專利名稱：檢測(cè)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測(cè)，更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及在藥物篩選和臨床環(huán)境下實(shí)時(shí)定量檢測(cè)病毒逆轉(zhuǎn)錄酶。
背景技術(shù)：
Silver等，Nucleic Acids Res.213593(1993)公開(kāi)了通過(guò)PCR擴(kuò)增病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的cDNA產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)生物樣品中的逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法。具有當(dāng)存在病毒RT時(shí)，才用這種方法合成cDNA產(chǎn)物，然后通過(guò)鑒定DNA存在情況的常規(guī)技術(shù)檢測(cè)所述cDNA。用于這一目的的技術(shù)包括例如，DNA印跡雜交、通過(guò)溴化乙錠染色顯示、測(cè)定摻入的放射標(biāo)記核苷酸以及用于與擴(kuò)增DNA結(jié)合的可檢測(cè)部分的免疫測(cè)定法。
產(chǎn)物-增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄酶測(cè)定(PERT，a/k/a″Amp-RT″)以及基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的逆轉(zhuǎn)錄酶測(cè)定(PBRT)的技術(shù)也已經(jīng)用于檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄病毒污染，使得相對(duì)于常規(guī)RT測(cè)定增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度106倍。因此，F(xiàn)DA生物評(píng)價(jià)和研究中心建議PERT測(cè)定用于篩選存在RT的患者，以及另外用于篩選病毒疫苗和基因治療制劑是否存在RT污染。美國(guó)專利號(hào)5,849,494也描述了應(yīng)用這些方法檢測(cè)生物樣品中存在的人類免疫缺陷病毒(HIV)。另一方面，PERT和PBRT在臨床應(yīng)用中存在明顯缺點(diǎn)，因?yàn)檫@些方法操作繁復(fù)而不能實(shí)時(shí)實(shí)施。
TaqMan技術(shù)(PE Biosystems)結(jié)合檢測(cè)RT的標(biāo)準(zhǔn)PCR-RT方法用于定量測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄酶是非常明確的。參見(jiàn)Ringel等，J.Clin.Endocrinol.& Metabolism 844037(1999)。用TaqMan技術(shù)檢測(cè)RT活性可以快速并相對(duì)安全地完成。所述TaqMan技術(shù)還優(yōu)于以前的方法，因?yàn)樗鄬?duì)于常規(guī)RT測(cè)定顯著增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度、可將測(cè)量時(shí)間縮短在6小時(shí)以內(nèi)，同時(shí)不需要毒性化學(xué)物質(zhì)如放射性同位素和溴化乙錠。
Lovatt等，J.Virological Methods 82185(1999)報(bào)道，在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用TaqManPCR技術(shù)檢測(cè)并定量未知樣品的病毒污染。盡管在實(shí)驗(yàn)室條件下應(yīng)用TaqMan技術(shù)，但顯然沒(méi)有用它檢測(cè)HIV逆轉(zhuǎn)錄酶。此外，盡管已知許多藥物可以抑制逆轉(zhuǎn)錄酶，但是在臨床水平缺少通過(guò)測(cè)定RT來(lái)監(jiān)測(cè)所述藥物的效力的方法。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供臨床容易應(yīng)用的檢測(cè)病毒RT的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)特別適合例如在高通量篩選環(huán)境下測(cè)試藥物影響RT活性的方法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)RT擴(kuò)增產(chǎn)物。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是通過(guò)監(jiān)測(cè)病毒RT活性來(lái)評(píng)定抗-HIV或其他抗病毒藥物或推定治療藥物的功效。
