專利名稱：一種固定核苷酸的支持相及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固定核苷酸的支持相及其制備方法，該支持相能夠用來(lái)固定核酸等，可應(yīng)用于分子生物學(xué)及基因工程相關(guān)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因分析廣泛用于分子生物學(xué)領(lǐng)域和基因工程領(lǐng)域，近年來(lái)也被用于疾病診斷等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
在基因分析中，近年來(lái)發(fā)展了DNA芯片，以此進(jìn)行基因分析的速度也越來(lái)越快。傳統(tǒng)的DNA芯片技術(shù)是將高分子物質(zhì)如聚賴氨酸涂于玻片或者有機(jī)硅基質(zhì)表面，然后固定DNA。另一種方法是運(yùn)用光蝕刻等半導(dǎo)體技術(shù)在玻璃基質(zhì)表面合成寡核苷酸。
但是在將高分子物質(zhì)如聚賴氨酸涂于玻片或者有機(jī)硅基質(zhì)表面的方法中，DNA的固定狀態(tài)是不穩(wěn)定的，在后續(xù)的雜交和漂洗步驟中DNA容易脫落。而且，在采用半導(dǎo)體技術(shù)的DNA芯片中，存在由于加工步驟復(fù)雜而成本昂貴的問題。
為了解決上述問題，必須將DNA以高強(qiáng)度和高密度固定在固體基質(zhì)表面。
還已知另一種固體基質(zhì)，其表面經(jīng)過(guò)了化學(xué)修飾。但是當(dāng)目的DNA以酰胺鍵直接結(jié)合于這些經(jīng)過(guò)了化學(xué)修飾的部位時(shí)，目的DNA的末端在例如這種化學(xué)鍵合的過(guò)程中存在被該處理?yè)p傷的危險(xiǎn)。因此這種基質(zhì)也需要改進(jìn)。
本發(fā)明的目的之一就是提供用來(lái)固定核苷酸的、在分子生物學(xué)和基因工程等領(lǐng)域有用的支持相，由此可有效地進(jìn)行DNA的闡明而其末端將不受損傷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果將含有預(yù)定的限制性酶切位點(diǎn)的寡核苷酸固定在經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的基質(zhì)上，使相應(yīng)于待固定的DNA的該限制性酶切位點(diǎn)得以形成，則有可能穩(wěn)定地固定。由此實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
因此，本發(fā)明用于固定核苷酸的支持相的特征在于，它是一種經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的基質(zhì)，寡核苷酸被固定在其上面，且該寡核苷酸具有限制性酶切位點(diǎn)。
這種情況下，優(yōu)選該寡核苷酸中只有一條鏈與化學(xué)修飾的基質(zhì)鍵合；還優(yōu)選該寡核苷酸通過(guò)酰胺鍵與化學(xué)修飾的基質(zhì)鍵合。
本發(fā)明用于固定核苷酸的支持相的制備方法的特征在于將該基質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾，將單鏈寡核苷酸固定在基質(zhì)上，然后將含有與以上單鏈寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列的另一條單鏈寡核苷酸和所述以上單鏈寡核苷酸雜交，由此鍵合了末端含有限制性酶切位點(diǎn)的寡核苷酸。
這種情況下，優(yōu)選基質(zhì)的化學(xué)修飾包含氯化、氨化和羧化，還優(yōu)選在基質(zhì)被化學(xué)修飾后，末端在脫水縮合劑存在下被活化。進(jìn)一步優(yōu)選脫水縮合劑是碳二亞胺。
這種情況下，還優(yōu)選基質(zhì)的化學(xué)修飾是基質(zhì)表面被氯化或者氨化，且產(chǎn)生的伯胺基與該活化二酯的一個(gè)酯基脫水縮合。還優(yōu)選該活化二酯的酯基是N-羥基琥珀酰亞胺或?qū)αu基琥珀酰亞胺。
