專利名稱：(r)－2－辛醇脫氫酶,產(chǎn)生此酶的方法,編碼此酶的dna,以及使用此酶生產(chǎn)醇類的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的(R)-2-辛醇脫氫酶，可用于生產(chǎn)醇類，酮類，特別是生產(chǎn)具有光學(xué)活性的醇類，例如(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯和(R)-丙氧苯衍生物；編碼此酶的DNAs；此酶生產(chǎn)方法；用此酶生產(chǎn)醇類，酮類，特別是生產(chǎn)具有光學(xué)活性的醇類，例如(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯和(R)-丙氧苯衍生物的方法。
背景技術(shù)：
化合物(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯作為中間體，用于合成HMG-CoA還原酶抑制劑，如D-肉堿等。此類化合物可用于藥物和殺蟲劑的合成。特別是如何(合成或分解)得到(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯的光學(xué)純的對映異構(gòu)體是工業(yè)上的重要問題。如今，已知利用微生物如面包酵母進(jìn)行不對稱合成，結(jié)晶，和不對稱還原的方法(尚未審查已公開的日本專利申請(JP-A)Sho 61-146191，JP-A Hei 6-209782等)可用于(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯的生產(chǎn)。但是由于存在一些問題，如產(chǎn)品光學(xué)純度低，產(chǎn)量低等，這些方法不適于工業(yè)應(yīng)用。
此外，也檢索了能還原4-鹵乙酰乙酸酯為(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯的酶。例如，下列已知的酶。已有報道采用這些酶可用于合成(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯。但是這些酶是還原酶，它們采用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)為輔酶。因此，利用這些酶合成(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯需要NADPH的參與和再生，而NADPH是昂貴的和化學(xué)性不穩(wěn)定的，不利于工業(yè)應(yīng)用。
●一些得自面包酵母的還原酶(D-酶-1，D-酶-2，美國化學(xué)學(xué)會會志(J.Am.Chem.Soc.)107，2993-2994，1985)
●得自赭色擲孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)的乙醛還原酶2(Appl.Environ.Microbiol.65，5207-5211，1999)●得自馬其頓假絲酵母(Candida macedoniensis)的酮泛酸酯還原酶(Arch.Biochem.Biophys.294，469-474，1992)●得自白地霉(Geotrichum candium)的4-氯乙酰乙酸乙酯還原酶(EnzymeMicrob.Technol.14，731-738，1992)●得自Candida magnoliae的羰基還原酶(WO 98/35025)●得自乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)的羰基還原酶(JP-A Hei11-187869)●β-酮?；?酰基載體蛋白還原酶，作為II型脂肪酸合成酶之一(JP-A2000-189170)盡管已知得自假單胞菌屬菌種(Pseudomonas sp.)PED的3-羥基類固醇脫氫酶(JP-A Hei 1-277494)，甘油脫氫酶(Tetrahedron Lett.29，2453-2454，1988)，和乙醇脫氫酶(有機(jī)化學(xué)雜志(J.Org.Chem.)57，1526-1532，1992)可作為以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)為電子供體的還原酶，但這些酶由于合成(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯的反應(yīng)活性低而不利于工業(yè)應(yīng)用。
如上面指出的，采用微生物和酶生產(chǎn)(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯的已知方法在某些方面不令人滿意如光學(xué)純度，產(chǎn)量，活性等。這些問題使已知方法難于進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用。
在另一方面，(R)-丙氧苯衍生物(JP-A hei 02-732)作為中間體可用于合成藥物，特別是氧氟沙星(ofloxacin)((S)-(-)-9-氟-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪)-7-氧代-2，3-二氫-7H-吡啶并[1，2，3-脫][1，4]苯噁嗪-6-羧酸，JP-A Sho 62-252790)這種合成抗細(xì)菌藥物的光學(xué)活性物質(zhì)。如何得到(合成或分解到)這些化合物的光學(xué)純的對映異構(gòu)體在工業(yè)上是一個重要問題。
已知利用脂肪酶和酯酶使丙氧苯衍生物的外消旋物不對稱酰化是一種用于生產(chǎn)(R)-丙氧苯衍生物的方法。在此方法中，需要一種在使(R)型?；髮⑹Ｓ嗟脑虾王；a(chǎn)物分離的方法和一種使?；a(chǎn)物脫酰的方法。因此，由于這些方法很復(fù)雜，此已知方法不適于工業(yè)應(yīng)用。
采用微生物使丙酮氧苯衍生物不對稱還原的方法已有報道。但是，由于產(chǎn)生的(R)-丙氧苯衍生物的光學(xué)純度低至84-98％(JP-A Hei 03-183489)或8.8-88.4％(JP-A Hei 05-68577)，以及由于底物濃度低至0.1-0.5％，此已知方法不適于工業(yè)應(yīng)用。鑒于通過不對稱還原得到高光學(xué)純度的方法，有報道可采用產(chǎn)生自Candida magnoliae的羰基還原酶(JP-A 2000-175693)合成光學(xué)純度為99％或更高的(R)-丙氧苯衍生物。但是，此羰基還原酶使用NADPH作為輔酶。因此采用此酶合成(R)-丙氧苯衍生物需要添加或再生昂貴且化學(xué)性不穩(wěn)定的NADPH，這在工業(yè)應(yīng)用上是不利的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供利用NADH作輔酶還原4-鹵乙酰乙酸酯并生產(chǎn)高光學(xué)純度的(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯的新型酶。此外，本發(fā)明的一個目的是提供利用此酶生產(chǎn)高光學(xué)純度(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯的方法。
另外，本發(fā)明的一個目的是提供以NADH作輔酶的新的酶，它可以生產(chǎn)用作合成抗細(xì)菌藥物的中間體的光學(xué)高純度(R)-丙氧苯衍生物。此外，本發(fā)明的一個目的是提供利用此酶生產(chǎn)有著高光學(xué)純度的(R)-丙氧苯衍生物的方法。
本發(fā)明人認(rèn)為可利用NADH作電子供體的乙醇脫氫酶可用于工業(yè)應(yīng)用。NADH比NADPH更廉價且化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定。為發(fā)現(xiàn)可以有效產(chǎn)生光學(xué)活性(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯的酶，本發(fā)明人篩選了對(R)-2-辛醇有高活性的乙醇脫氫酶，所述(R)-2-辛醇有著與(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯相同的構(gòu)型以及與4-鹵乙酰乙酸酯同樣長的長鏈。
以前的發(fā)現(xiàn)報道得自過濾弧菌(Comamonas terrigena)，畢赤酵母屬(Pichia)NRRL-Y-11328株，和假單胞菌屬(pseudomonas)SPD6株的酶作為仲醇脫氫酶，所述酶可以立體選擇性氧化(R)-2-辛醇，并且有生產(chǎn)2-辛醇的活性。但是，沒有關(guān)于這些酶可以還原4-鹵乙酰乙酸酯和產(chǎn)生(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯的報道。因為這些酶對(R)-2-辛醇的活性并不明顯大于對仲醇如2-丙醇(其側(cè)鏈較短)的活性，因此通過還原4-鹵乙酰乙酸酯(其碳?；Y(jié)合在體積大的側(cè)鏈上)生產(chǎn)(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯的活性預(yù)計較低。
因此，本發(fā)明人大量篩選含有能優(yōu)選氧化(R)-2-辛醇的酶類的微生物。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)下類屬的微生物具有優(yōu)選氧化(R)-2-辛醇的能力畢赤氏酵母屬(Pichia)假絲酵母屬(Candida)
Ogataea屬具體地，發(fā)現(xiàn)下列微生物具有優(yōu)選氧化(R)-2-辛醇的能力Pichia finlandicaPichia jadinii產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)Ogataea wicherhamii而且，本發(fā)明人培養(yǎng)了這些微生物并從這些微生物中純化得到了能氧化(R)-2-辛醇的酶。對這些酶的性質(zhì)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)這些酶對(R)-2-辛醇的氧化具有高度立體選擇性，此外，與(R)-2-辛醇相比更易于立體選擇性氧化仲醇。還發(fā)現(xiàn)這些酶不但具有還原4-氯乙酰乙酸乙酯和生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸酯的高活性，還具有還原2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯和生產(chǎn)2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯的高活性。這樣，本發(fā)明得以完成。
具體地，本發(fā)明涉及新的(R)-2-辛醇脫氫酶，其可用于生產(chǎn)醇類，酮類，特別是生產(chǎn)具有光學(xué)活性的醇類，例如(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯；編碼此酶的DNA；此酶生產(chǎn)方法；用此酶生產(chǎn)醇類，酮類，特別是生產(chǎn)具有光學(xué)活性的醇類，例如(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯和(R)-丙氧苯衍生物的方法。
一種(R)-2-辛醇脫氫酶，具有下列(1)和(2)的物化性質(zhì)(1)作用i)以氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸為輔酶，此酶通過氧化醇生產(chǎn)酮，且ii)以還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸為輔酶，此酶通過還原酮生產(chǎn)醇，且(2)底物特異性i)此酶優(yōu)先氧化2-辛醇兩種光學(xué)異構(gòu)體中的(R)-2-辛醇，且ii)此酶通過還原4-鹵乙酰乙酸酯生產(chǎn)(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯。
[1]中的(R)-2-辛醇脫氫酶，其有著下列(3)和(4)的物化性質(zhì)(3)最佳pH用于氧化反應(yīng)的最佳pH范圍為8.0-11.0，還原反應(yīng)的最佳pH范圍為5.0-6.5，且(4)底物特異性i)與伯醇相比，此酶對仲醇表現(xiàn)出更高的活性，且
ii)與2-丙醇相比，此酶對(R)-2-辛醇表現(xiàn)出顯著更高的活性。
[1]或[2]的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中此(R)-2-辛醇脫氫酶由挑選自畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬和Ogataea屬的微生物衍生。
[3]的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬于畢赤酵母屬的微生物是Pichiafinlandica。
[3]的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬于畢赤酵母屬的微生物是Pichiajadinii。
[3]的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬于假絲酵母屬的微生物是產(chǎn)朊假絲酵母。
[3]的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬于Ogataea屬的微生物是Ogataeawickerhamii。
[1]或[2]的用于生產(chǎn)(R)-2-辛醇脫氫酶的方法，此方法包括培養(yǎng)從畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬和Ogataea屬中挑選的微生物，所述微生物生產(chǎn)[1]或[2]的酶。
下列(a)到(e)的多核苷酸，此多核苷酸編碼了具有(R)-2-辛醇脫氫酶活性的蛋白(a)多核苷酸，其含有SEQ ID NO1的核苷酸序列，(b)多核苷酸，其編碼含有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白，(c)多核苷酸，其編碼含有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白，在此氨基酸序列中有一個或多個氨基酸的取代，缺失，插入和/或添加，(d)多核苷酸，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸雜交，且(e)編碼與SEQ ID NO2氨基酸序列有著不少于70％同源性的氨基酸序列的多核苷酸。
為[9]的多核苷酸編碼的蛋白。
重組載體，其中插入了[9]中的多核苷酸。
[11]的重組載體，其中進(jìn)一步插入一種多核苷酸，其編碼以β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸為輔酶并能催化氧化還原反應(yīng)的脫氫酶。
以可表達(dá)的方式含有[9]中多核苷酸或[11]中載體的轉(zhuǎn)化體。