本發(fā)明的一個(gè)類似目的是提供可以在臨床環(huán)境下快速安全地鑒定常見(jiàn)醫(yī)學(xué)疾患各種病原體的診斷技術(shù)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是檢測(cè)RT對(duì)已知RT抑制劑是否存在抗性或者其抗性水平。
在實(shí)現(xiàn)這些目的和其他目的的情況下，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面提供測(cè)量樣品中存在的RT的方法。在優(yōu)選低于RT失活溫度的大致溫度(HIV RT通常大約為37℃)下，使試樣與(i)RNA模板，例如聚腺苷酸化RNA，(ii)與RNA模板互補(bǔ)的引物，例如寡聚-dT，以及(iii)多種寡核苷酸特異性引物接觸，從而檢測(cè)樣品中存在的RT。如果在樣品中存在RT，那么就會(huì)產(chǎn)生cDNA，并因此可以進(jìn)行檢測(cè)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種用于檢測(cè)受試藥物對(duì)樣品中的RT活性的作用的方法。使可能含有RT的樣品與RNA模板(優(yōu)選人類)、互補(bǔ)引物以及多種寡核苷酸-特異性引物接觸，使得只有在樣品中存在RT才形成cDNA，cDNA形成量與與所述受試藥物的作用成反比。所述樣品優(yōu)選取自人類患者，在臨床環(huán)境下實(shí)時(shí)檢測(cè)所述樣品中的HIV RT存在情況。
關(guān)于這個(gè)方面，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，可以檢測(cè)樣品(優(yōu)選取自患者)中的RT以確定樣品中的RT是否已經(jīng)對(duì)已知RT抑制性受試藥物產(chǎn)生了抗性?？梢匀缦逻_(dá)到此目的測(cè)定已知RT抑制性受試藥物對(duì)樣品中的RT的活性的作用，比較所述活性與沒(méi)有所述已知RT抑制劑的RT活性和/或在有已知完全抑制樣品RT活性的RT抑制劑的情況下的RT活性。
通過(guò)考察詳細(xì)描述的優(yōu)選實(shí)施方案可以了解本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1圖示cDNA校準(zhǔn)曲線。
圖2圖示濃度不斷增加的受試藥物對(duì)rHIV RT的抑制作用。
圖3同樣描繪了濃度不斷增加的受試藥物對(duì)rHIV RT的抑制作用。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，測(cè)定樣品例如來(lái)自患者的生物樣品中的RT存在情況必須將樣品加入反應(yīng)混合物中，所述反應(yīng)混合物含有人類心臟總聚腺苷酸化RNA、寡聚-dT引物和dNTPs。如果樣品中存在RT，那么可以轉(zhuǎn)錄與人類心臟總多聚A-RNA相應(yīng)的cDNA。反之，如果樣品中沒(méi)有RT，則沒(méi)有cDNA產(chǎn)物形成。全部cDNA的形成都與樣品中存在的所有活化RT的濃度成正比。
按照本發(fā)明，首先由于樣品中存在RT而形成cDNA，接著優(yōu)選利用本領(lǐng)域公知的Taqman技術(shù)擴(kuò)增和檢測(cè)cDNA。也可以應(yīng)用本領(lǐng)域公知的其他技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增的cDNA產(chǎn)物，其他技術(shù)包括但也不限于DNA印跡雜交法、溴化乙錠染色、測(cè)定摻入的放射標(biāo)記的核苷酸、用于與擴(kuò)增DNA結(jié)合的可檢測(cè)部分的免疫測(cè)定法和熒光測(cè)定。
本發(fā)明適用于測(cè)定各種各樣的病原體RT酶。因此所述方法可用于有關(guān)的所有RNA病毒，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、黃病毒屬病毒(flaviviruses)以及黃熱病病毒。這方面的黃病毒屬病毒實(shí)例有西尼羅病毒和腦炎病毒，例如與圣路易型腦炎、西方馬腦炎、日本馬腦炎以及蜱傳腦炎相關(guān)的病毒株。
因?yàn)門(mén)aqman測(cè)定靈敏度低至10個(gè)拷貝DNA，所以它比常規(guī)PCR方法(包括凝膠分離PCR擴(kuò)增子)更靈敏數(shù)個(gè)對(duì)數(shù)倍。此外，Taqman測(cè)定適合于快速通量(rapid throughput)，并且如下所述可以用于測(cè)定RT活性和對(duì)RT活性的抑制作用。
