專利名稱：植物細(xì)胞培養(yǎng)基及使用培養(yǎng)基培養(yǎng)植物細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物細(xì)胞的培養(yǎng)基，尤其是植物模式細(xì)胞的培養(yǎng)基；以及使用該培養(yǎng)基制備植物細(xì)胞、特別是植物模式細(xì)胞的方法。
傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法有兩種，一種是土壤培養(yǎng)，一種是水培。
土壤培養(yǎng)能使植物形成根毛，但長度一般不足0.3mm，并且作為培養(yǎng)基質(zhì)的土壤通常難以與根毛細(xì)胞分離，就基質(zhì)與根細(xì)胞的分離來說，水培是最為方便的方法。
水培方法是植物科學(xué)研究中最基本的培養(yǎng)技術(shù)之一。是繼李比西的礦質(zhì)營養(yǎng)學(xué)說誕生之后，于1860年由德國學(xué)者Sachs和Knop用其發(fā)明的營養(yǎng)配方用水培方法培養(yǎng)植物獲得成功，并相繼證明N、P、K、Ca、Mg、S等為植物的必需營養(yǎng)元素后發(fā)展起來的一種方法。后來，隨著技術(shù)的進(jìn)步，化學(xué)試劑純度的提高，至1954年科學(xué)家先后證明Fe、Mn、Cu、B、Zn、Mo和Cl也是植物的必需營養(yǎng)元素，加上光合作用證明C、H、O是植物的必需元素，至此，植物共需16種必需營養(yǎng)元素。1987年美國科學(xué)家進(jìn)一步證明Ni是植物所必需的超微量元素。以上這些都是運用水培方法的實踐基礎(chǔ)。盡管水培技發(fā)明于140多年前，但因營養(yǎng)配方設(shè)計的出發(fā)點就是為所培養(yǎng)植物提供全部有效養(yǎng)分，確?！按笏蠓省?，這與植物生長的自然條件——土壤溶液有著本質(zhì)的區(qū)別水培營養(yǎng)液養(yǎng)分的有效濃度高，但沒有緩沖性，而土壤溶液雖然養(yǎng)分的有效濃度低，但有很強的緩沖性。所以Weatherley和Pitman(Weatherley，P.E.，Encyclopediaof Plant Physiology 12 APhysiological Plant Ecology II，Lange，O.L.，Nobel，P.S.，Osmomd，C.B.And Ziegler，H.，P103～105，Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York，1982。Pitman，M.G.，Anderson，W.P.AND Luttge，U.，Encyclopediaof Plant Physiology 2 BTransport in Plants II，Luttge，U.And M.G.Pitman.，P57～69，Springer-Verlag Berlin HeidelbergNew York，1976)等人認(rèn)為植物在水培條件下幾乎不形成根毛，Ridge和Hofer(Ridge，Robert W.，Plant RootsThe Hidden Half，eds Waisel，Y.，Eshel，A.，Kafkafi，U.，P 127～147，MarcelDekker，Inc.，New York，1996。Rose-Marie Hofer.，Plant RootsThe Hidden Half，eds Waisel，Y.，Eshel，A.，Kafkafi，U.，P111～126，Marcel Dekker，Inc.，New York，1996)等人甚至斷言，在水培條件下，玉米等作物100％不能形成根毛，即完全不能形成模式細(xì)胞，而在土壤條件下則能形成根毛。
因此，目前這兩種方法常常難以獲得理想的模式細(xì)胞。而在水培技術(shù)中，要像土培一樣使水培溶液中的養(yǎng)分具有緩沖性以培養(yǎng)出理想的模式細(xì)胞是植物科學(xué)家一直在追求解決而未能解決的問題。
