專利名稱：L－脯氨酸3位羥基化酶的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是涉及工業(yè)上有利地制造作為醫(yī)藥品合成原料或食品添加劑的有用的順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法以及用于該方法上的有用的新的L-脯氨酸3位羥基化酶。
作為以往的順式-3-羥基-L-脯氨酸的制造方法，化學(xué)合成方法是已經(jīng)公知的〔Journal of the American Chemical Society(J.Amer.Chem.Soc.)、84 3980(1962)、同書的85、2824(1963)、Nature、289、310(1981)、Journal of Organic Chemistry(J.Org.Chem.)、54、1866(1989)、Acta Chemica Scandinavica、43、290(1989)〕。
但是，在將L-脯氨酸直接在不同位置及立體選擇地羥基化后，制造順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法中，同時(shí)利用合成化學(xué)方法及生物機(jī)能的方法，目前尚沒有報(bào)導(dǎo)。
以往的用化學(xué)合成法制造順式-3-羥基-L-脯氨酸的制造方法，由于(1)原料昂貴、(2)反應(yīng)工序長(zhǎng)、(3)分離精制工序復(fù)雜、(4)生產(chǎn)效率低等的缺點(diǎn)，所以作為工業(yè)上的制造方法未必是滿意的方法，因而，目前尋求一種工業(yè)上有利的順式-3-羥基-L-脯氨酸的制造方法。
本發(fā)明的目的在于，提供一個(gè)利用發(fā)酵法從廉價(jià)的糖源在工業(yè)上廉價(jià)生產(chǎn)出的L-脯氨酸為原料，通過直接用微生物或酶進(jìn)行羥基化處理后，以工業(yè)規(guī)模且方便地制造順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法及用于該方法的L-脯氨酸3位羥基化酶。
按照本發(fā)明的方法，可以提供順式-3-羥基-L-脯氨酸的制造法及新的L-脯氨酸3位羥基化酶，其特征是將可在L-脯氨酸的3位上催化羥基化反應(yīng)的酶源、二價(jià)鐵離子、2-酮戊二酸及L-脯氨酸存在于水溶性介質(zhì)中，使得L-脯氨酸轉(zhuǎn)化成順式-3-羥基-L-脯氨酸，而后從該培養(yǎng)物中或該水溶性介質(zhì)中提取生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
用于本發(fā)明的順式-3-羥基-L-脯氨酸制造法中的酶源，只要是在羥基化L-脯氨酸時(shí)，具有催化生成順式-3-羥基-L-脯氨酸的活性就可以，例如，微生物的培養(yǎng)物、菌體、菌體處理物、精制酶或粗酶中的任何一種均可。作為微生物的合適例子可舉出鏈霉菌(Streptomyces)屬、或者芽胞桿菌(Bacillus)屬的微生物。具體的可舉出灰色鏈霉菌(Streptomyces canus)ATCC 12647及ATCC 12646、鏈霉菌屬菌(Streptomyces sp.)TH1、芽胞桿菌屬菌(Bacillus sp.)TH2及TH3，或者這些菌株的繼代培養(yǎng)物、突變體或者衍生物等。
鏈霉菌屬菌(Streptomyces sp.)TH1是本發(fā)明者們從土壤中重新分離出的微生物。以下表示了鏈霉菌屬菌(Streptomyces sp.)TH1的菌學(xué)性質(zhì)。1.形態(tài)的性質(zhì)表示在表1中。
表1形態(tài)的性質(zhì)
2.培養(yǎng)的性質(zhì)
TH1株在一般使用的合成及天然培養(yǎng)基中顯示了普通的或旺盛的繁殖，基生菌絲呈淺桃色、橙色或綠褐色。根據(jù)不同培養(yǎng)基也可能產(chǎn)生茶色或者黑色的可溶性色素。
在各種培養(yǎng)基上，在28℃下進(jìn)行14天培養(yǎng)時(shí)的特征表示在表2-(1)及表2-(2)中。此外，顏色的表示是按照顏色協(xié)調(diào)手冊(cè)(Color Harmony Manual(Container Corporation of America))的顏色分類而進(jìn)行的。
表2-(1)培養(yǎng)上的性質(zhì)
表2-(2)培養(yǎng)上的性質(zhì)
3.生理學(xué)方面的性質(zhì)TH1株的生理學(xué)的性質(zhì)表示在表3中。繁殖溫度范圍是7天后的結(jié)果，其它是在28℃、2～3周后的結(jié)果。
表3生理學(xué)的性質(zhì)
4.化學(xué)分類學(xué)方面的性質(zhì)菌體中的二氨基庚二酸的旋光異構(gòu)體LL型以上，按形態(tài)是在氣菌絲上形成了螺旋狀的由10個(gè)以上胞子構(gòu)成的胞子鏈。按化學(xué)分類，細(xì)胞壁是I型(LL-二氨基庚二酸)，所以本菌株被分類為放線菌中的鏈霉菌屬。
將本菌株命名為鏈霉菌屬菌(Streptomyces sp.)TH1，按照布達(dá)佩斯條約，平成5年9月1日寄存在工業(yè)技術(shù)院生物工程技術(shù)研究所，寄存號(hào)為FERM BP-4399。
芽胞桿菌屬菌(Bacillus sp.)TH2及TH3是本發(fā)明者從土壤中分離出的微生物。以下表示兩菌株的菌學(xué)性質(zhì)。
細(xì)胞的大小，TH2是1.5～1.8×3～4μm、TH3是1.2～1.5×3.5～4μm，DNA的堿基組成(G+C mol％)，TH2是36.46％、TH3是37.74％。此外，2株菌均具有以下的性質(zhì)。
1.形態(tài)的性質(zhì)TH2及TH3的形態(tài)的性質(zhì)示于表4。
表4形態(tài)性質(zhì)