生產(chǎn)[10]中蛋白的方法，此方法包含培養(yǎng)[13]中的轉(zhuǎn)化體。
生產(chǎn)醇的方法，此方法包含將[1]或[2]的(R)-2-辛醇脫氫酶，[10]的蛋白，可生產(chǎn)此酶或蛋白的微生物，或該微生物的加工產(chǎn)物與酮反應(yīng)以使酮還原。
[15]的方法，其中的微生物是[13]的轉(zhuǎn)化體。
[15]的方法，其中的酮是4-鹵乙酰乙酸酯的衍生物并且其中的醇是(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯衍生物。
[17]的方法，其中4-鹵乙酰乙酸酯的衍生物是4-氯乙酰乙酸乙酯且其中的醇是(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
[15]的方法，其中的酮是丙酮氧苯衍生物，其由通式1表示通式1 其中x1和x2表示鹵原子；其中的醇是丙氧苯衍生物，由通式2表示通式2 [20][19]的方法，其中丙酮氧苯衍生物是2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯且其中的醇是2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯。
[15]的方法，該方法還包括將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)換成其還原型。
用于生產(chǎn)酮的方法，此方法包括使[1]或[2]的(R)-2-辛醇脫氫酶，[10]的蛋白，可生產(chǎn)此酶或蛋白的微生物，或該微生物的加工產(chǎn)物與醇反應(yīng)以使醇氧化。
生產(chǎn)光學(xué)活性醇的方法，該方法包含的步驟有，將[1]或[2]的(R)-2-辛醇脫氫酶，[10]的蛋白，生產(chǎn)該酶或蛋白的微生物，或微生物加工產(chǎn)物與外消旋醇反應(yīng)以優(yōu)先氧化任一光學(xué)異構(gòu)體，并得到保留的光學(xué)活性醇。
[22]或[23]的方法，該方法另外進(jìn)一步包含將還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)換成其氧化型。
本發(fā)明提供具有下列(1)和(2)的物化性質(zhì)的酶(1)作用i)該酶通過氧化醇生產(chǎn)酮，其以氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)為輔酶，且ii)該酶通過還原酮生產(chǎn)醇，其以還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)為輔酶，且(2)底物特異性i)該酶優(yōu)先氧化2-辛醇兩種光學(xué)異構(gòu)體中的(R)-2-辛醇，且ii)該酶通過還原4-鹵乙酰乙酸酯生產(chǎn)(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯。
優(yōu)選地，本發(fā)明的酶進(jìn)一步具有下列(3)和(4)的酶性質(zhì)(3)最佳pH氧化反應(yīng)的最佳pH為8.0-11.0，還原反應(yīng)的為5.0-6.5，且(4)底物特異性i)與伯醇相比，此酶對仲醇表現(xiàn)出更高的活性，且ii)與2-丙醇相比，此酶對(R)-2-辛醇表現(xiàn)出顯著更高的活性。
此外，本發(fā)明優(yōu)選的(R)-2-辛醇脫氫酶具有下列(5)到(8)的物化性質(zhì)和酶性質(zhì)(5)最佳作用溫度范圍(R)-2-辛醇的氧化反應(yīng)最佳作用溫度范圍為45-55℃。乙基4-氯乙酰乙酸酯的還原反應(yīng)范圍為55-60℃。
(6)穩(wěn)定pH范圍該酶在pH8-9穩(wěn)定。
(7)抑制該酶受到氯化汞和螯合劑乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA 2Na)的輕微抑制。
(8)穩(wěn)定性N-乙基馬來酰亞胺，o-菲咯啉，氯化鎂，氯化鈣，和氯化錳可以穩(wěn)定該酶。
(9)純化方法本發(fā)明的酶可采用通常的純化方法從生產(chǎn)該酶的微生物中進(jìn)行純化。例如，可通過破壞真菌菌體后進(jìn)行硫酸魚精蛋白沉淀，用硫酸銨鹽析出離心上清液，再進(jìn)一步組合陰離子交換層析，疏水層析，親和層析，凝膠過濾等方法純化蛋白。
在此所用術(shù)語“脫氫酶”指可以催化脫氫反應(yīng)的酶，所述脫氫反應(yīng)指從含有氫的化合物上移去氫的氧化反應(yīng)。此外，該酶具有對酮的還原活性，且在還原條件下能催化氧化反應(yīng)的逆反應(yīng)。因此，本發(fā)明中的“脫氫酶”具有催化還原反應(yīng)的活性，所述還原反應(yīng)為氧化反應(yīng)的逆反應(yīng)，且其中加入了氫原子。通常，當(dāng)具有相同活性時，稱為“脫氫酶”“氧化還原酶”“氧化酶”“還原酶”，或類似名稱的酶都包括在本發(fā)明的脫氫酶中。
在本發(fā)明中，對4-氯乙酰乙酸酯的還原活性如下檢測。30℃下孵育反應(yīng)混合物，其中含有磷酸鉀緩沖液(pH6.5，100mM)，0.2mM NADH，20mM乙基4-氯乙酰乙酸酯以及該酶，檢測隨著NADH的減少在340nm處吸收度的降低可以確定其活性。1U定義為1分鐘時催化NADH減少1μmol的酶量?？墒褂玫鞍踪|(zhì)檢測試劑盒(BIORAD)通過染料結(jié)合方法進(jìn)行蛋白的定量。
在另一方面，對(R)-2-辛醇的氧化活性可如下測定。30℃下孵育反應(yīng)混合物，其中含有Tris-HCl緩沖液(pH8.5，50mM)，2.5mM NAD+，5mM(R)-2-辛醇以及該酶，檢測隨著NADH的產(chǎn)生在340nm處吸收度的升高可以確定其活性。1U定義為1分鐘時催化生成1μmol NADH的酶量。
本發(fā)明的(R)-2-辛醇脫氫酶具有對(R)-2-辛醇的高氧化活性。此外，該酶對(R)-2-辛醇的高氧化活性顯著高于對2-丙醇的活性。在此，以(R)-2-辛醇為底物，在NAD+的參與下，隨著NADH的增加或減少每單位時間在340nm處吸收度的變化速度(相對活性)要2倍或更多倍，優(yōu)選5倍或更多倍于以2-丙醇為底物的速度(作為1)，可以說該脫氫酶活性顯著較高。
在本發(fā)明中，(R)-2-辛醇脫氫酶優(yōu)先氧化(R)-2-辛醇是指當(dāng)(R)-2-辛醇脫氫酶對R型的酶活性作為100時，對S型的活性是50或更少，優(yōu)選20或更少，且更優(yōu)選10或更少。
有著如上所述物化性質(zhì)的(R)-2-辛醇脫氫酶可從生成此酶的微生物培養(yǎng)液中得到。例如，生產(chǎn)本發(fā)明酶的菌株可以在畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬和Ogataea屬中找到。特別是，畢赤氏酵母屬的Pichia finlandica和Pichiajadinii，假絲酵母屬的產(chǎn)朊假絲酵母，和Ogataea屬的Ogataea wickerhamii具有較強(qiáng)的產(chǎn)生本發(fā)明(R)-2-辛醇脫氫酶的能力?？梢缘玫奖景l(fā)明(R)-2-辛醇脫氫酶的菌株的例子有(i)Pichia finlandicaDSM 70280，DSM 1380(ii)Pichia jadiniiDSM 2361，DSM 70167，IFO 0987(iii)產(chǎn)朊假絲酵母IFO 0988，IFO 0626(iv)Ogataea wickerhamiiIFO 1706對于Pichia finlandica產(chǎn)生的仲醇脫氫酶，有報道采用無細(xì)胞提取物表現(xiàn)出2-丙醇脫氫酶活性(Biochimica et Biophysica Acta，716，298-307，1982)。但是，按照本發(fā)明人的附加實驗，在此菌株的無細(xì)胞提取液中包含多重2-丙醇脫氫酶。另一方面，本發(fā)明的(R)-2-辛醇脫氫酶是次要成分，2-丙醇脫氫酶活性很微弱。因此，本發(fā)明的(R)-2-辛醇脫氫酶與此文獻(xiàn)所述的酶截然不同。
上述的微生物培養(yǎng)在用于培養(yǎng)真菌的普通培養(yǎng)基如，YM培養(yǎng)基中。以葡萄糖，甘油或甲醇之任一作為碳源，可從Pichia finlandica中得到所要的酶。特定地，以甲醇為碳源可從產(chǎn)朊假絲酵母中得到所要的酶。充分增生后，回收真菌菌體，在加入了還原劑如2-巰基乙醇等和蛋白酶抑制劑如苯甲基磺酰氟PMFS的緩沖液中破碎，制成無細(xì)胞提取液。通過根據(jù)酶蛋白的溶解性進(jìn)行的分級分離和多種層析等可從無細(xì)胞提取液純化得到該酶。作為基于溶解性分級蛋白的方法，可以使用例如用有機(jī)溶劑如丙酮或二甲亞砜的沉降，用硫酸銨鹽析，或類似方法。另一方面已知的層析方法有陽離子交換層析，陰離子交換層析，凝膠過濾，疏水層析，以及使用螯合劑，色素，抗體等的多種親和層析。更特定地，通過使用苯基-Toyopearl的疏水層析，使用DEAE-Sepharose的陰離子交換層析，使用丁基-Toyopearl的疏水層析，使用Blue-Sepharose親和層析，Superdex 200的凝膠過濾等等，可以將酶純化為電泳中的幾乎一條帶。
本發(fā)明涉及編碼(R)-2-辛醇脫氫酶及同系物的多核苷酸。在本發(fā)明中，多核苷酸可以是自然存在的多核苷酸如DNA或RNA，也可以是包含人工合成的核苷酸衍生物的多核苷酸。
編碼本發(fā)明(R)-2-辛醇脫氫酶的多核苷酸包含，例如SEQ ID NO1的核苷酸序列。SEQ ID NO1的核苷酸序列編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO2的多肽。包含此氨基酸序列的多肽構(gòu)成本發(fā)明的(R)-2-辛醇脫氫酶的優(yōu)選實例。
本發(fā)明的多核苷酸包括編碼具有上述(1)和(2)的物化性質(zhì)，及含有SEQID NO2的氨基酸序列的多肽，所述序列有一個或多個氨基酸取代，缺失，插入，和或添加。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過定點誘變正確地將取代，缺失，插入，和或添加突變引入含有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA中(核酸研究(Nucleic Acid Res.)10頁，6487(1982)，酶學(xué)方法(Methods inEnzymol.)100，448頁(1983)；分子克隆(Molecular cloning)第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)，PCR實用方法(PCRA Practical Approach)，IRL出版社，200頁(1991))。
另外，本發(fā)明的多核苷酸包括與含有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA，以及編碼有著上述物化性質(zhì)(1)和(2)的蛋白的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸?！霸趪?yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸”指與核苷酸探針采用，例如，ECL直接核酸標(biāo)記和檢測系統(tǒng)(Amersham-Pharmacia Biotech)按所附說明書的建議條件(用含有0.5×SSC的初級沖洗緩沖液在42℃下洗滌)雜交的多核苷酸，該探針有一個或多個含至少20個連續(xù)核苷酸的片段，所述片段優(yōu)選至少30個連續(xù)核苷酸，例如40，60，或100個連續(xù)的核苷酸，它從核苷酸序列SEQ ID NO1中任意挑選。
與含有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸包括含有與SEQ ID NO1相似的核苷酸序列的那些。很可能這樣的多核苷酸編碼與含有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白功能等價的蛋白。
此外，本發(fā)明的多核苷酸包括編碼下述蛋白的多核苷酸，該蛋白與SEQID NO2氨基酸序列相比有至少70％，優(yōu)選至少80％或90％，更優(yōu)選95％或更高同一性?？梢匀菀椎剡M(jìn)行蛋白的同源性檢索，例如，在國際互聯(lián)網(wǎng)上，例如在涉及蛋白的氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫，如SWISS-PROT，PIR，等等；涉及DNA的數(shù)據(jù)庫，如日本的DNA Databank(DDBJ)，EMBL，GenBank等等；涉及基于DNA序列的推導(dǎo)的氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫；等等中使用FASTA程序，BLAST程序等進(jìn)行檢索。作為使用BLAST程序和SEQ ID NO2的氨基酸序列在DDBJ中同源性檢索的結(jié)果，在已知蛋白中表現(xiàn)出最高同源性的蛋白是枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶，其表現(xiàn)出43％的同一性和61％的陽性。本發(fā)明中不少于70％的同源性指示，例如，使用BLAST程序所得陽性樣本的同源性值。
本發(fā)明中，編碼具有上述物化性質(zhì)(1)和(2)的蛋白的多核苷酸被特別稱為含SEQ ID NO1核苷酸序列的多核苷酸的“同系物”。同系物可根據(jù)SEQID NO1的核苷酸序列從其它微生物經(jīng)PCR克隆和雜交分離得到，還可以引入突變而得到。例如，SEQ ID NO1的核苷酸序列是分離自Pichiafinlandica的基因的序列。此外，編碼具有上述物化性質(zhì)(1)和(2)的蛋白的多核苷酸以及那些可從例如，Pichia jadinii，假絲酵母屬的產(chǎn)朊假絲酵母，Ogataea屬的Ogataea wickerhamii，等等微生物得到的那些都包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明的多核苷酸可用于本發(fā)明的(R)-2-辛醇脫氫酶的基因工程生產(chǎn)。備選地，具有可用于生產(chǎn)酮和醇的(R)-2-辛醇脫氫酶活性的微生物能利用本發(fā)明的多核苷酸通過基因工程的方法生產(chǎn)。
本發(fā)明包含有著SEQ ID NO2的氨基酸序列并具有上述物化性質(zhì)(1)和(2)的(R)-2-辛醇脫氫酶，以及其同系物。包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白組成本發(fā)明優(yōu)選實施方案的(R)-2-辛醇脫氫酶。
本發(fā)明的(R)-2-辛醇脫氫酶同系物包含SEQ ID NO2的氨基酸序列，且其中有一個或多個氨基酸的缺失，取代，插入，和/或添加。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過定點誘變(核酸研究，10，6487(1982)，酶學(xué)方法，100，448(1983)；分子克隆，第二版，冷泉港實驗室出版社(1989)，PCR實用方法，IRL出版社，200(1991))或類似的方法正確地將取代，缺失，插入，和/或添加突變引入至包含SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA，從而容易地得到編碼所述(R)-2-辛醇脫氫酶同系物的DNA?？赏ㄟ^將編碼(R)-2-辛醇脫氫酶同系物的DNA引入宿主并在宿主中表達(dá)，而得到具有SEQ ID NO2的(R)-2-辛醇脫氫酶的同系物。