這種情況下，還優(yōu)選固定在基質(zhì)上的單鏈寡核苷酸在其待被固定側(cè)的末端具有1-10個(gè)帶有伯胺的核苷酸。還優(yōu)選固定在基質(zhì)上的單鏈寡核苷酸在其待被固定側(cè)的末端具有1-10個(gè)伯胺，之后有1-5個(gè)胸腺嘧啶或者鳥嘌呤。而且優(yōu)選固定在基質(zhì)上的單鏈寡核苷酸在其待被固定側(cè)的末端具有1-5個(gè)腺嘌呤或者胞嘧啶，之后有1-5個(gè)胸腺嘧啶或者胞嘧啶。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式根據(jù)本發(fā)明用于固定核苷酸的支持相的特征在于它是這樣一種基質(zhì)，其上通過(guò)化學(xué)修飾固定了寡核苷酸，而且該寡核苷酸具有限制性酶切位點(diǎn)。
限制性酶切位點(diǎn)是指可以被限制性內(nèi)切酶特異性切割的核酸序列。對(duì)于限制性內(nèi)切酶沒有特別限制，只要它是通常使用的。限制性內(nèi)切酶的例子有AatI，AatIIAccI，AflII，AluI，Alw44I，ApaI，AseI，AvaI，BamHI，BanI，BanII，BanIII，BbrPI，BclI，BfrI，BglI，BglII，BsiWI，BsmI，BssHII，BstEII，BstXI，Cfr9I，Cfr10I，Cfr13I，CspI，Csp45I，DdeI，DraI，Eco47I，Eco47III，Eco52I，Eco81I，Eco105I，EcoRI，EcoRII，EcoRV，EcoT22I，EheI，F(xiàn)spI，HaeII，HaeIII，HhaI，HinlI，HincII，HindIII，HinfI，HpaI，HpaII，KpnI，MboII，MluI，MroI，MscI，MspI，MvaI，NaeI，NarI，NciI，NcoI，NheI，NotI，NruI，NspV，PacI，PpuMI，PstI，PvuI，PvuII，RsaI，SacI，SacII，SalI，Sau3AI，Sau96I，ScaI，ScrFI，SfiI，SmaI，SpeI，SphI，SrfI，SspI，TaqI，TspEI，XbaI和XhoI從上述限制性內(nèi)切酶中自由選擇的限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)稱為限制性酶切位點(diǎn)。
由于寡核苷酸上需要有限制性酶切位點(diǎn)，因此必須是雙鏈核酸，如DNA。
寡核苷酸可以是天然的，如來(lái)自高等動(dòng)物，真菌，細(xì)菌或者病毒，當(dāng)然也可以是經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)改變和人工合成的。由于人工合成簡(jiǎn)單易行(后面還將提到)，因此優(yōu)選使用合成的寡核苷酸。一般地，寡核苷酸鏈中堿基的數(shù)目?jī)?yōu)選為10-50個(gè)。
用下述方法可以容易地制備本發(fā)明用于固定核苷酸的支持相(1)基質(zhì)的化學(xué)修飾在本發(fā)明用于固定核苷酸的支持相中，這種寡核苷酸固定在經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的基質(zhì)上。
基質(zhì)的例子是玻璃；金剛石；金、銀、銅、鋁、鎢、鉬等金屬；與上述玻璃、金剛石和金屬等復(fù)合成層的陶瓷類產(chǎn)品；以及聚碳酸酯和氟樹脂(fluorine resin)等塑料。
也可以使用其他材料，只要這些材料是化學(xué)穩(wěn)定的材料，如石墨，金剛石樣碳(diamond-like carbon)等。也可以用塑料和上述的金屬、玻璃、陶瓷類、金剛石等物質(zhì)的混合物或者成層產(chǎn)品。
出于導(dǎo)熱性的考慮，上述物質(zhì)中優(yōu)選使用金剛石或部分使用金剛石的材料作為基質(zhì)。金剛石具有良好的導(dǎo)熱性，可以被迅速加熱和冷卻，這樣大大縮短了像在PCR過(guò)程中重復(fù)加熱和冷卻的熱循環(huán)時(shí)間。
優(yōu)選本發(fā)明基質(zhì)的導(dǎo)熱率不低于0.1W/cm·K，優(yōu)選不低于0.5W/cm·K，尤其優(yōu)選不低于1.0W/cm·K。這是因?yàn)?，若基質(zhì)的導(dǎo)熱率不低于1.0W/cm·K，在將DNA固定于本發(fā)明支持相的化學(xué)修飾部分以后進(jìn)行PCR等操作時(shí)，加熱和冷卻的跟隨特性(follow-up property)極佳。
