專利名稱：應(yīng)用多重pcr技術(shù)的基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明應(yīng)用多重PCR技術(shù)的基因芯片涉及一種基因芯片及其制備方法和檢測(cè)方法?；蛐酒且环N在固態(tài)基底上有序排列的核酸分子，以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA或RNA并行檢測(cè)、識(shí)別、鑒定和診斷的器件?？蓱?yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction)簡(jiǎn)稱PCR，是一種模擬天然DNA復(fù)制的體外擴(kuò)增法。通過試管反應(yīng)使極少量的基因組DNA或RNA樣品中的特定基因片斷，在短短幾小時(shí)內(nèi)增加106倍，極大提高了檢測(cè)靈敏度，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，如在診斷遺傳性疾患，檢測(cè)臨床標(biāo)本中病原體的核酸序列、對(duì)法醫(yī)學(xué)標(biāo)本作遺傳學(xué)鑒定，以及分析激活癌基因中的突變情況包括分離、克隆、核酸序列分析、突變體和重組體的構(gòu)件和基因表達(dá)調(diào)控研究等?；蛐酒亲钪匾囊环N生物芯片，是指將大量探針分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過雜交信號(hào)的強(qiáng)弱判斷靶分子的數(shù)量。用該技術(shù)可將大量的探針同時(shí)固定于支持物上，所以一次可對(duì)大量核酸分子進(jìn)行檢測(cè)分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、檢測(cè)目的分子數(shù)量少、效率低等不足。它能在同一時(shí)間內(nèi)分析大量的基因，使人們準(zhǔn)確高效地破譯遺傳密碼。當(dāng)前多數(shù)公司在使用基因芯片的過程中都要對(duì)樣品進(jìn)行一定程度的擴(kuò)增即通過PCR使所需的核苷酸片段呈指數(shù)級(jí)增長以提高檢測(cè)的靈敏度。本發(fā)明在當(dāng)前基因芯片的基礎(chǔ)之上，將多重PCR(multiplex polymerase chain reaction)技術(shù)應(yīng)用于基因芯片。多重PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上改進(jìn)和發(fā)展起來的一種新的PCR擴(kuò)增技術(shù)?？稍谕籔CR反應(yīng)體系內(nèi)加入多對(duì)特異性引物，一次擴(kuò)增多個(gè)DNA或RNA片段，從而實(shí)現(xiàn)多種DNA或RNA片段的同時(shí)快速鑒定。常規(guī)PCR一次只能擴(kuò)增一種DNA或RNA片段，對(duì)需多個(gè)核苷酸片段的擴(kuò)增就無能為力，而且操作繁瑣費(fèi)時(shí)，成本又高。多重PCR有效地為臨床的混合感染，以及原因不明的患者的快速診斷，提供了快速、準(zhǔn)確的診斷手段，有效地減少了疾病的誤診和漏診；為生物的基因分型提供了簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的方法；更提高基因芯片的檢驗(yàn)效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種在待測(cè)DNA或RNA量較小的情況下，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)不同DNA或RNA片段的基因芯片，以及芯片的制備方法和檢測(cè)方法。
本發(fā)明的目的可通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)是將多重PCR的技術(shù)應(yīng)用于基因芯片，特點(diǎn)是將探針點(diǎn)陣于固相載體上，固相載體表面經(jīng)過封閉后，加入待測(cè)樣品的多重PCR產(chǎn)物的熒光標(biāo)記物，該熒光標(biāo)記物與固相探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，洗去未結(jié)合的物質(zhì)后，探針點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與樣品中待測(cè)成分的含量正相關(guān)。如圖1應(yīng)用多重PCR技術(shù)的基因芯片的反應(yīng)原理圖所示。
其中所述待測(cè)樣品的多重PCR產(chǎn)物的熒光標(biāo)記物，即為在DNA或RNA提取液中加入多對(duì)特異性引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，在同一反應(yīng)條件下一次擴(kuò)增多個(gè)DNA片段，并標(biāo)記熒光。
本發(fā)明所述待測(cè)樣品可以是血清、體液、組織液、細(xì)胞裂解液等提取的含有一種以上微量DNA的樣品或含有一種以上微量RNA的樣品、逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA樣品；所述特異性引物為與待測(cè)成分相互補(bǔ)的DNA片段；所述探針為待測(cè)成分相應(yīng)的DNA、RNA、cDNA或寡核苷酸。
應(yīng)用多重PCR技術(shù)的基因芯片的制造方法(1)選擇與待測(cè)成分相應(yīng)的探針，確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置；(2)將對(duì)照品、探針點(diǎn)印于固相載體上；(3)按照制作基因芯片的常規(guī)方法進(jìn)行固定、封閉、洗滌和干燥。