此外，本發(fā)明(R)-2-辛醇脫氫酶的同系物包括表現(xiàn)出與SEQ ID NO2氨基酸序列至少70％，優(yōu)選至少80％或90％，更優(yōu)選95％或更多同一性的蛋白?？梢匀菀椎剡M(jìn)行蛋白的同源性檢索，例如，在國際互聯(lián)網(wǎng)，例如在涉及蛋白的氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫，如SWISS-PROT，PIR，等等；涉及DNA的數(shù)據(jù)庫，如日本的DNA Databank(DDBJ)，EMBL，GenBank等等；涉及基于DNA序列的推導(dǎo)的氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫；等等中使用FASTA程序，BLAST程序等檢索。作為使用BLAST程序和SEQ ID NO2的氨基酸序列在DDBJ中同源性檢索的結(jié)果，在已知蛋白中表現(xiàn)出最高同源性的蛋白是枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶，其表現(xiàn)出43％的同一性和61％的陽性。本發(fā)明中不少于70％的同源性指示，例如，使用BLAST程序所得陽性樣本的同源性值。
編碼本發(fā)明(R)-2-辛醇脫氫酶的DNA可通過，例如下列步驟進(jìn)行分離。
在純化本發(fā)明的酶后，通過分析N-端氨基酸序列，再利用酶如賴氨酰內(nèi)肽酶，V8蛋白酶等等切割蛋白，通過反相液體層析等方法純化肽段，用蛋白測序儀分析氨基酸序列來確定多重氨基酸序列。
如果清楚了部分氨基酸序列，可以推出編碼這些氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明的DNA片段可基于推出的核苷酸序列或SEQ ID NO1的核苷酸序列設(shè)計PCR引物，采用此酶生產(chǎn)菌株的染色體DNA或cDNA文庫作為模板通過PCR得到。
此外，用所得DNA片段作為探針，通過菌落或噬菌斑雜交可得到本發(fā)明DNA，其中采用的文庫是通過將此酶生產(chǎn)菌株的染色體DNA的限制酶切產(chǎn)物引入噬菌體或質(zhì)粒，然后用該噬菌體或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到的或采用cDNA文庫。
另外，得到本發(fā)明DNA的步驟如下，分析PCR得到的DNA片段的核苷酸序列，基于已得到的序列設(shè)計PCR引物向外擴(kuò)展該DNA，采用適合的限制酶消化目的酶生產(chǎn)菌株的染色體DNA，采用自我連接的環(huán)狀DNA作模板進(jìn)行反向PCR(遺傳學(xué)120，621-623(1988))；或備選地通過RACE方法(cDNA末端的快速擴(kuò)增；“PCR實驗手冊”pp.25-33，HBJ出版社)。
本發(fā)明的DNA不僅包括由上述方法克隆的基因組DNA和cDNA，還包括化學(xué)合成的DNA。
將如此分離得到的編碼本發(fā)明(R)-2-辛醇脫氫酶的DNA插入到已知的表達(dá)載體以提供(R)-2-辛醇脫氫酶的表達(dá)載體。此外，通過培養(yǎng)用此表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可從已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中得到本發(fā)明的(R)2-辛醇脫氫酶。
在本發(fā)明中，對為表達(dá)(R)-2-辛醇脫氫酶(輔酶為NAD+)而進(jìn)行轉(zhuǎn)化的微生物沒有限制，只要此生物體能用含有編碼(R)-2-辛醇脫氫酶(輔酶為NAD+)活性多肽的DNA的載體轉(zhuǎn)化，并能表達(dá)(R)-2-辛醇脫氫酶(輔酶為NAD+)活性。可能的微生物是具有宿主-載體系統(tǒng)的那些，例如包括細(xì)菌如埃希氏菌屬，芽孢桿菌屬，假單胞菌屬，沙雷氏菌屬，短桿菌屬，棒桿菌屬，鏈球菌屬，乳桿菌屬；放線菌如紅球菌屬和鏈霉菌屬；酵母如糖酵母屬，克魯維氏酵母屬，裂殖糖酵母屬，接合糖酵母屬，Yarrowia屬，絲孢酵母屬，紅冬孢屬，畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬；及真菌如鏈孢霉屬，曲霉屬，頭孢屬，木霉屬；等。
可運(yùn)用在分子生物學(xué)，生物工程，和基因工程領(lǐng)域的一般方法(例如，參見Sambrook等，“分子克隆”，冷泉港實驗室)進(jìn)行轉(zhuǎn)化體制備和構(gòu)建適于宿主的重組載體。為在微生物中表達(dá)編碼本發(fā)明(R)-2-辛醇脫氫酶(輔酶為NAD+)的基因，必須將DNA引入該微生物中穩(wěn)定的質(zhì)粒載體或噬菌體載體上，并使遺傳信息得以轉(zhuǎn)錄和翻譯。為此，將啟動子(一種調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯的單位)置于DNA 5’端的上游，并且優(yōu)選將一個終止子放置于該DNA 3’端的下游。在被用作宿主的微生物內(nèi)，所述啟動子和終止子應(yīng)該是有效的。可用于上述各種微生物的載體，啟動子，和終止子都詳述于“微生物學(xué)基本課程(8)基因工程”，Kyoritsu Shuppan，酵母專輯，見“高等生物化學(xué)工程(Adv.Biochem.Eng.)43，75-102(1990)”和“酵母8，423-488(1992)”。
例如，對于埃希氏菌屬，特別是對于大腸桿菌，有效質(zhì)粒包括pBR系列和pUC系列的質(zhì)粒；有效啟動子包括得自lac(得自β-半乳糖苷酶基因)，trp(得自色氨酸操縱子)，tac和trc(為lac和trp的嵌合體)的啟動子，λ噬菌體的PL和PR，等。有效終止子得自trpA，噬菌體，rrnB核糖體RNA，等。
對于芽孢桿菌，有效載體是pUB110系列和pC194系列的質(zhì)粒；所述載體可以整合入宿主染色體。有效啟動子和終止子得自apr(堿性蛋白酶)，npr(中性蛋白酶)，amy(α-淀粉酶)，等。
對于假單孢菌，有為惡臭假單孢菌(P.putida)和蔥頭假單孢菌(P.cepacia)開發(fā)的宿主載體系統(tǒng)?；谂c甲苯化合物分解有關(guān)的TOL質(zhì)粒的寬宿主范圍載體，pKT240，(包含RSF1010衍生的自我復(fù)制所需的基因)也有效；得自脂酶基因的啟動子和終止子(JP-A No.Hei 5-284973)也有效。
對于短桿菌屬，特別是對于乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)，有效質(zhì)粒載體包括pAJ43(基因39，281(1985))。用于大腸桿菌的啟動子和終止子可以不經(jīng)任何修飾而用于短桿菌屬。
對于棒桿菌屬，特別是對于谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicam)，可使用質(zhì)粒載體例如pCS11(JP-A Sho 57-183799)和pCB101(Mol.Gen.Gennet.196，175(1984))。
對于鏈球菌屬，可以使用質(zhì)粒載體如pHV1301(FEMS Microbiol.Lett.26，239(1985)和pGK1(應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)(Appl.Environ.Microbiol.)，50，94(1985))。
對于乳桿菌屬，可利用為鏈球菌屬開發(fā)的質(zhì)粒載體pAMβ1(細(xì)菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.)137，614(1979))；也可利用用于大腸桿菌的啟動子。
對于紅球菌屬，可使用分離自紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)的質(zhì)粒載體(普通微生物學(xué)雜志(J.Gen.Microbiol.)138，1003(1992))。
對于鏈霉菌屬，可按照在Hopwood等的“鏈霉菌的遺傳操作實驗室手冊(Genetic Manipulation of StreptomycesA Laboratory Manual)”(冷泉港實驗室(1985))中所述方法構(gòu)建質(zhì)粒。特別是對于青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)，可利用pIJ486(分子普通遺傳學(xué)203，468-478，1986)，pKC1064(基因，103，97-99(1991))，和pUWL-KS(基因165，149-150(1995))同樣的質(zhì)粒也可用于弗吉尼亞鏈霉菌(Streptomyces virginiae)。
對于糖酵母屬，特別是對于釀酒酵母，YRp系列，YEp系列，YCp系列，YIp系列的質(zhì)粒均有效；整合型載體(參見EP 537456，等)，通過與多拷貝核糖體基因同源重組而整合進(jìn)入染色體，允許引入多個拷貝的目的基因且整合的基因可以穩(wěn)定保持在微生物體內(nèi)；因此，這些類型的載體也高度有效。有效啟動子和終止子來自編碼ADH(乙醇脫氫酶)，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)，PHO(酸性磷酸酶)，GAL(β-半乳糖苷酶)，PGK(磷酸甘油酸激酶)，ENO(烯醇化酶)，等的基因。
對于克魯維氏酵母屬，特別是對于乳克魯維氏酵母，可用的質(zhì)粒如得自釀酒酵母的2-μm質(zhì)粒，pKD1系列質(zhì)粒(細(xì)菌學(xué)雜志145，382-390(1981))，得自pGK11且參與放毒活性的質(zhì)粒，KARS(克魯維氏酵母自主復(fù)制序列)質(zhì)粒，和可以通過與核糖體DNA進(jìn)行同源重組被整合進(jìn)入染色體的質(zhì)粒(參見EP 537456，等)。可使用得自ADH，PGK等的啟動子和終止子。
對于裂殖糖酵母屬，可使用包含得自粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的ARS(自主復(fù)制序列)以及得自釀酒酵母的營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)選擇標(biāo)記(分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)6，80(1986))的質(zhì)粒載體?？墒褂萌绲米运诰屏阎程墙湍傅腁DH啟動子(EMBO J.6，729(1987))。特定地，pAUR224可向TaKaRa Shuzo公司購買。
對于接合糖酵母屬，可用的質(zhì)粒如得自Zygosaccharomyces rouxii的pSB3(核酸研究13，4267(1985))；可使用如得自釀酒酵母的PHO5啟動子和得自Zygosaccharomyces rouxii的GAP-Zr(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)啟動子(農(nóng)業(yè)和生物化學(xué)(Agri.Biol.Chem.)54，2521(1990))。
對于畢赤氏酵母屬，已開發(fā)出源自畢赤氏酵母的自主復(fù)制序列(PARS1，PARS2)的宿主-載體系統(tǒng)(分子細(xì)胞生物學(xué)5，3376(1985))，也可以運(yùn)用高效的啟動子如甲醇誘導(dǎo)型AOX啟動子，其可用于高細(xì)胞密度培養(yǎng)(核酸研究，15，3859(1987))。已開發(fā)出用于Pichia angusta(以前稱為多形漢遜氏酵母)的宿主載體系統(tǒng)。盡管得自Pichia angusta的自主復(fù)制序列(HARS1，HARS2)可用作載體，但它們是相當(dāng)不穩(wěn)定的。因此，染色體的多拷貝整合對于它們是有效的(酵母7，431-443(1991))。另外，可使用由甲醇等誘導(dǎo)的AOX(乙醇氧化酶)和FDH(甲酸脫氫酶)啟動子。
對于假絲酵母屬，已開發(fā)了用于麥芽糖假絲酵母(C.maltosa)，白色假絲酵母(C.albicans)，熱帶假絲酵母(C.tropicalis)，產(chǎn)朊假絲酵母，等的宿主-載體系統(tǒng)。源自麥芽糖假絲酵母的自主復(fù)制序列(農(nóng)業(yè)和生物化學(xué)(Agri.Biol.Chem.)51，51，(1987))已被克隆，并已針對麥芽糖假絲酵母開發(fā)了利用此序列的載體。此外，已開發(fā)用于產(chǎn)朊假絲酵母的帶有高效啟動子單元的染色體整合載體(JP-A Hei 08-173170)。
對于曲霉屬，其中的黑曲霉和米曲霉已得到深入研究，發(fā)現(xiàn)了有效的質(zhì)粒載體和染色體整合載體以及得自胞外蛋白酶基因和淀粉酶基因的啟動子(生物技術(shù)趨勢(Trends in Biotechnology)7，283-287(1989))。
對于木霉屬，已開發(fā)出針對Tricholderma reesei的宿主載體系統(tǒng)，還有諸如得自胞外纖維素酶基因的啟動子(生物技術(shù)7，596-603(1989))。
已開發(fā)出用于對除微生物以外的植物和動物的多種宿主-載體系統(tǒng)；特別是，那些對昆蟲，如蠶的系統(tǒng)(自然315，592-594(1985))，以及對植物如油菜籽，玉米，土豆等的系統(tǒng)。優(yōu)選運(yùn)用這些系統(tǒng)表達(dá)大量外源蛋白。
具有生產(chǎn)本發(fā)明中所用4-鹵乙酰乙酸酯還原酶能力的微生物包括能生產(chǎn)NAD+依賴型(R)-2-辛醇脫氫酶的屬于畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬，Ogataea屬的所有菌株，突變體，變異體和轉(zhuǎn)化體，所述轉(zhuǎn)化體通過基因工程構(gòu)建并獲得生產(chǎn)本發(fā)明酶的能力。
另外，由上述方法得到的表達(dá)本發(fā)明(R)-2-辛醇脫氫酶的菌株可用于生產(chǎn)本發(fā)明的酶以及下述的仲醇和酮。
這樣，本發(fā)明涉及上述的通過用(R)-2-辛醇脫氫酶還原酮生成仲醇的方法。本發(fā)明的(R)-2-辛醇脫氫酶可以使用NADH作為輔酶，它比NADPH更便宜更穩(wěn)定，因此更有利于工業(yè)應(yīng)用。所要的氧化反應(yīng)可如下進(jìn)行，將本發(fā)明的酶，含有酶的培養(yǎng)液，或其加工產(chǎn)物與反應(yīng)液接觸。
酶與反應(yīng)液接觸的方式并不受限于這些實施例。在反應(yīng)液中，底物和NADH(酶反應(yīng)所必需的輔酶)溶解在合適的溶劑中，得到酶活性表達(dá)所需的環(huán)境條件。包括本發(fā)明的(R)-2-辛醇脫氫酶的微生物加工產(chǎn)物，特別包括那些細(xì)胞膜通透性可以通過有機(jī)溶劑如去污劑，甲苯等處理而改變的微生物；通過用玻璃珠或通過酶處理破碎真菌菌體得到的無細(xì)胞提取物；其部分純化的提取物等。