作為金剛石基質(zhì)的材料，可以使用任何合成金剛石、高壓制作的金剛石和天然金剛石。在結(jié)構(gòu)上可以是單晶也可以是多晶。從生產(chǎn)效率的角度，優(yōu)選使用氣相合成法如微波等離子體CVD(化學(xué)氣相沉積)法制造的金剛石。
可以通過(guò)已知方法來(lái)形成以金剛石或其它物質(zhì)為材料的基質(zhì)。例子有微波等離子體CVD法，ECR CVD(電子回旋共振化學(xué)氣相沉積，electric cyclotron resonance Chemical Vapor Deposit)法，ICP(感應(yīng)耦合等離子體)法，直流噴鍍法(direct current sputteringmethod)，ECR(電子回旋共振)噴鍍法(sputtering method)，離子電鍍(ion plating)法，電弧離子電鍍(arc ion plating)法，EB(電子束)蒸汽淀積(electron beam vapor deposition)法和電阻加熱蒸汽沉積(resistance heating vapor deposition)法等。
此外，制造基質(zhì)的方法的一個(gè)例子是通過(guò)將金屬粉末或者陶瓷粉末與作為粘合劑的樹脂混合而鍵合和形成的產(chǎn)物。而且，制造基質(zhì)的方法的一個(gè)例子是如下方法，即將金屬粉末或者陶瓷粉末等材料用壓模機(jī)壓縮，并使此產(chǎn)品高溫?zé)Y(jié)。
優(yōu)選有意將基質(zhì)表面粗造化。其原因是，在這種粗糙表面，基質(zhì)的表面積增大，由此便于固定大量的DNA等?；|(zhì)的形狀可以是板狀，條狀，球狀，多邊狀，筒狀，粉末狀等任何形狀。此外，基質(zhì)也可以是金剛石和其它物質(zhì)(如兩相物質(zhì))的復(fù)合物。
通過(guò)用在末端具有極性基團(tuán)的烴基取代基質(zhì)的表面來(lái)進(jìn)行化學(xué)修飾，這些極性基團(tuán)的例子有羥基，羧基，環(huán)氧基，氨基，巰基或者異氰酸酯基(isocyanate group)等。這樣使得多核苷酸能與基質(zhì)表面發(fā)生鍵合。這種烴基的烴部分的碳原子數(shù)優(yōu)選為0-12個(gè)，更優(yōu)選為0-6個(gè)。實(shí)例有甲酸、乙酸和丙酸等單羧酸，草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來(lái)酸和延胡索酸等二羧酸，以及偏苯三酸等多元羧酸等。也可以使用由一種或者兩種酸組成的酸酐。特別優(yōu)選草酸和琥珀酸。
烴基優(yōu)選通過(guò)氨基鍵合于基質(zhì)表面。因?yàn)榘被I使得化學(xué)修飾作用更加容易且更加牢固。
這種化學(xué)修飾可以通過(guò)以下方式完成紫外線照射使基質(zhì)表面氯化，將基質(zhì)置于氨氣中用紫外線照射使其氨化，然后用適當(dāng)?shù)孽；然蛘叨人狒蛊漪然?br> (2)單鏈寡核苷酸的固定上述步驟完成后，單鏈寡核苷酸(以下稱為寡核苷酸A)通過(guò)酰胺鍵固定于經(jīng)過(guò)了化學(xué)修飾的部位上。在固定之前如果將化學(xué)修飾的烴基末端活化，固定方法就很容易進(jìn)行，因此優(yōu)選進(jìn)行這種活化。特別優(yōu)選使用碳二亞胺為脫水縮合劑。
除上述方法外，也可以以這種方式形成，即將基質(zhì)表面變成氯化和氨化狀態(tài)(非羧化)，產(chǎn)生的伯胺基就可以很容易與含有酯基的活化二酯的一個(gè)酯基如N-羥基琥珀酰亞胺和對(duì)硝基酚脫水縮合。
雖然對(duì)寡核苷酸A的序列沒有限制，但其未固定端(3’-末端)應(yīng)設(shè)計(jì)成與下一個(gè)其他寡核苷酸雜交獲得的雙鏈寡核苷酸具有限制性酶切位點(diǎn)。
考慮到與化學(xué)修飾基質(zhì)之間容易形成酰胺鍵，待固定側(cè)優(yōu)選具有1-10個(gè)帶有伯胺的核苷酸堿基，比如腺嘌呤，胞嘧啶和鳥嘌呤。特別優(yōu)選待固定側(cè)(5’-末端)1-5個(gè)堿基是腺嘌呤或胞嘧啶。還優(yōu)選腺嘌呤后面1-5個(gè)堿基是胸腺嘧啶或鳥嘌呤，以抑制后續(xù)雜交的趨異性。
(3)另一單鏈寡核苷酸與寡核苷酸A雜交另一單鏈寡核苷酸(以下稱為寡核苷酸B)應(yīng)該與寡核苷酸A具有互補(bǔ)序列。
