專利名稱：一種細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿和其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)細(xì)胞增殖調(diào)控的裝置，具體說涉及一種細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及細(xì)胞接觸抑制觀察皿和其應(yīng)用。
接觸抑制是正常細(xì)胞所具有的特性，它是指正常貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞在一定的培養(yǎng)環(huán)境中，貼附于培養(yǎng)容器表面進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到匯合狀態(tài)及一定的密度后，細(xì)胞出現(xiàn)的生長(zhǎng)增殖停止的狀態(tài)。
惡性腫瘤細(xì)胞是一種不受正常的細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制約束的無限制生長(zhǎng)細(xì)胞。體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞生長(zhǎng)的最重要區(qū)別性特征之一就是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)接觸抑制的喪失。此方面的研究，對(duì)于認(rèn)識(shí)正常細(xì)胞的癌變過程，即癌癥的發(fā)生機(jī)理，進(jìn)而深入研究探索治療癌癥的方法具有十分重要的意義。而應(yīng)用本發(fā)明所涉及的細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及細(xì)胞培養(yǎng)觀察皿進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞培養(yǎng)觀察皿對(duì)正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞均產(chǎn)生一種被本發(fā)明申請(qǐng)人命名的細(xì)胞外基質(zhì)“銳利邊緣抑制效應(yīng)”。所謂“銳利邊緣抑制效應(yīng)”，是指貼壁生長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞在沿其貼附生長(zhǎng)的容器平面爬行生長(zhǎng)時(shí)，若遇到該平面上的銳利陡起或凹陷，則細(xì)胞的前行即會(huì)停止，而不會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞繼續(xù)沿銳利陡起爬行生長(zhǎng)或跨過凹陷的銳利邊緣沿凹陷壁的爬行生長(zhǎng)。此時(shí)如果細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到匯合狀態(tài)及一定的密度，正常細(xì)胞即會(huì)出現(xiàn)增殖生長(zhǎng)抑制，而腫瘤細(xì)胞由于其增殖調(diào)控機(jī)制發(fā)生了改變，呈現(xiàn)復(fù)層堆積性生長(zhǎng)，故可出現(xiàn)復(fù)層上方的細(xì)胞繼續(xù)沿銳利陡起爬行生長(zhǎng)或跨過凹陷的銳利邊緣沿凹陷壁的爬行生長(zhǎng)，表現(xiàn)為接觸抑制與“銳利邊緣抑制效應(yīng)”的喪失?！颁J利邊緣抑制效應(yīng)”的發(fā)現(xiàn)對(duì)于揭示細(xì)胞的接觸抑制具有重要意義。
目前多數(shù)理論認(rèn)為，與細(xì)胞增殖有關(guān)的癌基因、抑癌基因的改變或被認(rèn)為屬于細(xì)胞間重要連接結(jié)構(gòu)且可行使細(xì)胞間通信功能的縫隙連接(Gap junction)獨(dú)自的功能異常，均可導(dǎo)致細(xì)胞的異常生長(zhǎng)，如接觸抑制的喪失。據(jù)認(rèn)為，縫隙連接是細(xì)胞傳遞生長(zhǎng)調(diào)控信號(hào)的重要結(jié)構(gòu)，細(xì)胞縫隙連接可以通過將生長(zhǎng)抑制信息從生長(zhǎng)靜止的細(xì)胞傳遞到生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞，并在達(dá)到一定閾值時(shí)，使后者停止生長(zhǎng)。而出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)接觸抑制的喪失，主要是縫隙連接功能的異常，致使通過縫隙連接的信號(hào)物質(zhì)傳遞發(fā)生障礙，從而引起細(xì)胞生長(zhǎng)的異常；其檢測(cè)方法目前主要是通過傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)細(xì)胞H3-胸腺嘧啶脫氧核苷(H3-Thymidine)標(biāo)記法，即檢測(cè)細(xì)胞增殖狀態(tài)的方法。其原理為，經(jīng)常規(guī)方式處理的細(xì)胞，生長(zhǎng)達(dá)到匯合狀態(tài)的一定密度時(shí)，用H3-胸腺嘧啶脫氧核苷(H3-Thymidine)標(biāo)記，再經(jīng)放射自顯影檢測(cè)若細(xì)胞有增殖生長(zhǎng)，則H3-胸腺嘧啶脫氧核苷(H3-Thymidine)被摻入到細(xì)胞內(nèi)的DNA中而產(chǎn)生標(biāo)記；反之，則H3-胸腺嘧啶脫氧核苷(H3-Thymidine)不能摻入到細(xì)胞內(nèi)的DNA中進(jìn)行標(biāo)記。因此，依據(jù)標(biāo)記指數(shù)可判定細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)檢測(cè)細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)化時(shí)多采用軟瓊脂培養(yǎng)法，即將細(xì)胞接種于夾層的軟瓊脂中，觀察其能否形成克隆，能形成克隆的則為轉(zhuǎn)化細(xì)胞或腫瘤形成細(xì)胞。上述方法為檢測(cè)細(xì)胞增殖狀態(tài)的方法，均非直接研究細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)理的方法；而利用檢測(cè)裝置，尤其是利用專一的器皿對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的接觸抑制進(jìn)行研究，至今還未見報(bào)道。