在本發(fā)明方法中可用于生產(chǎn)仲醇的酮，可以有苯乙酮，2-辛酮，4-鹵乙酰乙酸酯衍生物，可由通式1表示的丙酮氧苯衍生物通式1 (其中x1和x2表示鹵原子)，溴甲基環(huán)丙酮，2-乙酰丁內(nèi)酯，5-氯-2-戊酮。本發(fā)明的4-鹵乙酰乙酸酯衍生物是用任意鹵原子取代乙酰乙酸酯的位置4得到的化合物。組成上述乙酰乙酸酯的醇可以是任意的醇。4-鹵乙酰乙酸酯衍生物的鹵素可以是溴，氯，和碘，特別優(yōu)選氯。酯可以是含有直鏈，支鏈，和芳香取代基的醇的酯，如甲酯，乙酯，丙酯，異丙酯，丁酯，辛酯，苯酯，等，最優(yōu)選甲酯。4-鹵乙酰乙酸衍生物包括下述衍生物，其含有在位置2帶有直鏈或支鏈的烷基，或含有鹵素，如氯，溴，碘等。丙酮氧苯衍生物的鹵素包括溴，氯，碘，和氟，特別優(yōu)選氟。特別是，可用2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯，它生成的2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯是合成抗細(xì)菌藥物氧氟沙星的中間體。
本發(fā)明還涉及用上述(R)-2-辛醇脫氫酶氧化仲醇生成酮的方法。酮是反應(yīng)產(chǎn)物，可通過將本發(fā)明的(R)-2-辛醇脫氫酶，生產(chǎn)該酶的微生物，或其加工產(chǎn)物與仲醇反應(yīng)得到。在本發(fā)明中可以作為底物使用的仲醇有這樣的烷基醇，其帶有鹵素或芳香取代基等，如2-丙醇，2-丁醇，2-辛醇，1-苯乙醇等。
此外，以外消旋醇作底物，利用(R)-2-辛醇脫氫酶的不對稱氧化能力，可用本發(fā)明的酶，生產(chǎn)此酶的微生物，或其加工產(chǎn)物生產(chǎn)光學(xué)活性醇。也就是說，通過用本發(fā)明的酶優(yōu)選氧化任一光學(xué)異構(gòu)體以及通過得到殘余的光活性醇可以生產(chǎn)具有光學(xué)活性的醇。更特定地，本發(fā)明的(R)-2-辛醇脫氫酶在NAD+的參與下與外消旋物反應(yīng)，所述外消旋物中混合了2-辛醇或1-苯乙醇的(S)和(R)型。本發(fā)明的(R)-2-辛醇脫氫酶(其在立體選擇性上極佳)特異性作用于(R)型，將其氧化產(chǎn)生酮。但是，因為它不作用于該醇的(S)型，(S)型的比例逐漸變大。如果對這樣積累的(S)型進(jìn)行分離，可最終從外消旋物中回收該醇的(S)型。以此方法，可從(RS)-2-辛醇得到(S)-2-辛醇，從(RS)-苯乙醇得到(S)-苯乙醇。
在此所用術(shù)語“光學(xué)活性醇”指所含某一光學(xué)異構(gòu)體比其它光學(xué)異構(gòu)體更多的醇，或所含對映異構(gòu)體過量，優(yōu)選過量50％或更多，更優(yōu)選過量90％或更多，進(jìn)一步更優(yōu)選過量95％或更多的醇。而且，本發(fā)明的“光學(xué)異構(gòu)體”一般可以稱為“光學(xué)活性物質(zhì)”或“對映異構(gòu)體”。
本發(fā)明上述生產(chǎn)酮的方法可與NADH的再生系統(tǒng)組合。NADH從NAD+產(chǎn)生，其伴隨著由(R)-2-辛醇脫氫酶催化的氧化反應(yīng)。NAD+從NADH的再生可使用微生物中所含能從NADH再生NAD+的酶(系統(tǒng))來實現(xiàn)，或通過在反應(yīng)系統(tǒng)中加入能從NADH生成NAD+的微生物或酶，例如谷氨酸脫氫酶，NADH氧化酶，NADH脫氫酶，等類似的酶來實現(xiàn)。此外，利用本發(fā)明酶的底物特異性，可將還原反應(yīng)的底物，如2-辛酮，苯乙酮等，加入到反應(yīng)體系中，通過酶自身的作用共同促使NAD+從NADH的再生。
同樣，生產(chǎn)醇的方法可與NAD+的再生系統(tǒng)組合。NAD+從NADH產(chǎn)生并伴隨著還原反應(yīng)。微生物的NAD+還原能力(如糖酵解)可用于從NAD+再生NADH。在反應(yīng)體系中加入葡萄糖或乙醇可以加強(qiáng)此能力。備選地，能從NAD+產(chǎn)生NADH的微生物，或其處理產(chǎn)物或酶可以加入到反應(yīng)體系中。NADH的再生可用含有甲酸脫氫酶，葡萄糖脫氫酶，麥芽糖脫氫酶，甘油脫氫酶，乙醇脫氫酶，或類似酶的微生物，或其處理產(chǎn)物或其純化的酶來進(jìn)行。例如，在上述葡萄糖脫氫酶的情況下，可利用葡萄糖向δ-葡萄糖酸內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化進(jìn)行NADH的再生。利用本發(fā)明的(R)-2-辛醇脫氫酶的性質(zhì)，NADH可通過將氧化反應(yīng)的底物，如2-辛醇加入到反應(yīng)體系而利用酶自身進(jìn)行再生。
NADH再生反應(yīng)必需的反應(yīng)物可以以它們通常的形式或它們的固定化產(chǎn)物加入到生成本發(fā)明醇的反應(yīng)體系中。反應(yīng)物也可以通過一種能進(jìn)行NADH交換的膜與反應(yīng)體系接觸。
當(dāng)用含有本發(fā)明DNA的重組載體所轉(zhuǎn)化的微生物以活性狀態(tài)生產(chǎn)上述醇時，用于NADH再生的附加反應(yīng)系統(tǒng)可以省略。即，通過使用具有高NADH再生活性的微生物，可利用轉(zhuǎn)化體進(jìn)行有效的還原反應(yīng)，而不添加用于NADH再生的酶。而且，通過在宿主中引入可用于NADH再生的葡萄糖脫氫酶，甲酸脫氫酶，乙醇脫氫酶，氨基酸脫氫酶，有機(jī)酸脫氫酶(例如，蘋果酸脫氫酶，等)，等基因，以及同時引入編碼本發(fā)明NAD+依賴型(R)-2-辛醇脫氫酶的DNA，可以進(jìn)行NADH再生酶以及NAD+依賴型(R)-2-辛醇脫氫酶的更有效表達(dá)和還原反應(yīng)。將這兩個或多個基因引入宿主的方法有，用多個重組載體轉(zhuǎn)化宿主的方法，將兩個基因都引入一個單獨(dú)載體的方法，和將兩個基因引入染色體的方法，其中所述多個載體可通過為避免不相容而分別將基因引入具有不同復(fù)制起點的多個載體而獲得。
本發(fā)明中可用于NADH再生的葡萄糖脫氫酶的例子包括得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶。另外，甲酸脫氫酶的例子包括得自母牛分枝桿菌的甲酸脫氫酶。編碼這些酶的基因已經(jīng)克隆。備選地，這樣的基因可通過基于已知的核苷酸序列的PCR或雜交篩選從微生物中得到。
當(dāng)將多個基因引入一個載體時，每個基因都連接到涉及表達(dá)調(diào)節(jié)的區(qū)域，例如啟動子或終止子。多個基因也可以以包括多個順反子的操縱子象乳糖操縱子的形式表達(dá)。
使用本發(fā)明酶的氧化或還原反應(yīng)可在水中，或不溶于水的有機(jī)溶劑如乙酸乙酯，乙酸丁酯，甲苯，氯仿，正己烷，等，或在所述有機(jī)溶劑與水介質(zhì)如乙醇，丙酮等的兩相系統(tǒng)中進(jìn)行。
使用固定化酶，膜反應(yīng)器等可以完成本發(fā)明的反應(yīng)。
本發(fā)明的用(R)-2-辛醇脫氫酶進(jìn)行的酶反應(yīng)可在下列條件下進(jìn)行●反應(yīng)溫度4-60℃，優(yōu)選10-37℃●pH3-11，優(yōu)選5-10，更優(yōu)選6.0-9.0●底物濃度0.01-90％，優(yōu)選0.1-30％必要的話，可在反應(yīng)體系中加入0.001-100mM或優(yōu)選0.01-10mM輔酶NAD+或NADH。盡管底物可以在反應(yīng)開始時馬上加入，優(yōu)選連續(xù)或不連續(xù)加入，這樣可以使反應(yīng)混合液中底物濃度不至于太高。
要加入到再生NADH反應(yīng)體系的化合物，包括，例如，使用葡萄糖脫氫酶的情況下是葡萄糖，使用甲酸脫氫酶的情況下是甲酸，使用乙醇脫氫酶的情況下是乙醇或2-丙醇，加入時對底物酮的摩爾比是0.1∶20，優(yōu)選比底物酮過量0.5-5倍。加入的再生NADH的酶，如葡萄糖脫氫酶，甲酸脫氫酶，或乙醇脫氫酶可以是0.1-100倍，優(yōu)選0.5-20倍于本發(fā)明NAD+-依賴型(R)-2-辛醇脫氫酶的酶活性。
本發(fā)明中，通過還原酮產(chǎn)生的醇和不對稱氧化外消旋醇產(chǎn)生的醇可通過適當(dāng)組合對微生物細(xì)胞和蛋白的離心，經(jīng)過膜處理等的分離，溶劑萃取，蒸餾等方法而純化。
例如，對于4-鹵-3-羥基丁酸酯，在用離心從包含微生物細(xì)胞體的反應(yīng)混合物中除去微生物細(xì)胞后，可在上清液中加入溶劑如乙酸乙酯，甲苯等，將4-鹵-3-羥基丁酸酯萃取到溶劑層。在相分離后蒸餾可以純化得到高濃度的4-鹵-3-羥基丁酸酯。
用于所述各種合成反應(yīng)的本發(fā)明的酶并不限于純化的酶，還包括部分純化的酶，含此酶的微生物細(xì)胞，及其加工產(chǎn)物。在此所用術(shù)語“已加工的產(chǎn)物”總起來說是指微生物細(xì)胞，純化的酶，部分純化的酶，或由各種方法產(chǎn)生(fix)的類似物。構(gòu)成本發(fā)明酶反應(yīng)的酶可以以固定化的形式使用。酶固定化的方法并不特別受限制。例如，使用戊二醛，丙烯酰胺，κ-角叉菜聚糖，藻酸鈣，離子交換樹脂，硅藻土及其它來固定酶的方法是已知的。本發(fā)明的反應(yīng)可利用膜反應(yīng)器等進(jìn)行。組成膜反應(yīng)器的膜例如超濾膜，疏水膜，陽離子膜，納米濾膜(J.Ferment.Bioeng.83，54-58(1997))等。
所有在此的引用都作為參考文獻(xiàn)引入。
附圖簡述

圖1表示pH變化對純化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶活性的影響?？v軸表示以(R)-2-辛醇脫氫酶最大活性為100時的相對活性。
圖2表示pH變化對純化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶的乙基4-氯乙酰乙酸酯還原活性的影響。縱軸表示以最大活性為100時的相對活性。
圖3表示溫度變化對純化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶活性的影響?？v軸表示以最大活性為100時的相對活性。
圖4表示溫度變化對純化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶的乙基4-氯乙酰乙酸酯還原活性的影響?？v軸表示以最大活性為100時的相對活性。
圖5表示純化自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶的殘余活性?？v軸表示殘余活性，其以未經(jīng)處理的酶活性為100。
圖6表示質(zhì)粒(pSE-PFO1)的構(gòu)建，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因已引入其中。在此質(zhì)粒圖譜上，簡寫如下表示P(trc)，trc啟動子；T(rrnB)，rrnBT1T2終止子；Amp，表現(xiàn)出氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因；ori，質(zhì)粒的復(fù)制起點；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物。pSE-PFO1中的PfODH表示得自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶。
圖7表示質(zhì)粒(pSE-PFO2)的構(gòu)建，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因已引入其中。在此質(zhì)粒圖譜上，簡寫如下表示P(trc)，trc啟動子；T(rrnB)，rrnBT1T2終止子；Amp，表現(xiàn)出氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因；ori，質(zhì)粒的復(fù)制起點；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物。pSE-PFO2中的PfODH表示得自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶。
圖8表示質(zhì)粒(pSE-BSG3)的構(gòu)建，得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因已引入其中。在此質(zhì)粒圖譜上，簡寫如下表示P(trc)，trc啟動子；T(rrnB)，rrnBT1T2終止子；Amp，表現(xiàn)出氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因；ori，質(zhì)粒的復(fù)制起點；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物；BsGlcDH，得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因。
圖9表示質(zhì)粒(pSG-PFO1)的構(gòu)建，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因和得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因已引入該質(zhì)粒中。在此質(zhì)粒圖譜上，簡寫如下表示P(trc)，trc啟動子；T(rrnB)，rrnBT1T2終止子；Amp，表現(xiàn)出氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因；ori，質(zhì)粒的復(fù)制起點；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物；BsGlcDH，得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因；PfODH，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因。
圖10表示質(zhì)粒(pSG-PFO2)的構(gòu)建，其中引入了得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因和得枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因。在此質(zhì)粒圖譜上，簡寫如下表示P(trc)，trc啟動子；T(rrnB)，rrnBT1T2終止子；Amp，表現(xiàn)出氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因；ori，質(zhì)粒的復(fù)制起點；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物；BsGlcDH，得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因；PfODH，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因。
