由MTT粉劑溶于磷酸緩沖液(PBS，pH＝7.4)配制成含MTT 5mg/ml的溶液，并用0.22μm過濾器過濾除菌，適量分裝，低溫、避光(用不透光的金箔包裹)保存。鹽酸異丙醇由異丙醇500ml中加入0.04N鹽酸制成，適量分裝保存。這兩種液體均應(yīng)新鮮配制，短期內(nèi)使用。選用節(jié)用型配液池2個(gè)，分別用于調(diào)配MTT溶液和鹽酸異丙醇溶液。
上述器皿應(yīng)由無毒性的塑料或玻璃制成，各種原材料、藥品和試劑可自制或采用市場所售的商品進(jìn)行加工處理后調(diào)配組合而成。本發(fā)明組合套件的6種套盒(或藥盒)的組成比例不是固定不變的，可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)要求調(diào)整各部分的配給量。均應(yīng)新鮮配制，消毒滅菌，分類包裝，按條件妥善保存，在一定的有效期內(nèi)使用。
本發(fā)明的具體使用方法和步驟以文獻(xiàn)所述組織培養(yǎng)技術(shù)(鄂征主編，組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)，北京出版社，1994.12)為指導(dǎo)，采用本發(fā)明進(jìn)行實(shí)體腫瘤MTT法腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)(MTT-TCA)。應(yīng)用每件本發(fā)明可以測定一個(gè)腫瘤標(biāo)本對8種化療藥物(三孔重復(fù))的敏感性和耐藥性，但是要求相關(guān)實(shí)驗(yàn)室需具備以下基本實(shí)驗(yàn)條件、儀器設(shè)備、可多次重復(fù)使用的耐用器具和批量應(yīng)用的各種物品等。
基本條件在手術(shù)室進(jìn)行無菌操作行標(biāo)本取材的條件，在實(shí)驗(yàn)室清潔無菌操作間安裝的超凈工作臺等組織培養(yǎng)設(shè)施和基本條件，計(jì)算機(jī)及相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理軟件等。
儀器設(shè)備多功能離心機(jī)(可離心多種型號的試管和細(xì)胞培養(yǎng)板)，倒置顯微鏡，冰箱(2～8℃)和冰柜(-20℃)，37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，酶標(biāo)儀(分光光度儀)等。
耐用器具手術(shù)刀、眼科組織剪、平鑷、眼科組織彎鑷、玻璃吸管等若干，消毒滅菌后備用。消毒備用的三角燒瓶、磁力攪拌棒及攪拌器。不同型號的可調(diào)移液器，1～200μl和200～1000μl可調(diào)微量加樣器、1～200μl可調(diào)多道微量加樣器和細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。
批量應(yīng)用的物品已消毒的各種型號的注射器、離心管、刻度吸管和加樣器吸頭若干。Hanks液和不含鈣、鎂離子的D-Hanks液各若干。無菌的普通培養(yǎng)基(MEM、DMEM或RPMI1640)若干。無菌的腫瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)基若干，在本實(shí)驗(yàn)中確定為基本檢測培養(yǎng)基(Complete Assay Medium，CAM)，可以抑制非腫瘤細(xì)胞的生長，選擇性地培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞。0.4％胎盤藍(lán)(Trypan-blue)溶液、冰塊等若干。
將本發(fā)明應(yīng)用于實(shí)體腫瘤MTT-TCA的基本實(shí)驗(yàn)步驟和程序如下，其中第1～6步驟需嚴(yán)格地執(zhí)行無菌操作技術(shù)，并注意參考有關(guān)資料正確處理、儲藏或棄置藥物和試劑，避免造成環(huán)境污染1.標(biāo)本取材與保存將在無菌條件下切取的直徑0.5～1.0cm大小的腫瘤標(biāo)本數(shù)塊立即放入培養(yǎng)皿中，用適量洗滌液漂洗，浸泡5～10分鐘后，切成2～3mm的薄片。反復(fù)漂洗2～3次后，再移入已加入保存液的標(biāo)本杯中，將標(biāo)本杯放入大杯中，在標(biāo)本杯周圍加入適量碎冰塊，冰浴低溫保存標(biāo)本并盡快運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。標(biāo)本供立刻實(shí)驗(yàn)用或因故不能及時(shí)用時(shí)，可在4℃冰箱保存數(shù)小時(shí)至24小時(shí)再用。