2.培養(yǎng)方面的性質(zhì)在各種培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)14天后的繁殖及顏色特征表示在表5中。此外，顏色的表示是按照(Color Harmony Manual(Container Corporation of America))顏色分類進(jìn)行的。
表5培養(yǎng)方面的性質(zhì)
3.生理學(xué)性質(zhì)TH2及TH3的生理學(xué)性質(zhì)示于表6-(1)及表6-(2)中。
表6-(1)生理學(xué)性質(zhì)
(W弱)
表6-(2)酸及氣體的生成
+生成，-不生成
4.其它各種性質(zhì)表示在表7中，化學(xué)分類學(xué)性質(zhì)表示在表8中。
表7其它的各種性質(zhì)
+有，-無表8化學(xué)分類的性質(zhì)
將具有以上菌學(xué)性質(zhì)的菌與Bergey’s手冊(cè)(Bergey’s Manualof Systematic Bacteriology，Vol.2，1986年)上記載的相對(duì)應(yīng)。
從以上結(jié)果可以鑒定2個(gè)菌株均屬于芽胞桿菌(Bacillus)屬的細(xì)菌，分別命名為芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)TH2、芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)TH3，并根據(jù)布達(dá)佩斯條約平成5年9月1日寄存在工業(yè)技術(shù)院生物工程技術(shù)研究所，寄存號(hào)分別為FERM BP-4397及FERM BP-4398。
培養(yǎng)這些微生物的培養(yǎng)基，只要是含有可使微生物同化的碳源、氮源、無機(jī)鹽類等，并能高效地培養(yǎng)具有以下催化活性的微生物的培養(yǎng)基，即具有使L-脯氨酸羥基化后，生成順式-3-羥基-L-脯氨酸反應(yīng)的催化活性的話，無論是天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基都可以。
作為碳源，只要是可使各種微生物同化的話都可以，例如可使用葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有這些組分的糖蜜、淀粉或淀粉加水分解物等的碳水化合物、醋酸、丙酸等有機(jī)酸、乙醇、丙醇等的醇類。
作為氮源可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等的各種無機(jī)酸和有機(jī)酸的銨鹽、其它含氮化合物以及胨、肉浸汁、酵母浸汁、玉米淀粉汁(コ-ンスチ-プカ-)、酪蛋白加水分解物、大豆渣子及大豆渣加水分解物、各種發(fā)酵菌體及其消化物等。
作為無機(jī)物可使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養(yǎng)可在振蕩培養(yǎng)或者深部通氣攪拌培養(yǎng)等的需氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)的溫度是15-37℃，培養(yǎng)時(shí)間通常是16-96小時(shí)。
培養(yǎng)中的pH保持在5.0-9.0。pH的調(diào)節(jié)，可用無機(jī)或者有機(jī)的酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等進(jìn)行調(diào)節(jié)。
作為菌體處理物可舉出菌體的干燥物、冷凍干燥物、表面活性劑和/或有機(jī)溶劑處理物、酶處理物、超聲波處理物、機(jī)械磨碎處理物、溶劑處理物、菌體的蛋白餾分、菌體及菌體處理物的固定化物等。另外也可以使用由該菌體萃取出的具有羥基化酶活性的酶，這些酶的精制標(biāo)樣、固定化物等。
另外，也可以使用從該菌體萃取得到的具有催化從L-脯氨酸向順式-3-羥基-L-脯氨酸的羥基化反應(yīng)活性的酶，這些酶的精制標(biāo)樣、固定物等。作為具有該活性的酶源可以舉出顯示下述(1)-(11)的理化性質(zhì)的L-脯氨酸3位羥基化酶。
該酶是具有(1)-(11)理化性質(zhì)的新的L-脯氨酸3位羥基化酶。
(1)作用及基質(zhì)特異性在2-酮戊二酸及二價(jià)鐵離子的存在下，與游離的L-脯氨酸作用后可生成順式-3-羥基-L-脯氨酸。
(2)最佳pH在30℃下，進(jìn)行20分鐘反應(yīng)，具有pH6.5-7.5的最佳pH。
(3)pH的穩(wěn)定性在4℃，進(jìn)行23小時(shí)處理，在pH6.5-8.0的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。
(4)最佳溫度在pH7.0，反應(yīng)15分鐘，具有35-40℃的最佳溫度。
(5)溫度的穩(wěn)定性在pH7.5、50℃下，處理30分鐘后，失活。
(6)阻礙劑用Zn++、Cu++、Co++及Ba++的金屬離子及乙二胺四乙酸(EDTA)進(jìn)行阻礙。
(7)活化活化時(shí)，不需要輔酶，向反應(yīng)液中添加L-抗壞血酸可以促進(jìn)反應(yīng)。
(8)Km值在100mM的N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)緩沖液(pH7.0)中含有5mM L-抗壞血酸、1mM硫酸亞鐵及酶標(biāo)準(zhǔn)樣品的反應(yīng)液中測(cè)得的，對(duì)于L-脯氨酸的Km值是0.49mM，對(duì)于2-酮戊二酸的Km值是0.11mM。
(9)等電點(diǎn)用Phast系統(tǒng)(Phast system；弗爾瑪西亞公司制)測(cè)定的等電點(diǎn)是4.3。