圖11表示質(zhì)粒(pSE-MCF15)的構(gòu)建，得自母牛分枝桿菌的甲酸脫氫酶基因已引入其中。在此質(zhì)粒圖譜上，簡寫如下表示P(trc)，trc啟動子；T(rrnB)，rrnBT1T2終止子；Amp，表現(xiàn)出氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因；ori，質(zhì)粒的復(fù)制起點；rop，ROP-蛋白基因；laqIq，乳糖阻遏物；McFDH，得自母牛分枝桿菌的甲酸脫氫酶基因。
圖12表示質(zhì)粒(pSF-PFO2)的構(gòu)建，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因和得自母牛分枝桿菌的甲酸脫氫酶基因已引入其中。在此質(zhì)粒圖譜上，簡寫如下表示P(trc)，trc啟動子；T(rrnB)，rrnBT1T2終止子；Amp，表現(xiàn)出氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因；ori，質(zhì)粒的復(fù)制起點；rop，ROP-蛋白基因；1aqIq，乳糖阻遏物；McFDH，得自母牛分枝桿菌的甲酸脫氫酶基因；PfODH，得自Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶基因。
圖13表示pH變化對純化自產(chǎn)朊假絲酵母的(R)-2-辛醇脫氫酶活性的影響?？v軸表示相對活性，其中以最大活性為100。
圖14表示pH變化對純化自產(chǎn)朊假絲酵母的(R)-2-辛醇脫氫酶的乙基4-氯乙酰乙酸酯還原活性的影響?？v軸表示相對活性，其中以最大活性為100。
實施本發(fā)明的最佳模式本發(fā)明參照下面的實施例進(jìn)行詳細(xì)說明，但并不限于此。實施例1(R)-2-辛醇脫氫酶的篩選酵母的(R)-2-辛醇脫氫酶通過電泳后的活性染色方法來篩選，底物為(R)-或(S)-2-辛醇底物，反應(yīng)混合物包括NAD+，吩嗪硫酸二甲酯(PMS)，氮藍(lán)四唑(NBT)。反應(yīng)混合物的組成如下5mM(R)-或(S)-2-辛醇1.3mM NAD+0.13mM PMS0.48m MNBT結(jié)果，當(dāng)?shù)孜锸?S)-2-辛醇時沒有被染色，但當(dāng)?shù)孜锸?R)-2-辛醇時優(yōu)先被染色的酶在以下酵母菌株中發(fā)現(xiàn)。這些有著(R)-2-辛醇脫氫酶活性的酶也具有通過還原4-氯乙酰乙酸乙酯生產(chǎn)(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯的活性。
●Pichia finlandicaDSM 70280，DSM 1380●Pichia jadiniiDSM 2361，DSM 70167，IFO 0987●產(chǎn)朊假絲酵母IFO 0988，IFO 0626●Ogataea wickerhamiiIFO 1706實施例2生產(chǎn)(R)-2-辛醇脫氫酶的培養(yǎng)條件實施例1的生產(chǎn)(R)-2-辛醇脫氫酶的菌株由2％葡萄糖改變?yōu)?％甘油或1％甲醇的碳源中培養(yǎng)。結(jié)果是，Pichia finlandica可以在所有培養(yǎng)液中誘導(dǎo)此酶。當(dāng)甲醇作碳源時，產(chǎn)朊假絲酵母可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)該酶。實施例3純化得自于Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶Pichia finlandica DSM 70280菌株培養(yǎng)在4.8L培養(yǎng)基A中，離心制備微生物細(xì)胞。得到的微生物細(xì)胞懸浮在100mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，10％甘油，1mM乙二胺四乙酸2Na(EDTA2·Na)，0.02％2-巰基乙醇，和2mM苯甲烷磺酰氟(PMSF)中，用玻璃珠攪拌器(Biospec)勻漿。然后，離心除去微生物細(xì)胞碎片，得到無細(xì)胞提取液。加入硫酸魚精蛋白，離心除去核酸得到上清液。將硫酸銨加入上清液中，在40-75％飽和度得到沉淀的級分。將含有30％飽和度的硫酸銨的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液加入到沉淀級分中，得到含有40％(終濃度)飽和的硫酸銨的酶液。離心該酶液得到上清液。將該上清液上樣到以含有30％飽和的硫酸銨的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液平衡的Phenyl-Toyopearl650M(5.0cm×25cm)，以30％-0％飽和的硫酸銨梯度洗脫。培養(yǎng)基A和標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的組成如下培養(yǎng)基A10g/L酵母提取物20g/L蛋白胨20g/L葡萄糖pH6.0標(biāo)準(zhǔn)緩沖液10mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)0.01％2-巰基乙醇10％甘油(R)-2-辛醇脫氫酶活性可以在梯度洗脫的級分中觀測到?；厥赵摲逯挡糠植⑼ㄟ^超濾濃縮。
濃縮的酶液用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液透析后，離心得到上清液。將上清液上樣到Blue-Sepharose CL-6B(5cm×10cm)，以標(biāo)準(zhǔn)緩沖液洗柱，用0-1.5M氯化鈉進(jìn)行濃度梯度洗脫。當(dāng)(R)-2-辛醇脫氫酶活性已洗脫在梯度洗脫部分中時，回收和濃縮該級分。用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(pH8.5)透析濃縮的酶液后，上樣到DEAE-Sepharose FF(1.6cm×10cm)，以標(biāo)準(zhǔn)緩沖液沖洗，用0-1M氯化鈉進(jìn)行濃度梯度洗脫。當(dāng)(R)-2-辛醇脫氫酶活性已洗脫至流過級分和梯度洗脫部分中時，回收和濃縮這些活性級分。對得自流過級分的酶液進(jìn)行凝膠過濾，其使用Superdex 200(0.32cm×30cm，SMART系統(tǒng)，Amersham PharmaciaBiotech)，并使用含0.3M氯化鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液。將凝膠過濾的活性級分濃縮得到酶。
所純化的酶的最高比活性是約91U/mg-蛋白，其是氧化(R)-2-辛醇的活性。純化概述如下表
表1

實施例4(R)-2-辛醇脫氫酶分子量的測定SDS-PAGE結(jié)果顯示實施例3中得自Pichia finlandica的酶的分子量約為30,000Da。當(dāng)使用Superdex200柱凝膠過濾時，分子量約為83,000Da。實施例5(R)-2-辛醇脫氫酶的最佳pH使用磷酸緩沖液(KPB)，Tris-HCl緩沖液，甘氨酸緩沖液改變pH，觀察實施例3所得酶的(R)-2-辛醇脫氫酶活性。圖1顯示了相對活性，其以最大活性為100。實驗結(jié)果為，此酶的最佳pH范圍為8.0-11.0。
接著，使用磷酸緩沖液(KPB)，Tris-HCl緩沖液，甘氨酸緩沖液改變pH，觀察實施例3所得酶的4-氯乙酰乙酸乙酯還原酶活性。圖2顯示了以最大活性為100時的相對活性。實驗結(jié)果為，此酶的最佳pH范圍為5.0-6.5。實施例6(R)-2-辛醇脫氫酶的最佳溫度在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下只改變溫度觀察得自實施例3的酶的(R)-2-辛醇氧化活性。圖3顯示了以最大活性為100時的相對活性。實驗結(jié)果為，此酶的最佳溫度范圍為45-55℃。
在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下只改變溫度觀察得自實施例3的酶的4-氯乙酰乙酸乙酯還原酶活性。圖4顯示了以最大活性為100時的相對活性。實驗結(jié)果為，此酶的最佳溫度范圍為55-60℃。實施例7酶穩(wěn)定的pH范圍實施例3的酶在Britten-Robinson緩沖液pH3-12，30℃下孵育30分鐘，測定殘余活性。圖5顯示了殘余活性，其以未處理的酶活性為100。pH8.0-9.0之間酶最穩(wěn)定。實施例8(R)-2-辛醇脫氫酶的底物特異性使(R)-2-辛醇脫氫酶與各種醇反應(yīng)，測定其氧化活性。表2表示了相對活性，其以(R)-2-辛醇在NAD+為輔酶時的氧化活性為100。
表2底物(氧化反應(yīng))(R)-2-辛醇100(S)-2-辛醇4.732-丙醇6.791-辛醇1.72乙基(R)-4-氯-3-羥基丁酸酯 0.172乙基(S)-4-氯-3-羥基丁酸酯 2.24(R)-1-苯乙醇 255(S)-1-苯乙醇 1.81乙基(R)-3-羥基丁酸酯 41.1乙基(S)-3-羥基丁酸酯 1.03乙醇 0.668(R)-2-丁醇49.3(S)-2-丁醇7.31環(huán)己醇0.172(R)-1-苯基-1，3-丙二醇0.344(S)-1-苯基-1，3-丙二醇0.2582-己醇54.1(R)-1，3-丁二醇 1.29(S)-1，3-丁二醇 0.5162-辛醇77.81-苯氧基-2-丙醇 15.5結(jié)果是，對(S)-2-辛醇的相對活性為4.7％，對2-丙醇為6.8％，對(R)-1-苯乙醇為255％。
使實施例3的酶與各種酮反應(yīng)，測定其還原活性。表3顯示了以NADH為輔酶的4-氯乙酰乙酸乙酯還原活性為100時的相對活性。
表3底物(還原反應(yīng))乙基4-氯乙酰乙酸酯 1002-辛酮 31.2苯乙酮 45.3乙酰乙酸乙酯1061-苯氧基-2-丙酮 54.2丙醛18.44-羥基-2-丁酮 0.691丙酮1.822-丁酮 7.99實驗結(jié)果為，對2-辛酮的相對活性為31.2％，對苯乙酮為45％。實施例9(R)-2-辛醇脫氫酶對試劑的行為(R)-2-辛醇脫氫酶用各種試劑30℃下處理30分鐘，測定(R)-2-辛醇脫氫酶活性。表4顯示了所得殘余活性，其以未加試劑而在30℃處理了30分鐘的酶的活性為100。本發(fā)明(R)-2-辛醇脫氫酶受氯化汞和乙二胺四乙酸2Na(EDTA·2Na)的輕微抑制。用N-乙基馬來酰亞胺，o-菲咯啉，氯化鎂，氯化鈣，和氯化錳穩(wěn)定該酶。
表4試劑 濃度 殘余活性(mM) (％)對照- 100苯甲基磺酰氟1 111對氯苯甲酸汞0.05 118N-乙基馬來酰亞胺1 147EDTA·2Na 1 81O-菲咯啉1 162二硫蘇糖醇 1 123NH2OH·HCl 0.01 99五羥黃酮0.1 99KCl 1 106MgCl2·6H2O 1 185CaCl2·2H2O 1 174MnCl2·4H2O 1 185FeCl21 93CoCl2·6H2O 1 99NiCl2·6H2O 1 103ZnCl21 96BaCl2·2H2O 1 102CuSO41 100HgCl20.01 62實施例10試劑對(R)-2-辛醇脫氫酶的活化作用測定在各種試劑中(R)-2-辛醇脫氫酶的活化作用。表5顯示了得到的活性，其以沒有試劑時的活性為100。本發(fā)明(R)-2-辛醇脫氫酶被鎂，錳和鋅離子活化。陰離子中，硫酸離子可活化此酶活性。
表5試劑 濃度 相對活性(mM) (％)對照 - 100MgCl2·6H2O 1 122MgSO41 125MnCl2·4H2O 1 114MnSO4·4-5H2O1 121ZnCl21 105ZnSO4·7H2O 1 110實施例11(R)-2-辛醇脫氫酶的部分氨基酸序列采用實施例3的，但N端氨基酸已被封閉的酶通過蛋白測序儀分析N端氨基酸序列。然后，SDS-PAGE分離所純化的酶，切下含有(R)-2-辛醇脫氫酶的凝膠。將含有胰蛋白酶的Tris緩沖液加入該凝膠中，35℃下處理20小時。然后，用反相HPLC處理樣品溶液，分離肽段。用蛋白測序儀分析肽段。結(jié)果得到三種氨基酸序列。肽A，B，C的氨基酸序列分別表示在SEQID NO3，4，5中。
SEQ ID NO3肽AVal-Ala-Val-Val-Thr-Gly-Ala-Leu-Ser-GlySEQ ID NO4肽BLeu-Ile-Ser-Glu-Thr-Leu-Ala-Thr-Phe-Gly-Gly-LeuSEQ ID NO5肽CLeu-Gly-Arg-Pro-Glu-Glu-Val-Ala-Asp-Ala實施例12從Pichia finlandica制備染色體DNA通過Cryer方法(細(xì)胞生物學(xué)方法(Meth.Cell Biol.)12，39-44(1975))，從Pfchia finlandica純化染色體DNA。實施例13對(R)-2-辛醇脫氫酶基因的核心區(qū)域的PCR克隆合成對應(yīng)于肽A的有義引物和對應(yīng)于肽C的反義引物。將BamHI限制酶切位點(GTCGGATCC)加入到每一引物的5’端。每一引物的核苷酸序列表示在SEQ ID NO6(引物A)和SEQ ID NO7(引物C)中。
SEQ ID NO6引物A
GTCGGATCCGTBGCHGTBGTBACHGGHGCSEQ ID NO7引物CGTCGGATCCGCRTCNGCNACYTCYTCNGG用50μL反應(yīng)液進(jìn)行PCR，其中含有引物A和C各50pmol，10nmoldNTP，100ng來自Pichia finlandica的染色體DNA，用于ExTaq的緩沖液(Takara)，和ExTaq 2U(Takara)。PCR條件為94℃變性30秒，37℃下退火30秒，70℃下延伸1分鐘的30個循環(huán)。結(jié)果為特異性PCR產(chǎn)物得到了擴(kuò)增。實施例14對(R)-2-辛醇脫氫酶基因核心區(qū)域的PCR片段的亞克隆PCR擴(kuò)增的每一DNA片段用苯酚/氯仿提取，經(jīng)乙醇沉淀回收，BamHI限制酶消化。2％瓊脂糖凝膠電泳后，使用Sephaglas(Pharmacia)切下合適寬度的區(qū)帶，回收。
使用Takara連接試劑盒第2版將得到的每一DNA片段與BamHI限制酶消化的pUC18(Takara)連接。然后，大腸桿菌(E.coli)菌株JM109用其轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化菌株在平板上孵育，該平板上含有50μg/mL氨芐青霉素，50μg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷和20μg/mL異丙基硫代-β-D-半乳吡喃糖苷(IPTG)和LB培養(yǎng)基(1％細(xì)菌用蛋白胨，0.5％細(xì)菌用酵母提取物，1％氯化鈉)。一些白色的菌落在含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用Flex-Prep(Pharmacia)純化含有DNA片段的質(zhì)粒。