應(yīng)用多重PCR技術(shù)的基因芯片的使用方法(1)待測(cè)樣品的處理先針對(duì)樣品的待測(cè)成分設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物，以待測(cè)的DNA或RNA樣品為模板，將多對(duì)特異性引物同時(shí)加入，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物加入熒光標(biāo)記；(2)雜交反應(yīng)在點(diǎn)好樣的基因芯片上滴加熒光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，37℃避光溫育30分鐘，洗凈并室溫晾干；(3)反應(yīng)結(jié)束后，用專業(yè)的芯片掃描分析儀對(duì)基因芯片進(jìn)行結(jié)果的讀取和分析。
本發(fā)明的優(yōu)越性在于第一，本發(fā)明繼承了基因芯片高度集成化、高效率、高準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高、成本降低，能在同一時(shí)間內(nèi)分析大量基因。第二，將PCR技術(shù)應(yīng)用于基因芯片，從而使極少量的基因組DNA或RNA樣品中的特定基因片斷，在短短幾小時(shí)內(nèi)增加106倍，極大提高了檢測(cè)靈敏度。更節(jié)省所需樣品的量。第三，將多重PCR技術(shù)應(yīng)用于基因芯片，在同一PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入多對(duì)特異性引物，一次擴(kuò)增多個(gè)DNA或RNA片段，從而實(shí)現(xiàn)多種微量DNA或RNA的同時(shí)、快速鑒定。并進(jìn)一步提高了工作效率，降低成本。第四，應(yīng)用范圍廣，可廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?？捎糜诨蚍治?、生物分型、疾病的臨床診斷、分析等。第五，特異性高，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，可靠性高。


附圖1，應(yīng)用多重PCR技術(shù)的基因芯片的反應(yīng)原理圖。其中1-探針固定于固相載體上，2-加入帶熒光標(biāo)記的多重PCR產(chǎn)物，3-雜交結(jié)果待測(cè)DNA或RNA的多重PCR產(chǎn)物結(jié)合于相應(yīng)的探針上。
附圖2，實(shí)施例一圖，將本發(fā)明用于腦膜炎多種病原體的檢測(cè)附圖3，實(shí)施例二圖，將本發(fā)明應(yīng)用于沙眼衣原體分型的檢測(cè)圖，其中左圖為點(diǎn)樣模式點(diǎn)樣陣列為3×3，其中A1為陽性對(duì)照，A2為陰性對(duì)照，B1～D2依次為D～K型相應(yīng)的探針。中圖為檢測(cè)結(jié)果為D型；右圖為檢測(cè)結(jié)果為K型。
具體實(shí)施例方式
如圖1反應(yīng)原理圖，本發(fā)明應(yīng)用多重PCR技術(shù)的基因芯片，特點(diǎn)是將與待測(cè)成分相應(yīng)的探針點(diǎn)陣于固相載體上，固相載體表面經(jīng)過封閉后，加入待測(cè)樣品的多重PCR產(chǎn)物的熒光標(biāo)記物，該熒光標(biāo)記物與固相探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，待測(cè)DNA或RNA的多重PCR產(chǎn)物結(jié)合于相應(yīng)的探針上，洗去未結(jié)合的物質(zhì)后，探針點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與樣品中待測(cè)成分的含量正相關(guān)。
應(yīng)用多重PCR技術(shù)的基因芯片的制造方法(1)選擇與待測(cè)成分相應(yīng)的探針，確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置；(2)將對(duì)照品、探針點(diǎn)印于固相載體上；(3)按照制作基因芯片的常規(guī)方法進(jìn)行固定、封閉、洗滌和干燥。
應(yīng)用多重PCR技術(shù)的基因芯片的使用方法(1)待測(cè)樣品的處理先針對(duì)樣品的待測(cè)成分設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物，以待測(cè)的DNA或RNA樣品為模板，將多對(duì)特異性引物同時(shí)加入，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物加入熒光標(biāo)記；(2)雜交反應(yīng)在點(diǎn)好樣的基因芯片上滴加熒光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，37℃避光溫育30分鐘。洗凈并室溫晾干；(3)反應(yīng)結(jié)束后，用專業(yè)的芯片掃描分析儀對(duì)基因芯片進(jìn)行結(jié)果的讀取和分析。
如圖2，本實(shí)施例將本發(fā)明用于腦膜炎多種病原體的檢測(cè)。左圖為點(diǎn)樣模式點(diǎn)樣陣列為3×3，其中A1為陽性對(duì)照，C2為陰性對(duì)照，A2為檢測(cè)新型隱球菌探針，B1為檢測(cè)結(jié)核桿菌探針，B2為檢測(cè)腦膜炎雙球菌探針，C1為檢測(cè)嗜血流感菌探針。檢測(cè)結(jié)果如中圖和右圖所示。中圖為某病人的檢測(cè)結(jié)果掃描圖，該病人為腦膜炎雙球菌感染；右圖為另一病人的檢測(cè)結(jié)果，該病人為新型隱球菌與腦膜炎雙球菌共感染。