(10)分子量用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳法測(cè)定時(shí)，是35,000±5,000。
(11)N末端氨基酸序列具有用序列號(hào)1表示的N末端氨基酸序列。
(N末端)1 MetCysSerHisIIeLeuGlyArgIIeGlu11 LeuAspGlnGluArgLeuGlyArgAspLeu21 GluTyrLeuAlaThrValProThrVal這些酶源在反應(yīng)液中的酶活性量是根據(jù)使用的基質(zhì)量等確定的，一般是10-10,000,000U/l、優(yōu)選的是1,000-2,000,000U/l。使用微生物的菌體及菌體處理物時(shí)，其濃度，通常以濕菌體計(jì)為1-300g/l。
用于反應(yīng)的L-脯氨酸的濃度是1mM-2M。
反應(yīng)時(shí)，需要二價(jià)鐵離子，通常使用1-100mM。作為使用的二價(jià)鐵離子，只要所含的二價(jià)鐵不阻礙反應(yīng)，使用任何種類的都可以。例如可舉出硫酸亞鐵等的硫化物、氯化亞鐵等的氯化物，碳酸亞鐵等之外，檸檬酸鹽、乳酸鹽、富馬酸鹽等之類的有機(jī)酸鹽。
另外，在反應(yīng)中需要2-酮戊二酸，可以向反應(yīng)液中添加酮戊二酸或也可以使用通過所用菌體及菌體處理物具有的代謝活性可轉(zhuǎn)換成2-酮戊二酸的化合物。這樣的化合物可舉出葡萄糖類的糖質(zhì)、谷氨酸、琥珀酸等。這些化合物可單獨(dú)使用，也可數(shù)種并用。
作為水溶性介質(zhì)，可舉出水、磷酸鹽、碳酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、三羥甲基氨基甲烷等緩沖液(TRIS)、甲醇、乙醇等的醇類、醋酸乙酯等的酯類、丙酮等的酮類、乙酰胺等的酰胺類等。
反應(yīng)可在具有使L-脯氨酸羥基化后，可以生成順式-3-羥基-L-脯氨酸反應(yīng)的催化活性的上述微生物的培養(yǎng)物中進(jìn)行，也可以使用從該培養(yǎng)物分離出的菌體或者該菌體的處理物或者用精制酶和粗酶，在水介質(zhì)中進(jìn)行。
反應(yīng)通常是在溫度15-50℃、pH6.0-9.0條件下，進(jìn)行1-96小時(shí)。
必要時(shí)，在菌體處理或反應(yīng)時(shí)，添加表面活性劑和有機(jī)溶劑。
作為表面活性劑可舉出聚氧化乙烯·硬脂酰胺(如萘明(ナイシ-ン)S-215、日本油脂社制等)、十六烷基三甲基銨·溴化物、陽離子FB、陽離子F2-40E等的陽離子表面活性劑、油酰胺硫酸鈉、NureXTAB、臘披索爾(ラビゾ-ル)80等的陽離子表面活性劑、聚氧化乙烯山梨糖醇酐·單硬脂酸酯(如，非離子ST 221)等兩性表面活性劑、其它叔胺PB、六癸基二甲胺等，只要是促進(jìn)反應(yīng)任何的都可以使用。使用的濃度通常為0.1-50mg/ml，優(yōu)選1-20mg/ml的濃度。
作為有機(jī)溶劑可以使用甲苯、二甲苯、脂肪醇、苯、醋酸乙酯等。使用的濃度通常是0.1-50μl/ml，優(yōu)選1-20μl/ml。
作為從培養(yǎng)物中或水溶性介質(zhì)中回收順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法，可以使用離子交換樹脂等的柱色譜或結(jié)晶法等的通常分離方法。被回收的順式-3-羥基-L-脯氨酸可用13C-NMR譜、1H-NMR譜、質(zhì)譜、比旋光度等通常的分析手段確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。
以下，說明本發(fā)明的順式-3-羥基-L-脯氨酸的制取方法。
這種酶的制取方法是首先培養(yǎng)具有生產(chǎn)L-脯氨酸3位羥基化酶能力的微生物，在培養(yǎng)物中生成積蓄了L-脯氨酸3位羥基化酶，從該培養(yǎng)物中提取L-脯氨酸3位羥基化酶而得到。
只要是具有生產(chǎn)L-脯氨酸3位羥基化酶的微生物，無論是野生株、或其繼代培養(yǎng)物、突變體、誘變體等任何一種微生物都可以使用。適宜的例子有屬于鏈霉菌(Streptomyces)屬或芽胞桿菌(Bacillus)屬，而且具有生產(chǎn)L-脯氨酸3位羥基化酶能力的微生物。具體的可舉出上述的灰色鏈霉菌(Streptomyces canus)ATCC12647及ATCC 12646、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)TH1、芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)TH2及TH3、或者這些菌株的繼代培養(yǎng)物、突變體或誘變體。
培養(yǎng)這樣微生物的培養(yǎng)基，只要含有可同化微生物的碳源、氮源、無機(jī)鹽類等，并且有效地培養(yǎng)具有生成L-脯氨酸3位羥基化酶能力的微生物，無論天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基都可以使用。
作為碳源可以使用各種可同化微生物的碳源，如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有這些糖類的糖蜜、淀粉或者淀粉加水分解物等的碳水化合物、醋酸、丙酸等的有機(jī)酸、乙醇、丙醇等的醇類。
作為氮源可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等的各種無機(jī)酸和有機(jī)酸銨鹽、其它的含氮化合物以及胨、肉汁、酵母汁、玉米淀粉汁、酪蛋白加水分解物、大豆渣及大豆渣子加水分解物、各種發(fā)酵菌體及其消化物等。