Taqman測(cè)定的基礎(chǔ)是taq聚合酶具有核酸內(nèi)切酶活性和聚合酶活性。通過(guò)RT作用形成cDNA后，那么寡核苷酸-特異性引物就用于PCR擴(kuò)增方面。在cDNA上的引物之間雜交，Taqman探針在所述寡核苷酸的5′末端包含信號(hào)氟(可以是FAM)，而在所述探針的3′末端含有猝滅染料(可以是TAMRA)。由于分子內(nèi)熒光猝滅，所述探針本身不是熒光性的。因此，當(dāng)所述探針是完整的時(shí)候，所述信號(hào)氟鄰近猝滅染料導(dǎo)致主要通過(guò)Frster型能量傳遞抑制熒光信號(hào)。進(jìn)行PCR時(shí)，對(duì)靶cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，在延伸引物序列時(shí)DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)對(duì)探針信號(hào)的5′切割，從而逆轉(zhuǎn)猝滅的熒光信號(hào)，因此可測(cè)量cDNA產(chǎn)生的熒光信號(hào)。
PCR反應(yīng)的熒光發(fā)射超過(guò)背景熒光水平時(shí)的循環(huán)數(shù)稱為(CT)，并實(shí)時(shí)計(jì)算循環(huán)閾值。CT值取決于PCR模板量和在反應(yīng)混合物中存在的cDNA。因此，可以通過(guò)比較在相同條件下進(jìn)行的未知的檢測(cè)樣品的CT值和具有已知cDNA量的樣品的CT值來(lái)定量檢測(cè)樣品中的RT活性。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Taqman方法用來(lái)檢測(cè)重組HIV(rHIV)RT的存在情況。在這一方面，寡聚-dT用作rHIV RT的模板。寡聚-dT與反應(yīng)混合物中存在的人類心臟總RNA的聚腺苷酸化RNA組分互補(bǔ)。rHIV RT在有dNTP核苷酸時(shí)由寡聚-dT/RNA復(fù)合體形成cDNA。如果準(zhǔn)備檢測(cè)患者樣品中的HIV RT存在情況，那么加入由患者樣品制備的提取物代替rHIV-RT。
某些RT往往是熱敏感性的，所以上述反應(yīng)必須在不破壞RT活性的循環(huán)條件下進(jìn)行，例如對(duì)于rHIV RT在大約37℃下進(jìn)行。因此，對(duì)于rHIV RT的溫度循環(huán)條件是大約25℃10分鐘，接著大約37℃60分鐘，最后95℃5分鐘。95℃時(shí)rHIV RT活性被破壞。注意標(biāo)準(zhǔn)Taqman溫度循環(huán)條件也會(huì)破壞rHIV RT的活性。一般本方法的這種情況是在程序化PCR熱循環(huán)儀上的Taqman裝置以外進(jìn)行。
接著，將以上RT步驟形成的cDNA等份導(dǎo)入Taqman裝置(PEModel 7700)中并加入到含有Taqman通用主混合物(taq聚合酶緩沖液)、β肌動(dòng)蛋白-特異性正向引物、β肌動(dòng)蛋白-特異性反向引物以及β肌動(dòng)蛋白Taqman探針的反應(yīng)混合物中。所述PCR步驟在標(biāo)準(zhǔn)TaqmanPCR條件下于所述裝置中進(jìn)行。盡管如上所述本發(fā)明方法描述為兩個(gè)試管反應(yīng)，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道這些步驟可以組合在一個(gè)反應(yīng)容器中。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，確定可抑制RT活性的受試藥物的功效。在這種情況下，最好在存在所述樣品的情況下混合模板RNA、與模板RNA互補(bǔ)的引物以及dNTPs時(shí)加入所述受試藥物。因此，盡管所述樣品可能含有活性RT，但是反應(yīng)混合物中存在的受試藥物可以抑制通過(guò)RT轉(zhuǎn)錄cDNA。
包含受試藥物的樣品的CT值增加說(shuō)明了所述受試藥物的抑制特性。所述受試藥物抑制RT活性的作用越強(qiáng)，相對(duì)于不含受試藥物的對(duì)照反應(yīng)測(cè)得的Taqman測(cè)定CT值越高。因?yàn)镽T抑制作用可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，所以本發(fā)明最適合于可能具有潛在RT抑制特性的受試藥物的實(shí)時(shí)藥物篩選。此外，可以利用來(lái)自患者的生物樣品和不同的已知RT抑制劑例如核苷和核苷酸類似物以及非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或其組合物進(jìn)行本發(fā)明方法，以便實(shí)時(shí)篩選和測(cè)量所述患者RT對(duì)這些RT抑制藥物的抗性，從而更多了解藥物劑量和調(diào)劑藥物。