本發(fā)明還提供一種使用上述培養(yǎng)基制備植物細(xì)胞特別是植物模式細(xì)胞的有效方法。
本發(fā)明描述了一種植物細(xì)胞培養(yǎng)基，含有1.0nM～6.0mM鈣鹽，1.0nM～6.0mM硝酸鹽，兩者的濃度分別按鈣離子和硝酸根計，和1.0ng～5.0g/L水難溶性磷酸鹽。優(yōu)選地，鈣鹽為CaCl2·2H2O，硝酸鹽為NaNO3，磷酸鹽為Ca3(PO4)2或FePO4。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基還可含有1.0nl～10.0ml 3％H2O2/L或相應(yīng)量濃度的其他過氧化物，如過氧化鈉或過氧化鉀等。
任選地，本發(fā)明所述的培養(yǎng)基還可含有1.0nM～8.0mM MgSO4·7H2O，1.0nM～200.0μM FeSO4·7H2O，1.0nM～200.0μM EDTA(乙二胺四乙酸)，1.0nM～40.0μM MnCl2·4H2O，1.0nM～12.0μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，1.0nM～20.0μM ZnSO4·7H2O，1.0nM～40.0μM H3BO3，1.0nM～20.0μM CuSO4·4H2O，1.0nM～6.0mM(NH4)2SO4，，1.0nM～3.0mM Na2SiO3，1.0nM～5.0mM K2SO4。
本發(fā)明制備植物細(xì)胞特別是植物模式細(xì)胞的方法是使用本發(fā)明的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選地，在培養(yǎng)過程中間隔地，例如每日向培養(yǎng)基中加入上述配方中的過氧化物如過氧化氫、過氧化鉀或過氧化鈉，或者對水培液進(jìn)行通氣或用其他方法使培養(yǎng)基溶氧量增加。
本發(fā)明培養(yǎng)基的營養(yǎng)配方，能極好地模擬土壤溶液中磷等養(yǎng)分低濃度、高緩沖性的特點，不僅小麥、小黑麥等植物能形成長達(dá)3mm的根毛，而且已被斷言100％不能形成根毛的玉米也能形成又長又密的根毛。這在科學(xué)上取得了新的突破，尤其是證明了控制玉米根毛發(fā)生的基因在傳統(tǒng)水培方法下完全不能表達(dá)，但用本發(fā)明的技術(shù)進(jìn)行培養(yǎng)，則玉米的根毛基因能100％地超常表達(dá)。這為分子生物學(xué)研究，以及轉(zhuǎn)基因研究中，新基因的表達(dá)檢測提供了新的思路和技術(shù)方法。根據(jù)實驗，在水培條件下，本發(fā)明的技術(shù)能使小麥、小黑麥、玉米、擬南芥、白三葉草和百脈根等植物的根系形成從頭到腳長達(dá)1-3mm的又長又密根毛，形同刺猬一般，故稱為“刺猬根”。
此外，本發(fā)明培養(yǎng)基的營養(yǎng)配方還具有如下優(yōu)點1.能形成持續(xù)而穩(wěn)定的低水溶性磷營養(yǎng)緩沖環(huán)境2.培養(yǎng)液的pH基本接近中性
3.能使植物形成長壽命的超長致密根毛4.營養(yǎng)配方組成簡單5.無需經(jīng)常更換培養(yǎng)液6.營養(yǎng)液無需進(jìn)行通氣處理7.操作便利。
為了更進(jìn)一步地說明本發(fā)明，下面給出實施本發(fā)明的具體方式和實施例，但這不得解釋為對本發(fā)明的限制。
1、培養(yǎng)基的制備將化學(xué)試劑按實施例的配方溶于水中，即可制得本發(fā)明的培養(yǎng)基。
實施例中的試劑都是分析純以上級別，可從化學(xué)試劑商店買到。水為純凈水或蒸餾水即可。
2、培養(yǎng)方法在光照強度為50 000 Lux左右的植物生長箱或5～10月在自然太陽光照條件下，溫度維持在25～35℃左右。將植物種子放置在培養(yǎng)皿中浸種催芽，待根系長3cm以上便以泡沫塑料作為載體，移栽到前述配方的水培培養(yǎng)基上，每日向培養(yǎng)基中加入一定量的H2O2，培養(yǎng)時間在3周以內(nèi)，一般就能形成“刺猬根”。
