專利名稱：無病毒生物技術(shù)藥物生產(chǎn)系統(tǒng)的建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無病毒的生物技術(shù)藥物生產(chǎn)系統(tǒng)。
生物信息學(xué)和基因組學(xué)的廣泛應(yīng)用推動(dòng)了用于醫(yī)藥的新生物分子的發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)。根據(jù)Freedonia研究組的資料(www.freedoniagroup.com)，藥物和生物制品中生物技術(shù)的份額到2002年將達(dá)到13％。生物技術(shù)工業(yè)組織(BIO，www.bio.org)的報(bào)告指出美國FDA近5年批準(zhǔn)上市的生物技術(shù)藥物的數(shù)量超過過去13年的總和，僅1999年就達(dá)到了22種。目前在市場上已有近100種生物技術(shù)藥物用于治療各種疑難病和常見病，另有約350種生物藥物處于臨床試驗(yàn)的晚期。在制藥工業(yè)上，新技術(shù)的創(chuàng)新將愈來愈顯得重要和有前景。生物制藥的種類將繼續(xù)增加，用于預(yù)防和治療的病種將會(huì)擴(kuò)大，包括傳染病、自家免疫性疾病以致癌癥和神經(jīng)系統(tǒng)疾患。
但是，迄今國內(nèi)外生物制品與藥品生產(chǎn)系統(tǒng)只能做到無菌和熱源合格。產(chǎn)品質(zhì)量控制除使用質(zhì)量合格的注射用水，制品純度、制品活性外，僅從無菌角度進(jìn)行檢測，在某些特殊產(chǎn)品進(jìn)行特定病毒的檢測；還無法在生產(chǎn)過程中對病毒污染進(jìn)行有效監(jiān)控和對半成品、成品進(jìn)行普遍性的常規(guī)無病毒檢測。
目前病毒對人類健康的影響愈來愈受到人們的注意第一，隨著人類基因組工程的進(jìn)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在人類基因組中有233條細(xì)菌基因和約400-500條反轉(zhuǎn)錄病毒基因序列，這些病原體基因是如何進(jìn)入人體的，究竟對健康帶來什么后果，不得不引起病毒學(xué)家的深思和生物制品和藥品廠家的關(guān)注。
第二，世界瘋牛病的流行，對朊病毒引起普遍重視，朊病毒與人類早老癡呆及腦海綿狀病變有關(guān)。朊病毒是一種蛋白質(zhì)，不含核酸，100℃不能滅活。因此，如何去除和檢測朊病毒給生物制劑和藥品生產(chǎn)者又出了難題。
第三，美國的一項(xiàng)研究表明，當(dāng)今傳染病占全球死亡病因之首位，在美國占第三位。(2001年5月15日出版的″Genetic Engineering News″)。21世紀(jì)又要回到向傳染病作斗爭的時(shí)代。
第四，病毒感染是一種分子感染，除了能引起人類許多嚴(yán)重急性傳染病外，常引起人類的持續(xù)性感染，與腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系密切；一些DNA病毒和帶有反轉(zhuǎn)錄酶的RNA病毒的基因還可插入人的基因組中。
第五，美國NIH將乙肝病毒(HBV)，丙肝病毒(HCV)和乳頭瘤病毒(HPV)列為16種致癌物質(zhì)的成員，是在任何藥品和生物制品的生產(chǎn)過程中必需排除的。
第六，病毒無處不在，對環(huán)境的污染極為嚴(yán)重。病毒可以通過空氣、水源、血源、蟲媒、組織器官移植或接觸等方式廣泛傳播。已有報(bào)道，非洲的塵埃云層可攜帶微生物飄過大西洋對美洲大陸的人類健康和生態(tài)環(huán)境形成威脅(U.S.Geological Surveyhttp//www.usgs.gov)。帶有微生物的塵埃在5-7天的飄浮過程中由于云層阻擋了紫外線的照射而受到保護(hù)。在揚(yáng)塵天氣一夸脫(quart)(1/4加侖，946ml)空氣平均帶有158個(gè)細(xì)菌，213個(gè)病毒和201個(gè)熒光細(xì)菌，而在晴朗天氣則平均為18個(gè)細(xì)菌，18個(gè)病毒，無熒光細(xì)菌。