在臨床環(huán)境下，現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)受試藥物的效力使樣品通量提高以及隨后尋找具有抑制活性的具有前景的藥物的效率提高。因此，除了測(cè)定和定量所述抑制劑的比活外，還可以跟蹤抑制劑的純化。同樣，可以分析對(duì)特定藥物可能已經(jīng)產(chǎn)生抗性的患者的藥物選擇，而不會(huì)喪失由于進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)以確定所述患者是否具有抗性可能喪失的治療時(shí)間。進(jìn)一步能夠限制藥物對(duì)患者產(chǎn)生的毒性和副作用，因?yàn)榭梢詼y(cè)試抑制劑的劑量以確定抑制藥物的最佳劑量。
此外，可以在臨床環(huán)境下在體外對(duì)人類患者實(shí)施本發(fā)明。因?yàn)楸景l(fā)明可以在體外進(jìn)行，所以可以以對(duì)患者無(wú)毒性的方式測(cè)定RT活性和受試藥物的效力。如上所述，因?yàn)楸景l(fā)明實(shí)時(shí)測(cè)量RT活性或其抑制作用，所以可以非常及時(shí)地(一般少于1小時(shí))分析患者樣品中特定病原體的存在情況。
以下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步闡明了本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。在以下方法中應(yīng)用以下溶液1.TaqmanRT試劑盒，它含有10X反應(yīng)緩沖液、氯化鎂儲(chǔ)液以及RNA酶抑制劑--Perkin Elmer目錄號(hào)N808-0234；2.rHIV RT--Worthington Biochemical目錄號(hào)5006(500U，12.5U/μl)；3.人類心臟總RNA--Ambion目錄號(hào)7966(100μg，1mg/ml)；4.100mM dNTP混合物(每種NTP 25mM)--Perkin Elmer目錄號(hào)N808-0261；5.寡聚dT(17-mer)；6.隨機(jī)六聚體(寡聚(dNTP)6)；7.2X TaqMan通用主混合物--Perkin Elmer目錄號(hào)PE 4304437；8.TaqManβ肌動(dòng)蛋白試劑，它包括β肌動(dòng)蛋白特異性正向和反向寡核苷酸引物以及β肌動(dòng)蛋白的TaqMan探針--Perkin Elmer
目錄號(hào)401846；以及9.β肌動(dòng)蛋白質(zhì)粒DNA(美國(guó)典型組織培養(yǎng)物(American TypeTissue Culture)目錄號(hào)769559 R)。如下制備10mM dNTP溶液用水作稀釋劑將100mM dNTP溶液稀釋10倍。同時(shí)制備50μM寡聚dT水儲(chǔ)液。
制備rHIV RT溶液(主混合物溶液)，它包含5μL 10X RT反應(yīng)緩沖液、11μL 25mM MgCl2，10μL 10mM dNTP工作儲(chǔ)液、2.5μL 50μM寡聚dT、1μL RNA酶抑制劑和1.25μL rHIV RT。所述主混合物溶液的總量是30.75μL?；蛘?，可以加入隨機(jī)六聚體替代寡聚dT。但是寡聚dT是優(yōu)選引物。
水+受試藥物(總共18.25μL)+1μL人類心臟總RNA，例如1μL受試藥物+17.25μL水+1μL人類心臟總RNA；2μL受試藥物+16.25μL水+1μL人類心臟總RNA；5μL受試藥物+13.25μL水+1μL人類心臟總RNA；10μL受試藥物+8.25μL水+1μL人類心臟總RNA；15μL受試藥物+3.25μL水+1μL人類心臟總RNA；將它們加到30.75μL的主混合物溶液中。因此，所述反應(yīng)混合物包含50μL總?cè)芤毫俊?br> 本實(shí)施例的對(duì)照包括一個(gè)含有18.25μL水+1μLRNA的陽(yáng)性對(duì)照，以及一個(gè)含有19.25μL水的陰性對(duì)照。
如下啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)將反應(yīng)混合物放置在MWG溫度循環(huán)儀中，或在相同的溫度循環(huán)條件下25℃10分鐘，接著37℃60分鐘，最后95℃5分鐘。最后溫度循環(huán)步驟使rHIV RT失活。接著向45μL的主混合物溶液中加入5μL可能含有cDNA的溫度循環(huán)后的RT反應(yīng)混合物。所述主混合溶液含有25μL 2X Taqman通用主混合物、5μLβ肌動(dòng)蛋白正向引物、5μLβ肌動(dòng)蛋白反向引物和5μL水。因此，PCR反應(yīng)混合物總共含有50μL。