在本發(fā)明通過(guò)雜交獲得的雙鏈寡核苷酸中，與待固定側(cè)相對(duì)的一端具有限制性酶切位點(diǎn)，因此寡核苷酸A和B必形成限制性酶切位點(diǎn)。雜交條件與通常使用的條件相同。
相應(yīng)于待結(jié)合的DNA分子的限制性酶切位點(diǎn)形成后，如此制備的本發(fā)明用于固定核苷酸的支持相就能夠進(jìn)行結(jié)合。
下面通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)地舉例說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1帶有EcoRI酶切位點(diǎn)的用于固定核苷酸的支持相的制備(1)基質(zhì)的化學(xué)修飾將含有金剛石的基質(zhì)置于氯氣中用紫外線照射使基質(zhì)表面氯化。之后置于氨氣中用紫外線照射使其氨化，然后用酰氯在氯仿中回流使基質(zhì)羧化，由此基質(zhì)表面實(shí)現(xiàn)化學(xué)修飾。
(2)單鏈寡核苷酸的固定將上述(1)制備的化學(xué)修飾基質(zhì)浸在1，4-二氧六環(huán)溶液中15分鐘(金剛石基質(zhì)和二氧六環(huán)的比為1∶100μl)，二氧六環(huán)溶液中溶有2.5mg/ml碳二亞胺和1.5mg/ml N-羥基琥珀酰亞胺，使末端羧基脫水縮合。該反應(yīng)完成后，先用水沖洗產(chǎn)物，再用1，4-二氧六環(huán)溶液洗滌，然后干燥。
然后，具有序列表中SEQ ID NO1所示序列的寡核苷酸A-1的5’-末端腺嘌呤通過(guò)酰胺鍵與基質(zhì)活化部位鍵合。
(3)寡核苷酸B與寡核苷酸A雜交制備具有與寡核苷酸A(序列aaaggttttt tttttttttt tttg，參見SEQ ID NO1)互補(bǔ)的序列的寡核苷酸B(序列aattcaaaaaaaaaaaaaaa aaacctt，參見序列表中SEQ ID NO2)，并與在上述(2)中已經(jīng)固定的寡核苷酸A雜交。
將寡核苷酸B溶于78μl無(wú)菌水中，再加入20μl的20×ssc(檸檬酸鈉鹽溶液)和2μl的SDS溶液，使總體積為100μl。在35℃條件下使上述固定有寡核苷酸A的基質(zhì)浸泡在此溶液中10小時(shí)。
結(jié)果，制備了帶有EcoRI酶切位點(diǎn)的本發(fā)明固定用支持相。
(4)帶有限制性酶切位點(diǎn)的gDNA的制備在具有下列組成的緩沖液中用EcoRI處理目的DNA(37℃ 1小時(shí))，反應(yīng)后加熱失活酶，瓊脂糖凝膠電泳，回收具有EcoRI酶切位點(diǎn)的gDNA片斷。緩沖液組成如下 EcoRI 2μl 10×H緩沖液4μl 無(wú)菌水 34μl總體積 40μl(5)用連接酶將DNA的限制性酶切部分與基質(zhì)連接。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明用于固定核苷酸的支持相通過(guò)連接酶將待固定的核酸(如DNA)固定于具有限制性酶切位點(diǎn)的寡核苷酸上。因此，與傳統(tǒng)通過(guò)化學(xué)鍵直接固定的方法相比，DNA等核酸能被固定得更加牢固。
此外，根據(jù)本發(fā)明的制備方法，能夠有效地產(chǎn)生DNA等核酸可以穩(wěn)定地固定的用于固定核苷酸的支持相。
當(dāng)本發(fā)明用于固定核苷酸的支持相以這種狀態(tài)投放市場(chǎng)時(shí)，用戶可以預(yù)先通過(guò)用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割DNA來(lái)制備限制性酶切位點(diǎn)，這樣用戶自己就可以容易地將該DNA穩(wěn)定地固定。
序列表<110>TOYO KOHAN CO.，LTD.<120>一種固定核苷酸的支持相及其制備方法<130>1738PCT<150>JP 2000-019301<151>2000-01-27<160>2<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>1aaaggttttt tttttttttt tttg24<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>2aattcaaaaa aaaaaaaaaa aaacctt 2權(quán)利要求