第七，目前所知，與人類疾病相關(guān)的病毒至少有544種，對人有致病性的新病毒還在不斷增加，自1973年以來發(fā)現(xiàn)了17種對人致病的新病毒。1999年Sandstrom等從與非人的靈長類動(dòng)物接觸的人中分離出一種泡沫病毒(spumavirus)，屬反轉(zhuǎn)錄病毒科(美國專利5,882,912)。這些由美國鹿鼠攜帶的出血熱病毒引起美國和英國肺型出血熱的流行，由黑線姬鼠和褐色家鼠引起我國的腎型出血熱，該病毒可通過感染動(dòng)物的排泄物，經(jīng)空氣傳播。
雖然去除病毒要比去除細(xì)菌困難得多，但近年來生物技術(shù)的進(jìn)步，目前已有可能對生物制品和藥品進(jìn)行病毒質(zhì)控。本發(fā)明根據(jù)生物制品類型的不同以及生物制品生產(chǎn)的特點(diǎn)初步研究建立了一種無菌、無熱源、無病毒的“三無”生物制品生產(chǎn)體系，以提高我國生物制品和藥品的質(zhì)量，保障人類健康。下面對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
一.無病毒生物藥物和生物制品的概念由于病毒本身的特點(diǎn)，“無病毒”的概念是相對的。目前尚不可能建立一種病毒學(xué)絕對安全的產(chǎn)品生產(chǎn)體系。檢查不出病毒不能解釋為沒有病毒或其基因元件的存在。有病毒存在而檢測不出來的因素很多，包括第一，缺少敏感的檢測方法。即使使用較敏感的PCR方法，PCR陰性也不能確切說明產(chǎn)品中完全去除了病毒(感染性或無感染性)，因?yàn)檫@有樣本大小和方法敏感性問題。Hilfen-haus等證明，對100-mL樣本容量，PCR試驗(yàn)的檢出量極限為100個(gè)病毒顆粒/mL，當(dāng)這批10L的產(chǎn)品中尚有106個(gè)病毒顆粒時(shí)，PCR仍為陰性結(jié)果。因此，取出樣本直接進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果證明為無病毒，仍不能得出在終產(chǎn)品中無感染性病毒顆粒的結(jié)論。
第二，在血漿中感染性病毒被中和抗體所掩蓋；第三，病毒的高度多樣性。新病毒不斷出現(xiàn)，原有病毒經(jīng)常變異，未知病毒變種的組織嗜性不清楚，難以及時(shí)建立特定病毒的檢測方法。對每一類病毒需要特殊的檢測方法；因此，對某種生物藥物和生物制品無病毒的標(biāo)準(zhǔn)是不同的，需要根據(jù)病毒學(xué)的研究，制訂相應(yīng)的無病毒質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
一種生物制品和生物藥物在臨床上接受的程度要根據(jù)其危害性評(píng)估和分析以及對其現(xiàn)實(shí)的和可能的危害性的處理方案，這包括危害性評(píng)價(jià)，危害性減少的程度，危害性控制策略和生產(chǎn)過程的控制。
危害性評(píng)估涉及病毒污染的本質(zhì)，是事實(shí)上的污染，還是僅在理論上可能有污染，以及污染病毒的致病性問題。不同的制品，考慮其危害性是不同的，有些生物制品，已經(jīng)過充分的鑒定，病毒污染常常是理論上的；而有些生物制品如傳統(tǒng)的血液制品，病毒污染明顯存在，如微小病毒B-19，肝炎病毒，HIV等。
評(píng)價(jià)病毒的致病性也要考慮多種因素。例如，在血漿中低水平的病毒是絕對禁止的，所有病毒污染的原材料必需嚴(yán)格檢疫。在使用細(xì)胞系制備生物制品時(shí)，如含有內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒的水平在106-109顆粒/mL(電鏡觀測)的CHO細(xì)胞仍可接受作為細(xì)胞源，理由是這些病毒顆粒是無感染性的。二.無病毒生物藥物和生物制品的標(biāo)準(zhǔn)至于在終產(chǎn)物中清除了多少病毒，才是安全的，即在整個(gè)生產(chǎn)流程中需要將病毒清除到幾個(gè)對數(shù)以下。目前，這一安全的限度標(biāo)準(zhǔn)是很難簡單確定的。整個(gè)生產(chǎn)流程不僅要清除事實(shí)上已污染的病毒，如血液制品中攜帶的病毒，還要清除不能測出的潛在的病毒污染源或新病毒的污染。鑒于這樣的要求，清除病毒的目標(biāo)有兩個(gè)方面一是要估計(jì)生產(chǎn)流程清除已知污染病毒的能力；二是要估計(jì)清除未知的、潛在的病毒污染的可能性。
