專利名稱：一種耐熱、抗蛋白酶的酸性－中性木聚糖酶及其基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種木聚糖酶及其基因，本發(fā)明還涉及一種動(dòng)物飼料。
現(xiàn)在普遍認(rèn)為，木聚糖可能通過多種方式影響飼料的營養(yǎng)價(jià)值和動(dòng)物對(duì)飼料的消化利用。其中最直觀的原因是可溶性木聚糖能結(jié)合大量的水，使采食動(dòng)物消化道中食糜的體積增大、粘度升高，影響胃腸道運(yùn)動(dòng)對(duì)食糜的混合效率，從而影響消化酶與底物接觸和消化產(chǎn)物向小腸上皮絨毛滲透，進(jìn)一步影響了動(dòng)物對(duì)飼料的消化和養(yǎng)分吸收。木聚糖還可能與消化酶或消化酶活性必需的其它成分(如膽汁酸或無機(jī)離子等)結(jié)合而影響消化酶的活性。另外由于木聚糖是細(xì)胞壁的主要成分，不能被消化酶水解，大分子消化酶也不能通過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因而對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物形成了一種包被結(jié)構(gòu)，木聚糖的這種包被作用也會(huì)干擾有些谷物細(xì)胞內(nèi)其它養(yǎng)分的消化吸收。另外，木聚糖使采食動(dòng)物對(duì)養(yǎng)分吸收減少，而在腸道的蓄積增加，這為腸道微生物的繁殖提供了良好的環(huán)境，大量有害微生物的增殖，會(huì)產(chǎn)生許多酸性物質(zhì)，改變腸道pH環(huán)境，從而影響消化酶發(fā)揮最佳效應(yīng)，同時(shí)微生物會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，降低物質(zhì)的利用率。
由于木聚糖具有上述抗?fàn)I養(yǎng)活性，在實(shí)際生產(chǎn)中，飼糧中木聚糖不能有效降解，會(huì)顯著降低營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，降低采食量，影響畜禽的生產(chǎn)性能。粘性糞便的排泄，給衛(wèi)生控制帶來困難，畜禽發(fā)病率增加；同時(shí)，還能影響禽蛋色素的沉積，使肉禽胴體色質(zhì)偏白，降低胴體等級(jí)。(Morgan A J et al.Proc Aust Poult Sym，，7109～115，1995)木聚糖酶是能夠降解木聚糖的一類水解酶。研究結(jié)果表明，飼料中如果添加木聚糖酶，就可顯著降低或消除木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用。其具體作用及機(jī)理包括(1)添加木聚糖酶和β-葡聚糖酶后，將大分子的多聚糖降解成分子量較小的多糖片段，從而降低食糜的粘稠性。加拿大Sasktoon大學(xué)的研究證實(shí)，雛雞活體增重和料重比與前腸食糜粘度的對(duì)數(shù)之間存在一種線性關(guān)系；美國商業(yè)聯(lián)合體的試驗(yàn)證明，大麥飼糧中添加酶制劑使肉雞腸道內(nèi)容物粘度由37.0CPS下降到6.4CPS；Badford和Classen(1991)證實(shí)，70％-80％的雛雞增重與飼料轉(zhuǎn)化率的提高是由食糜粘度下降引起的。腸內(nèi)容物粘度的降低有利于消化酶和營養(yǎng)物質(zhì)的充分混合，降低不動(dòng)水層的厚度，減少膽汁酸的排出，利于腸道的消化吸收，從而提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率；(2)提高內(nèi)源性消化酶活性，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)尤其是脂肪和蛋白質(zhì)的消化和吸收。王振來(1997)在仔豬上的試驗(yàn)證實(shí)，添加外源木聚糖酶提高了腸內(nèi)容物中的總蛋白水解酶、淀粉酶和脂肪酶活力。但它如何提高內(nèi)源酶活的機(jī)理還不清楚；(3)添加木聚糖酶和β-葡聚糖酶后，可以降低因粘度過高而引起的營養(yǎng)物質(zhì)在腸道的蓄積，從而減少腸道細(xì)菌群落，這種變化可以使腸壁變薄，改善營養(yǎng)吸收，同時(shí)腸道中沙門氏桿菌的減少，可以降低膽汁鹽的早期解離，有助脂肪的消化。細(xì)菌群落的削弱可以降低動(dòng)物的腹瀉率，有利于畜禽的健康生長；(4)木聚糖是植物細(xì)胞壁的成分之一，畜禽內(nèi)源性消化酶不能分解木聚糖，細(xì)胞壁內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)難以釋放出來，木聚糖酶可以分解木聚糖而破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使消化酶能與營養(yǎng)物質(zhì)充分接觸，另一方面，木聚糖的降解，可以使與之相結(jié)的蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪游離出來，有利于營養(yǎng)的消化，提高動(dòng)物采食量、增重和飼料轉(zhuǎn)化率。