本發(fā)明的目的是由如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿，由培養(yǎng)皿體、細(xì)胞培養(yǎng)觀察板、鋼夾、灌注頭、灌注頭固定盤、皿蓋組成，置于皿體底盤中央的細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上有一凹穴，觀察板通過固定鋼夾壓緊在皿體底盤上；凹穴部位垂直立有圓錐型中空灌注頭，灌注頭上端套有固定盤，固定盤通過鋼夾固定于皿體中部。
所述細(xì)胞培養(yǎng)觀察板的形狀是三角形、圓形、正方形、菱形等任意幾何形狀之一。
所述細(xì)胞培養(yǎng)觀察板的材料是聚苯乙烯。
所述細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上的凹穴形狀為任何幾何形狀之一。
所述凹穴形狀為圓型，且直徑為0.2～0.7mm，穴深30～100μm。
所述細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上的凹穴底面與其壁的夾角為45～100度。
所述凹穴的位置決定灌注頭垂直立于凹穴中心或凹穴旁。
所述灌注頭固定盤的外形是瓣?duì)睢?br> 灌注頭固定盤圍繞灌注頭上口開有調(diào)整孔。
灌注頭固定盤上開有3個(gè)圓型調(diào)整孔。
應(yīng)用細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿作為細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”與接觸抑制檢測(cè)裝置的方法，該方法包括下列步驟(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，制單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106～1×1013個(gè)/ml，備用；(2)取上述單細(xì)胞懸液，利用灌注頭在距凹穴1～2mm的細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上(觀察“銳利邊緣抑制效應(yīng)”)或細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上的凹穴內(nèi)(觀察接觸抑制)種入細(xì)胞懸液，懸液量5～30μl；(3)取上述細(xì)胞的培養(yǎng)液，避開灌注頭部位，由灌注頭固定盤上的調(diào)整孔，加入到細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿中，培養(yǎng)液的量以皿體容量的一半為宜；(4)將上述觀察皿在5％CO2、37℃、100％相對(duì)濕度的條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；(5)從培養(yǎng)箱中取出上述觀察皿，在無菌條件下，卸掉灌注頭固定盤的鋼夾，取出灌注頭及其固定盤；(6)重新封好觀察皿，放回到原培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)6～16小時(shí)后，通過觀察凹穴口邊緣的細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上的細(xì)胞生長(zhǎng)或凹穴內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)，來檢測(cè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的“銳利邊緣抑制效應(yīng)”或接觸抑制結(jié)果；(7)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞出現(xiàn)“銳利邊緣抑制效應(yīng)”或接觸抑制后，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)2～5個(gè)細(xì)胞周期，并應(yīng)對(duì)凹穴口邊緣板面上的或凹穴中的細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞形態(tài)、位置進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，以確定“銳利邊緣抑制效應(yīng)”與接觸抑制結(jié)果的真實(shí)性，而對(duì)經(jīng)繼續(xù)培養(yǎng)后，細(xì)胞在生長(zhǎng)匯合后又呈現(xiàn)堆積生長(zhǎng)，且出現(xiàn)細(xì)胞跨越凹穴壁生長(zhǎng)的現(xiàn)象，則為非接觸抑制。