作為無機(jī)物，可使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養(yǎng)可在振蕩培養(yǎng)或者深部通氣攪拌培養(yǎng)等的需氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)的溫度是15-37℃，培養(yǎng)時(shí)間通常是16-96小時(shí)。
培養(yǎng)中的pH保持在5.0-9.0的調(diào)節(jié)，可用無機(jī)或者有機(jī)的酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等進(jìn)行調(diào)節(jié)。
在培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)需要也可添加L-脯氨酸。
在這樣得到的菌體中是否生成了L-脯氨酸3位羥基化酶，可通過向培養(yǎng)物中或在含有該菌體或菌體處理物的適合于酶反應(yīng)的水性介質(zhì)中加入L-脯氨酸、二價(jià)鐵離子及2-酮戊二酸，進(jìn)而需要時(shí)，添加表面活性劑和有機(jī)溶劑觀察是否使L-脯氨酸轉(zhuǎn)化成順式-3-羥基-L-脯氨酸而加以確定。
用此反應(yīng)來確認(rèn)順式-3-羥基-L-脯氨酸的生成，在菌體中確認(rèn)其生成的L-脯氨酸3位羥基化酶的活性，可用以下的方法測(cè)定。酶的活性，可用在下述測(cè)定條件下，把1分鐘內(nèi)生成1nmol的順式-3-羥基-L-脯氮酸的活性作為1個(gè)單位(U)來表示。
在含有5mML-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、1mM硫酸亞鐵及5mML-抗壞血酸的100mM的TES緩沖溶液(pH7.0)中，添加酶標(biāo)品，合計(jì)100μl，在35℃下反應(yīng)10分鐘。在100℃下，加熱反應(yīng)液2分鐘，停止反應(yīng)后，用高速液相色譜定量測(cè)定在反應(yīng)液中生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
定量時(shí)，只要是可以定量測(cè)定順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法，采用任何的方法都可以。例如可舉出通常使用的高速液相色譜的后置柱衍生化法或者預(yù)先使用NBD氯化物(7-氯-4-硝基苯并-2-氧-1，3-二唑)使反應(yīng)液中的目的化合物NBD衍生化，將其放在使用高速液相色譜的逆相色譜上分離NBD衍生物后，使用熒光(激勵(lì)波長(zhǎng)503nm、熒光波長(zhǎng)541nm)進(jìn)行定量的方法(前置柱衍生物化法)等。再者，用前置柱衍生物化法的鑒定可以按照烏利姆·J.林德布拉特及羅伯特·F·狄蓋爾曼等人的方法〔(Analytical Biochemistry)、138、390、(1984)〕上的方法進(jìn)行。
從培養(yǎng)液離析精制酶時(shí)，可采用通常的酶的離析、精制法。例如，離心分離營(yíng)養(yǎng)液并集菌后，通過超聲波破碎和法式擠壓機(jī)、曼特高林機(jī)(マントンガウリン)、動(dòng)力磨等的機(jī)械破碎，得到無細(xì)胞提取液。將得到的離心沉淀后的上清液，通過進(jìn)行如用硫銨等的鹽析、DEAE(二乙胺乙基)-瓊脂糖等陰離子交換色譜層析、丁基纖維素、苯基纖維素等疏水性的色譜層析、使用分子篩的凝膠過濾法、等電點(diǎn)電泳等的電泳法等，可得到精制酶標(biāo)樣。得到酶標(biāo)樣的理化特征，可用通常酶學(xué)的方法鑒定。
用這種方法得到的L-脯氨酸3位羥基化酶具有下述(1)-(11)的理化性質(zhì)。
(1)作用及基質(zhì)特異性在2-酮戊二酸及二價(jià)鐵離子的存在下，作用在游離的L-脯氨酸后，可生成順式-3-羥基-L-脯氨酸。
(2)最佳pH在30℃下，反應(yīng)20分鐘時(shí)，具有最佳pH6.5-7.5。
(3)pH穩(wěn)定性在4℃下，進(jìn)行23小時(shí)處理，在pH6.5-8.0的范圍保持穩(wěn)定。
(4)最佳溫度在pH7.0、反應(yīng)15分鐘時(shí)，具有最佳溫度35-40℃。
(5)溫度穩(wěn)定性在pH7.5、50℃下處理30分鐘失活。
(6)阻礙劑由于Zn++、Cu++、Co++及Ba++的金屬離子及EDTA可受到阻礙。
(7)活化活化時(shí)，無必要使用輔酶。向反應(yīng)液中添加L-抗壞血酸可促進(jìn)反應(yīng)。
(8)Km值在100mM的TES緩沖溶液(pH7.0)中，含有L-抗壞血酸、1mM硫酸亞鐵及酶標(biāo)樣的反應(yīng)液中進(jìn)行測(cè)定的對(duì)于L-脯氨酸的Km值是0.49，對(duì)于2-酮戊二酸的Km值是0.11mM。
(9)等電點(diǎn)用Phast(Phast system；フルマミア社制)系統(tǒng)測(cè)定的等電點(diǎn)是4.3。
(10)分子量用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳法測(cè)定時(shí)是35,000±5,000。
(11)N末端氨基酸序列具有用序列號(hào)1表示的N末端氨基酸。
以下說明本發(fā)明的實(shí)施例。