我國農(nóng)業(yè)部第105號(hào)公告中，在制定的《允許使用的飼料和飼料添加劑品種目錄》上，將木聚糖酶列入飼料級(jí)酶制劑。目前在我國已有一些飼料廠生產(chǎn)木聚糖酶，但僅限于自用，由于其產(chǎn)量低，成本高，未形成產(chǎn)業(yè)化。目前，對(duì)木聚糖酶等聚糖酶作為飼料添加劑的應(yīng)用效果的研究較多，但對(duì)其理化性質(zhì)、作用機(jī)理、活性測(cè)定、適宜添加量等理論研究方面還比較薄弱，有待深入研究。木聚糖酶在飼料行業(yè)中的應(yīng)用面臨產(chǎn)量低、成本高、耐熱性差及抗動(dòng)物胃腸道中的蛋白酶能力弱等問題，亟待篩選適合于飼料中應(yīng)用的性質(zhì)優(yōu)良的木聚糖酶，并運(yùn)用基因工程和蛋白質(zhì)工程手段來規(guī)?；畠r(jià)生產(chǎn)。
對(duì)木聚糖酶的研究早在六十年代就已開始，主要研究集中在適合于食品工業(yè)、制漿造紙工業(yè)、能源工業(yè)等方面的木聚糖酶，已經(jīng)從不同來源的微生物中分離到大量的不同類型不同功能的木聚糖酶。研究得較為清楚的有Trichoderma reesei(里氏木霉)、Aspergillus niger(黑曲霉)、Streptomyces lividans(淺青紫鏈霉菌)、Cellulomonas fimi(糞肥桿菌)、Clostridium thermocellum(熱纖維梭菌)、Penicillium simplicissimum(簡青霉)等所產(chǎn)生的木聚糖酶。最近十幾年，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，特別是基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們對(duì)木聚糖酶的了解更加深入，已經(jīng)分離出多種木聚糖酶基因，并已工業(yè)化生產(chǎn)多種木聚糖酶產(chǎn)品。表一列舉了部分已克隆到的木聚糖酶基因。
表一近年來克隆出的部分木聚糖酶基因菌株來源基因名稱 參考文獻(xiàn)Thermotoga neapolitanaxynAZverlov et al.1996Clostridium thermocellum xynA，B Hayashi，et al.1999Trichoderma longibrachiatum xyn Bedford et al.1997Thermomyces lanuginosus xyn Hansen et al.1998Fibrobacter succinogens xynCParadis et al.1993Cellulomonas fimi xynCClarke et al.1996Rhodothermus marinus xyn1Nordberg et al.1997Caldicellulosiruptor Rt69BxynA，B，C，D Morris et al.1999Cellulomonas sp. xcs16 Chaudhary et al.1997Streptomyces halstediixyslRuiz-arribas et al.1997Dictyoglomus thermophilum xynBMorris et al.1998Bacillus strain N137 xyaATabernero et al.1995Thermotoga maritime. xynAWinterhalter et al.1995Thermotoga neapolitanaxynAZverlov et al.1996Neocallimastix patriciarumxynBBlack et al.1994Bacillus stearothermophilus xynAGat et al.1994Bacillus sp. xynBBlanco et al.1996Thermoanaerobacterium.xynALee et al.1993saccharolyticumCaldocellum saccharolyticum xynALüthi et al.1990Raminococcus flavefaciens xynDFlint et al.1993Cochliobolus carbonum xyllPatricia et al.1993Butyrivibrio fibrisolvens xynBLin et al.1993Streptomyces lividans xyhA，B，C Moreau et al.1994Penicillium sp.40 xynAKimura et al.2000Bacillus sp.BT-7 bx1，2，3 Tong et al.1999