所述PCR反應(yīng)在Perkin Elmer 7700 TaqMan儀器中按照生產(chǎn)商的建議在以下條件下進(jìn)行在50℃2分鐘，然后在95℃10分鐘。在95℃15秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后，60℃1分鐘。完成后，按Perkin Elmer 7700TaqMan儀器說(shuō)明書(shū)將數(shù)據(jù)作圖并進(jìn)行目測(cè)。
監(jiān)測(cè)熒光增加，熒光增加是循環(huán)數(shù)的函數(shù)。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)熒光與CT值。CT值和DNA的拷貝數(shù)之間的關(guān)系根據(jù)應(yīng)用已知DNA的量制備的校準(zhǔn)曲線測(cè)定。在PCR反應(yīng)步驟中該測(cè)定用β肌動(dòng)蛋白代替RT反應(yīng)混合物。用來(lái)制備校準(zhǔn)曲線的β肌動(dòng)蛋白DNA的有用范圍是5ag(渺克(atogram))(相當(dāng)于大約一個(gè)DNA拷貝)到500fg(飛母托克(femtogram))(相當(dāng)于9.5×104個(gè)DNA拷貝)。
DNA的拷貝數(shù)是以下面的觀測(cè)結(jié)果為基礎(chǔ)的1微克(1μg)PBR322質(zhì)粒DNA等同于36pmol PBR 322質(zhì)粒DNA(2.2×1011個(gè)DNA拷貝)。PBR322質(zhì)粒DNA包含4360bp。β肌動(dòng)蛋白質(zhì)粒DNA包含5000bp。
所述TaqMan校準(zhǔn)曲線示于圖1。圖1中，已知量(已知拷貝數(shù))β-肌動(dòng)蛋白DNA用作所述測(cè)定方法的PCR組分并記錄觀測(cè)到的閾值(CT)。注意隨著拷貝數(shù)的降低，CT值升高。所述校準(zhǔn)曲線測(cè)定下降至至少1個(gè)DNA拷貝，延伸到至少100,000個(gè)DNA拷貝。所述曲線擬合為表觀線性回歸曲線(即線性/對(duì)數(shù)圖)，回歸擬合系數(shù)(regressionfit)為0.99。直線方程是Y＝-3.12(X)+36，其中X是DNA拷貝數(shù)，36是在無(wú)限低(低于1)的DNA拷貝時(shí)的CT值。
在下面的實(shí)施例中應(yīng)用上述方法，只對(duì)其進(jìn)行了對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的微小改進(jìn)。
實(shí)施例I實(shí)施例I應(yīng)用受試藥物最終濃度不斷增加的0、1％、5％、10％(v/v)說(shuō)明熒光是循環(huán)數(shù)的函數(shù)。用水平黑色線表示陽(yáng)性對(duì)照的CT值。該CT值是背景以上的熒光增強(qiáng)的中間值。如圖2所示，所述陽(yáng)性對(duì)照樣品表示24個(gè)循環(huán)的CT值。圖2的其他曲線證實(shí)在申請(qǐng)人有產(chǎn)權(quán)的受試藥物存在情況下對(duì)rHIV RT的抑制作用。受試藥物的濃度越高，CT值增加越多，表明rHIV RT活性被進(jìn)行性抑制。
實(shí)施例II在申請(qǐng)人有產(chǎn)權(quán)的第二個(gè)抗病毒受試藥物存在的情況下抑制rHIV RT的另一個(gè)實(shí)施例。如圖3所示，與閾值CT26交叉的樣品是RT PCR對(duì)照(沒(méi)有受試藥物)和1％(v/v)受試藥物(在RT反應(yīng)混合物中的最終濃度)。5％(v/v)受試藥物樣品在33個(gè)循環(huán)的閾值交叉，10％(v/v)受試藥物不與閾值交叉，表明100％抑制rHIV RT活性。
受試藥物產(chǎn)生的抑制作用可以表示為PCR反應(yīng)混合物中存在的DNA的拷貝數(shù)。因此
實(shí)施例III下面的實(shí)施例說(shuō)明AZT對(duì)包含rHIV RT的樣品的抑制效力。
用250μM-1.25mM范圍內(nèi)的AZT(dT的核苷酸類似物)代替dT加入到rHIV RT反應(yīng)混合物中。當(dāng)加入AZT時(shí)，在PCR步驟后沒(méi)觀察到cDNA的擴(kuò)增。同樣，當(dāng)在PCR反應(yīng)混合物中包含代替dT的AZT時(shí)，在PCR步驟后沒(méi)見(jiàn)到cDNA的擴(kuò)增。
最后，在有固定濃度的dT存在的RT反應(yīng)混合物中加入濃度逐漸降低的AZT。AZT終濃度范圍由1.25mM降到250μM。在所有濃度的AZT觀察到的CT大于40個(gè)循環(huán)，表明100％抑制活性。