2.細(xì)胞分離與純化用酶消化法分離腫瘤組織成單細(xì)胞懸液，先把標(biāo)本放置于一個(gè)無菌培養(yǎng)皿中，剝除結(jié)締組織、脂肪和壞死組織，再切成2.0～3.0mm3的碎塊。將1.0克左右(約1.0ml)的腫瘤碎塊加入三角燒瓶中，瓶內(nèi)有攪拌棒，向瓶內(nèi)加入預(yù)先加溫至室溫的0.25％胰蛋白酶30～50ml，置電磁攪拌器臺上，在37℃溫箱中消化30～60分鐘。如需長時(shí)間消化，中間可更換消化液。在400g的速率下離心樣本5～8分鐘，棄置上清液，再用Hanks液10ml漂洗兩遍，而后懸浮于10ml培養(yǎng)基中。再在另一個(gè)無菌培養(yǎng)皿中，經(jīng)過50μm網(wǎng)篩濾過，去除未充分消化的較大的組織碎塊，得單細(xì)胞懸液。
采用Ficoll-Hypaque密度梯度分離法純化腫瘤細(xì)胞懸液，去除死細(xì)胞和紅細(xì)胞。先將5ml室溫的Ficoll-Hypaque溶液(1.077g/ml)加入15ml錐形離心管中。把10ml的細(xì)胞懸濁液加到Ficoll-Hypaque的上層，避免兩層混合。以400g的轉(zhuǎn)速在室溫下離心30分鐘后，把上層的培養(yǎng)基吸出?；罴?xì)胞在培養(yǎng)基和Ficoll-Hypaque兩層之間，將其移至另一個(gè)15ml錐形離心管中。用10ml培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，400g離心5-8分鐘，共洗滌兩次。最后用CAM懸浮細(xì)胞，得腫瘤單細(xì)胞懸液。用胎盤藍(lán)排除法測定細(xì)胞數(shù)和存活率。在通常情況下，細(xì)胞存活率應(yīng)該在80％～95％之間，獲得總細(xì)胞數(shù)在2×106以上可滿足實(shí)驗(yàn)需要。
3.細(xì)胞接種培養(yǎng)一般細(xì)胞數(shù)量在1×104～5×104細(xì)胞/孔的范圍可以得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推薦采用的細(xì)胞數(shù)量范圍為2×104～4×104細(xì)胞/孔，那么接種的細(xì)胞密度應(yīng)為2×105～4×105細(xì)胞/ml，接種量為0.1ml/孔。在節(jié)用型配液池中用CAM調(diào)整細(xì)胞密度，用可調(diào)多道微量加樣器，將細(xì)胞懸液接種到2塊96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板上。如表1所示，設(shè)定每種藥物測定6種濃度，每種藥物則需分6組加藥孔(A～F行)，設(shè)立1組只接種細(xì)胞而不加藥的對照孔(G行)，設(shè)立1組無細(xì)胞空白對照孔(H行)，各3孔重復(fù)?？瞻讓φ战M中(H行)只加入不含細(xì)胞的等量CAM。細(xì)胞接種完畢，在37℃、5％CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時(shí)至一天，使細(xì)胞活性得以恢復(fù)后再加藥。
4.抗癌藥物的配制與添加在細(xì)胞接種時(shí)已向各孔中加入0.1ml CAM細(xì)胞懸液或CAM，加藥時(shí)向各個(gè)試驗(yàn)孔再加入0.1ml含藥物的CAM，將使含藥濃液得到2倍的稀釋，故添加的藥物濃度應(yīng)為檢測濃度的2倍。例如選用半對數(shù)級稀釋法，最高檢測濃度為10倍STDC，則稀釋后的最高藥物濃度應(yīng)為2×10倍STDC。取一只含0.1ml儲備液待測藥瓶，設(shè)其濃度為2×1000倍STDC，則需先配制為最高稀釋濃度3.16倍(2×31.6倍STDC)的藥物原液。即向含有0.1ml儲備液的瓶中加入0.9ml CAM稀釋至2×100倍STDC，再加入2.16ml CAM則進(jìn)一步稀釋成2×31.6倍STDC的藥物原液。