實(shí)施例1順式-3-羥基-L-脯氨酸的生成將SR3培養(yǎng)基〔含有葡萄糖1.0％、可溶性淀粉1.0％、酵母浸汁0.5％、胰胨0.5％、肉浸汁0.3％及磷酸鎂0.05％，用6N NaOH調(diào)節(jié)成pH 7.2的培養(yǎng)基〕，分別以10ml注入到試管(直徑25mm×200mm)中，在120℃下，殺菌20分鐘。在此培養(yǎng)基上用一鉑環(huán)移植在HT瓊脂平板培養(yǎng)基上〔含可溶性淀粉1％、NZ胺0.2％、酵母浸汁0.1％、肉浸汁0.1％及瓊脂1.5％，用6N NaOH調(diào)到pH7.2后，在120℃下，殺菌20分鐘的培養(yǎng)基〕繁殖的鏈霉菌(Strep-tomyces sp.)TH1，并在28℃下振蕩培養(yǎng)2天，作為種培養(yǎng)液使用。將本種培養(yǎng)液進(jìn)而分注到2升的三角燒瓶中，移植到在120℃下進(jìn)行20分鐘殺菌了的200ml的SR3培養(yǎng)基上，在28℃下振蕩培養(yǎng)2天。將此培養(yǎng)液無菌地接種到在5升的發(fā)酵缸中分注了2升的DF3培養(yǎng)基上〔含有可溶性淀粉5％、玉米淀粉汁3.0％、磷酸二氫鉀0.05％、硫酸鎂7水鹽0.05％及碳酸鈣0.5％，用6N NaOH調(diào)節(jié)為pH7.0的培養(yǎng)基〕，并在700rpm、1vvm的條件下于28℃，培養(yǎng)2天。培養(yǎng)中不調(diào)節(jié)pH值。將得到的培養(yǎng)液用15000×g、4℃下離心分離10分鐘，每1升培養(yǎng)液得到75g濕菌體。在4℃下，用生理鹽水洗滌濕菌體，離心后至使用時(shí)為止要冷凍保持在-80℃下。
將得到的濕菌體1.0g懸浮在10ml的反應(yīng)液(a)中〔在含有5mML-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、5mML-抗壞血酸及1mM硫酸亞鐵的100mM TES緩沖液(pH7.5)中添加1.4％(v/v)奈明(ナイミ-ン)溶液而制成的(其奈明溶液是將4g奈明S-21J(日本油脂株式會(huì)社制)溶解在10ml二甲苯中的溶液)〕進(jìn)行懸浮，而后在30℃下，反應(yīng)5小時(shí)。
反應(yīng)后，從菌體反應(yīng)液離心除去菌體，對(duì)于上清液中生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸進(jìn)行分析。
分析是在高速液相色譜上，使用后置柱衍生物化法，在以下的條件下分析。檢測(cè)是將目的化合物從柱中洗脫出后，在線上NBD衍生物化，使用NBD衍生物的熒光進(jìn)行的。
高速液相色譜分析條件〔1〕裝置島津制作所制高速液相色譜色譜紙束(chromatopack) CR6A系統(tǒng)控制器 SCL-6B自動(dòng)注射器 SIL-6B送液泵 LC-6A柱烘箱 CTO-6A化學(xué)反應(yīng)槽 CRB-6A熒光檢測(cè)器 RF-550A
〔2〕使用柱SUMCHIRAL OA5000(株式會(huì)社住化分析中心制)(直徑4.5mm×250mm)〔3〕分析條件1)移動(dòng)相1mM硫酸銅水溶液2)移動(dòng)相流速1.0ml/分3)柱溫度38℃4)緩沖液0.3M硼酸緩沖液(pH9.6)25mM EDTA5)緩沖液流速0.2ml/分6)NBD氯化物溶液0.5g/l甲醇溶液7)上述溶液的流速0.5ml/分8)反應(yīng)溫度 60℃9)反應(yīng)時(shí)間 約3分10)檢測(cè)波長(zhǎng) 激勵(lì)波長(zhǎng)503nm熒光波長(zhǎng)541nm11)試樣 10μl其結(jié)果，在反應(yīng)液中生成了910μM(119mg/l)的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
實(shí)施例2
順式-3-羥基-L-脯氨酸的精制將實(shí)施例1得到的濕菌體100g懸浮在1升的反應(yīng)液(a)中，在2升的燒杯中，邊攪拌，邊在30℃下反應(yīng)5小時(shí)。
反應(yīng)后，對(duì)于從菌體反應(yīng)液離心除去菌體的上清液中生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸進(jìn)行分析，其結(jié)果，反應(yīng)液中生成了809μM(106mg/l)的順式-3-羥基-L-脯氨酸。將反應(yīng)上清液調(diào)節(jié)pH為4.5后使其通過裝有200ml迪阿翁離子交換樹脂SKIB(NH4+型、三菱化成社制)的塔內(nèi)。在減壓下濃縮出含有順式-3-羥基-L-脯氨酸餾分后，通過含有迪阿翁離子交換樹脂PA412(OH-型、三菱化成社制)20ml的塔。減壓濃縮含有順式-3-羥基-L-脯氨酸餾分后，使pH值調(diào)節(jié)到9.6后，加入10％體積的鄰苯二甲醛溶液(0.075g/ml乙醇溶液)及2％體積的β-巰基乙醇溶液(10％v/v水溶液)，在60℃下，保持5分鐘，使夾雜的直鏈(一級(jí))氨基酸進(jìn)行鄰位苯二甲醛化。再通過含有10ml的分離珠離子交換樹脂SP207(三菱化成社制)，分離鄰位苯二甲醛化的夾雜一級(jí)氨基酸和順式-3-羥基-L-脯氨酸。減壓濃縮含有順式-3-羥基-L-脯氨酸餾分后，再次通入含有20ml迪阿翁離子交換樹脂PA412(OH-型、三菱化成社制)的塔中，得到含有順式-3-羥基-L-脯氨酸的餾分。干燥此餾分，得到順式-3-羥基-L-脯氨酸的白色結(jié)晶68mg(收率63％)。
上述化合物的理化性質(zhì)如下。
比旋光度〔α〕D21＝-93.4°(C＝0.503、H2O)FAB-質(zhì)譜132(M+H)+13C-NMR譜(D2O、125MHz)ppm33.9、44.5、68.3、71.6、171.31H-NMR譜(D2O、500MHz)ppm2.18(1H)、2.27(1H)、3.52(1H)、3.62(1H)、4.18(1H)、4.77(1H)上述的用比旋光度、質(zhì)譜測(cè)定的分子量、1H-NMR譜、13C-NMR譜等的分析結(jié)果，與文獻(xiàn)記載的數(shù)值是相一致的〔the Jour-nal of Biological Chemistry(J.Biol.Chem.)、241、1300(1966)〕〔Journal of Antibiotics、45、824(1992)〕及按照文獻(xiàn)記載的方法合成的化學(xué)合成順式-3-羥基-L-脯氨酸〔(Liebigs Ann.Chem)、1881、(1979)〕〔四面體(Tetrahedron)、42、2421、(1986)〕。