一般地說，生產(chǎn)過程必需確證能有效地去除或滅活在原始材料中估計(jì)污染病毒滴度的3-5個(gè)數(shù)量級(jí)病毒。對一些已知有病毒污染的產(chǎn)品，如內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒，必需要測定在一定劑量生物產(chǎn)品中理論上的病毒量。因此，對CCL-產(chǎn)品，估計(jì)其病毒量要根據(jù)生物學(xué)方法(如感染性和反轉(zhuǎn)錄酶)和形態(tài)學(xué)檢查(電鏡)。
關(guān)于那些病毒要包括在清除病毒的評(píng)價(jià)范圍之內(nèi)，生物制品管理?xiàng)l例文件和其它參考文獻(xiàn)都有詳細(xì)討論。一般地說，清除那些因子是基于整個(gè)生產(chǎn)過程中危險(xiǎn)因子的估計(jì)?？紤]的因子包括原始材料，如缺乏種屬屏障的的人源化細(xì)胞比其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，更具有危險(xiǎn)性；在原始材料中的多樣性程度，如從細(xì)胞庫中生產(chǎn)的血漿制品；以及生產(chǎn)過程，如病毒清除能力，清除病毒的特殊步驟。
FDA-ICH文件中說，“在通常情況下，確證終產(chǎn)品中缺少感染性病毒不僅是單獨(dú)直接進(jìn)行試驗(yàn)，監(jiān)測病毒的存在，還需要證明，生產(chǎn)中所采用的純化方案是能夠去除或滅活病毒的?！倍喾轿坏娜コ蜏缁畈《痉桨甘强扇〉模葐我徊襟E更為有效。三.當(dāng)前生物藥物和生物制品生產(chǎn)過程的現(xiàn)實(shí)情況和病毒污染的可能來源從病毒污染來源的可能性來進(jìn)行分類，當(dāng)前(生物)藥物和生物制品的制造可分為三類第一，不用人或動(dòng)物細(xì)胞、組織或器官制備的，也不含上述細(xì)胞、組織或器官成分作為保護(hù)劑的的(生物)藥物和生物制品。
這包括大部分人工合成藥，包括寡核苷酸藥物，如CMV反意核酸；大部分采用充分鑒定的真菌，細(xì)菌(如大腸桿菌K12系)和酵母(如釀酒酵母)來生產(chǎn)的抗生素，部分不添加人白蛋白作為穩(wěn)定劑的基因重組藥物，如重組酵母乙肝疫苗，重組干擾素等。
這類藥物的普遍性生產(chǎn)流程是用純凈水進(jìn)行產(chǎn)品的分離、提取，再用高溫維持的蒸餾水管道輸送到終端對原液進(jìn)行灌裝配互，最后進(jìn)行膜過濾除菌后分裝或凍干。從原則上講，不論是蒸餾法，還是反滲透法制備的純水均可完全去除細(xì)菌以及大部分病毒，但是，依然存在有容器和空氣病毒污染的問題。
第二，雖不用人或動(dòng)物細(xì)胞、組織或器官制備，但用人白蛋白等生物原料作為添加劑的的(生物)藥物和生物制品。
這包括大部分基因重組藥物，如重組干擾素α1b，α2a，α2b，αcon，β，γ，重組G-CSF，重組GM-CSF，重組IL-2/17Cys，IL-2/17Ser，重組人胰島素，重組人生長激素，重組IL-11，重組IL-2-白喉毒素，重組EGF，重組牛bFGF，重組降鈣素等。
這類藥品除上述病毒污染的可能性外，主要是添加劑的病毒污染。
第三，使用人或動(dòng)物細(xì)胞、組織或器官制備的生物藥物和生物制品。
這類生物藥物和生物制品病毒污染的可能性最大，是控制病毒污染的重點(diǎn)。其中又分為三種情況
1.使用人和動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)的生物藥物和生物制品，如大部分細(xì)胞培養(yǎng)(CHO細(xì)胞，VIRO細(xì)胞，人二倍體細(xì)胞，人和動(dòng)物原代細(xì)胞等)生產(chǎn)的疫苗、藥物和基因治療產(chǎn)品。
2.用動(dòng)物組織、器官生產(chǎn)的藥物。如純化鼠腦出血熱疫苗，雞胚尿囊流感疫苗。
3.直接從動(dòng)物細(xì)胞、組織、器官提取的生化制劑。如人用豬胰島素，肝細(xì)胞生長因子，人白細(xì)胞干擾素等。
