專利名稱：分泌人粒細(xì)胞集落刺激因子(g－csf)的大腸桿菌菌株的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及生產(chǎn)和分泌人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)的大腸桿菌，更具體地說，涉及構(gòu)建的在大腸桿菌中表達(dá)分泌性hG-CSF的重組質(zhì)粒，用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的分泌hG-CSF的大腸桿菌以及用所述轉(zhuǎn)化的大腸桿菌制備hG-CSF的方法。
現(xiàn)有技術(shù)的描述在正常人體的多個部分均可發(fā)現(xiàn)已知可通過各種細(xì)胞例如單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞合成的集落刺激因子(CSF)。將CSF分成三類，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(M-CSF)和粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)，其中G-CSF是在通過促進(jìn)造血干細(xì)胞的增殖和分化來生產(chǎn)血細(xì)胞中的一種必需蛋白質(zhì)，并可促進(jìn)粒細(xì)胞數(shù)量的增加，特別是促進(jìn)保護(hù)身體免于感染的嗜中性粒細(xì)胞的增加。廣泛用于治療生長性腫瘤的化療不僅抑制了腫瘤的生長，而且也抑制了嗜中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生，由于嗜中性粒細(xì)胞的保護(hù)功能降低而產(chǎn)生嚴(yán)重副作用。已知給進(jìn)行所述化療的患者施用G-CSF促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量的增加是一種治療和預(yù)防所述傳染性疾病的有效方法。
在1986年，由Nagata等(參見Nagata等，Nature 319415(1986))從人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系CHU-II中分離了hG-CSF基因，首次確定了其核苷酸序列并在COS細(xì)胞中表達(dá)。hG-CSF是一種由174個氨基酸殘基組成的含30種信號肽的糖蛋白。hG-CSF包括5個半胱氨酸殘基，其中4個半胱氨酸殘基，在Cys-36與Cys-64和Cys-64與Cys-74間形成2個二硫鍵，它們有助于所表達(dá)蛋白質(zhì)的折疊及其活性(參見Hill等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，905167-5171(1993))。hG-CSF沒有用于N-糖基化的共有序列(Asn-X-Thr/Ser)，但在Thr-133發(fā)生O-糖基化。但是已知在大腸桿菌中產(chǎn)生的G-CSF與天然G-CSF具有幾乎相同的生物學(xué)活性，這意味著糖基化對于G-CSF活性是非必需的。
利用重組DNA技術(shù)的最新進(jìn)展，可以在細(xì)菌、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞中生產(chǎn)G-CSF，在此描述一些以前報告的結(jié)果Souza等從人膀胱癌細(xì)胞系5637中分離了cDNA，確定了其序列并報告了其在大腸桿菌中的表達(dá)(Souza等，Science，23261(1986))。此外，已報告了對在大腸桿菌、植物細(xì)胞和動物細(xì)胞中生產(chǎn)hG-CSF以及對于構(gòu)建和生產(chǎn)hG-CSF衍生物的研究。但是，迄今為止已知的用于在大腸桿菌中生產(chǎn)hG-CSF的技術(shù)就蛋白質(zhì)產(chǎn)率或生產(chǎn)成本而言有許多缺點(diǎn)，因為hG-CSF是在胞質(zhì)中以不溶性包函體的形式生產(chǎn)的，這需要隨后溶解并復(fù)性以得到hG-CSF蛋白質(zhì)的生物活性形式。盡管可以直接分離少量可溶性hG-CSF，但所述方法在一定意義上仍有限制hG-CSF蛋白質(zhì)的活性級分不得不從大量大腸桿菌蛋白質(zhì)的庫中分離。
總之，分泌到大腸桿菌周質(zhì)中的蛋白質(zhì)攜帶信號序列，在所有可運(yùn)輸出胞質(zhì)的蛋白質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)了信號序列，然后由信號肽酶在周質(zhì)中裂解所述信號序列。信號序列對于在大腸桿菌中分泌蛋白質(zhì)是必要的。因此，通過將已知的信號序列(OmpA、OmpF、PelB、PhoA、SpA等)(就其本身或有稍微的修飾)與編碼外源蛋白質(zhì)之基因的N末端相連，可以將原本不由大腸桿菌基因編碼的重組蛋白質(zhì)分泌到周質(zhì)中或者分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)液中。