利用此質(zhì)粒，分析插入的DNA的核苷酸序列。用BigDye TerminatorCycle Sequencing FS Ready Reaction試劑盒(Applied Biosystems)進(jìn)行PCR，采用PRISM 310基因分析試劑盒(Applied Biosystems)分析DNA的核苷酸序列。測定的核心區(qū)核苷酸序列表示在SEQ ID NO8PF-CORE中。實施例15(R)-2-辛醇脫氫酶基因核心區(qū)附近的DNA的亞克隆用BstYI，NspI，PstI限制性酶消化來自Pichia finlandica的染色體DNA。每一片段用T4連接酶16℃過夜使之自我連接而環(huán)化。將BamHI酶切位點(GTCGGATCC)加入到引物PfOD-c5u(SEQ ID NO9)和PfOD-c3d(SEQ IDNO10)的5’末端。PCR在含上述引物各50pmol，10nmol dNTP，125ng自連接的DNA，用于ExTaq的緩沖液(Takara)，ExTaq 1U(Takara)的反應(yīng)液中進(jìn)行。PCR條件為94℃變性30秒，55℃下退火30秒，70℃下延伸7分鐘的30個循環(huán)，采用的是GeneAmp PCR系統(tǒng)2400(Perkin Elmer)。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測到約為3500bp，2000bp，4000bp的DNA片段，它們分別對應(yīng)于模板DNA用BstYI，NspI，和PstI酶消化得到的DNA片段。
SEQ ID9PfOD-c5uGTCGGATCCTCAGAGATCGTTACTTTGGCSEQ ID10PfOD-c3dGTCGGATCCCGACTCCTTTGATAGATGAGPCR擴(kuò)增的每一DNA片段用苯酚/氯仿提取，經(jīng)乙醇沉淀回收，并用BamHI限制酶消化。瓊脂糖凝膠電泳后，用Sephaglas(Pharmacia)切下有著適當(dāng)寬度的區(qū)帶，并回收。
使用Takara連接試劑盒第2版，將得到的每一DNA片段連接到用BamHI限制酶消化的pUC18(Takara)。然后用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109。轉(zhuǎn)化菌株在含有LB培養(yǎng)基(1％細(xì)菌用蛋白胨，0.5％細(xì)菌用酵母提取物，1％氯化鈉)的平板上孵育，培養(yǎng)基中有50μg/ml氨芐青霉素，50μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷，和20μg/ml異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。取一些白色菌落培養(yǎng)在含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，用Flex-Prep(Parmacia)純化含DNA片段的質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒是pPF-Bst，pPF-Nsp，和pPF-Pst，其分別對應(yīng)于用于制備的限制酶BstYI，NspI，和PstI。
從所純化質(zhì)粒分析所插入DNA的核苷酸序列。用BigDye TerminatorCycle Sequencing FS Ready Reaction試劑盒(Applied Biosystems)進(jìn)行PCR。DNA的核苷酸序列用PRISM310基因分析試劑盒(Applied Biosystems)分析。將分析過的，pPF-BST，pPF-Nsp，和pPF-Pst中所插入DNA的核苷酸序列分到核心區(qū)的5’上游區(qū)域和3’下游區(qū)域并表示為PF-5U(SEQ ID NO11)和PF-3D(SEQ ID NO12)。
合成PF-5U，PF-3D，和PF-CORE的核苷酸序列，通過開放讀碼框(ORF)檢索確定(R)-2-辛醇脫氫酶的序列。所確定的核苷酸序列表示在SEQ IDNO1中，核苷酸序列編碼的氨基酸序列表示為SEQ ID NO2。這些合成和ORF檢索用軟件Genetyx-ATSQ/WIN和Genetyx-WIN(SoftwareDeveloping Company)進(jìn)行。實施例16(R)-2-辛醇脫氫酶的克隆-1基于(R)-2-辛醇脫氫酶結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列合成用于構(gòu)建表達(dá)載體的引物PFO-ATG1(SEQ ID No13)和PFO-TAA1(SEQ ID NO14)。用含上述引物各50pmol，10nmoldNTP，50ng來自Pichia finlandica的染色體DNA，用于Pfu-DNA聚合酶的緩沖液(STRATAGENE)，和Pfu-DNA聚合酶1.25U(STRATAGENE)的50μL反應(yīng)液進(jìn)行PCR。PCR條件為95℃變性30秒，55℃下退火1分鐘，70℃下延伸1.5分鐘的30個循環(huán)，采用的是GeneAmpPCR系統(tǒng)2400(PerkinElmer)。
SEQ ID NO13 PFO-ATG1TCGACATGTCTTATAATTTCCATAACAAGSEQ ID NO14 PFO-TAA1GCAGAATTCCTCTAGATTACTGGGCTGTGTACCCPCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，可以檢測到特異性區(qū)帶。
得到的DNA片段用苯酚/氯仿提取，經(jīng)乙醇沉淀回收。用AflIII和EcoRI限制酶消化所述DNA片段。瓊脂糖凝膠電泳后，使用Sephaglas(Pharmacia)切下合適寬度的區(qū)帶，回收。
將得到的DNA片段用Takara連接試劑盒連接到用NcoI和EcoRI限制酶消化的質(zhì)粒pSE420D(Invitrogen)，但帶有修飾的多克隆位點的變體(JP-A2000-189170)上。然后，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株。
將轉(zhuǎn)化菌株在含有50μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。從一些菌落中純化質(zhì)粒，分析插入片段的核苷酸序列。將含有本發(fā)明的(R)-2-辛醇脫氫酶的質(zhì)粒命名為pSE-PF01。圖6表示了構(gòu)建該質(zhì)粒的過程。實施例17(R)-2-辛醇脫氫酶的克隆-2用于構(gòu)建表達(dá)載體的引物PFO-ATG2(SEQ ID NO15)和PFO-TAA2(SEQ ID NO16)根據(jù)(R)-2-辛醇脫氫酶結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列合成。用50μL反應(yīng)液進(jìn)行PCR，其中包括上述引物各10pmol，10nmol dNTP，50ng來自Pichia finlandica的染色體DNA，用于Pfu-DNA聚合酶的緩沖液(STRATAGENE)，和Pfu-DNA聚合酶1.25U(STRATAGENE)。PCR條件為95℃變性30秒，50℃下退火60秒，70℃下延伸1.5分鐘的30個循環(huán)，采用的是GeneAmp PCR系統(tǒng)2400(PerkinElmer)。
SEQ ID NO15 PFO-ATG2CACGAATTCTAAAATGTCTTATAATTTCCATAACAAGSEQ ID NO16 PFO-TAA2AGTACTAGTATTACTGGGCTGTGTACCC
PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，可以檢測到特異性區(qū)帶。
得到的DNA片段用苯酚/氯仿提取，經(jīng)乙醇沉淀回收，然后用EcoRI和SpeI限制酶消化。瓊脂糖凝膠電泳后，使用Sephaglas(Pharmacia)切下合適寬度的區(qū)帶。
將得到的DNA片段借助Takara連接試劑盒連接到SpeI和EcoRI限制酶消化的質(zhì)粒pSE420D上。然后，用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109菌株。
將轉(zhuǎn)化菌株在含有50μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。從一些菌落純化質(zhì)粒，分析插入片段的核苷酸序列。有著本發(fā)明的(R)-2-辛醇脫氫酶的質(zhì)粒命名為pSE-PF02。圖7表示了構(gòu)建該質(zhì)粒的過程。實施例18由大腸桿菌生產(chǎn)重組(R)-2-辛醇脫氫酶將用(R)-2-辛醇脫氫酶基因的表達(dá)質(zhì)粒pSE-PF01和pSE-PF02轉(zhuǎn)化的JM109菌株，在含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)過夜，加入0.1mMIPTG，再培養(yǎng)4小時。
離心收集微生物細(xì)胞后，用含有0.02％ 2-巰基乙醇和1mM硫酸鎂的100mM Tris-HCl緩沖液(pH8.5)懸浮菌體，用密閉超生破碎儀UCD-200TM(CosmoBio)破碎處理4分鐘。上清作為提取液回收。實施例19重組(R)-2-辛醇脫氫酶活性測定實施例18的重組(R)-2-辛醇脫氫酶對(R)-2-辛醇的活性，并與沒有質(zhì)粒的無細(xì)胞提取液的活性相比。結(jié)果顯示于表6中。
表6

實施例20通過各種大腸桿菌菌株生產(chǎn)重組(R)-2-辛醇脫氫酶用表達(dá)(R)-2-辛醇脫氫酶基因的質(zhì)粒pSE-PF01轉(zhuǎn)化菌株HB101，TG1(大腸桿菌DSM6056)，和MG1665(大腸桿菌ATCC 47076)。
將每種重組大腸桿菌在LB液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)過夜，添加0.1mMIPTG，再培養(yǎng)4小時。收集得到的兩種大腸桿菌，測定它們的酶活性。實施例21用質(zhì)粒pSE-PF01轉(zhuǎn)化的各種大腸桿菌菌株的活性實施例20的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(對應(yīng)于2mL培養(yǎng)液)由實施例18的方法破碎。制備提取液，測定酶活?；钚燥@示于表7。

實施例22枯草芽孢桿菌DNA的純化枯草芽孢桿菌BGSC 1A1菌株培養(yǎng)在LB培養(yǎng)基中。使用QiagenGenomic Tip(Qiagen)，遵循所附手冊描述的方法從該菌株提取染色體DNA。實施例23枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的克隆為再生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，對文獻(xiàn)(JP-A 2000-189170)所述的枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因克隆。按照該參考中的方法得到pSE-BSG1。合成引物BSG-ATG3(SEQ ID NO19)和BSG-TAA3(SEQ IDNO20)，基于結(jié)構(gòu)基因5’末端和3’末端的序列構(gòu)建新的質(zhì)粒。使用pSE-BSG1作模板進(jìn)行PCR，條件為95℃變性30秒，50℃下退火60秒，75℃下延伸3分15秒的30個循環(huán)。然后，獲得特異性區(qū)帶。
SEQ ID NO17BSG-ATG3AGACCATGGATCCAATGTATCCAGATTTAAAGGAASEQ ID NO18BSG-TAA3GAATCTAGATTAACCGCGGCCTGCCTG得到的DNA片段用NcoI和XbaI限制酶消化。質(zhì)粒載體也用NcoI和XbaI限制酶消化。PCR擴(kuò)增后用兩種酶消化的DNA片段用T4 DNA連接酶連接到上述質(zhì)粒中，得到pSE-BSG3。圖8表示了構(gòu)建該質(zhì)粒的過程。實施例24共表達(dá)Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶基因和枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的質(zhì)粒pSG-PF01的構(gòu)建通過用兩種限制性酶，MluI和EcoRI消化實施例15中構(gòu)建的pSE-PF01制備出含有Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶基因的DNA片段。
實施例23中構(gòu)建的質(zhì)粒pSE-BSG1包含得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因，用兩種限制性酶，MluI和EcoRI消化該質(zhì)粒，制備含有得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因的DNA片段。用T4連接酶將該片段連接到含有Pichia finlandica的，用酶從pSE-PF01剪切得到的(R)-2-辛醇脫氫酶基因的DNA片段上，得到質(zhì)粒pSG-PF01，其可同時表達(dá)葡萄糖脫氫酶和(R)-2-辛醇脫氫酶。圖9表示了該質(zhì)粒的構(gòu)建過程。實施例25共表達(dá)Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶基因和枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶基因的質(zhì)粒pSG-PF02的構(gòu)建用兩種限制性酶，EcoRI和SpeI消化在實施例16中構(gòu)建的pSE-PF02，從而制備含有Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶基因的DNA片段。
實施例23構(gòu)建的質(zhì)粒pSE-BSG3含有得自枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因，用用兩種限制性酶，EcoRI和SpeI消化該質(zhì)粒。用T4 DNA連接酶將此片段連接到下述DNA片段，該DNA片段包含用酶從pSE-PF02剪切得到的來自Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶基因，這樣就得到了質(zhì)粒pSG-PF02，其可同時表達(dá)葡萄糖脫氫酶和(R)-2-辛醇脫氫酶。圖10表示了該質(zhì)粒的構(gòu)建過程。實施例26枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶和Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶在大腸桿菌中的同時表達(dá)用共表達(dá)枯草芽孢桿菌葡萄糖脫氫酶和Pichia finlandica(R)-2-辛醇脫氫酶的質(zhì)粒pSG-PF01或pSG-PF02轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109。
將每種重組大腸桿菌菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)過夜。然后，加入IPTG 0.1mM，再培養(yǎng)大腸桿菌4小時。收集得到的兩種大腸桿菌，測定酶活。實施例27用pSG-PF01或pSG-PF02轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的酶活性實施例26中轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(相當(dāng)于2mL培養(yǎng)液)用實施例17的方法破碎以制備提取物。此提取物用于酶活的測定。在含100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5)，2.5mM NAD+，100mM D-葡萄糖，和葡萄糖脫氫酶的反應(yīng)液中30℃下進(jìn)行酶活性的測定。1U為在上述條件下1分鐘催化生產(chǎn)1μmol NADH的酶量。兩者活性列于表8中。