表1 腫瘤藥敏試驗(yàn)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上約物及其濃度(％STDC)設(shè)置 按半對數(shù)級稀釋法稀釋配制抗癌藥物，每種藥物測定6種濃度。對每種藥物的稀釋，需用一塊含6個(gè)小型節(jié)用型稀釋池的多梯度微量藥物稀釋盤。先向每個(gè)池槽中加入2.16ml CAM，取1ml藥物原液(2×31.6倍STDC)加入1號池槽中，充分混勻，此時(shí)濃度為2×10倍(2×103％)STDC。自1號池槽中取1ml加入2號池槽中，充分混勻。自2號池槽中取1ml加入3號池槽中，充分混勻。依次類推，最后自6號池槽中取出1ml棄掉。則1～6號池槽中各含2.16ml CAM藥液，而藥物濃度分別為2×103％、2×102.5％、2×102％、2×101.5％、2×101％和2×100.5％STDC。在細(xì)胞接種當(dāng)日或次日向試驗(yàn)孔加入0.1ml/孔含藥物的CAM，由低濃度向高濃度逐級加藥，每一藥物濃度三孔重復(fù)，不同藥物需更換加樣頭，對照組和空白對照組中只加入不含藥物的等量的CAM(表1)。從A到F行各孔中藥物濃度分別為103％、102.5％、102％、101.5％、101％和100.5％STDC，檢測藥物濃度范圍為2.5個(gè)數(shù)量級。
5.持續(xù)培養(yǎng)與藥物反應(yīng)過程將加藥后的96孔培養(yǎng)板在37℃、5％CO2條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)持續(xù)培養(yǎng)，這是抗癌藥物作用于細(xì)胞的反應(yīng)過程，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求確定加藥后的培養(yǎng)時(shí)間，一般培養(yǎng)3～5天左右。培養(yǎng)過程中注意保持濕度大于95％，以防過度蒸發(fā)影響試驗(yàn)結(jié)果。
6.MTT法終點(diǎn)顯示在帶藥培養(yǎng)3～5天后進(jìn)行終點(diǎn)檢測。在節(jié)用型配液池中配制MTT溶液，取MTT儲備液2.5ml(5mg/ml)，加入22.5ml CAM配制成含500μg/ml的MTT溶液。離心96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，去上清液，避免損失細(xì)胞，向每孔加入MTT溶液0.1ml，含MTT50μg/孔。繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間(4小時(shí))等待MTT的細(xì)胞代謝反應(yīng)，生成藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜。在另一個(gè)節(jié)用型配液池中調(diào)配鹽酸異丙醇，向每孔加入100μl，攪勻，使甲臜充分溶解。在1小時(shí)內(nèi)在570nm波長測定每孔的O.D值，即吸光度(A)。根據(jù)分光光度儀或酶標(biāo)儀的輸出格式打印結(jié)果或輸出到計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，建立數(shù)據(jù)庫。
7.數(shù)據(jù)處理與計(jì)算腫瘤生長抑制率采用三孔樣本吸光度的平均值進(jìn)行計(jì)算。檢測孔(A～G行，包括無藥對照孔)中樣本的實(shí)際吸光度應(yīng)為檢測孔測定的吸光度減去空白對照孔的平均吸光度。根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤生長抑制率(％TGI)％TGI＝[1-(At-Ab)/(Ac-Ab)]×100％，其中At為加藥組的平均吸光度，Ac為對照組的平均吸光度，Ab為空白對照組的平均吸光度。依據(jù)測定的％TGI繪制各種抗癌藥物的藥物劑量-抑制曲線。在藥物劑量-抑制曲線中用插補(bǔ)法求各藥抑制半數(shù)腫瘤生長的藥物濃度(IC50)。