生產(chǎn)過程病毒污染的來源是多種多樣的，從空氣、水、細(xì)胞系到各種操作以及在生產(chǎn)和純化流程中的添加物。病毒污染的可能性有1.空氣、水源污染在目前(生物)藥物的生產(chǎn)過程中，人工操作的比重很大，每個(gè)生產(chǎn)步驟從空氣、水和容器污染病毒的可能性均很大；蒸餾水高溫維持超過一定時(shí)間仍可出現(xiàn)熱源，熱源是Gram(-)桿菌的菌壁脂多糖，這說明微生物污染的機(jī)會(huì)是相當(dāng)普遍的。就在百級(jí)潔凈度的環(huán)境下也難保證高效過濾器能造成無病毒環(huán)境。因?yàn)楦咝н^濾器不能阻擋鈉米大小的病毒顆粒。朊病毒是蛋白質(zhì)，耐高溫，更難于去除。
2.產(chǎn)品制作的最后一道程序是進(jìn)行膜過濾除菌后，除菌后分裝或凍干成終產(chǎn)品，而目前所用的除菌裝置，尚未考慮去病毒。病毒、類病毒是納米顆粒，一般除菌器不能去除。
3.細(xì)胞系是病毒污染的重要來源。例如，連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系(CCLs)曾被廣泛應(yīng)用和檢定，污染的病毒常不產(chǎn)生細(xì)胞病變，而是慢性病毒或隱性病毒。CCLs相關(guān)的反轉(zhuǎn)錄病毒是有感染性的，有致癌的危險(xiǎn)性。廣泛應(yīng)用于單克隆抗體的生產(chǎn)的小鼠細(xì)胞系，已強(qiáng)調(diào)了有可能傳播動(dòng)物病毒的危險(xiǎn)性。一種常用于單抗生產(chǎn)的CHO細(xì)胞能攜帶漢坦病毒。從B淋巴細(xì)胞來源的人源化細(xì)胞系有可能攜帶反轉(zhuǎn)錄病毒，肝炎病毒，人皰疹病毒，巨細(xì)胞病毒和人乳頭瘤病毒。此外，細(xì)胞系或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系常用某種病毒因子來建立的(如EB病毒或仙臺(tái)病毒)，病毒的影響應(yīng)予充分考慮。
5.通過生產(chǎn)和純化流程污染病毒。病毒的污染可以是外源性的，通過添加劑或生產(chǎn)流程。細(xì)胞系常培養(yǎng)在含有5-10％或2-4％血清的培養(yǎng)液中。牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)已被鑒定為牛血清中最為常見的污染病毒。可能的污染還有呼腸病毒，傳染性牛鼻氣管炎病毒(IBR)，牛副流感病毒3(PI-3)，牛白血病病毒和牛多瘤病毒。用于細(xì)胞培養(yǎng)的豬胰蛋白酶常有可能污染有豬微小病毒。當(dāng)然可以選擇無血清培養(yǎng)基作為培養(yǎng)細(xì)胞的生長液，但無血清培養(yǎng)基和不添加哺乳動(dòng)物產(chǎn)品培養(yǎng)基不是同義的。無血清培養(yǎng)基常添加來源于哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白。同樣，一種化學(xué)合成的培養(yǎng)基添加有重組生長因子，后者是在有血清的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的。無蛋白這一名稱可不含蛋白，但可含有濾過性蛋白水解物。純化過程也可污染病毒。例如，采用單抗親和層析可增加外源病毒的污染的可能性。病毒污染的其它來源還可能是GMP生產(chǎn)環(huán)節(jié)的某些缺陷，從生產(chǎn)環(huán)境或人員導(dǎo)至病毒污染。
所以，外源性病毒污染是多樣的，下列是某些病毒污染的來源例舉，可在生產(chǎn)流程的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生。
用于誘導(dǎo)表達(dá)編碼目的蛋白的特殊基因的病毒。例如EB病毒，仙臺(tái)病毒和其它誘導(dǎo)病毒。
● 在生產(chǎn)過程中的試劑和添加物，例如血清，培養(yǎng)基，胰蛋白酶，生長因子和其它添加物，污染有牛腹瀉病毒，感染性牛鼻氣管炎病毒，副流感病毒3等。
● 在純化過程中的試劑，例如單抗親和層析柱等，可污染來自單抗的病毒和來自大量多克隆抗體的未知病毒。
● 用于產(chǎn)品配互的賦形劑、穩(wěn)定劑，例如血清和人白蛋白?？晌廴镜牟《景ㄒ倚透窝祝⑿〔《綛-19等。