在木聚糖酶基因的表達(dá)方面，近年來已有了許多有益的嘗試。1990年Luthi等用大腸桿菌(Escherichia coli)為受體菌嘗試表達(dá)來源于Caldocellum sacharolyticum的耐熱木聚糖酶基因xynA，控制xynA的啟動(dòng)子采用表達(dá)載體PJLA602上的溫度誘導(dǎo)的pR和pL啟動(dòng)子。xynA的表達(dá)量可達(dá)到細(xì)胞總蛋白的20％以上。并且表達(dá)的XYNA具有正常的生物學(xué)活性，與原始天然酶無顯著差異(Lüthi E et al.Appli.and EnviroMicrobio，562677～2683，1990)。1993年Sung等根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏向人工合成環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)木聚糖酶編碼基因，并采用lac啟動(dòng)子，結(jié)果重組木聚糖酶在細(xì)胞周質(zhì)中的表達(dá)量高達(dá)300mg/L發(fā)酵液(Sung W L et al.Protein Expr.Purif.，4200～206，1993)。1993年Shendye、1996年Lapidotd等也同樣利用大腸桿菌做為受體菌分別表達(dá)了來源于Bacillus的耐熱木聚糖酶，后者用T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)木聚糖酶基因，表達(dá)量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的70％。(Shendye A et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.，，195776～784，1993；Shendye A，et al.FEMS Microbiol.Lett.，108297～302，1993；Lapidot A et al.J.Biotechnol.51259～264，1996)。1994年Wakarchuk等在木聚糖酶中引入Ser，形成不影響其活性的二硫鍵，使其耐熱性提高了15℃。(Wakarchuk WW et al.Protein Engineering，71379～1386，1994)。1999年Sung等對(duì)來源于Trichoderma reesei的XYNII和Bacillus circulans的木聚糖酶進(jìn)行了改良，通過點(diǎn)突變、取不同木聚糖酶的片斷組成雜合酶、在酶N端加不超過10個(gè)氨基酸等方法，將酶的耐熱性提高了28℃之多。(Sung et al.UnitedStates patent，5866408，1999)。同年，Moreau等通過不同點(diǎn)突變將來源于Streptomyces lividans的XYLA的特異性酶活性提高了10％到25％不等，酶的半衰期最高提高了47％，而突變酶酶反應(yīng)的pH性質(zhì)與天然酶相同。(Moreau A et al.Enzyme Microb.Technol，16420～424.，1994)在我國，對(duì)木聚糖酶的研究最近十幾年才開始，但現(xiàn)在基本上還限于對(duì)產(chǎn)木聚糖酶天然優(yōu)良菌株的篩選、木聚糖酶純化及性質(zhì)分析上，僅克隆了少數(shù)木聚糖酶基因，運(yùn)用基因工程手段來產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)木聚糖酶產(chǎn)品還未見報(bào)道。
飼料專用的木聚糖酶的研究近幾年才開始，有別于食品、造紙、能源工業(yè)上應(yīng)用的木聚糖酶，應(yīng)用于飼料中的木聚糖酶在性質(zhì)上有著特殊的要求。真正適合于在飼料中應(yīng)用的包括木聚糖酶等各種酶制劑必須同時(shí)具備以下3個(gè)特殊性質(zhì)1.酶具有好的熱穩(wěn)定性而在常溫下又必須具備高活性。在飼料生產(chǎn)上，飼料加工都需經(jīng)過一個(gè)制粒工藝，在制粒過程中有一個(gè)持續(xù)時(shí)間為數(shù)分鐘的高溫過程，一般在75～93℃的范圍內(nèi)，這就要求飼料用酶必須能耐高溫。但另一方面，飼料用酶又必須在常溫下具有較高的酶活性，因?yàn)轱暳嫌妹缸罱K的作用場(chǎng)所是動(dòng)物正常體溫的腸胃道中，這與工業(yè)上所使用的一些在高溫條件下反應(yīng)的高溫酶不同。2.酶在酸性和中性的范圍內(nèi)均具有高活性。