實(shí)施例3順式-3-羥基-L-脯氨酸的生成使用灰色鏈霉菌(Streptomyces canus)ATCC 12647及ATCC12646、芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)TH2及TH3進(jìn)行L-脯氨酸的羥基化。
將SR3培養(yǎng)基〔含有葡萄糖1.0％、可溶性淀粉1.0％、酵母浸汁0.5％，胰蛋白胨0.5％，肉浸汁0.3％以及磷酸鎂0.05％，并用6N NaOH調(diào)節(jié)至pH7.2的培養(yǎng)基〕，各以10ml分注到試管(直徑25mm×200mm)中，在120℃下，進(jìn)行20分鐘殺菌。而后用一鉑環(huán)將生長(zhǎng)在HT瓊脂培養(yǎng)基上的各菌株移植在此培養(yǎng)基上，在28℃、振蕩培養(yǎng)1天，作為種培養(yǎng)液使用。
另一方面，將Df4培養(yǎng)基〔含有甘油2.5％、葡萄糖2.5％、大豆粉1.5％、磷酸二氫鉀0.05％、硫酸鎂7水合鹽0.05％、碳酸鈣0.5％，并用6N NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0的培養(yǎng)基〕，各以10ml分注到試管(直徑25mm×200mm)中，在120℃下，殺菌20分鐘。在此培養(yǎng)基上無菌地接種種培養(yǎng)液1ml，在28℃下，振蕩培養(yǎng)1天。得到的培養(yǎng)液2ml用15000×g、4℃下離心分離10分鐘。而后用80mM TES緩沖液(pH7.5)洗滌得到的菌體后，離心分離。把得到的濕菌體懸浮在1ml的反應(yīng)液(a)中，在30℃下，進(jìn)行3小時(shí)反應(yīng)。
其結(jié)果，在反應(yīng)液中分別生成了242μM、202μM、318μM、141μM的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
實(shí)施例4順式-3-羥基-L-脯氨酸的生成將芽胞桿菌屬菌(Bacillus，sp)TH2及TH3使用添加了L-脯氨酸1g/l的Df2培養(yǎng)基〔含有可溶性淀粉5％、干燥酵母1.5％、磷酸二氫鉀0.05％、硫酸鎂7水合鹽0.05％、碳酸鈣0.5％，用6NNaOH調(diào)節(jié)為pH7.0的培養(yǎng)基〕代替Df4培養(yǎng)基，與實(shí)施例3同樣地進(jìn)行1天種培養(yǎng)，在Df2培養(yǎng)基上進(jìn)行1天培養(yǎng)。其結(jié)果，在培養(yǎng)液的上清液中生成TH2株745μM(97.6mg/l)、TH3株327μM(42.8mg/l)的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
實(shí)施例5L-脯氨酸3位羥基化酶的離析精制(1)無細(xì)胞提取液的配制將由實(shí)施例2得到的冷凍菌體30g溶解后，在冰冷下懸浮在200ml的緩沖液(A)中〔含有1mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.2mMEDTA、0.1％(V/V)吐溫(Tween 20)及10％(V/V)甘油的20mM哌嗪緩沖液(用6N HCl調(diào)節(jié)pH為5.3)〕，在冰冷下，用超聲波破碎懸浮液中的菌體，在4℃下，用30000×g進(jìn)行30分鐘離心后得到上清液。
以后的操作均在冰冷乃至4℃下進(jìn)行。
(2)用柱色譜進(jìn)行離析及精制(2)-1.酸處理將由上述工序得到的上清液的pH用6N鹽酸調(diào)節(jié)到4.5后，用15,000×g，進(jìn)行30分鐘離心、分離除去生成的沉淀，得到上清液。
(2)-2.RESOURCE Q柱色譜(I)將由上述工序得到的上清液，通過裝有用緩沖液(A)進(jìn)行平衡的弗爾瑪西亞社制的RESOURCE Q柱(RESOURCETMQ，6ml)的柱。用緩沖液(A)洗滌后，用在緩沖液(A)中制定的從0-0.3M間的食鹽直線濃度梯度溶液，洗脫出含該酶的餾分。
(2)-3.RESOURCE Q柱色譜(II)將由上述工序得到的活性餾分用緩沖液(B)〔含有1mMDTT、0.2mM EDTA及10％(V/V)甘油的20mM TES緩沖液(pH調(diào)節(jié)為7.5)〕稀釋3倍后，通過裝有用緩沖液(B)平衡的弗爾瑪西亞社制的RESOURCE Q柱(RESOURCETMQ，1ml)的塔。用緩沖液(B)洗滌后，使用在緩沖液(B)中制定的從0-0.3M間的食鹽線性濃度梯度溶液，洗脫出含該酶的餾分。
(2)-4.苯基瓊脂糖色譜在上述工序得到的活性餾分中，添加、溶解食鹽，使食鹽濃度達(dá)到2M，并使其通過裝有用含2M食鹽的緩沖液(B)平衡的苯基瓊脂糖柱(Phenyl Sepharose HP Hiload，1ml)的塔。用含2M食鹽緩沖液(B)洗滌后，使用含0.1％(V/V)吐溫20(Tween 20)緩沖液(B)洗脫出含該酶的餾分。
(2)-5.RESOURCE Q柱色譜(III)對(duì)于上述工序得到的活性餾分，使用以緩沖液(A)平衡的弗爾瑪西亞社制PD-10柱脫鹽后，通過裝有用緩沖液(A)平衡的弗爾瑪西亞社制的RESOURCE Q柱(RESOURCETMQ，1ml)的塔。用緩沖液(A)洗滌后，使用在緩沖液(A)中制得的從0-0.3M間的食鹽的直線濃度梯度溶液，洗脫出含該酶的餾分。
(2)-6.RESOURCE Q柱色譜(IV)