通過分泌到周質(zhì)間隙而生產(chǎn)hG-CSF的方法比上述通過胞質(zhì)生產(chǎn)的常規(guī)方法有如下優(yōu)點(diǎn)首先，容易分離和純化重組蛋白，在周質(zhì)中的純度比在胞質(zhì)中高，因為在周質(zhì)中的蛋白質(zhì)比在胞質(zhì)中的少(Nossal，N.G.等，J.Biol.Chem.，2413055-3062(1966))；第二，分泌到周質(zhì)中的重組蛋白與其中發(fā)現(xiàn)有大多數(shù)蛋白酶的胞質(zhì)分隔開，由于避免了胞質(zhì)中蛋白酶對蛋白質(zhì)的降解而可在重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中得到高產(chǎn)率(Meerman和Georgiou，Ann.N.Y.Acad.Sci.，721292-302(1994))；第三，細(xì)菌周質(zhì)比胞質(zhì)的氧化環(huán)境更強(qiáng)，完成多肽的二硫鍵形成和正確折疊更容易，因此，可避免不溶性集聚物的形成(Hockney，TIBTECH，12456-463(1994))。
由于具有所述優(yōu)點(diǎn)，導(dǎo)致重組蛋白分泌到周質(zhì)中的方法已被用于在大腸桿菌中生產(chǎn)hG-CSF，并有如下報告Perez-Perez等已努力得到分泌形式的hG-CSF，使用大腸桿菌信號序列之一的OmpA，沒有成功。為了解決該問題，他們使用兩種分子侶伴蛋白DnaK和DnaJ的共表達(dá)系統(tǒng)，僅僅得到少量分泌的hG-CSF(Perez-Perez等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，210524-529(1995))；另外，Chung等用另一種信號序列PelB試圖得到分泌形式的hG-CSF，同樣沒有成功，但hG-CSF以不溶性包函體的形式在胞質(zhì)中積累(Chung等，J.Fermen.Bioengin.，85443-446(1998))。
就上述情況來看，仍需要繼續(xù)開發(fā)通過不需要溶解不溶性包函體以及隨后再折疊的相當(dāng)簡單的方法，促進(jìn)hG-CSF以實質(zhì)水平分泌到周質(zhì)的技術(shù)。
發(fā)明概述本發(fā)明人經(jīng)過努力開發(fā)了用于促進(jìn)hG-CSF分泌到周質(zhì)中的技術(shù)，因此，他們已發(fā)現(xiàn)用含編碼由13個氨基酸，芽孢桿菌衍生的木聚糖內(nèi)切酶(endoxylanase)信號序列和6個組氨酸殘基組成之寡肽的核苷酸序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌可以有效分泌寡肽/hG-CSF融合蛋白，這樣可以用所述轉(zhuǎn)化的大腸桿菌生產(chǎn)hG-CSF蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明的第一個目的是提供構(gòu)建的用于大腸桿菌的重組質(zhì)粒以便從中表達(dá)和分泌hG-CSF融合蛋白。
本發(fā)明的第二個目的是提供用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。
本發(fā)明的第三個目的是提供用所述微生物生產(chǎn)hG-CSF蛋白質(zhì)的方法。
附圖簡述結(jié)合下列附圖，本發(fā)明的上述目的、其他目的和特征對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的，其中

圖1是插入到質(zhì)粒p19CSF中的hG-CSF基因的核苷酸序列。
圖2表示質(zhì)粒p19CSFm的構(gòu)建示意圖和遺傳圖譜。
圖3是插入到質(zhì)粒p19CSFm中的hG-CSF基因的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列。
圖4表示質(zhì)粒pEDCSFm的構(gòu)建示意圖和遺傳圖譜。
圖5是插入到質(zhì)粒pEDCSFm中的hG-CSF基因的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列。
圖6表示質(zhì)粒pEDCSFmII的構(gòu)建示意圖和遺傳圖譜。
圖7是插入到質(zhì)粒pEDCSFmII中的hG-CSF基因的N-末端部分的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列。
圖8表示質(zhì)粒pTrcSCSFmII的構(gòu)建示意圖和遺傳圖譜。
圖9是插入到質(zhì)粒pTrcSCSFmII中的hG-CSF基因的N-末端部分的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列。
圖10表示質(zhì)粒pTrcKCSFmII的構(gòu)建示意圖和遺傳圖譜。
圖11表示質(zhì)粒pTHSCSFmII的構(gòu)建示意圖和遺傳圖譜。
圖12是插入到質(zhì)粒pTHSCSFmII中的hG-CSF基因的N-末端部分的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列。
圖13表示質(zhì)粒pTHKCSFmII的構(gòu)建示意圖和遺傳圖譜。