飼料用酶的作用環(huán)境是動(dòng)物的胃腸道，單胃動(dòng)物的胃呈酸性，pH值在2.0～3.5，進(jìn)入腸道后pH值逐漸升高，直至pH達(dá)到6.5-7.0，這就要求優(yōu)良的飼料用酶的最適pH為酸性，而且在pH2.0到6.5的這一范圍內(nèi)均能維持高活性，這樣酶的作用時(shí)間最長，能最高地發(fā)揮其效率。3.酶有較強(qiáng)的抗蛋白酶降解能力。動(dòng)物在胃腸道中分泌胃蛋白酶、胰蛋白酶等多種蛋白酶以消化食物，飼料用酶本身就是一種蛋白質(zhì)，也有可能被這些蛋白酶降解而失去活性，這就要求飼料用酶必需對(duì)動(dòng)物胃腸道中的蛋白酶有一定的抗性。另外，在復(fù)合飼料用酶制劑中則還需考慮各種飼料用酶對(duì)復(fù)合酶中的蛋白酶的抗性問題。到目前為止，還未有同時(shí)具備上述3種特性的木聚糖酶的報(bào)道。
本發(fā)明人篩選到一種天然菌株，它所產(chǎn)生的木聚糖酶適合于在飼料中使用。這種木聚糖酶XYNB同時(shí)具有好的熱穩(wěn)定性而在常溫下又必須具備高活性、在酸性和中性的范圍內(nèi)均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本發(fā)明篩選到的鏈霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1所產(chǎn)生的木聚糖酶，其最適pH值為4.6，在pH2～7的范圍內(nèi)維持60％以上的酶活性；最適溫度為50℃，在80℃下處理30分鐘，酶活性維持在80％以上；用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理30分鐘，酶活性維持在98％。這種性質(zhì)的木聚糖酶還未曾有過報(bào)道。該酶的氨基酸序列示于SEQ ID NO2。
本發(fā)明的分離克隆到此木聚糖酶的編碼基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，為此基因的改造并在各種外源基因表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)提供優(yōu)良的基因材料。通過PCR的方法分離克隆了這一木聚糖酶基因xynB，DNA全序列分析結(jié)果表明，編碼成熟蛋白的結(jié)構(gòu)基因全長576個(gè)核苷酸，編碼191個(gè)氨基酸。氨基酸序列表明，N端前十個(gè)氨基酸與目前報(bào)道的來源于鏈霉菌的G/11組木聚糖酶蛋白N端序列有很高的同源性，但XYNB成熟蛋白完整的氨基酸序列與GeneBank上各種木聚糖酶氨基酸序列同源性比較，最高的僅為86％，說明XYNB是一種新的木聚糖酶。XYNB的氨基酸序列中僅有催化區(qū)，沒有纖維素結(jié)合區(qū)(CBD)。
土樣和堆肥樣品按常規(guī)稀釋后涂布于產(chǎn)酶培養(yǎng)基(2％木聚糖，1％牛肉胨，0.3％酵母培養(yǎng)物，1％磷酸氫二鉀，0.05％硫酸鎂，1.5％瓊脂糖，pH5.0)平板上，35℃培養(yǎng)5～6d，挑取產(chǎn)生透明圈菌落在產(chǎn)酶培養(yǎng)基平板劃線分離，重復(fù)劃線分離過程3輪，使菌株純化。通過此方法篩選到分泌木聚糖酶的菌株230株。
為了從中篩選到酶學(xué)性質(zhì)符合要求的木聚糖酶產(chǎn)生菌株，這些菌株分別在液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，培養(yǎng)液經(jīng)稀釋后進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的初步判定。酶學(xué)測(cè)定采用國際通用的Somogyi-Nelson法，將0.25ml 0.5％的可溶性4-O-Me-D-glucurono-D-xylan(Sigma公司，F(xiàn)rom birchwood)溶液與0.2ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液加入試管，放入55℃水浴中預(yù)熱3min。再將0.05ml已經(jīng)稀釋好的酶液加入到試管中，繼續(xù)在37℃水浴中反應(yīng)10min，向試管中加入0.5ml Somogyi試劑(堿性銅試劑)終止反應(yīng)，將試管在沸水中加熱15min，立即用流水冷卻到室溫，向試管中加入0.5ml Nelson試劑(砷鉬酸鹽試劑)顯色，在Voltex mixer上劇烈攪拌，室溫下放置10min，加入1ml蒸餾水，10000rpm離心5分鐘，去除絮狀物。500nm處測(cè)吸光值。對(duì)照為先將0.05ml酶液加入到0.2ml檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，在100℃沸水中煮20分鐘滅活，再加入同體積的底物保溫。木聚糖酶活性單位(U)定義為在一定條件下，每分鐘由木聚糖釋放出1μmol木糖所需的酶量。