8.評價(jià)結(jié)果推導(dǎo)“抗瘤譜”以藥物劑量-抑制曲線是否呈S形初步判斷試驗(yàn)結(jié)果是否合理。因?yàn)镾TDC的數(shù)值是相對的，判斷腫瘤對化療藥物的敏感性與耐藥性程度的指標(biāo)也是相對的，目前尚沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。對于某一檢測藥物，IC50越高，腫瘤耐藥性越強(qiáng)；IC50越低，腫瘤對該藥物越敏感。有關(guān)研究人員和臨床醫(yī)師可自行設(shè)定藥敏與耐藥程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)，例如表2中列出了將腫瘤藥敏與耐藥程度分為五級的方案，各級IC50的范圍為半個(gè)對數(shù)級(100.5)，此方案可供參考。根據(jù)所求得的每種藥物的IC50值和腫瘤藥敏與耐藥的判斷標(biāo)準(zhǔn)來判斷各種抗癌藥物的敏感性或耐藥性程度，即得所檢測的各種抗癌藥物的“抗瘤譜”，將此試驗(yàn)結(jié)果以實(shí)驗(yàn)報(bào)告形式提供給臨床醫(yī)師即完成本項(xiàng)試驗(yàn)。
表2 腫瘤化療敏感性與耐藥性程度的分級方案藥敏與耐藥 IC50值的范圍程度的分級 下限值 上限值高度敏感＜101％STDC中度敏感 ≥101％STDC ＜101.5％STDC底度敏感 ≥101.5％STDC＜102.0％STDC耐藥 ≥102.0％STDC＜102.5％STDC高度耐藥 ≥102.5％STDC與現(xiàn)有TCA方法試劑盒比較，本發(fā)明在MTT-TCA中的應(yīng)用具有如下優(yōu)點(diǎn)與積極效果本發(fā)明既充分發(fā)揮實(shí)驗(yàn)室所具備的儀器設(shè)備的作用，又按實(shí)驗(yàn)所需提供了經(jīng)過加工、處理的消耗材料和試劑。利用本發(fā)明進(jìn)行的MTT-TCA具有以下特點(diǎn)(1)用抗污染的保存液保存標(biāo)本，提高試驗(yàn)成功率；(2)細(xì)胞分離與純化相結(jié)合，提高腫瘤細(xì)胞純度；(3)應(yīng)用節(jié)用型配液池，使細(xì)胞液和多種液體得到充分利用；(4)先接種細(xì)胞再加藥，利于細(xì)胞活性的恢復(fù)；(5)利用腫瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)基，可以抑制非腫瘤細(xì)胞的生長，減少其對結(jié)果的干擾；(6)測定6種藥物濃度，利于繪制藥物劑量-抑制曲線，準(zhǔn)確求算IC50值；(7)帶藥培養(yǎng)時(shí)間3～5天，短于ATP-TCA方法的7天時(shí)間。另外，使用本發(fā)明操作方便、準(zhǔn)確高效、節(jié)省人力和物力資源，對原材料的加工和二次分裝處理等采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，使結(jié)果誤差小、可比性強(qiáng)。
目前市場上尚未見到與本發(fā)明類似的產(chǎn)品和用途。本發(fā)明的應(yīng)用將會起到推廣應(yīng)用MTT-TCA方法指導(dǎo)臨床腫瘤化療的作用，使廣大腫瘤患者受益。
附圖的圖面說明如下圖1節(jié)用型配液池(A)立體圖；圖2圖1的剖視圖，為圖1中的O-O剖面；圖3圖1的側(cè)視圖； 圖4圖1的正視圖；圖5圖1的俯視圖； 圖6節(jié)用型配液池(A)的實(shí)施例；圖7多梯度微量藥物稀釋盤(G)立體圖；圖8多梯度微量藥物稀釋盤(G)的實(shí)施例。