本發(fā)明詳述設(shè)計用于從大腸桿菌中有效分泌hG-CSF融合蛋白的本發(fā)明重組質(zhì)粒含有卡那霉素抗性基因、木聚糖內(nèi)切酶信號序列、編碼由含6個連續(xù)組氨酸殘基的13個氨基酸殘基組成的寡肽的核苷酸序列、經(jīng)修飾的hG-CSF基因和Trc啟動子。通過用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌制備有效分泌hG-CSF蛋白質(zhì)的本發(fā)明重組大腸桿菌。用Ni-柱和隨后的蛋白酶處理，通過從由所轉(zhuǎn)化大腸桿菌中得到的蛋白質(zhì)庫分離hG-CSF融合蛋白，可以制備高純度hG-CSF蛋白。
下面詳細(xì)說明本發(fā)明。
首先，構(gòu)建含編碼hG-CSF蛋白的cDNA、用于hG-CSF蛋白分泌的木聚糖內(nèi)切酶信號序列、是強(qiáng)可誘導(dǎo)啟動子的Trc啟動子、編碼非分泌蛋白的卡那霉素抗性基因以及編碼寡肽的核苷酸序列組成的重組質(zhì)粒載體pTHKCSFmII，所述寡肽由在木聚糖內(nèi)切酶信號序列與hG-CSF多肽間含6個連續(xù)組氨酸殘基的13個氨基酸殘基組成，構(gòu)建所述載體pTHKCSFmII用于制備表達(dá)hG-CSF融合蛋白并將其分泌到周質(zhì)中的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌其中通過將得自人乳腺癌cDNA文庫的第3外顯子缺失的hG-CSF cDNA與合成的第3外顯子、用于促進(jìn)從大腸桿菌分泌hG-CSF蛋白的由芽孢桿菌屬衍生的木聚糖內(nèi)切酶信號序列以及用作選擇性標(biāo)記的卡那霉素抗性基因相連來構(gòu)建編碼hG-CSF蛋白的cDNA。此外，為了防止在大腸桿菌分泌hG-CSF蛋白的過程中發(fā)生細(xì)胞溶解，在木聚糖內(nèi)切酶信號序列的DNA與hG-CSF基因間加入編碼含6個連續(xù)組氨酸殘基的13個氨基酸殘基組成的寡肽的核苷酸序列，所述寡肽的氨基酸序列是N’-Ala-Gly-Pro-His-His-His-His-His-His-Ile-Glu-Gly-Arg-C’(SEQ ID NO1)。
隨后，通過將上述構(gòu)建的質(zhì)粒pTHKCSFmII導(dǎo)入大腸桿菌來制備分泌hG-CSF融合蛋白的重組大腸桿菌其中可以使用大腸桿菌菌株BL21(DE3)、HBi01、MC4100、W3110和XL1-Blue，優(yōu)選MC4100。將用重組質(zhì)粒pTHKCSFmII轉(zhuǎn)化的大腸桿菌MC4100命名為大腸桿菌MC4100/pTHKCSFmII，于2000年3月13日該菌株已保藏在附屬于韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，該保藏機(jī)構(gòu)是國際保藏機(jī)構(gòu)，該菌株的保藏號為KCTC0754BP。
最后，用Ni-柱和蛋白酶從得自轉(zhuǎn)化大腸桿菌的蛋白質(zhì)庫制備完整的hG-CSF蛋白所述大腸桿菌分泌hG-CSF融合蛋白，該蛋白的N末端與由含6個連續(xù)組氨酸殘基的13個氨基酸殘基組成的寡肽相連。用Ni-柱分離分泌的hG-CSF融合蛋白，所述融合蛋白的寡肽中存在的6個連續(xù)組氨酸殘基可與該柱結(jié)合，然后通過蛋白酶處理除去所述寡肽，從上述分離的hG-CSF融合蛋白制備完整hG-CSF蛋白。由于hG-CSF對所用的蛋白酶不敏感，因此，通過其識別序列不存在于hG-CSF蛋白中的蛋白酶應(yīng)該可以選擇性地裂解掉所述寡肽的C末端序列。作為實例，在本發(fā)明中，選擇所述寡肽的C末端氨基酸序列是Ile-Glu-Gly-Arg(見SEQ ID NO1)，該序列被Xa因子識別和切割，在hG-CSF蛋白中沒有該蛋白酶的識別序列。
進(jìn)一步以下列實施例說明本發(fā)明，所述實施例不應(yīng)限制本發(fā)明的范圍。實施例1制備人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)的cDNA為了分離hG-CSF基因，通過PCR擴(kuò)增人乳腺癌cDNA文庫制備hG-CSF cDNA。在GenBank中檢索hG-CSF基因的核苷酸序列，然后分別合成引物15’-GCGAATTCATGGCTGGACCTGCCACCCAG-3’(SEQ ID NO2)和引物25’-GCGGATCCTTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3’(SEQ ID NO3)。為了便于克隆PCR產(chǎn)物，分別在引物1和引物中導(dǎo)入EcoRI和BamHI限制位點(diǎn)。然后利用高保真度PCR系統(tǒng)(Boehringer Mannheim Co.，Germany)，在下列條件下完成PCR一個循環(huán)的在94℃變性7分鐘；30個循環(huán)的下列過程94℃變性1分鐘，50℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘；然后一個循環(huán)的在72℃延伸7分鐘。將通過PCR得到的DNA分子進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以分離約530 bp的DNA片段，隨后用EcoRI和BamHI消化該片段以得到所需的DNA片段。