首先進(jìn)行酶促反應(yīng)的pH測(cè)定，每個(gè)菌株所產(chǎn)的木聚糖酶均在pH3和pH6.5的緩沖系統(tǒng)中同時(shí)測(cè)定酶活性，如果一種木聚糖酶在這兩個(gè)pH條件下酶活性相互差異超過25％，則淘汰，因?yàn)槲覀円Y選的是在酸性和中性條件下均具有較高酶活性的木聚糖酶。通過這種方法，初步篩選到pH特性可能符合要求的菌株22株。
下一步進(jìn)行酶熱穩(wěn)定性的初篩，上述22株菌株所產(chǎn)的木聚糖酶，分別在70℃下保溫30分鐘，再在常溫下測(cè)定酶活性，與未作70℃處理的同一木聚糖酶的酶活性相比較，篩選剩余酶活性達(dá)到70％以上的木聚糖酶，這種木聚糖酶可能會(huì)具有較好的熱穩(wěn)定性。通過這一方法，從上一步的22株菌株中篩選到7株。
再進(jìn)一步對(duì)木聚糖酶抗蛋白酶能力進(jìn)行初步測(cè)定，上一步篩選到的7株菌株產(chǎn)生的木聚糖酶，分別取0.5ml稀釋液，各加入0.5ml胃蛋白酶和0.5ml胰蛋白酶(0.1mg/ml，用pH2.0、0.1mol/L Gly-HCl緩沖液配制)，混合后pH約3.5，于37℃處理30min，再用常規(guī)方法測(cè)酶活性，以未作處理的酶活性為對(duì)照，酶活性損失在5％以內(nèi)的說明其有較強(qiáng)的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力。通過此步篩選，分離到符合要求的菌株一株，經(jīng)初步鑒定為Streptomyces olivaceoviridis，命名為Streptomyces olivaceoviridis A1，并做為進(jìn)一步研究的材料。
實(shí)驗(yàn)二本實(shí)驗(yàn)說明木聚糖酶的純化程序。
首先進(jìn)行木聚糖酶的硫酸銨沉淀，菌株在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)6～7天后，離心取上清酶液，將粗酶液置于冰浴中，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨至50％飽和度，置冰上2小時(shí)，然后13000rpm離心30min，取沉淀，沉淀用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液重溶，成為濃縮酶液。接著進(jìn)行離子交換層析純化，將濃縮酶液上HiTrap Q Sepharose XL(amersham pharmaciabiotech預(yù)裝柱)陰離子柱。加樣0.5ml，先用pH9.0、0.02mol/L的Tris-HCl緩沖溶液洗脫平衡柱子，改用相同緩沖液配制的0～1mol/L NaCl梯度洗脫，流速為2ml/min，分部收集，每管1ml。然后對(duì)收集管中的溶液測(cè)酶活并進(jìn)行蛋白電泳分析。最后進(jìn)行凝膠層析分離，將經(jīng)離子交換柱層析后的檢測(cè)有酶活的收集樣再經(jīng)一次分子篩Superdex 75 HR 10/30(amersham pharmacia biotech預(yù)裝柱)，加樣0.5ml，用pH5.7檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液洗脫，流速為0.4ml/min，分部收集，每管1ml，得到純木聚糖酶XYNB。
分別測(cè)定了以上各步樣品的酶活力、蛋白質(zhì)含量并進(jìn)行了SDS-PAGE。純化結(jié)果見表1，粗酶液經(jīng)幾步純化后，比活從154.64U/mg提高到2869.78/mg，純化倍數(shù)為18.56倍，得率8.6％。蛋白電泳結(jié)果(

圖1)表明，純化后的木聚糖酶蛋白在電泳上為單一條帶，分子量約為23kD。
表1木聚糖酶XYNB純化步驟及結(jié)果體積(ml) 總酶活(U)比活(U/mg) 得率(％)粗酶液10749.67 154.64100濃縮液0.5 171.34 162.4022.9過離子柱 5 130.50 1124.20 17.4過分子篩 1264.322869.78 8.6注蛋白質(zhì)濃度用考馬斯亮蘭法測(cè)定實(shí)驗(yàn)三本實(shí)驗(yàn)說明木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定方法。