培養(yǎng)的最佳方法是進(jìn)行2裂或多裂分根培養(yǎng)，即將植物的根系分成幾個部分進(jìn)行培養(yǎng)。例如，將Ca3(PO4)2與其他養(yǎng)分分別置于不同的器具中進(jìn)行植物培養(yǎng)，即是將Ca與Ca3(PO4)2置于一個培養(yǎng)缽中，而將其他養(yǎng)分置于另一培養(yǎng)缽中，將植株的根系分成兩半，各置一半，這樣，前一培養(yǎng)缽中就會形成“刺猬根”。
對培養(yǎng)得到的根毛長度用顯微尺檢測，并進(jìn)行顯微照相或普通照相。
實施例1以擬南芥為材料，用下列營養(yǎng)配方進(jìn)行培養(yǎng)。2.9mM NaNO3，2.0μM(NH4)2SO4，1.0g/L Ca3(PO4)2，1.0233mM K2SO4，1.9980mMCaCl2·2H2O，1.6458mM MgSO4·7H2O，89.5μM FeSO4·7H2O，89.5μM EDTA，9.1μM MnCl2·4H2O，0.5μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2μM ZnSO4·7H2O，18.5μM H3BO3，0.2μM CuSO4·4H2O，0.5ml 3％H2O2/L·日。用瓊脂作為載體，培養(yǎng)2～3周。
實驗結(jié)果得到長度3mm以上的根毛，顯微照相見

圖1。
實施例2以小黑麥為材料，用下列營養(yǎng)配方進(jìn)行培養(yǎng)。2.5mM NaNO3，1.0μM(NH4)2SO4，0.8233mM K2SO4，2.90mM CaCl2·2H2O，1.6mMMgSO4·7H2O，79.5μM FeSO4·7H2O，79.5μM EDTA，8.0μM MnCl2·4H2O，0.4μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2μM ZnSO4·7H2O，15.5μM H3BO3，0.1μMCuSO4·4H2O，100μM 3％H2O2/L·日。培養(yǎng)2～3周。
實驗結(jié)果得到長度3mm以上的根毛，顯微照相見圖2。
實施例3以百脈根為材料，用下列營養(yǎng)配方進(jìn)行培養(yǎng)。2.8mM NaNO3，1.3μM(NH4)2SO4，2.0g/L Ca3(PO4)2，1.0mM K2SO4，2.0mM CaCl2·2H2O，1.6mM MgSO4·7H2O，90.8μM FeSO4·7H2O，90.8μM EDTA，9.0μMMnCl2·4H2O，0.5μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2μM ZnSO4·7H2O，18.5μMH3BO3，0.2μM CuSO4·4H2O，150μl 3％H2O2/L·日。培養(yǎng)2～3周。
實驗結(jié)果得到長度1-2mm以上的根毛，顯微照相見圖3。
實施例4以玉米為材料，用下列營養(yǎng)配方進(jìn)行培養(yǎng)。2.8mM NaNO3，0.3μM(NH4)2SO4，1.0g/L Ca3(PO4)2，1.0mM K2SO4，3.8mM CaCl2·2H2O，1.6mM MgSO4·7H2O，90.8μM FeSO4·7H2O，90.8μM EDTA，9.0μMMnCl2·4H2O，0.5μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2μM ZnSO4·7H2O，18.5μMH3BO3，0.2μM CuSO4·4H2O，150μl 3％H2O2/L·日。培養(yǎng)2～3周。
實驗結(jié)果得到長度1-2mm以上的根毛，顯微照相見圖4。
實施例5以白三葉草為材料，用下列營養(yǎng)配方進(jìn)行培養(yǎng)。2.9mM NaNO3，0.1μM(NH4)2SO4，1.5g/L Ca3(PO4)2，1.0mM K2SO4，3.9mM CaCl2·2H2O，1.6mM MgSO4·7H2O，90.8μM FeSO4·7H2O，90.8μM EDTA，9.0μMMnCl2·4H2O，0.5μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2μM ZnSO4·7H2O，18.5μMH3BO3，0.2μM CuSO4·4H2O，150μl 3％H2O2/L·日。培養(yǎng)2～3周。