采用本發(fā)明的細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿和其應(yīng)用方法可直接觀察細(xì)胞增殖調(diào)控的過程，具有較傳統(tǒng)的軟瓊脂克隆和同位素標(biāo)記方法更方便、客觀且無放射性污染的優(yōu)越性。該裝置及方法的建立，改變了傳統(tǒng)的接觸抑制理論，證明了細(xì)胞生長(zhǎng)接觸抑制的產(chǎn)生與細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的幾何空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，任何影響細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間應(yīng)力消除的因素(包括異常的縫隙連接)均可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)接觸抑制的喪失。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于自然界的動(dòng)物細(xì)胞增殖調(diào)控具有廣泛的生物學(xué)意義，并且對(duì)于進(jìn)一步深入研究細(xì)胞增殖調(diào)控的機(jī)理，揭示生命現(xiàn)象和癌變誘因具有十分重要的理論與實(shí)際意義。
利用上述檢測(cè)裝置及應(yīng)用方法進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明在不具有縫隙連接的條件下，或不存在信號(hào)物質(zhì)通過縫隙連接在細(xì)胞間傳遞的情況下，培養(yǎng)的正常細(xì)胞依然會(huì)出現(xiàn)接觸抑制。并且，利用本發(fā)明的觀察皿除觀察到細(xì)胞的接觸抑制外，還可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，自如控制加入觀察皿的細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)行顯微鏡下細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)、位置的即時(shí)跟蹤觀察，為深入直觀地進(jìn)行細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)理的研究提供了一種有效的手段。該技術(shù)用傳統(tǒng)方法是無法實(shí)現(xiàn)的，這也是本發(fā)明的創(chuàng)新特點(diǎn)之一。
對(duì)于貼壁細(xì)胞(包括正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞)，利用上述檢測(cè)裝置及應(yīng)用方法進(jìn)行培養(yǎng)，在未達(dá)到匯合狀態(tài)密度時(shí)，細(xì)胞可呈現(xiàn)沿細(xì)胞培養(yǎng)觀察板表面或凹穴表面的遷移運(yùn)動(dòng)，但當(dāng)細(xì)胞遷移至凹穴壁并與壁緊密接觸時(shí)，細(xì)胞原朝向凹穴壁方向的運(yùn)動(dòng)即行停止，即使是腫瘤細(xì)胞也不出現(xiàn)越過凹穴壁邊界的現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性接觸抑制。但是出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性接觸抑制的細(xì)胞，仍可向凹穴壁以外的其他方向移動(dòng)。除非是建系的腫瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞，當(dāng)其生長(zhǎng)達(dá)到單層匯合狀態(tài)密度并與凹穴壁緊密接觸以后，在不改變培養(yǎng)條件的情況下，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)繼續(xù)增殖，并呈堆積性生長(zhǎng)狀態(tài)；增殖的細(xì)胞能越過凹穴壁，并貼附于凹穴外的表面上向外周擴(kuò)散性生長(zhǎng)，表現(xiàn)為接觸抑制的喪失。
利用本發(fā)明的細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿和其應(yīng)用方法，將貼壁細(xì)胞(包括正常、腫瘤及轉(zhuǎn)化細(xì)胞)接種于距凹穴外1～2mm處的細(xì)胞培養(yǎng)觀察板平面上，待細(xì)胞遷移生長(zhǎng)至凹穴邊緣時(shí)，正常細(xì)胞朝向凹穴邊緣的運(yùn)動(dòng)即會(huì)停止，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到匯合密度時(shí)，出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞生長(zhǎng)的“銳利邊緣抑制效應(yīng)”。腫瘤及轉(zhuǎn)化細(xì)胞遷移生長(zhǎng)至凹穴邊緣時(shí)，細(xì)胞朝向凹穴邊緣的運(yùn)動(dòng)亦會(huì)出現(xiàn)停止，但隨著細(xì)胞的進(jìn)一步增殖，細(xì)胞呈堆積性生長(zhǎng)狀態(tài)，并且細(xì)胞會(huì)越過凹穴邊緣向凹穴內(nèi)生長(zhǎng)，同樣表現(xiàn)出“銳利邊緣抑制效應(yīng)”的喪失。
應(yīng)用細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿作為細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”與接觸抑制檢則裝置的方法包括以下步驟取貼壁生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，如人胚肺成纖維細(xì)胞，BEL-7402肝癌細(xì)胞、SGC胃癌細(xì)胞之一，常規(guī)胰酶消化成單細(xì)胞懸液；調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1012個(gè)/ml，取10μl細(xì)胞懸液，利用灌注頭7接種于細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上的凹穴2內(nèi)；避開灌注頭部位，由灌注頭固定盤上的調(diào)整孔8向觀察皿3中加入細(xì)胞培養(yǎng)液，其量以皿體容量的一半為宜；將上述細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿3在5％CO2、37℃、100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁；從培養(yǎng)箱中取出上述觀察皿，在無菌條件下，卸掉灌注頭固定盤的固定鋼夾，取出灌注頭7及其固定盤6；重新封好觀察皿，放回到原培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)后，通過觀察凹穴內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)，來檢測(cè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的接觸抑制結(jié)果；實(shí)驗(yàn)細(xì)胞出現(xiàn)接觸抑制后，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)3個(gè)細(xì)胞周期，并應(yīng)對(duì)凹穴中的細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞形態(tài)、位置進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，以確定細(xì)胞接觸抑制結(jié)果的真實(shí)性，而對(duì)經(jīng)繼續(xù)培養(yǎng)后，細(xì)胞在生長(zhǎng)匯合后又呈現(xiàn)堆積生長(zhǎng)，且出現(xiàn)細(xì)胞跨越凹穴壁生長(zhǎng)的現(xiàn)象，則為非接觸抑制。
實(shí)施例2

圖1所示細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿3底面是由35mm培養(yǎng)皿、位于中央的聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)觀察板1和其固定鋼夾4組成；在三角形觀察板1的上面有一用鏡面拋光的直徑為0.5mm不銹鋼圓柱體烙燙成的凹穴2，凹穴底面與其邊緣壁的夾角成90度，凹穴深70μm，且觀察板通過固定鋼夾4壓緊在皿體底盤上；凹穴2旁垂直立有圓錐型中空灌注頭7，灌注頭上端套有圓型瓣?duì)罟潭ūP6，固定盤通過圓型鋼夾固定于皿體中部；圖3所示瓣?duì)畹墓嘧㈩^固定盤上開有3個(gè)圓型調(diào)整孔8，用于調(diào)整固定盤位置和加注細(xì)胞培養(yǎng)液。
應(yīng)用細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿作為細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”與接觸抑制檢則裝置的方法包括以下步驟取貼壁生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，如人胚肺成纖維細(xì)胞，BEL-7402肝癌細(xì)胞、SGC胃癌細(xì)胞之一，常規(guī)胰酶消化成單細(xì)胞懸液；調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，取20μl細(xì)胞懸液，利用灌注頭7接種于距凹穴2mm的細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上；避開灌注頭部位，由灌注頭固定盤上的調(diào)整孔8向觀察皿3中加入細(xì)胞培養(yǎng)液，其量以皿體容量的一半為宜；將上述細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿3在5％CO2、37℃、100％相對(duì)濕度的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁；從培養(yǎng)箱中取出上述觀察皿，在無菌條件下，卸掉灌注頭固定盤的固定鋼夾，取出灌注頭7及其固定盤6；重新封好觀察皿，放回到原培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)15小時(shí)后，通過觀察細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上的細(xì)胞生長(zhǎng)，來檢測(cè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的“銳利邊緣抑制效應(yīng)”結(jié)果；實(shí)驗(yàn)細(xì)胞出現(xiàn)“銳利邊緣抑制效應(yīng)”后，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)5個(gè)細(xì)胞周期，并應(yīng)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上的細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞形態(tài)、位置進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，以確定“銳利邊緣抑制效應(yīng)”結(jié)果的真實(shí)性，而對(duì)經(jīng)繼續(xù)培養(yǎng)后，細(xì)胞在生長(zhǎng)匯合后又呈現(xiàn)堆積生長(zhǎng)，且出現(xiàn)細(xì)胞跨越凹穴壁生長(zhǎng)的現(xiàn)象，則為“銳利邊緣抑制效應(yīng)”喪失。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿，由培養(yǎng)皿體、細(xì)胞培養(yǎng)觀察板、鋼夾、灌注頭、灌注頭固定盤、皿蓋組成，置于皿體底盤中央的細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上有一凹穴，觀察板通過固定鋼夾壓緊在皿體底盤上；凹穴部位垂直立有圓錐型中空灌注頭，灌注頭上端套有固定盤，固定盤通過鋼夾固定于皿體中部。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)觀察板的形狀是三角形、圓形、正方形、菱形等任意幾何形狀之一。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)觀察板的材料是聚苯乙烯。