木聚糖酶的最適pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定方法如下經(jīng)純化的木聚糖酶在不同的pH值下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中37℃下進(jìn)行木聚糖酶活力測(cè)定。結(jié)果(圖2)表明，XYNB的最適pH為4.6，在pH2～7的范圍內(nèi)，酶活性均維持在最大酶活性的60％以上。木聚糖酶于上述各種不同pH的緩沖液中37℃處理30min，再在pH4.6緩沖液體系中37℃下測(cè)定酶活性，以研究酶的pH耐性。結(jié)果(圖3)表明，木聚糖酶在pH1～9的范圍內(nèi)穩(wěn)定，說明此酶具有較好的耐酸堿性。
木聚糖酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定方法如下木聚糖酶的最適溫度的測(cè)定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH4.6)緩沖液體系及不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。耐溫性測(cè)定為木聚糖酶在不同溫度下處理不同時(shí)間，再在37℃下進(jìn)行酶活性測(cè)定。酶反應(yīng)最適溫度測(cè)定結(jié)果(圖4)表明，其最適溫度為50℃。酶的熱穩(wěn)定性性試驗(yàn)表明(圖5)，80℃處理30min后，剩余酶活還有85％左右，處理60min后，酶活性依然維持在70％以上。
木聚糖酶的Km值測(cè)定方法如下用不同濃度的木聚糖(4-O-Me-D-glucurono-D-xylan，Sigma Frombirchwood)為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH4.6)緩沖液體系中，37℃下測(cè)定酶活性，計(jì)算出其在37℃下的km值。經(jīng)測(cè)定，此木聚糖酶在37℃下以木聚糖為底物的km值為22.1(g/Kg)，最大反應(yīng)速度Vmax為105.26(μmol/ml·min)不同化學(xué)試劑對(duì)XYNB酶活的影響測(cè)定如下各種化合物(終濃度為1mmol/L)與酶液在37℃下保溫30min，然后按常規(guī)方法測(cè)定酶活力，以對(duì)照的酶活力為100％。結(jié)果(表2)表明，只有Mg2+、Cr3+對(duì)XYNB有輕微的激活作用，其余沒有顯著作用。
表二各種化學(xué)試劑對(duì)木聚糖酶XYNB活力的影響濃度 剩余酶活性試劑(mol/L) (％)CK100KCl 10-3100MgCl210-3115CaCl210-3104ZnSO410-397CrCl310-3110EDTA 10-3107CuSO410-392SDS 10-3101木聚糖酶的纖維素酶活性測(cè)定方法如下用0.5％甲基纖維素M20作底物，其余與測(cè)木聚糖酶活性相同來測(cè)纖維素酶活性，結(jié)果表明此木聚糖酶無纖維素酶活性。
木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力測(cè)定如下0.5ml木聚糖酶溶液，加入0.5ml胃蛋白酶、胰蛋白酶(0.1mg/ml，用pH2.0、0.1mol/L Gly-HCl緩沖液配制)，混合后pH約3.5，于37℃處理30min，然后再用常規(guī)方法測(cè)酶活，結(jié)果表明酶活無影響，說明此酶具有良好的抗胃蛋白酶、胰蛋白酶能力。
對(duì)純化后的XYNB成熟蛋白N端進(jìn)行了氨基酸序列測(cè)定，結(jié)果表明其N-端的前10個(gè)氨基酸序列為A-T-V-I-T-T-N-Q-T-G。
實(shí)驗(yàn)四本實(shí)驗(yàn)說明木聚糖酶成熟蛋白編碼基因xynB的分離克隆程序菌株在液體培養(yǎng)基(木聚糖20g/L、牛肉胨10g/L、酵母培養(yǎng)物3g/L、磷酸氫二鉀10g/L、硫酸鎂0.5g/L，pH5.4)中35℃、240rpm培養(yǎng)3～4天，10000rpm離心沉淀收集菌體，取500mg菌體沉淀，無菌水洗滌，離心沉淀，沉淀重懸于5mL溶菌酶溶液(2mg/mL溶菌酶、50μg/mL RNase、0.3mol/L蔗糖、25mmol/L Tris-HCl、25mmol/L EDTA，pH8.0)中，37℃下保溫30分鐘，再加入1mL溶菌酶溶液，45℃下保溫30分鐘，加入3mL 2％SDS并攪拌，直到溶液濃度顯著下降，加入9mL酚(Tris飽和)，離心取上清，用等體積的苯酚-氯仿、氯仿依次抽提，酒精沉淀DNA后溶于pH8.0的TE中備用。