為了克隆上述得到的DNA片段，用T4 DNA連接酶將所述DNA片段連接到用EcoRI和BamHI消化了的質(zhì)粒pUC19(Yanisch-Perron等，Gene，33109-119(1985))中，然后通過電穿孔技術(shù)將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌XL1-Blue(supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi relA1lacF’(proAB+lacIqlacZΔM15Tn(tetr)))(Bullock，W.O.等，BioTechniques，5376-378(1987))以得到轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。在含氨芐青霉素(50μg/l)的LB瓊脂培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化體，由此得到重組質(zhì)粒p19CSF。用自動DNA測序儀(ABI Prism 377型，Perkin Elmer Co.，USA)確定p19CSF中片段的核苷酸序列。已發(fā)現(xiàn)與公開的hG-CSF的核苷酸序列相比，在本發(fā)明克隆的片段的中部有108bp缺失，同時其余508bp的序列與公開的hG-CSF基因的序列相同(見圖1)。與hG-CSF的基因組DNA序列相比，本發(fā)明片段中的108bp缺失對應(yīng)于hG-CSF基因5個外顯子中的第3個外顯子。
為了得到完整的hG-CSF基因序列，制備對應(yīng)于第3外顯子的4個引物，即引物35’-TCCTCGGGGTGGCACAGCTTGTAGGTGGCACACAGCTTCTCCTGGAGCGC-3’(SEQ ID NO4)、引物45’-GCTGTGCCACCCCGAGGAGCTGGTGCTGCTCGGACACTCTCTGGGCATCC-3’(SEQ ID NO5)、引物55’-TGGCTGGGGCAGCTGCTCAGGGGAGCCCAGGGGATGCCCAGAGAGTGTC-3’(SEQ IDNO6)和引物65’-AGCAGCTGCCCCAGCCAGGCCCTGCAGCTGGCAGGCTGCTTGAGCCAA-3’(SEQID NO7)，然后完成PCR。用上述引物1和得到的PCR產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增p19CSF，用引物2，以與用引物1相同的方式完成PCR。用這兩個PCR產(chǎn)物，再完成一次PCR，將所得產(chǎn)物用兩種限制酶EcoRI和BamHI消化，然后將所述片段克隆到與上述所用位點(diǎn)相同的pUC19的位點(diǎn)。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌XL1-Blue在含氨芐青霉素(50μg/l)的LB瓊脂培養(yǎng)基上篩選，由此得到重組質(zhì)粒p19CSFm(圖2)。確定p19CSFm中片段的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)與公開的hG-CSF基因的序列相同(圖3)。實施例2構(gòu)建重組質(zhì)粒pEDCSFm為了從實施例1所得到的hG-CSF基因得到表達(dá)的hG-CSF蛋白，通過從p19CSFm中除去信號序列構(gòu)建成熟hG-CSF基因(圖5)。為了克隆成熟hG-CSF基因，制備引物75’-GCGAATTCATATGACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3’(SEQ ID NO8)。使用引物2和7，PCR擴(kuò)增p19CSFm，將擴(kuò)增的DNA分子用兩種限制酶NdeI和BamHI消化。將所得DNA片段連接到用NdeI和BamHI消化的含T7啟動子的質(zhì)粒pET21c(Novagen Co.，USA)中。通過電穿孔用連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue后，在含氨芐青霉素(50微克/l)的LB瓊脂培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化體，由此得到重組質(zhì)粒pEDCSFm(圖4)。