● 在生產(chǎn)流程中的設(shè)備和人員也是重要的污染源，例如鼻病毒，呼吸道合胞病毒和輪狀病毒等。
目前證明清除病毒的生產(chǎn)規(guī)程和條例是基于下列2個(gè)因素1.歷史上發(fā)生過的病毒污染事故；2.由于缺少有效的檢測所有病毒的方法，要保證完全無病毒是有限的、相對的。
歷史上發(fā)生過的病毒污染事件某些主要是由于病毒不完全滅活，諸如某些疫苗污染感染性病毒，如polio疫苗，狂犬疫苗和口蹄疫疫苗；病毒培養(yǎng)系統(tǒng)污染的內(nèi)源性污染，如polio疫苗污染SV40，黃熱病疫苗污染禽白血病病毒(ALV)，SV40和ALV在相應(yīng)的宿主中是有致癌潛能的。幸運(yùn)的是，流行病學(xué)回顧調(diào)查研究，接種疫苗的人群中腫瘤的發(fā)病率并沒有增加。其它病毒污染的事件是由于產(chǎn)品中加有被污染的賦形劑或穩(wěn)定劑造成的，如污染有HBV的血清用于黃熱病疫苗的穩(wěn)定劑，最近，用人血清白蛋白作為重組VIII因子的穩(wěn)定劑，從而污染了人微小病毒B19。
上述的病毒污染事件均不是由于在生產(chǎn)流程的某個(gè)環(huán)節(jié)上疏忽所引起的，僅由于在當(dāng)時(shí)缺少敏感的診斷方法或生產(chǎn)流程中指標(biāo)有小的改動(dòng)。疫苗相關(guān)的醫(yī)源性意外事件現(xiàn)已明顯下降，但是，現(xiàn)在盡管有供體的篩選和清除病毒的方案，血漿來源的凝血因子(VIII因子，IX因子)仍有發(fā)生污染HIV、肝炎病毒和微小病毒。雖然細(xì)胞培養(yǎng)液有外源性病毒污染，但幸運(yùn)的是目前尚無從這些產(chǎn)品中傳播病毒的報(bào)道。有關(guān)接種生物制品相關(guān)的醫(yī)源性病毒污染事故例舉見這些病毒污染不能通過傳統(tǒng)的除菌濾器來去除；因此，每生產(chǎn)批號(hào)病毒污染的可能性要充分估計(jì)。四、目前生物藥物和生物制品去除病毒污染的方法通過常規(guī)的加工工藝和純化步驟也可偶然地清除病毒。在生產(chǎn)流程中，根據(jù)其大小，電荷，密度，結(jié)合能力和其它病毒與產(chǎn)品之間的不同，通過沉淀，親和，離子交換，凝膠過濾，疏水性作用，混合型層析等均可物理地從產(chǎn)品中去除病毒。在生產(chǎn)過程中也可通過pH的作用而滅活病毒，蛋白質(zhì)用低pH緩沖液中從層析柱中溶離出，還有用于純化過程的試劑能滅活病毒。重組α型干擾素就是一個(gè)明顯的例證。
某些滅活病毒的方法學(xué)是可行的，這包括加溫滅活、光化學(xué)法、UV照射、化學(xué)物質(zhì)如β-propiolactone和辛酸(caprylate)、溶劑-去污劑等。去除病毒的方法包括過濾、層析分離、分離成不同的部分。聯(lián)合方法如UV照射加β-propiolactone處理、用補(bǔ)骨脂素(psoralens)聯(lián)合長波紫外照射(UVA)。新的滅活病毒的方法常針對有膜病毒，如生物表面活性劑和Inactines，還有應(yīng)用加壓循環(huán)技術(shù)。近年來，有些來源于動(dòng)物和人的組織或血液制品采用了一些新方法和新技術(shù)1.日本人Ueno等人(美國專利6,194,192 February 27，2001)描述了采用來源于棕色海藻(brown algae)或海黃瓜(sea cucumber)的含有硫酸海藻糖的多糖(fucoidan，fucoidin和fucan)或其降解物固定在載體上(凝膠，或顆粒，或薄膜，活中空纖維)來純化或去除生物制品中去除病毒的方法。所有化學(xué)物質(zhì)均是藥典所允許的。2.Van Holten等(美國專利6,096,872 August 1，2000)采用納米濾器清除病毒制備高度純化的無病毒的免疫球蛋白特別是抗D免疫球蛋白。3.Horowitz等(美國專利5,981,163 November 9，1999)采用照射技術(shù)滅活在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外(如紅細(xì)胞)可能存在的病毒，而不破壞原有生物物質(zhì)的生物活性。