根據(jù)測(cè)定的此木聚糖酶N端氨基酸序列合成簡并引物(P15’ATCACCACCAACCAGACCGGC 3’)，另一端的引物采用20個(gè)隨機(jī)引物，分別與引物P1組對(duì)，以Streptomyces olivaceoviridis A1總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃變性1min、50℃退火45sec、72℃延伸1min；循環(huán)30輪后72℃保溫10min。其中一組引物擴(kuò)增到了約1kb的PCR片段。根據(jù)測(cè)定的此蛋白的分子量，推斷此酶蛋白氨基酸個(gè)數(shù)應(yīng)在200個(gè)左右，相應(yīng)的基因長度不超過1.kb左右，推斷此PCR片段為可能為我們擬克隆的木聚糖酶編碼基因。通過序列測(cè)定表明，此基因長576個(gè)核苷酸，編碼191個(gè)氨基酸，根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)出的N-端氨基酸序列與純化蛋白的氨基酸序列測(cè)定結(jié)果一致?？寺〉降拇嘶蚺cGenebank上的木聚糖酶基因序列進(jìn)行同源比較，結(jié)果表明，它與報(bào)道的來源于鏈霉菌的木聚糖酶有同源性，說明我們克隆到的基因是木聚糖酶的編碼基因，但其核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高的均僅為86％，綜合其酶學(xué)性質(zhì)上的顯著差異，說明此木聚糖酶基因?yàn)橐恍禄颉?br> 此基因我們進(jìn)一步在大腸桿菌中驗(yàn)證了其基因功能。在大腸桿菌中表達(dá)的木聚糖酶具有正常的生物學(xué)活性，這進(jìn)一步證明了我們克隆到的基因是有功能的木聚糖酶基因。
序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>一種耐熱\抗蛋白酶的酸性-中性木聚糖酶及其基因<130>I2001244<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>576<212>DNA<213>Streptomyces olivaceoviridis<220><221>CDS<222>(1)..(576)<223><400>1gcc acg gtc atc acc acc aac cag acc ggc acc aac aac ggg ttc tac 48Ala Thr Val Ile Thr Thr Asn Gln Thr Gly Thr Asn Asn Gly Phe Tyr1 5 10 15tac tcc ttc tgg acc gac ggc ggc ggt tcg gtc tcg atg acc ctg aac 96Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ser Val Ser Met Thr Leu Asn20 25 30tcc ggc ggc aac tac agc acc tcg tgg acg aac tgc ggg aac ttc gcc 144Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Thr Ser Trp Thr Asn Cys Gly Asn Phe Ala35 40 45gcc ggc aag ggc tgg agc aac ggc gga cgc agg aac gtg cag tac tcg 192Ala Gly Lys Gly Trp Ser Asn Gly Gly Arg Arg Asn Val Gln Tyr Ser50 55 60ggc agc ttc tac ccg tcc ggc aac ggc tac ctg gcg ctg tac ggg tgg 240Gly Ser Phe Tyr Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp65 70 75 80acc tcg aac ccg ctc gtc gag tac tac atc gtc gac aac tgg ggc aac 288Thr Ser Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Asn85 90 95tac cgg ccc acc gga acg tac aag ggc acg gtc acc agc ggc ggc ggc 336Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Gly Gly Gly100 105 110acg tac gac gtc tac cag acg acg cgg tac aac gcc ccc tcc gtg gaa 384Thr Tyr Asp Val Tyr Gln Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Val Glu115 120 125ggc acc aag acc ttc aac cag tac tgg agc gtc cgg cag tcc aag cgg 432Gly Thr Lys Thr Phe Asn Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg130 135 140acc ggc