如圖3，本實(shí)施例將本發(fā)明應(yīng)用于沙眼衣原體分型的檢測(cè)。左圖為點(diǎn)樣模式點(diǎn)樣陣列為3×3，其中A1為陽性對(duì)照，A2為陰性對(duì)照，B1～D2依次為D～K型相應(yīng)的探針。結(jié)果如中圖和右圖所示。中圖為檢測(cè)結(jié)果為D型；右圖為檢測(cè)結(jié)果為K型。
權(quán)利要求
1，應(yīng)用多重PCR(multiplex polymerase chain reaction)技術(shù)的基因芯片，特征在于將探針點(diǎn)陣于固相載體上，固相載體表面經(jīng)過封閉后，加入待測(cè)樣品的多重PCR產(chǎn)物的熒光標(biāo)記物，該熒光標(biāo)記物與固相探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，洗去未結(jié)合的物質(zhì)后，探針點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與樣品中待測(cè)成分的含量正相關(guān)。
2，根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用多重PCR技術(shù)的基因芯片，特征在于所述待測(cè)樣品的多重PCR產(chǎn)物的熒光標(biāo)記物，即為在DNA或RNA提取液中加入多對(duì)特異性引物，進(jìn)行聚合酶聯(lián)反應(yīng)(polymerase chainreaction)，在同一反應(yīng)條件下一次擴(kuò)增多個(gè)DNA片段，并標(biāo)記熒光。
3，根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的應(yīng)用多重PCR技術(shù)的基因芯片，特征在于在所述待測(cè)樣品的多重PCR產(chǎn)物的熒光標(biāo)記物中，待測(cè)樣品可以是血清、體液、組織液、細(xì)胞裂解液等提取的含有一種以上微量DNA的樣品或含有一種以上微量RNA的樣品、逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA樣品；所述特異性引物為與待測(cè)成分相互補(bǔ)的DNA片段；所述探針為待測(cè)成分相應(yīng)的DNA、RNA、cDNA或寡核苷酸。
4，應(yīng)用多重PCR技術(shù)的基因芯片的制造方法，特征在于(1)選擇與待測(cè)成分相應(yīng)的探針，確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置；(2)將對(duì)照品、探針點(diǎn)印于固相載體上；(3)按照制作基因芯片的常規(guī)方法進(jìn)行固定、封閉、洗滌和干燥。
5，應(yīng)用多重PCR技術(shù)的基因芯片的使用方法，特征在于(1)待測(cè)樣品的處理先針對(duì)樣品的待測(cè)成分設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物，以待測(cè)的DNA或RNA樣品為模板，將多對(duì)特異性引物同時(shí)加入，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物加入熒光標(biāo)記；(2)雜交反應(yīng)在點(diǎn)好樣的基因芯片上滴加熒光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，37℃避光溫育30分鐘，洗凈并室溫晾干；(3)反應(yīng)結(jié)束后，用專業(yè)的芯片掃描分析儀對(duì)基因芯片進(jìn)行結(jié)果的讀取和分析。
全文摘要
本發(fā)明應(yīng)用多重PCR技術(shù)的基因芯片,涉及基因芯片技術(shù),基因芯片是一種在固態(tài)基底上有序排列的核酸分子,以實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA或RNA并行檢測(cè)、識(shí)別、鑒定和診斷的器件?？蓱?yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域。本發(fā)明是將多重PCR的技術(shù)應(yīng)用于基因芯片,是將探針點(diǎn)陣于固相載體上,固相載體表面經(jīng)過封閉后,加入待測(cè)樣品的多重PCR產(chǎn)物的熒光標(biāo)記物,該熒光標(biāo)記物與固相探針進(jìn)行雜交反應(yīng),洗去未結(jié)合的物質(zhì)后,探針點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與樣品中待測(cè)成分的含量正相關(guān)。在待測(cè)DNA或RNA量較小的情況下,可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)不同DNA或RNA片段,具有集成化程度高、靈敏度高,應(yīng)用范圍廣,特異性高,檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定,可靠性高的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1373227SQ0114262
公開日2002年10月9日 申請(qǐng)日期2001年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月11日
發(fā)明者張濤, 李賓, 彭永濟(jì), 鄧富橋, 任一萍, 葛海鵬 申請(qǐng)人:上海晶泰生物技術(shù)有限公司