為了在大腸桿菌中生產(chǎn)hG-CSF蛋白質(zhì)，將重組質(zhì)粒pEDCSFm導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)(F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)攜帶T7 RNA聚合酶基因的原噬菌體)。將含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌接種到250毫升燒瓶中的50毫升液體LB培養(yǎng)基中，在37℃溫育。當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到OD600為約0.7時，將1mM IPTG(異丙基-β-硫代半乳糖苷)加入培養(yǎng)物中以誘導(dǎo)hG-CSF基因的表達(dá)。誘導(dǎo)4小時后，取出分成1毫升的培養(yǎng)液。4℃將取出的培養(yǎng)液以6000rpm離心5分鐘以收集細(xì)胞，然后洗滌，在4℃再以6000rpm離心5分鐘，然后重懸在0.2ml TE緩沖液中。將64微升細(xì)胞懸浮液與16微升樣品緩沖液(Tris-HCl 60mM25％甘油(v/v)2％SDS(v/v)2-巰基乙醇14.4mM0.1％溴酚藍(lán))的混合物在100C加熱10分鐘，然后在分離的凝膠中進(jìn)行SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)。SDS-PAGE后，用染色溶液(考馬斯亮藍(lán)R 0.25g/l甲醇40％(v/v)、乙酸7％(v/v))將凝膠染色2小時，然后用脫色溶液(甲醇40％(v/v)、乙酸7％(v/v))脫色兩次，每次2小時。SDS-PAGE沒有顯示對應(yīng)于hG-CSF蛋白質(zhì)的帶。實施例3構(gòu)建重組質(zhì)粒pEDCSFmII基于Devlin等的報告，在hG-CSF基因N末端部分的高G+C含量對該基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯有抑制作用(Devlin等，Gene，6513-22(1988))，制備引物85’-GCGAATTCATATGACTCCGTTAGGTCCAGCCAGC-3’(SEQ ID NO9)以得到具有較低G+C含量的基因，以便可在大腸桿菌中有效轉(zhuǎn)錄和翻譯。
用引物8和引物2通過PCR擴(kuò)增質(zhì)粒p19CSFm。將所得的PCR產(chǎn)物用NdeI和BamHI消化，克隆到pET21c的相同位點(diǎn)，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue中。在含氨芐青霉素(50微克/l)的LB瓊脂培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化的大腸桿菌XL1-Blue，由此得到重組質(zhì)粒pEDCSFmII(圖6)。與pEDCSFm中片段的序列相比，發(fā)現(xiàn)pEDCSFmII中片段的核苷酸序列與該基因的N末端部分相同，同時總共有6個核苷酸殘基的差異，有5個密碼子發(fā)生改變(ACC CCC CTG GGC CCT→ACTCCG TTA GGT CCA)。
將質(zhì)粒pEDCSFmII轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，分析其表達(dá)。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，按實施例2所述完成總蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和分析，按下列方法完成不溶性集聚物的分級分離。將通過離心1毫升培養(yǎng)液得到的細(xì)胞懸浮在0.5ml TE緩沖液(Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM，pH8.0)中，然后在4℃再以3000xg離心5分鐘，然后重懸在0.2ml TE緩沖液中。用超聲儀(Branson Ultrsonics Co.，USA)破碎細(xì)胞，然后在4℃以10000xg離心10分鐘。將上清液分類成可溶性蛋白，將沉淀溶解在0.2ml TE緩沖液中，并分類成不溶性蛋白。鑒定出在用質(zhì)粒pEDCSFmII轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)的hG-CSF蛋白的含量占總蛋白質(zhì)的約40％，發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的大部分hG-CSF蛋白是沒有生物活性的不溶性集聚物。實施例4構(gòu)建重組質(zhì)粒pTrcSCSFmII
將衍生于芽孢桿菌屬菌種的木聚糖內(nèi)切酶的信號序列用于從大腸桿菌中分泌hG-CSF蛋白。為了通過PCR將木聚糖內(nèi)切酶的信號序列與hG-CSF多肽的N末端相連，分別制備引物95’-GGAATTCACATGTTTAAGTTTAAAAAGAAATTC-3’(SEQ ID NO10)、引物105’-GGCTGGACCTAACGGAGTTGCAGAGGCGG-3’(SEQ ID NO11)和引物115’-GCAACCGCCTCTGCAACTCCGTTAGGTCCAGCC-3’(SEQ ID NO12)。從用引物9和10、攜帶木聚糖內(nèi)切酶基因的質(zhì)粒pKJX4(Jeong等，Enzyme Microb Technol.22(7)599-605(1998))為靶DNA完成的PCR，得到含木聚糖內(nèi)切酶信號序列的PCR產(chǎn)物，從用引物2和11完成的PCR，得到含hG-CSF基因的PCR產(chǎn)物。另外，用上述得到的兩種PCR產(chǎn)物和引物2和9完成PCR以得到含木聚糖內(nèi)切酶信號序列-融合的hG-CSF基因的PCR產(chǎn)物，然后用兩種限制酶AflIII和BamHI消化該產(chǎn)物。