A.節(jié)用型配液池 B.池槽 C.邊框 D.匯集區(qū) E.過度區(qū) F.擴(kuò)展區(qū)G.多梯度微量藥物稀釋盤 H.編號本發(fā)明的實(shí)施方式如下實(shí)施例本實(shí)施例是由標(biāo)本洗滌與保存套盒、細(xì)胞分離與純化套盒、細(xì)胞接種培養(yǎng)套盒、多種微量抗癌藥物藥盒、多梯度微量藥物稀釋盤套盒和終點(diǎn)檢測試劑藥盒組成的體外腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)用組合套件。以對原發(fā)性肝癌進(jìn)行體外腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)為例，本發(fā)明組合套件的各部分的組成如下(1)標(biāo)本洗滌與保存套盒由100×15(mm)培養(yǎng)皿1個(gè)、標(biāo)本套杯1套、洗滌液100ml和保存液20ml組成；(2)細(xì)胞分離與純化套盒由100×15(mm)培養(yǎng)皿2個(gè)、0.25％胰蛋白酶50ml、50μm尼龍網(wǎng)篩1個(gè)和Ficoll-Hypaque溶液(1.077g/ml)5ml組成；(3)細(xì)胞接種培養(yǎng)套盒由25ml節(jié)用型配液池1個(gè)和96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板2塊組成；(4)多種微量抗癌藥物藥盒由8種抗癌藥物的微量儲備液各0.1ml分裝組成，8種抗癌藥物的STDC/儲備液的濃度分別是阿霉素(ADR 0.50μg/ml，1.00mg/ml)、表阿霉素(EPR 0.50μg/ml，1.00mg/ml)、絲裂霉素(MMC 0.23μg/ml，0.46mg/ml)、5-氟脲嘧啶(5-FU 22.50μg/ml，45.00mg/ml)、順鉑(CDDP 3.80μg/ml，7.60mg/ml)、卡鉑(CBDCA 15.80μg/ml，31.60mg/ml)、長春新堿(VCR 0.40μg/ml，0.80mg/ml)及過氧化環(huán)磷酰胺(4-HC 3.00μg/ml，6.00mg/ml)；(5)多梯度微量藥物稀釋盤套盒由8塊多梯度微量藥物稀釋盤和25ml節(jié)用型配液池1個(gè)組成；(6)終點(diǎn)檢測試劑藥盒由MTT儲備液2.5ml、鹽酸異丙醇溶液25ml和25ml節(jié)用型配液池2個(gè)組成。
權(quán)利要求
1.一種體外腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)用的器材，它是由標(biāo)本洗滌與保存套盒、細(xì)胞分離與純化套盒、細(xì)胞接種培養(yǎng)套盒、多種微量抗癌藥物藥盒、多梯度微量藥物稀釋盤套盒和終點(diǎn)檢測試劑藥盒組成的體外腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)用組合套件。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多梯度微量藥物稀釋盤套盒，其特征是多梯度微量藥物稀釋盤(G)是由多個(gè)相同的節(jié)用型配液池(A)排列成組制成的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的節(jié)用型配液池(A)，其特征是每個(gè)節(jié)用型配液池(A)由池槽(B)和邊框(C)構(gòu)成，池槽(B)是由匯集區(qū)(D)、過度區(qū)(E)和擴(kuò)展區(qū)(F)組成的。
全文摘要
本發(fā)明體外腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)用組合套件，是由標(biāo)本洗滌與保存套盒、細(xì)胞分離與純化套盒、細(xì)胞接種培養(yǎng)套盒、多種微量抗癌藥物藥盒、多梯度微量藥物稀釋盤套盒和終點(diǎn)檢測試劑藥盒組成。本發(fā)明按照噻唑藍(lán)比色法腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)流程，對消耗性材料和試劑進(jìn)行設(shè)計(jì)加工、處理，組合配套供給。采用本發(fā)明使實(shí)驗(yàn)操作方便、準(zhǔn)確高效，使腫瘤化療藥物敏感性試驗(yàn)指導(dǎo)臨床腫瘤化療易于推廣，使廣大腫瘤患者受益。
文檔編號C12Q1/02GK1407111SQ0113270
公開日2003年4月2日 申請日期2001年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月5日
發(fā)明者王悅?cè)A, 蔡亞寧 申請人:蔡亞寧, 王悅?cè)A