4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上的凹穴形狀為任何幾何形狀之一。
5.如權(quán)利要求4所述的細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿，其特征在于所述凹穴形狀為圓型，且直徑為0.2～0.7mm，穴深30～100μm。
6.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上的凹穴底面與其壁的夾角為45～100度。
7.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿，其特征在于所述凹穴的位置可決定灌注頭垂直立于凹穴中心或凹穴旁。
8.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿，其特征在于所述灌注頭固定盤的外形是瓣?duì)睢?br> 9.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿，其特征在于灌注頭固定盤圍繞灌注頭上口開有調(diào)整孔。
10.如權(quán)利要求9所述的細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿，其特征在于灌注頭固定盤上開有3個(gè)圓型調(diào)整孔。
11.應(yīng)用細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿作為細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”與接觸抑制檢測(cè)裝置的方法，該方法包括下列步驟(1)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，制單細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106～1×1013個(gè)/ml，備用；(2)上述單細(xì)胞懸液，利用灌注頭在距凹穴1～2mm的細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上或在細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上的凹穴內(nèi)種入細(xì)胞懸液，懸液量5～30μl；(3)取上述細(xì)胞的培養(yǎng)液，避開灌注頭部位，由灌注頭固定盤上的調(diào)整孔，加入到細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿中，培養(yǎng)液的量以皿體容量的一半為宜；(4)將上述觀察皿在5％CO2、37℃、100％相對(duì)濕度的條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；(5)從培養(yǎng)箱中取出上述觀察皿，在無菌條件下，卸掉灌注頭固定盤的鋼夾，取出灌注頭及其固定盤；(6)重新封好觀察皿，放回到原培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)6～16小時(shí)后，通過觀察凹穴口邊緣的細(xì)胞培養(yǎng)觀察板上的細(xì)胞生長(zhǎng)或凹穴內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)，來檢測(cè)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的“銳利邊緣抑制效應(yīng)”或接觸抑制結(jié)果；(7)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞出現(xiàn)“銳利邊緣抑制效應(yīng)”或接觸抑制后，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)2～5個(gè)細(xì)胞周期，并應(yīng)對(duì)凹穴口邊緣板面上的或凹穴中的細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞形態(tài)、位置進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，以確定“銳利邊緣抑制效應(yīng)”與接觸抑制結(jié)果的真實(shí)性，而對(duì)經(jīng)繼續(xù)培養(yǎng)后，細(xì)胞在生長(zhǎng)匯合后又呈現(xiàn)堆積生長(zhǎng)，且出現(xiàn)細(xì)胞跨越凹穴壁生長(zhǎng)的現(xiàn)象，則為接觸抑制喪失。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”及接觸抑制觀察皿和及其應(yīng)用方法。該觀察皿由培養(yǎng)皿和置于皿體底盤中央帶有凹穴的細(xì)胞培養(yǎng)觀察板,垂直立于凹穴部位的灌注頭,以及灌注頭固定盤和固定鋼夾組成。應(yīng)用該裝置可準(zhǔn)確、直觀地進(jìn)行細(xì)胞“銳利邊緣抑制效應(yīng)”的觀察和細(xì)胞接觸抑制的檢測(cè)。該裝置結(jié)構(gòu)獨(dú)特,能利用顯微鏡對(duì)細(xì)胞的數(shù)量,形態(tài)、位置進(jìn)行即時(shí)跟蹤觀察。
文檔編號(hào)C12M3/00GK1354257SQ0113520
公開日2002年6月19日 申請(qǐng)日期2001年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月30日
發(fā)明者國(guó)前, 于金明, 廖湘魯, 李敏, 王興武, 魏玲, 鄭燕 申請(qǐng)人:國(guó)前