4.Eib等(美國專利5,864,016 January 26，1999)采用無毒性溶劑的去污劑處理血液產(chǎn)品，結(jié)合加溫處理以去除病毒。作者采用AIDS病毒或Sindbis病毒模型。5.Karges(美國專利5,723,123 March 3，1998)描述了一種無病毒污染的凝血酶的制備方法。6.Eibl等(美國專利5,733,885 March 31，1998)描述了一中去除生物制劑或藥物制劑中污染病毒的方法即在生物制劑中加入兩性物質(zhì)加溫滅活病毒，原有的生物學(xué)活性至少可保存50％。7.Malchesky(美國專利5,932,171常August 3，1999)采用電泳液產(chǎn)生的陰極電解液和陽極電解液的消毒儀器來進(jìn)行醫(yī)療器械的消毒。
上述方法大都針對來源于血液制品或人和動(dòng)物組織來源的制品進(jìn)行去除病毒的處理。存在的問題是第一，不保證能去除所有病毒包括朊病毒；第二，不能保證被處理制劑的生物學(xué)活性不受影響；第三，不是普遍針對所有生物制劑和藥品生產(chǎn)。五、本發(fā)明的主要內(nèi)容由上可見，建立無病毒、無細(xì)菌、無熱源的生物藥物和生物制品，首先要解決如下2個(gè)關(guān)鍵問題1.建立一種從水、空氣、原材料中去除各類病毒、類病毒和朊病毒的通用性技術(shù)。
2.建立一整套檢測水、空氣、原材料、半成品和成品中各類病毒、類病毒和朊病毒的通用性技術(shù)。
據(jù)此，本發(fā)明的內(nèi)容為(一)建立從水中去除任何病毒的裝置。以確保用于生物制劑和藥品生產(chǎn)的水源是無菌、無病毒(包括朊病毒)的。
(二)建立從空氣去除任何病毒(包括朊病毒)的裝置。以確保用于生物制劑和藥品生產(chǎn)百級(jí)高效過濾器可造成無菌、無病毒的微環(huán)境。
(三)建立可以在生物制品生產(chǎn)線的全過程中監(jiān)控病毒污染的技術(shù)和生產(chǎn)線模型裝置。
(四)建立從水、空氣、血液、生物制劑和藥品的半成品和成品中檢測主要病毒群的新技術(shù)。
(五)建立“三無”產(chǎn)品的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。六、本發(fā)明的主要技術(shù)路線和方法建立無病毒、無菌、無熱源生物技術(shù)藥物生產(chǎn)系統(tǒng)的技術(shù)路線，是依據(jù)上述不同類型產(chǎn)品來決定的。
第一，不用人或動(dòng)物細(xì)胞、組織或器官制備的，也不含上述細(xì)胞、組織或器官成分作為保護(hù)劑的(生物)藥物和生物制品。
1.建立檢測生產(chǎn)菌(真菌包括酵母、細(xì)菌)噬菌體的敏感方法，以保證生產(chǎn)菌種是無病毒污染的。
2.除有保溫蒸溜水系統(tǒng)外，對一些不能高壓滅菌的溶液進(jìn)行去病毒處理，建立去除水源病毒的裝置基本原理是用物理方法。可以去除水中全部有胞膜和無胞膜病毒以及朊病毒。研究去除病毒效果的報(bào)告病毒為polio-1(疫苗株)，CoxB6，人乳頭瘤病毒，甲型流感病毒，人腺病毒，人皰疹病毒，朊病毒。將定量的上述報(bào)告病毒加入蒸餾水中，通過上述裝置，以最敏感的單一病毒檢驗(yàn)法以檢驗(yàn)去病毒的效果。其中polio-1(疫苗株)，CoxB6采用敏感細(xì)胞進(jìn)行檢測；人乳頭瘤病毒采用保守DNA序列進(jìn)行PCR檢測；甲型流感病毒采用雞胚尿囊分離技術(shù)；人腺病毒，人皰疹病毒采用敏感細(xì)胞進(jìn)行檢測；朊病毒用ELISA法檢測(需再考慮)。濃縮水裝置10升/1毫升。以保證生產(chǎn)全過程的用水是無病毒的。
清除病毒的效力是以病毒滴度減少的對數(shù)單位(log10)來表示(LTR)，即在處理前每單位體積樣品中的病毒濃度與處理后每單位體積樣品中的病毒濃度之比來表示。一般地說，清除病毒少于1個(gè)對數(shù)，認(rèn)為是方法本身的差異，該方法無顯著意義。