雖然已經(jīng)闡明并描述了優(yōu)選實(shí)施方案，但是應(yīng)該知道，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員在不偏離以下權(quán)利要求書(shū)定義的更寬范圍的本發(fā)明的情況可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行改變和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)藥物對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶的作用的方法，所述藥物影響可能含有逆轉(zhuǎn)錄酶的樣品，所述方法包括(a)使所述樣品與模板RNA、與所述模板RNA互補(bǔ)的引物以及多種寡核苷酸-特異性引物在一定條件下接觸，使得它們?cè)谟心孓D(zhuǎn)錄酶存在的情況下反應(yīng)形成與所述藥物作用成反比的cDNA產(chǎn)物，以及(b)測(cè)量所述cDNA產(chǎn)物量。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述模板RNA是聚腺苷酸化RNA，與所述模板RNA互補(bǔ)的引物是寡聚-dT引物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)包括擴(kuò)增所述cDNA產(chǎn)物，然后檢測(cè)相對(duì)于沒(méi)有所述藥物存在時(shí)獲得的cDNA產(chǎn)物的量。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述聚腺苷酸化RNA是人類RNA。
5.權(quán)利要求2的方法，其中所述條件包括37℃或低于37℃的反應(yīng)溫度。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶是HIV逆轉(zhuǎn)錄酶。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄酶是重組HIV逆轉(zhuǎn)錄酶。
8.權(quán)利要求3的方法，其中所述樣品包括HIV感染的生物材料。
9.權(quán)利要求2的方法，其中在步驟(a)之前從患者獲取所述樣品。
10.權(quán)利要求3的方法，其中在步驟(a)之前從患者獲取所述樣品。
11.一種用于檢測(cè)可能含有HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的樣品中的逆轉(zhuǎn)錄酶的方法，該方法包括(a)使所述樣品與模板RNA、與所述模板RNA互補(bǔ)的引物以及多種寡核苷酸-特異性引物在一定條件下接觸，使得它們?cè)谟心孓D(zhuǎn)錄酶存在的情況下反應(yīng)形成cDNA產(chǎn)物，其中所述條件包括低于所述逆轉(zhuǎn)錄酶大致失活溫度的反應(yīng)溫度，以及(b)檢測(cè)存在的cDNA產(chǎn)物。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述模板RNA是聚腺苷酸化RNA，與所述模板RNA互補(bǔ)的引物是寡聚-dT引物。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述反應(yīng)溫度低于大約37℃。
14.權(quán)利要求10的方法，其中步驟(b)包括擴(kuò)增然后測(cè)量所述cDNA產(chǎn)物。
全文摘要
在臨床環(huán)境和藥物發(fā)現(xiàn)情況下，可以如下檢測(cè)甚至定量可能影響逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)的藥物的作用通過(guò)將可能含有RT的樣品與RNA模板、與RNA模板互補(bǔ)的引物以及適當(dāng)?shù)墓押塑账幔禺愋砸镌谝欢l件下接觸，使得它們?cè)谟蠷T存在下形成與所述藥物成反比的cDNA產(chǎn)物。然后可以測(cè)量產(chǎn)生的cDNA產(chǎn)物量。該方法作為檢測(cè)RT活性的實(shí)時(shí)、定量動(dòng)態(tài)測(cè)定法容易實(shí)施。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1451051SQ01802418
公開(kāi)日2003年10月22日 申請(qǐng)日期2001年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月21日
發(fā)明者羅伯特B·哈里斯, T·R·雷諾 申請(qǐng)人:維珍實(shí)驗(yàn)室公司