表8


實施例28母牛分枝桿菌甲酸脫氫酶的亞克隆從參考文獻(xiàn)(Appl.Microbiol.Biotechnol.44，479-483(1995))所描述的母牛分枝桿菌中克隆甲酸脫氫酶基因以再生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸。
基于該參考文獻(xiàn)中結(jié)構(gòu)基因的5’端和3’核苷酸序列合成引物MCF-ATG2(SEQ ID NO19)和MCF-TAA3(SEQ ID NO20)，以便只克隆甲酸脫氫酶的開放讀碼框。采用質(zhì)粒pSFR415(Seimeikenjouki登記號7391(FERMBP-7391))為模板進(jìn)行PCR，95℃下45秒，50℃下1分鐘，75℃下7分鐘共30個循環(huán)。然后得到特定的區(qū)帶。得到的DNA片段用NcoI和XbaI限制酶消化。質(zhì)粒pSE420D也用NcoI和XbaI限制酶消化。將用同樣的酶消化的DNA片段用T4 DNA連接酶連接到載體上，得到pSE-MCF15。圖11顯示了構(gòu)建該質(zhì)粒的方法。
插入的DNA片段的核苷酸序列分析結(jié)果顯示，此DNA編碼的蛋白與所述文獻(xiàn)中的氨基酸序列相同。
SEQ ID NO19MCF-ATG2CTTTCTAGAGGAATTCAACCATGGCAAAAGTTCTGTGTGTTCSEQ ID NO20MCF-TAA3CAGTCTAGATTAGACCGCTTTTTTGAATTTGGCG用pSFR415轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株JM109的國際保藏(a)保藏機(jī)構(gòu)名稱和地址名稱國立生命科學(xué)和人體技術(shù)研究所，產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所，經(jīng)濟(jì)通產(chǎn)省(原名通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所)地址日本國茨城縣筑波市東1丁目1番3號305-8566(b)保藏日期2000年11月10日(c)保藏號碼FERM BP-7391實施例29既表達(dá)Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶又表達(dá)分枝桿菌的甲酸脫氫酶的質(zhì)粒pSF-PF02的構(gòu)建實施例16的pSE-PF02用EcoRI和SpeI消化，制備含Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶的DNA片段。
實施例28的質(zhì)粒pSF-MCF15用EcoRI和SpeI消化，制備含分枝桿菌甲酸脫氫酶基因的DNA片段。使用T4連接酶將該DNA連接至含有用上述酶從pSE-PF01剪切得到的Pichia finlandica(R)-2-辛醇脫氫酶基因的DNA片段。于是，得到了可同時表達(dá)甲酸脫氫酶和(R)-2-辛醇脫氫酶的質(zhì)粒pSF-PF02。圖12顯示了構(gòu)建該質(zhì)粒的方法。實施例30在大腸桿菌中同時表達(dá)Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶和分枝桿菌的甲酸脫氫酶用質(zhì)粒pSF-PF02轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109，該質(zhì)粒可共表達(dá)Pichiafinlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶和分枝桿菌的甲酸脫氫酶。
將此重組大腸桿菌接種至LB液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)過夜。然后，加入IPTG 0.1mM，再培養(yǎng)大腸桿菌4小時。收集得到的大腸桿菌，測定酶活。實施例31用pSF-PF02轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的酶活性實施例30中制備的用pSF-PF02轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(相當(dāng)于2mL培養(yǎng)液)按照實施例17的方法進(jìn)行破碎以制備提取液。提取液用于測定酶活。在30℃下進(jìn)行葡萄糖脫氫酶活性的測定，反應(yīng)液中含有100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5)，2.5mM NAD+，100mM甲酸，及所述酶。1U表示為在上述條件下1分鐘內(nèi)催化生產(chǎn)1μmol NADH的酶量。由重組大腸桿菌得到的粗制酶液的(R)-2-辛醇脫氫酶活性為8.99U/mg-蛋白，甲酸脫氫酶活性為0.653U/mg-蛋白。實施例32用Pichia finlandic的(R)-2-辛醇脫氫酶合成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5)，139.8mg NADH，1.75U實施例3的Pichiafinlandica(R)-2-辛醇脫氫酶，和0.5％4-氯乙酰乙酸乙酯30℃下反應(yīng)過夜。生產(chǎn)的(S)-4-氯-3-羥基丁酸酯的光純度按照下列方法確定。從反應(yīng)液中用乙酸乙酯萃取出(S)-4-氯-3-羥基丁酸酯，除去溶劑，使用光學(xué)離析柱進(jìn)行液相色譜分析。液相色譜采用Daicel Chemical Industries，LTD的CHIRALCELOD.(4.6mm×25cm)和洗脫液(正己烷∶2-丙醇＝93∶7)以流速1mL/min進(jìn)行，并進(jìn)行RI檢測。結(jié)果顯示，本發(fā)明生產(chǎn)的4-氯-3-羥基丁酸乙酯中S型超過99％。實施例33用Pichia finlandica的(R)-2-辛醇脫氫酶合成2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯將含有1％2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯的1mL甲苯加入1mL反應(yīng)液中，該反應(yīng)液含有200mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5)，86mM葡萄糖，1mM NAD+，1mM硫酸鎂，1U的實施例3的Pichia finlandica(R)-2-辛醇脫氫酶，25℃下攪拌反應(yīng)15小時。
最終反應(yīng)物的分析結(jié)果顯示，產(chǎn)生了1.0g/L的2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯，其光學(xué)純度為100％。
通過HPLC分析水相和有機(jī)相中得到的產(chǎn)物來定量2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯，所述HPLC在室溫下，洗脫液(水/乙腈＝1/1)以流速0.5mL/min進(jìn)行洗脫。260nm下進(jìn)行UV檢測。
使用光學(xué)離析柱(Daicel Chemical Industries，LTD的CHIRALCEL OD.0.46mm×25cm)通過HPLC進(jìn)行2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯的光學(xué)純度的檢測，所述HPLC在40℃下用洗脫液(己烷∶2-丙醇＝9/1)以流速1mL/min進(jìn)行洗脫。260nm下進(jìn)行UV檢測。實施例34使用pSF-PF02合成2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯收集實施例30的用pSF-PF02轉(zhuǎn)化的大腸桿菌(相當(dāng)于5mL培養(yǎng)液)。將500mg 2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯加入到5.22mL反應(yīng)液中，該反應(yīng)液含有500mM HEPES/NaOH緩沖液(pH6.5)，829mM甲酸鈉，1mM硫酸鎂，30℃下攪拌反應(yīng)18小時。
最終反應(yīng)液的分析結(jié)果顯示，產(chǎn)生了486mg 2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯，其光學(xué)純度為約100％。
2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯的定量測定按照下面方法進(jìn)行添加甲苯到反應(yīng)液中以便萃取出產(chǎn)物，通過氣相色譜分析水相和有機(jī)相中的產(chǎn)物。得到該合成子(synthon)的產(chǎn)量。氣相色譜條件是OV-21020％Chromosorb W(AW-DMCS)60/80目(G-L Science，3.2mm×200cm)，柱溫170℃。使用火焰離子化檢測器(FID)進(jìn)行檢測。
使用光學(xué)離析柱(Daicel Chemical Industries，LTD的CHIRALCEL OD.0.46mm×25cm)通過HPLC進(jìn)行2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯的光學(xué)純度的檢測，所述HPLC是在40℃用洗脫液(己烷/乙醇＝9/1)以流速1mL/min進(jìn)行洗脫。260nm下進(jìn)行UV檢測。實施例35純化產(chǎn)朊假絲酵母的(R)-2-辛醇脫氫酶產(chǎn)朊假絲酵母IFO0988菌株培養(yǎng)在3.6L培養(yǎng)基B中，離心制備微生物細(xì)胞。得到的微生物細(xì)胞懸在100mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)，10％甘油，1mM乙二胺四乙酸2Na(EDTA·2Na)，0.01％2-巰基乙醇，和2mM苯甲烷磺酰氟(PMSF)中，用玻璃珠(Biospec)勻漿。然后，離心除去微生物細(xì)胞碎片，得到了無細(xì)胞提取液。將硫酸魚精蛋白加入到此無細(xì)胞提取液中，離心除去核酸得到上清液。將硫酸銨加入到上清液中，得到的上清液是粗制酶液，為30％飽和度。用含30％飽和銨的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液透析該溶液，上樣到phenyl-Sepharose HP柱(2.6cm×10cm)，用相同緩沖液平衡。用30％到0％飽和度硫酸銨進(jìn)行梯度洗脫?；厥仗崛〉募壏种芯哂?R)-2-辛醇選擇性的級分并通過超濾濃縮。
培養(yǎng)基B組成如下Medium B10g/L酵母提取物20g/L蛋白胨1％甲醇pH6.0已濃縮的酶液用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液透析后，上樣到Blue-Sepharose HP(1.6cm×2.5cm)，用該緩沖液洗柱。用0到1.5M氯化鈉進(jìn)行濃度梯度洗脫?；厥站哂?R)-2-辛醇脫氫酶活性的級分并濃縮。將此酶液上樣到已用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液平衡的Mono Q HR 5/5(0.5cm×5cm)柱，進(jìn)行0到1M氯化鈉的濃度梯度洗脫。回收具有(R)-2-辛醇脫氫酶活性的級分并濃縮。此濃縮酶液使用Superdex200(0.32cm×30cm)，以含0.3M氯化鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液進(jìn)行凝膠過濾。濃縮活性級分得到該酶。
該酶的比活是3.33U/mg，這是氧化(R)-2-辛醇的活性。純化細(xì)節(jié)總結(jié)于表9中表9步驟蛋白量(mg) 總活性(U) 比活(U/mg)無細(xì)胞提取物1,220 6.58 0.00539去除的核酸 396 2.30.0058130％硫酸銨 471 1.14 0.00242Phenyl-Sepharose17.70.757 0.0429Blue-Sepharose 10.20.745 0.0727MonoQ 0.776 0.386 0.497Superdex 2000.0131 0.0434 3.33實施例36(R)-2-辛醇脫氫酶分子量的測定來自實施例35的產(chǎn)朊假絲酵母的酶經(jīng)Superdex200凝膠柱測定的分子量大約是150,000Da。實施例37(R)-2-辛醇脫氫酶的最佳pH我們使用Tris-HCl緩沖液和甘氨酸緩沖液改變pH，以觀察得自實施例35的酶的(R)-2-辛醇脫氫酶活性。圖13表示了以最大活性為100時的相對活性。結(jié)果顯示，此酶的最佳pH是8.5-11.0。
我們還使用磷酸緩沖液(KPB)，乙酸鈉(NaOAc)改變pH，以觀察得自實施例35的酶的4-氯乙酰乙酸乙酯還原酶活性。圖14表示了以最大活性為100時的相對活性。結(jié)果顯示，此酶的最佳pH是5.0-6.5。實施例38(R)-2-辛醇脫氫酶的底物特異性使(R)-2-辛醇脫氫酶與多種醇反應(yīng)，測定其氧化活性。表10表示了相對活性，其以使用NAD+為輔酶對(R)-2-辛醇的氧化活性為100。結(jié)果顯示，對(S)-2-辛醇的相對活性為6.7％，對2-丙醇為8.3％，對(R)-1-苯乙醇為86％。
表10底物(氧化反應(yīng))(R)-2-辛醇 100(S)-2-辛醇 6.72-丙醇 8.3(R)-1-苯乙醇 86.7(S)-1-苯乙醇 6.7實施例35的酶也與多種酮反應(yīng)，測定其還原活性。表11表示了相對活性，其以使用NADH為輔酶時的4-氯乙酰乙酸乙酯還原活性為100。結(jié)果顯示，對2-辛酮的相對活性為26.6％，對苯乙酮為25.3％。
表11

實施例39采用來自產(chǎn)朊假絲酵母的(R)-2-辛醇脫氫酶合成(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯
100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5)，139.8mg NADH，0.06U來自產(chǎn)朊假絲酵母的(R)-2-辛醇脫氫酶，0.5％ 4-氯乙酰乙酸乙酯30℃下反應(yīng)過夜。產(chǎn)生的4-氯-3-羥基丁酸乙酯按照實施例32所述方法測定其光學(xué)純度。結(jié)果顯示，本發(fā)明生產(chǎn)的4-氯-3-羥基丁酸乙酯中S型超過97％ee。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明提供有利于工業(yè)生產(chǎn)的NADH-依賴型(R)-2-辛醇脫氫酶。使用此酶使有效生產(chǎn)光學(xué)活性醇如(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯成為可能。特別是，使用4-鹵乙酰乙酸酯為底物經(jīng)本發(fā)明的酶反應(yīng)得到的(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯是合成藥物和殺蟲劑，如HMG-CoA還原酶抑制劑，D-肉毒堿等的中間體。因此，本發(fā)明在工業(yè)上特別有用。