另外，用NcoI和BamHI消化攜帶強(qiáng)可誘導(dǎo)啟動子trc啟動子的質(zhì)粒pTrc99A(Pharmacia Biotech Co.，USA)，然后與上述兩種PCR產(chǎn)物相連。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue中。在含氨芐青霉素(50微克/l)的LB瓊脂培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化體，由此得到重組質(zhì)粒pTrcSCSFmII(圖8)。用自動DNA測序儀(ABI Prism 377型，Perkin Elmer Co.，USA)確定hG-CSF基因N末端部分的核苷酸序列(圖9)。
為了分析在不同大腸桿菌菌株中hG-CSF蛋白的分泌，將重組質(zhì)粒pTrcSCSFmII轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌HB101(F-hsdS20(rk-，mk-)recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20(strr)xyl1-5mtl-1 supE44λ-)、大腸桿菌MC4100(F-araD139Δ(argF-lac)U169rpsL150(strr)relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR)和大腸桿菌W3110(衍生自大腸桿菌K-12，λ-，F(xiàn)-，原養(yǎng)型)中。分別將各轉(zhuǎn)化體接種到含氨芐青霉素(50微克/l)的50毫升LB培養(yǎng)基上以便通過實施例2所述方法測定表達(dá)水平和進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。但是，用1mM IPTG誘導(dǎo)后，細(xì)胞突然開始溶解，在2小時內(nèi)大部分細(xì)胞溶解。將培養(yǎng)物離心以得到轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)沒有對應(yīng)于hG-CSF蛋白的蛋白質(zhì)。實施例5構(gòu)建重組質(zhì)粒pTrcKCSFmII考慮到質(zhì)粒pTrcSCSFmII中的氨芐青霉素抗性基因(Apr)編碼分泌到大腸桿菌周質(zhì)中的β-內(nèi)酰胺酶，因此推測在β-內(nèi)酰胺酶與hG-CSF蛋白的分泌之間存在競爭，所述競爭產(chǎn)生實施例4中觀察到的細(xì)胞溶解?；谒黾僭O(shè)，用卡那霉素抗性基因(Kmr)代替氨芐青霉素抗性基因(Apr)作為選擇性標(biāo)記，因為卡那霉素抗性基因編碼非分泌性蛋白，仍可用作選擇壓力。為了用卡那霉素抗性基因(Kmr)取代質(zhì)粒pTrcSCSFmII中的氨芐青霉素抗性基因(Apr)，用引物125’-GCGAATTCTTTAAAGCCACGTTGTGTCCTCAAA-3’(SEQ ID NO13)和引物135’-GCGAATTCTTTAAATTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3’(SEQ ID NO14)，質(zhì)粒pACYC177作為靶DNA完成PCR。將所得的含卡那霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物用DraI消化，然后連接到用DraI部分消化以除去氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒pTrcSCSFmII中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue中。將轉(zhuǎn)化體在含卡那霉素(25微克/l)的LB瓊脂培養(yǎng)基上篩選，由此，得到重組質(zhì)粒pTrcKCSFmII(圖10)。
為了分析hG-CSF蛋白的分泌，將重組質(zhì)粒pTrcKCSFmII轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌HB101、大腸桿菌MC4100和大腸桿菌W3110中。將各轉(zhuǎn)化體分別接種到50毫升含卡那霉素(25微克/l)LB培養(yǎng)基中以便按實施例2所述方法完成測定表達(dá)水平和蛋白質(zhì)分析的試驗，得到與使用pTrcSCSFmII的實施例4相同的結(jié)果。即用pTrcKCSFmII也在用1mM IPTG誘導(dǎo)后細(xì)胞過量溶解，所回收蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析表明沒有對應(yīng)于hG-CSF的蛋白質(zhì)。從上述研究發(fā)現(xiàn)用卡那霉素抗性基因取代氨芐青霉素抗性基因沒有發(fā)揮避免細(xì)胞溶解的作用，因此，需要另一種可解決因hG-CSF蛋白分泌引起的細(xì)胞溶解這一內(nèi)在問題的遺傳操作方式。實施例6構(gòu)建重組質(zhì)粒pTHSCSFmII和pTHKCSFmII