3.建立從大面積空氣中去除任何病毒的裝置。以確保用于生物制劑和藥品生產(chǎn)特種高效過濾器可造成空氣中無菌、無病毒環(huán)境，以便用于局部配互和分裝。去除空氣病毒的裝置的基本原理是物理方法?？梢匀コ諝庥邪ず蜔o胞膜病毒以及朊病毒。研究去除病毒效果的報(bào)告病毒為polio-1(疫苗株)，CoxB6，人乳頭瘤病毒，甲型流感病毒，人腺病毒，人皰疹病毒，朊病毒。將定量的上述報(bào)告病毒加入定量空氣中，通過上述裝置，以最敏感的單一病毒檢驗(yàn)法以檢驗(yàn)去病毒的效果。其中polio-1(疫苗株)，CoxB6采用敏感細(xì)胞進(jìn)行檢測；人乳頭瘤病毒采用保守DNA序列進(jìn)行PCR檢測；甲型流感病毒采用雞胚尿囊分離技術(shù)；人腺病毒，人皰疹病毒采用敏感細(xì)胞進(jìn)行檢測；朊病毒用ELISA法檢測。濃縮空氣裝置10升/1毫升。
4.用生物材料(血清或白蛋白)作為產(chǎn)品的添加劑，或所有添加劑為無病毒、無細(xì)菌、無熱源的材料。
5.在上述1-3研究的基礎(chǔ)上建立病毒污染質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。獲得國家藥品監(jiān)督管理局的認(rèn)可。
6.在上述1-3研究的基礎(chǔ)上建立通用性檢測用病毒芯片(代表500多種病毒)，對原料、半成品和成品進(jìn)行常規(guī)性病毒檢測。包括所有對人致病或潛在致病的病毒如polio-1-3型；CoxA和B；ECHO病毒；人乳頭瘤病毒L1保守序列；甲型、乙型流感病毒；副流感病毒；RSV；鼻病毒保守序列；人腺病毒保守和人皰疹病毒基因保守區(qū)；朊病毒另行采用ELISA法檢測。
7.利用上述技術(shù)建立封閉式生產(chǎn)系統(tǒng)，即“三無”生產(chǎn)線模型裝置，驗(yàn)證上述技術(shù)的可靠性。按照本研究的設(shè)計(jì)，向國外廠家訂貨。
第二，雖不用人或動(dòng)物細(xì)胞、組織或器官制備，但用人白蛋白等生物原料作為添加劑的(生物)藥物和生物制品。
1.除上述1-7條外，建立去除添加劑中病毒的裝置，基本原理是物理方法。
2.根據(jù)添加劑品種中可能存在的病毒，建立針對性病毒檢測方法和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
3.結(jié)合當(dāng)時(shí)病毒流行情況，建立特種病毒的檢測方法和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
(同第一，其實(shí)作為添加劑的人白蛋白等生物原料的生產(chǎn)流程最終也涉及“三無”)第三，使用人或動(dòng)物細(xì)胞、組織或器官制備的生物藥物和生物制品。
1.除上述1-7條外，建立去除動(dòng)物細(xì)胞、組織或均漿中病毒的裝置，基本原理是物理方法。
2.根據(jù)人或動(dòng)物細(xì)胞、組織或器官的種類，建立針對性的人和病毒檢測方法和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
3.用于基因治療的細(xì)胞產(chǎn)物，根據(jù)特殊情況，特殊要求。一種理想的清除病毒的方法應(yīng)具備下列特點(diǎn)1.滅活或去除病毒滴度的能力要高，同時(shí)產(chǎn)品回收率要高；2.所選擇的方法不改變產(chǎn)品的生物學(xué)成份和產(chǎn)品的質(zhì)量；3.滅活或清除病毒的機(jī)制是清楚的；4.所用方法可以升級(jí)提高的，并符合生產(chǎn)流程要求；5.所用方法可用于多種產(chǎn)品，即方法具有普遍性；6.所選擇的方法不再有污染的可能。
選擇特殊清除方法的可靠性要根據(jù)產(chǎn)品的特性來確定如蛋白質(zhì)的大小，它的構(gòu)象，對熱或其它滅活方法的穩(wěn)定性；潛在污染病毒的特點(diǎn)如病毒大小，穩(wěn)定性，是非有特殊的大分子，如脂質(zhì)膜等。
十分明顯，含有感染性或產(chǎn)生細(xì)胞病變的病毒的原料不能用于生物制品的生產(chǎn)。血液制品廠家常規(guī)要檢查血漿的來源是非污染有HIV、HCV和HBV。自1999年7月起，要用核酸擴(kuò)增技術(shù)(NAT)來檢測HCV-RNA。同樣，生物技術(shù)工廠所用的細(xì)胞系要系統(tǒng)檢查其一致性和純度，以及感染因子的存在。
權(quán)利要求