將由上述工序得到的活性餾分，用含0.1％(V/V)吐溫20(Tween 20)的緩沖液(B)稀釋3倍后，通過裝有用緩中液(B)平衡的弗爾瑪西亞社制的柱(RESOURCETMQ，1ml)的柱。用緩沖液(B)洗滌后，使用在緩沖液(B)中制得的從0-0.3M間的食鹽直線濃度梯度溶液，洗脫出含該酶的餾分。
L-脯氨酸3位羥基化酶的離析及精制的概要總結(jié)在表9中表9L-脯氨酸3位羥基化酶的離析及精制的概要餾分 總蛋白 全活性 比活性 收率(mg) (U) (U/mg蛋白)(％)無細(xì)胞提取液 542 3540 6.5 100pH4.5處理上清液106 1800 17 56RESOURCEQ(I)pH5.3 7.5 1553 207 44RESOURCE Q(I)pH7.5 3.3 1036 306 29苯基瓊脂糖 0.43188 437 5.3RESOURCE Q(III)pH5.3 0.1690.5 566 2.6RESOURCE Q(IV)pH7.50.035 60.3 17231.7實(shí)施例6L-脯氨酸3位羥基化酶的性質(zhì)(1)電泳分析用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳法(使用ATTO社制聚丙烯酰胺PAGELNPU-12.5L及BIORAD社制分子量標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE Molecular Weight Standard Broad Range)分析實(shí)施例5得到的精制酶標(biāo)樣。其結(jié)果，明顯地看出該酶是由分子量35000±5000大致均一的亞單位構(gòu)成的。
(2)關(guān)于酶反應(yīng)的性質(zhì)使用以下的反應(yīng)液，通過進(jìn)行反應(yīng)成分基質(zhì)省略試驗(yàn)(Omis-sion test)及添加物試驗(yàn)研究L-脯氨酸3位羥基化酶反應(yīng)的必需化合物、促進(jìn)化合物、阻礙化合物。
基本反應(yīng)液組成是含有5mM L-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、1mM硫酸亞鐵、5mM L-抗壞血酸及酶標(biāo)樣的100mM的TES緩沖液(pH7.0)，總計(jì)液量為100μl。通過添加酶開始反應(yīng)，在35℃下反應(yīng)10分鐘。反應(yīng)液在100℃下加熱2分鐘，停止反應(yīng)后，按照前置柱衍生物化法，使用高速液相色譜定量在反應(yīng)液中生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸。向100μl反應(yīng)液中添加0.3M硼酸緩沖液(pH10.7)100μl、10％(V/V)巰基乙醇水溶液4μl及5％(W/V)鄰苯二甲醛的乙醇溶液16μl，在60℃下放置30秒。進(jìn)而加入2％(W/V)NBD氯化物的乙醇溶液50μl，在60℃下反應(yīng)40分鐘。加入1N鹽酸30μl停止反應(yīng)后，通過離心、過濾除去沉淀后，用高速液相色譜進(jìn)行分析，定量生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
在以下條件進(jìn)行高速液相色譜分析移動(dòng)相10mM檸檬酸(pH4.0)/甲醇＝3/1(V/V)流速1ml/分柱YMC Pack ODS AQ-312(YMC社制、6×150mm)柱溫度50℃檢測(cè)熒光檢測(cè)、激勵(lì)波長(zhǎng)503nm、熒光波長(zhǎng)541nm從其結(jié)果可看出，在L-脯氨酸3位羥基化時(shí)，L-脯氨酸、2-酮戊二酸、Fe++離子是必需的，L-抗壞血酸有促進(jìn)反應(yīng)的作用，另外，Zn++、Cu++、Co++及Ba++離子及EDTA的添加可阻礙反應(yīng)。
其結(jié)果表示在表10中。
表10酶反應(yīng)成分的研究反應(yīng)液成分 添加物(+)2)相對(duì)活性3)無添加(-)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液1)100-酶標(biāo)樣0-L-脯氨酸 0-2-酮戊二酸0-Fe++0-L-抗壞血酸25+2mM EDTA 5+1mM Zn++0+1mM Cu++4+1mM Co++13+1mM Ba++42
1)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液成分是含有5mM L-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、1mM硫酸亞鐵、5mM L-抗壞血酸及酶標(biāo)樣的100mM TES緩沖液，pH是7.0，液量總計(jì)100μl。反應(yīng)是在35℃下進(jìn)行10分鐘。
2)添加物(+)，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液中添加以表中+表示的化合物進(jìn)行反應(yīng)。無添加(-)，從標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液中除去以表中-表示的化合物進(jìn)行反應(yīng)，表中表示的濃度是反應(yīng)液的濃度。
3)活性，以標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液的活性作為100表示其相對(duì)值。
(3)最佳pH在L-脯氨酸3位羥基化酶活性測(cè)定法中，用下述緩沖液置換反應(yīng)液中的緩沖液成分，進(jìn)行反應(yīng)，即pH5.5-6.0時(shí)，用MES〔2-(N-嗎啉)乙磺酸〕緩沖液、pH6.5-7.5時(shí)，用PIPES〔哌嗪-N，N’-雙(2-乙磺酸)〕緩沖液、pH7.0-8.0時(shí)，用TES緩沖液、pH8.0-9.0時(shí)，用TAPS〔N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸)〕緩沖液進(jìn)行反應(yīng)的結(jié)果，pH為6.5-7.5時(shí)顯示了最高活性的80％以上。其結(jié)果表示在表11中。