1.用于固定核苷酸的支持相，其中經(jīng)化學(xué)修飾的基質(zhì)上固定了寡核苷酸，其特征在于所述寡核苷酸具有限制性酶切位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用于固定核苷酸的支持相，其中寡核苷酸的僅一條鏈鍵合至經(jīng)化學(xué)修飾的基質(zhì)上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用于固定核苷酸的支持相，其中寡核苷酸通過(guò)酰胺鍵鍵合至經(jīng)化學(xué)修飾的基質(zhì)上。
4.制備用于固定核苷酸的支持相的方法，其中將基質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾，在該基質(zhì)上固定單鏈寡核苷酸，然后將另一具有與以上單鏈寡核苷酸互補(bǔ)的堿基序列的單鏈寡核苷酸與所述以上單鏈寡核苷酸雜交，由此鍵合在末端具有限制性酶切位點(diǎn)的寡核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的制備用于固定核苷酸的支持相的方法，其中基質(zhì)的化學(xué)修飾包含基質(zhì)表面的氯化，氨化和羧化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的制備用于固定核苷酸的支持相的方法，其中基質(zhì)被化學(xué)修飾，然后在脫水縮合劑存在下活化其末端。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的制備用于固定核苷酸的支持相的方法，其中脫水縮合劑為碳二亞胺和/或N-羥基琥珀酰亞胺。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的制備用于固定核苷酸的支持相的方法，其中基質(zhì)的化學(xué)修飾按下述方式進(jìn)行基質(zhì)表面被氯化和氨化，形成的伯胺基與活化過(guò)的二酯中的一個(gè)酯基脫水和縮合。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的制備用于固定核苷酸的支持相的方法，其中活化過(guò)的二酯中的酯基是N-羥基琥珀酰亞胺或?qū)αu基琥珀酰亞胺。
10.根據(jù)權(quán)利要求4的制備用于固定核苷酸的支持相的方法，其中待固定于基質(zhì)上的單鏈寡核苷酸在待固定側(cè)末端具有1-10個(gè)帶有伯胺的核苷酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的制備用于固定核苷酸的支持相的方法，其中待固定于基質(zhì)上的單鏈寡核苷酸在待固定側(cè)末端具有帶有1-10個(gè)伯胺的核苷酸和然后的1-5個(gè)胸腺嘧啶或鳥嘌呤。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的制備用于固定核苷酸的支持相的方法，其中待固定于基質(zhì)上的單鏈寡核苷酸在待固定側(cè)末端具有1-5個(gè)腺嘌呤或胞嘧啶和然后的1-5個(gè)胸腺嘧啶或鳥嘌呤。
全文摘要
一種固定核苷酸的支持相，能夠在不損傷DNA末端的情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA的闡述，因此可用于分子生物學(xué)及生物化學(xué)等領(lǐng)域。此固定核苷酸的支持相是一種固定了寡核苷酸的經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的基質(zhì)，其特征在于此寡核苷酸具有限制性酶切位點(diǎn)。此支持相的制備是通過(guò)基質(zhì)的化學(xué)修飾、單鏈寡核苷酸的固定、單鏈寡核苷酸與另一與之具有互補(bǔ)序列的寡核苷酸的雜交、以及與末端具有限制性酶切位點(diǎn)的寡核苷酸的連接等而實(shí)現(xiàn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1396954SQ01804171
公開日2003年2月12日 申請(qǐng)日期2001年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月27日
發(fā)明者丹花通文, 岡村浩, 高木研一, 高橋浩二郎 申請(qǐng)人:東洋鋼板株式會(huì)社