1.一種無病毒生物技術(shù)藥物生產(chǎn)系統(tǒng)，其特征在于生物制品生產(chǎn)流程為全封閉管道式生產(chǎn)，具有從水(或其它溶液)中去除任何病毒的裝置，以確保用于生物制劑和藥品生產(chǎn)的溶液是無菌、無病毒的；具有從空氣去除任何病毒的裝置，以確保用于生物制劑和藥品生產(chǎn)局部用的高效過濾器可造成局部無菌、無病毒環(huán)境；具有監(jiān)控病毒污染的方法，可以從水、空氣、血液、生物制劑和藥品的半成品和成品中檢測主要病毒群的病毒芯片及相應(yīng)儀器和設(shè)備。
2.根據(jù)權(quán)利要求1設(shè)計(jì)的從水(或其它溶液)中去除任何病毒的裝置。其特征在于除有保溫蒸溜水系統(tǒng)外，對一些不能高壓滅菌的溶液進(jìn)行去病毒處理，建立了去除水源病毒的裝置基本原理是用物理方法?？梢匀コ腥坑邪ず蜔o胞膜病毒以及朊病毒。并包括濃縮水裝置10升/1毫升。
3.根據(jù)權(quán)利要求1設(shè)計(jì)的從大面積空氣中去除任何病毒的裝置。其特征在于去除空氣病毒的裝置的基本原理是物理方法?？梢匀コ諝庵杏邪ず蜔o胞膜病毒以及朊病毒。以確保用于生物制劑和藥品生產(chǎn)特種高效過濾器可造成空氣中無菌、無病毒環(huán)境，以便用于局部配互和分裝。
4.根據(jù)權(quán)利要求1設(shè)計(jì)的監(jiān)控和檢測主要病毒群的病毒芯片及相應(yīng)儀器和設(shè)備。其特征在于根據(jù)病毒DNA序列同源性設(shè)計(jì)的多種病毒檢測的多組合DNA芯片和設(shè)備，并與生產(chǎn)流程的各個(gè)環(huán)節(jié)相連接，可直接用于檢測病毒存在的可能性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1建立的可以在生物制品生產(chǎn)線的全過程中監(jiān)控病毒污染的技術(shù)和生產(chǎn)線模型裝置。其特征在于整個(gè)模型裝置以現(xiàn)代生物技術(shù)藥物生產(chǎn)線為基礎(chǔ)，進(jìn)行全管道封閉式的設(shè)計(jì)，并包括上述權(quán)利1，2，3，4所提的所有防止、去除和檢測病毒污染的設(shè)備和儀器，可直接用于驗(yàn)證特定生物制品生產(chǎn)線去病毒和生產(chǎn)的能力。
6.根據(jù)權(quán)利要求1建立的不同類型生物制品和/或特定生物制品的質(zhì)控標(biāo)。其特征在于依據(jù)不同類型產(chǎn)品來決定建立針對性的病毒檢測方法和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合當(dāng)時(shí)病毒流行情況，建立特種病毒的檢測方法和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。
全文摘要
近半個(gè)世紀(jì)以來，在生物制品生產(chǎn)過程中對微生物污染的質(zhì)控要求主要是無菌、無熱源；對病毒污染，除特定病毒外，尚無無病毒的普遍要求和相應(yīng)的質(zhì)控手段。本發(fā)明旨在建立生物制品和藥品的無病毒生產(chǎn)規(guī)范及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。無病毒生產(chǎn)規(guī)范則包括有效地在原材料(水等)和生產(chǎn)流程中(空氣，設(shè)備，人員等)去除或/和滅活病毒的裝置及監(jiān)控病毒污染的技術(shù)和設(shè)備；質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)則主要針對半成品和成品中病毒潛在存在的檢測標(biāo)準(zhǔn)和量化的具體要求。這對提高生物制品和藥品的質(zhì)量，保障人民健康將起重大作用。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1406631SQ0114205
公開日2003年4月2日 申請日期2001年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月10日
發(fā)明者侯云德, 段招軍, 舒躍龍, 徐義輝, 張麗蘭 申請人:北京東康龍病毒生物技術(shù)工程研究中心