表11反應(yīng)的最佳pHpH (緩沖液) 相對(duì)活性1)5.5 (MES) 15.06.0 (MES) 70.96.5 (PIPES) 83.37.0 (PIPES) 92.17.0 (TES) 1007.5 (PIPES) 80.47.5 (TES) 85.08.0 (TES) 72.28.0 (TAPS) 76.38.5 (TAPS) 52.99.0 (TAPS) 44.51)活性是對(duì)最高活性作為100時(shí)的相對(duì)活性(4)pH穩(wěn)定性緩沖液(B)中的本發(fā)明的酶液用100mM緩沖液〔pH5.5-6.5時(shí)，用MES緩沖液、pH6.1-7.5時(shí)，用PIPES緩沖液、pH7.0-8.0時(shí)，用TES緩沖液、pH8.0-9.0時(shí)，用TAPS緩沖液〕稀釋3倍，在4℃，保持23小時(shí)后，測(cè)定活性。pH范圍保持在6.5-8.0范圍的酶具有保持前面的活性的80％以上的活性，說明pH在6.5-8.0的范圍內(nèi)活性保持穩(wěn)定。
(5)最佳溫度在測(cè)定L-脯氨酸3位羥基化酶的活性時(shí)，在15-50℃的溫度范圍內(nèi)，進(jìn)行15分鐘反應(yīng)，其結(jié)果顯示出在35-40℃時(shí)，有最高活性的80％以上的活性。結(jié)果表示在表12中。
表12反應(yīng)的最佳溫度反應(yīng)溫度相對(duì)活性1)15 1920 2925 5330 7435 10040 8945 6450 281)活性是以最高活性為100時(shí)的相對(duì)活性表示的(6)溫度的穩(wěn)定性將本發(fā)明的酶在緩沖液(B)中，在0-60℃的溫度范圍內(nèi)保持30分鐘后，測(cè)定其活性。結(jié)果表明，本發(fā)明酶在50℃下，處理30分鐘完全失活。
(7)Km值在含有100mM TES緩沖液(pH7.0)、1mM硫酸亞鐵、5mML-抗壞血酸及酶標(biāo)樣反應(yīng)液中測(cè)定，對(duì)于L-脯氨酸的Km值是0.49mM，對(duì)于2-酮戊二酸Km值是0.11mM。
(8)等電點(diǎn)用Phast系統(tǒng)(Phast system；弗爾瑪西亞社制)測(cè)定等電點(diǎn)的結(jié)果，等電點(diǎn)是4.3。
(9)N末端氨基酸序列使用Protein sequencer model PPSQ-10(島津制作所社制)分析本發(fā)明酶蛋白的N末端氨基酸序列，得到以下結(jié)果(N末端) 1MetCsSerHisIIeLeuGlyArgIIeGlu11 LeuAspGlnGluArgLeuGlyArgAspLeu21 GluTyrLeuAlaThrValProThrVal(序列號(hào)1)實(shí)施例7L-脯氨酸的羥基化使用實(shí)施例5得到的精制酶標(biāo)樣進(jìn)行L-脯氨酸的羥基化。
使用含有20mM 2-酮戊二酸、20mM L-脯氨酸、5mM L-抗壞血酸、1mM硫酸亞鐵及106U的精制酶標(biāo)樣的200mM TES緩沖液(pH7.0)100μl，在35℃反應(yīng)30分鐘。其結(jié)果，在反應(yīng)液中生成18mM(2.4g/l)的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
序列表序列號(hào) 1序列長(zhǎng)度29序列類型氨基酸拓譜學(xué) 直鏈狀序列的種類 肽起源鏈霉菌屬(Streptomyces sp)株名TH1(FERM BP-4399)序列Met Cys Ser His Ile Leu Gly Arg Ile Glu Leu Asp Gln Glu Arg Leu Gly1 5 10 15Arg Asp Leu Glu Tyr Leu Ala Thr Val Pro Thr Val20 25根據(jù)本發(fā)明，可以提供對(duì)于用發(fā)酵法從糖源工業(yè)性地生產(chǎn)的L-脯氨酸，通過微生物或酶的直接羥基化，在工業(yè)上有效地制造順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法以及用于該方法的有用的新的L-脯氨酸羥基化酶。
權(quán)利要求
1.L-脯氨酸3位羥基化酶的制造方法，其特征在于培養(yǎng)屬于鏈霉菌(Streptomyces)屬或芽胞桿菌屬(Bacillus)，并且具有生產(chǎn)L-脯氨酸3位羥基化酶能力的微生物，通過酸處理、陰離子交換色譜層析、疏水性色譜層析的組合精制方法精制所說的微生物的細(xì)胞提取液。
全文摘要
L－脯氨酸3位羥基化酶的制造方法,其特征在于培養(yǎng)屬于鏈霉菌(Streptomyces)屬或芽胞桿菌屬(Bacillus),并且具有生產(chǎn)L－脯氨酸3位羥基化酶能力的微生物,通過酸處理、陰離子交換色譜層析、疏水性色譜層析的組合精制方法精制所說的微生物的細(xì)胞提取液。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1375555SQ0113746
公開日2002年10月23日 申請(qǐng)日期1994年9月5日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月7日
發(fā)明者尾崎明夫, 森英郎, 柴崎剛, 安藤勝?gòu)? 落合惠子, 千葉繁, 宇於崎洋一 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社