為了促進(jìn)大腸桿菌分泌hG-CSF蛋白而不會產(chǎn)生細(xì)胞溶解，使用在木聚糖內(nèi)切酶信號序列與hG-CSF蛋白間插入小寡肽的策略。為了達(dá)到該目的，用引物145’-CACCATCACCATATCGAAGGCCGTACTCCGTTAGGTCCA-3’(SEQ ID NO15)和引物155’-GATATGGTGATGGTGATGGTGCGGGCCAGCTGCAGAGGCGG-3’(SEQ ID NO16)和pEDSCSFmII作為靶DNA完成PCR。首先，用引物14和2、引物15與9分別完成PCR。然后將兩種PCR產(chǎn)物混合，用引物2和9完成另一PCR，將所得產(chǎn)物用AflIII和BamHI消化以便連接到質(zhì)粒pTrc99A的NcoI/BamHI位點(diǎn)。將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌XL1-Blue后，在含氨芐青霉素(50微克/升)的LB瓊脂培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化體，由此得到重組質(zhì)粒pTHSCSFmII(圖11)。圖12表明插入到質(zhì)粒pTHSCSFmII中的DNA的核苷酸序列和推斷的氨基酸序列，其中斜體表示木聚糖內(nèi)切酶信號序列，黑體表示插入的寡肽序列。
與實施例5相似，為了用卡那霉素抗性基因(Kmr)取代氨芐青霉素抗性基因(Apr)，用DraI部分消化質(zhì)粒pTHSCSFmII以除去氨芐青霉素抗性基因，然后與攜帶通過用DraI消化pTrcKCSFmII得到的卡那霉素抗性基因的DNA片段相連。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，在含卡那霉素(50微克/l)的LB瓊脂培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化體，由此得到重組質(zhì)粒pTHKCSFmII(圖13)。實施例7從攜帶重組質(zhì)粒pTHKCSFmII的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中分泌hG-CSF融合蛋白為了分析從pTHKCSFmII的hG-CSF融合蛋白的表達(dá)和分泌，將重組質(zhì)粒pTHKCSFmII分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌HB101、大腸桿菌MC4100和大腸桿菌W3110中。分別在37℃和30℃在50毫升LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)各轉(zhuǎn)化體，然后按實施例2所述分析hG-CSF融合蛋白的分泌。用1mM IPTG誘導(dǎo)hG-CSF基因表達(dá)4小時后，取1毫升培養(yǎng)液離心得到細(xì)胞，然后用SDS-PAGE分析hG-CSF融合蛋白的表達(dá)，表明從所有轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中都分泌hG-CSF融合蛋白。在表1中列出了從各轉(zhuǎn)化的大腸桿菌分泌的hG-CSF融合蛋白的含量和分泌效率。
表1比較重組大腸桿菌中hG-CSF的生產(chǎn)和分泌
為了檢測分泌的hG-CSF蛋白是否已被正確加工，即是否正確地除去了信號序列，從凝膠中分離hG-CSF融合蛋白，確定其N末端氨基酸序列為N’-Ala-Gly-Pro-His-His-His-His-His-His-Ile-Glu-Gly-Arg-Thr-C’，該序列與hG-CSF融合蛋白的N末端部分推斷的氨基酸序列一致，表明在兩個溫度條件下從大腸桿菌中成功地分泌了hG-CSF融合蛋白，所有轉(zhuǎn)化體均有較高的分泌效率，而且在30℃的hG-CSF蛋白含量比在37℃的高。轉(zhuǎn)化的5個大腸桿菌菌株中，BL21(DE3)和MC4100的產(chǎn)率最高。因此，將用重組質(zhì)粒pTHKCSFmII轉(zhuǎn)化的大腸桿菌MC4100命名為大腸桿菌MC4100/pTHKCSFmII，于2000年3月13日該菌株已保藏在附屬于韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究所(KRIBB)的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)，該保藏機(jī)構(gòu)是國際保藏機(jī)構(gòu)，該菌株的保藏號為KCTC 0754BP。
在經(jīng)內(nèi)膜分泌到周質(zhì)的過程中對在轉(zhuǎn)化的大腸桿菌MC4100/pTHKCSFmII中表達(dá)的hG-CSF融合多肽進(jìn)行了加工以除去木聚糖內(nèi)切酶分泌序列，導(dǎo)致分泌寡肽/hG-CSF融合蛋白。由于融合蛋白N末端部分的6個組氨酸殘基，用鎳柱很容易分離hG-CSF融合蛋白，Xa因子可識別所述融合蛋白中寡肽的C末端，因此，可切割掉所述寡肽以得到完整的hG-CSF蛋白。