實驗結(jié)果得到長度1-2mm以上的根毛，顯微照相見圖5。
實施例6以小麥為材料，用下列營養(yǎng)配方進(jìn)行培養(yǎng)。2.7mM NaNO3，0.3μM(NH4)2SO4，1.4g/L Ca3(PO4)2，1.0mM K2SO4，3.3mM CaCl2·2H2O，1.6mM MgSO4·7H2O，90.8μM FeSO4·7H2O，90.8μM EDTA，9.0μMMnCl2·4H2O，0.5μM(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2μM ZnSO4·7H2O，18.5μMH3BO3，0.2μM CuSO4·4H2O，150μl 3％H2O2/L·日。培養(yǎng)2～3周，即能形成1～2mm長以上的根毛。
實驗結(jié)果得到長度1-2mm以上的根毛，顯微照相見圖6。
權(quán)利要求
1.一種植物細(xì)胞培養(yǎng)基，含有1.0nM～6.0mM鈣鹽，1.0nM～6.0mM硝酸鹽，兩者的濃度分別按鈣離子和硝酸根離子計，和1.0ng～5.0g/L水難溶性磷酸鹽。
2.權(quán)利要求1所述的植物細(xì)胞培養(yǎng)基，其中鈣鹽為CaCl2·2H2O，硝酸鹽為NaNO3，磷酸鹽為Ca3(PO4)2或FePO4。
3.權(quán)利要求2所述的植物細(xì)胞培養(yǎng)基，還含有1.0nl～10.0ml3％H2O2/L或相應(yīng)量濃度的其他過氧化物。
4.權(quán)利要求3所述的植物細(xì)胞培養(yǎng)基，其中過氧化物為過氧化鈉或過氧化鉀。
5.權(quán)利要求2或3所述的植物細(xì)胞培養(yǎng)基，還可含有下述一種或多種化學(xué)物質(zhì)1.0nM～8.0mM MgSO4·7H2O，1.0nM～200.0μM FeSO4·7H2O，1.0nM～200.0μM EDTA，1.0nM～40.0μM MnCl2·4H2O，1.0nM～12.0μM (NH4)6Mo7O24·4H2O，1.0nM～20.0μM ZnSO4·7H2O，1.0nM～40.0μM H3BO3，1.0nM～20.0μM CuSO4·4H2O，1.0nM～6.0mM(NH4)2SO4，1.0nM～3.0mM Na2SiO3，1.0nM～5.0mM K2SO4。
6.一種培養(yǎng)植物細(xì)胞的方法，其特征在于使用權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
7.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于在培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)基中間隔地加入權(quán)利要求3、4所述植物細(xì)胞培養(yǎng)基中的過氧化物，或者向培養(yǎng)基中通氣或者采取其他方法使培養(yǎng)基的溶氧量增加。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物細(xì)胞培養(yǎng)基及使用培養(yǎng)基培養(yǎng)植物細(xì)胞的方法,屬于植物組織和植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。該培養(yǎng)基應(yīng)用水培技術(shù),含有1.0nm～6.0mm鈣鹽,1.0nm～6.0mM硝酸鹽和1.0ng～5.0g/l磷酸鹽；優(yōu)選的鈣鹽為CaCl
文檔編號C12N5/04GK1422948SQ01140210
公開日2003年6月11日 申請日期2001年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月5日
發(fā)明者劉國棟 申請人:劉國棟