綜上所述，JP-A Hei 02-732中所述的(R)-丙氧苯衍生物作為中間體是特別有用的化合物，如氧氟沙星((S)-(-)-9-氟-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧-2，3-二氫-7H-吡啶并[1，2，3-脫][1，4]苯噁嗪-6-羧酸(JP-A Sho 62-252790，其為合成性抗細(xì)菌藥物)的光學(xué)活性物質(zhì)。已經(jīng)確定，氧氟沙星的特定光學(xué)異構(gòu)體具有高抗細(xì)菌活性。本發(fā)明可以得到具有高光學(xué)純度的氧氟沙星合成中間體，這樣就可以合成出氧氟沙星的光學(xué)異構(gòu)體。
序列表<110>大賽璐化學(xué)工業(yè)株式會社(DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES，LTD.)<120>(R)-2-辛醇脫氫酶，產(chǎn)生此酶的方法，編碼此酶的DNA，以及使用此酶生產(chǎn)醇類的方法<130>D1-A0001Y1P<140><141><150>JP 2000-43506<151>2000-02-16<150>JP 2000-374593<151>2000-12-08<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>765<212>DNA<213>Pichia finlandica<220><221>CDS<222>(1)..(765)<400>1atg tct tat aac ttc cat aac aag gtt gca gtt gtt act gga gct cta 48Met Ser Tyr Asn Phe His Asn Lys Val Ala Val Val Thr Gly Ala Leu1 5 10 15tca gga atc ggc tta agc gtc gca aaa aag ttc ctt cag ctc ggc gcc 96Ser Gly Ile Gly Leu Ser Val Ala Lys Lys Phe Leu Gln Leu Gly Ala20 25 30aaa gta acg atc tct gat gtc agt gga gag aaa aaa tat cac gag act 144Lys Val Thr Ile Ser Asp Val Ser Gly Glu Lys Lys Tyr His Glu Thr35 40 45gtt gtt gct ctg aaa gcc caa aat ctc aac act gac aac ctc cat tat 192Val Val Ala Leu Lys Ala Gln Asn Leu Asn Thr Asp Asn Leu His Tyr50 55 60gta cag gca gat tcc agc aaa gaa gaa gat aac aag aaa ttg att tcg 240Val Gln Ala Asp Ser Ser Lys Glu Glu Asp Asn Lys Lys Leu Ile 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Leu Asp Ile Val Cys Ala Asn Ala85 90 95Gly Ile Gly Lys Phe Ala Pro Thr His Glu Thr Pro Phe Asp Val Trp100 105 110Lys Lys Val Ile Ala Val Asn Leu Asn Gly Val Phe Leu Leu Asp Lys115 120 125Leu Ala Ile Asn Tyr Trp Leu Glu Lys Ser Lys Pro Gly Val Ile Val130 135 140Asn Met Gly Ser Val His Ser Phe Val Ala Ala Pro Gly Leu Ala His145 150 155 160Tyr Gly Ala Ala Lys Gly Gly Val Lys Leu Leu Thr Gln Thr Leu Ala165 170 175Leu Glu Tyr Ala Ser His Gly Ile Arg Val Asn Ser Val Asn Pro Gly180 185 190Tyr Ile Ser Thr Pro Leu Ile Asp Glu Val Pro Lys Glu Arg Leu Asp195 200 205Lys Leu Val Ser Leu His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Arg Pro Glu Glu210 215 220Val Ala Asp Ala Val Ala Phe Leu Cys Ser Gln Glu Ala Thr Phe Ile225 230 235 240Asn Gly Val Ser Leu Pro Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln245 250<210>3<211>10<212>PRT<213>Pichia finlandica<400>3Val Ala Val Val Thr Gly Ala Leu Ser Gly1 5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>Pichia finlandica<400>4Leu Ile Ser Glu Thr Leu Ala Thr Phe Gly Gly Leu1 5 10<210>5<211>10<212>PRT<213>Pichia finlandica<400>5Leu Gly Arg Pro Glu Glu Val Ala Asp Ala1 5 10<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<220><221>misc feature<222>(1)..(9)<223>BamHI位點<400>6gtcggatccg tbgchgtbgt bachgghgc 29<210>7<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(9)<223>BamHI位點<220><221><222>(15)<223>Na，c，t或g<220><221><222>(18)<223>Na，c，t或g<220><221><222>(27)<223>Na，c，t或g<400>7gtcggatccg crtcngcnac ytcytcngg 29<210>8<211>623<212>DNA<213>Pichia finlandica<400>8gctctatcag gaatcggctt aagcgtcgca aaaaagttcc ttcagctcgg cgccaaagta 60acgatctctg atgtcagtgg agagaaaaaa tatcacgaga ctgttgttgc tctgaaagcc 120caaaatctca acactgacaa cctccattat gtacaggcag attccagcaa agaagaagat 180aacaagaaat tgatttcgga aactctggca acctttgggg gcctggatat tgtttgtgct 240aatgcaggaa ttggaaagtt cgctcccacc catgaaacac ccttcgacgt atggaagaag 300gtgattgctg tgaatttgaa tggagtattc ttactggata agctagccat caattactgg 360ctagagaaaa gcaaacccgg cgtaattgtc aacatgggat cagtccactc 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1.一種(R)-2-辛醇脫氫酶，其具有下列(1)和(2)的物化性質(zhì)(1)作用i)此酶以氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸為輔酶通過氧化醇而生產(chǎn)酮，且ii)此酶以還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸為輔酶通過還原酮而生產(chǎn)醇，且(2)底物特異性i)此酶優(yōu)先氧化2-辛醇的兩種光學(xué)異構(gòu)體中的(R)-2-辛醇，且ii)此酶通過還原4-鹵乙酰乙酸酯生產(chǎn)(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯。
2.權(quán)利要求1中的(R)-2-辛醇脫氫酶，其有著下列(3)和(4)的物化性質(zhì)(3)最佳pH用于氧化反應(yīng)的最佳pH范圍為8.0-11.0，還原反應(yīng)的最佳pH范圍為5.0-6.5，且(4)底物特異性i)與伯醇相比，此酶對仲醇表現(xiàn)出更高的活性，且ii)與2-丙醇相比，此酶對(R)-2-辛醇表現(xiàn)出顯著更高的活性。
3.權(quán)利要求1或2的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中此(R)-2-辛醇脫氫酶由選自畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬和Ogataea屬的微生物衍生。
4.權(quán)利要求3的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬于畢赤酵母屬的微生物是Pichia finlandica。
5.權(quán)利要求3的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬于畢赤酵母屬的微生物是Pichia jadinii。
6.權(quán)利要求3的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬于假絲酵母屬的微生物是產(chǎn)朊假絲酵母。
7.權(quán)利要求3的(R)-2-辛醇脫氫酶，其中屬于Ogataea屬的微生物是Ogataea wickerhamii。
8.權(quán)利要求1或2的用于生產(chǎn)(R)-2-辛醇脫氫酶的方法，此方法包括培養(yǎng)從畢赤氏酵母屬，假絲酵母屬和Ogataea屬中挑選的微生物，該微生物生產(chǎn)權(quán)利要求1或2的酶。
9.下列(a)到(e)的多核苷酸，此多核苷酸編碼了具有(R)-2-辛醇脫氫酶活性的蛋白(a)一種多核苷酸，其含有SEQ ID NO1的核苷酸序列，(b)一種多核苷酸，其編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白，(c)一種多核苷酸，其編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白，在此氨基酸序列中有一個或多個氨基酸的取代，缺失，插入和/或添加，(d)一種多核苷酸，其在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含核苷酸序列SEQ ID NO1的多核苷酸雜交，且(e)編碼與SEQ ID NO2的氨基酸序列有著不少于70％同源性的氨基酸序列的多核苷酸。
10.由權(quán)利要求9的多核苷酸編碼的蛋白。
11.重組載體，其中插入了權(quán)利要求9的多核苷酸。
12.權(quán)利要求11的重組載體，其中進(jìn)一步插入一種多核苷酸，其編碼以β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸為輔酶并能催化氧化還原反應(yīng)的脫氫酶。
13.以可表達(dá)的方式含有權(quán)利要求9中多核苷酸或權(quán)利要求11中載體的轉(zhuǎn)化體。
14.生產(chǎn)權(quán)利要求10中蛋白的方法，此方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求13中的轉(zhuǎn)化體。
15.生產(chǎn)醇的方法，此方法包括將權(quán)利要求1或2的(R)-2-辛醇脫氫酶，權(quán)利要求10的蛋白，可生產(chǎn)所述酶或蛋白的微生物，或該微生物的加工產(chǎn)物與酮反應(yīng)以使該酮還原。
16.權(quán)利要求15的方法，其中的微生物是權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)化體。
17.權(quán)利要求15的方法，其中的酮是4-鹵乙酰乙酸酯的衍生物并且其中的醇是(S)-4-鹵-3-羥基丁酸酯衍生物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中4-鹵乙酰乙酸酯的衍生物是4-氯乙酰乙酸乙酯且其中的醇是(S)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯。
19.權(quán)利要求15的方法，其中的酮是丙酮氧苯衍生物，其由通式1表示通式1 其中x1和x2表示鹵原子；且其中的醇是由通式2表示的丙氧苯衍生物通式2
20.權(quán)利要求19的方法，其中丙酮氧苯衍生物是2-丙酮氧基-3，4-二氟硝基苯且其中的醇是2，3-二氟-6-硝基[[(R)-2-羥丙基]氧]苯。
21.權(quán)利要求15的方法，該方法還包括將氧化型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)換成其還原型。
22.用于生產(chǎn)酮的方法，此方法包括使權(quán)利要求1或2的(R)-2-辛醇脫氫酶，權(quán)利要求10的蛋白，可生產(chǎn)所述酶或蛋白的微生物，或該微生物的加工產(chǎn)物與醇反應(yīng)以使該醇氧化。
23.生產(chǎn)光學(xué)活性醇的方法，該方法包含的步驟有，將權(quán)利要求1或2的(R)-2-辛醇脫氫酶，權(quán)利要求10的蛋白，生產(chǎn)所述酶或蛋白的微生物，或該微生物的加工產(chǎn)物與外消旋醇反應(yīng)以優(yōu)先氧化任一光學(xué)異構(gòu)體，并得到保留的光學(xué)活性醇。
24.權(quán)利要求22或23的方法，該方法另外進(jìn)一步包含將還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)換成其氧化型。
全文摘要
以NAD
文檔編號C12N15/53GK1366550SQ01800758
公開日2002年8月28日 申請日期2001年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月16日
發(fā)明者工藤真丈, 山本浩明 申請人:大賽璐化學(xué)工業(yè)株式會社