ggc acc atc acc acc ggc aac cac ttc gac gcc tgg gcc cgc 480Thr Gly Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg145 150 155 160tac ggc atg caa ctg ggc agc ttc agc tac tac atg atc ctc gcc acc 528Tyr Gly Met Gln Leu Gly Ser Phe Ser Tyr Tyr Met Ile Leu Ala Thr165 170 175gag ggc tac cag agc agc ggc tcc tcc aac atc acg gtc agc ggc tga 576Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Asn Ile Thr Val Ser Gly180 185 190<210>2<211>191<212>PRT<213>Streptomyces olivaceoviridis<400>2Ala Thr Val Ile Thr Thr Asn Gln Thr Gly Thr Asn Asn Gly Phe Tyr1 5 10 15Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Gly Gly Gly Ser Val Ser Met Thr Leu Asn20 25 30Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Thr Ser Trp Thr Asn Cys Gly Asn Phe Ala35 40 45Ala Gly Lys Gly Trp Ser Asn Gly Gly Arg Arg Asn Val Gln Tyr Ser50 55 60Gly Ser Phe Tyr Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp65 70 75 80Thr Ser Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Asp Asn Trp Gly Asn85 90 95Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Thr Val Thr Ser Gly Gly Gly100105 110Thr Tyr Asp Val Tyr Gln Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Val Glu115 120 125Gly Thr Lys Thr Phe Asn Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg130 135 140Thr Gly Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg145 150 155 160Tyr Gly Met Gln Leu Gly Ser Phe Ser Tyr Tyr Met Ile Leu Ala Thr165 170 175Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Asn Ile Thr Val Ser Gly180 185 190<210>3<211>21<212>DNA<213>Artificial<400>3atcaccacca accagaccgg c 2權(quán)利要求
1.一種木聚糖酶，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的木聚糖酶的基因。
3.按照權(quán)利要求2所述的基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
4.一種動(dòng)物飼料，它含有權(quán)利要求1所述的木聚糖酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可適用于動(dòng)物飼料的木聚糖酶及其編碼基因。此木聚糖酶具有熱穩(wěn)定性好、在酸性和中性pH下均有高活性、抗胃蛋白酶和胰蛋白酶降解等優(yōu)良特性，做為一種新型的飼料添加劑，可廣泛用于單胃畜禽和魚類的飼料中。
文檔編號(hào)C12N9/42GK1405304SQ0114216
公開日2003年3月26日 申請(qǐng)日期2001年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月14日
發(fā)明者姚斌, 范云六, 張紅蓮, 王亞茹, 操時(shí)樹, 史秀云, 袁鐵錚 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所