以上清楚地表明本發(fā)明提供了生產(chǎn)和分泌人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)的大腸桿菌、用于其的質(zhì)粒載體，以高純度從所述微生物所分泌的蛋白庫中生產(chǎn)完整hG-CSF蛋白的方法。根據(jù)本發(fā)明，通過促進(jìn)大量hG-CSF融合蛋白分泌到周質(zhì)中的相當(dāng)簡單的方法可以高純度制備hG-CSF蛋白，所述方法不需要復(fù)雜的加工過程例如對于通過常規(guī)技術(shù)分離胞質(zhì)中產(chǎn)生的作為不溶性包函體的hG-CSF蛋白所需的溶解和隨后再折疊，因此，在開發(fā)用于抗癌治療的補(bǔ)充藥物的過程中可用hG-CSF廣泛地作為活性成分。
應(yīng)理解上述描述僅僅是優(yōu)選實施方案的說明，它不是為了將本發(fā)明的范圍限制到所列的具體形式，但相反，是用來覆蓋由所附權(quán)利要求定義的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的所述改變、修飾和等同物。有關(guān)保藏的微生物或其它生物材料的說明(PCT細(xì)則13bis)
PCT/RO/134(1998年7月)
權(quán)利要求
1.重組質(zhì)粒載體，包括卡那霉素抗性基因；啟動子；木聚糖內(nèi)切酶信號序列；編碼由含6個連續(xù)組氨酸殘基的13個氨基酸組成的寡肽的核苷酸序列；和人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)基因。
2.權(quán)利要求1的重組質(zhì)粒載體，其中所述寡肽在C末端含有氨基酸序列異亮氨酸-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸(Ile-Glu-Gly-Arg)。
3.圖13所示的重組質(zhì)粒載體pTHKCSFmII，包括卡那霉素抗性基因；Trc啟動子；衍生自芽孢桿菌屬菌種的木聚糖內(nèi)切酶信號序列；編碼SEQ ID NO1所示的寡肽的核苷酸序列；和編碼人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG-CSF)的經(jīng)修飾的基因，該基因在N末端含有SEQ ID NO26的核苷酸序列。
4.一種大腸桿菌微生物，其是用權(quán)利要求3的質(zhì)粒載體pTHKCSFmII轉(zhuǎn)化了的。
5.權(quán)利要求4的微生物，其中所述大腸桿菌選自大腸桿菌XL1-Blue、大腸桿菌MC4100、大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌HB101和大腸桿菌W3110。
6.大腸桿菌MC4100/pTHKCSFmII(KCTC 0754BP)，其是用權(quán)利要求3的質(zhì)粒載體pTHKCSFmII轉(zhuǎn)化了的。
7.制備人粒細(xì)胞集落刺激因子的方法，該方法包括下列步驟培養(yǎng)用權(quán)利要求1的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌以得到人粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白；和用蛋白酶處理人粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白以得到人粒細(xì)胞集落刺激因子。
8.權(quán)利要求7的制備人粒細(xì)胞集落刺激因子的方法，其中所述權(quán)利要求1的質(zhì)粒載體是pTHKCSFmII。
9.權(quán)利要求7的制備人粒細(xì)胞集落刺激因子的方法，其中用Ni-柱從培養(yǎng)物中得到所述人粒細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白。
10.權(quán)利要求7的制備人粒細(xì)胞集落刺激因子的方法，其中所述蛋白酶是Xa因子。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有卡那霉素抗性基因、啟動子、木聚糖內(nèi)切酶信號序列、編碼由含6個連續(xù)組氨酸殘基的13個氨基酸組成的寡肽的核苷酸序列和人粒細(xì)胞集落刺激因子(hG－CSF)基因的重組質(zhì)粒載體;以及用所述載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌;以及以高純度從所述微生物分泌的蛋白庫中生產(chǎn)完整hG－CSF蛋白的方法。根據(jù)本發(fā)明,通過促進(jìn)大量hG－CSF融合蛋白分泌到周質(zhì)中的相當(dāng)簡單的方法可以高純度制備hG－CSF蛋白,所述方法不需要復(fù)雜的加工過程例如對于通過常規(guī)技術(shù)分離胞質(zhì)中產(chǎn)生的作為不溶性包函體的hG－CSF所需的溶解和隨后再折疊,因此,在開發(fā)用于抗癌治療的補(bǔ)充藥物的過程中可用hG－CSF蛋白廣泛地作為活性成分。
文檔編號C12N15/70GK1366551SQ01800753
公開日2002年8月28日 申請日期2001年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月31日
發(fā)明者李相燁, 丁基峻 申請人:韓國科學(xué)技術(shù)院