專利名稱：用氫代謝甲烷細菌生產(chǎn)維生素b的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及維生素B12的制造方法。
眾所周知，鈷胺素即維生素B12的類似物化學合成困難，是由細菌或放線菌經(jīng)生物合成而得，不能由酵母、霉菌、植物、動物進行生物合成而得。目前工業(yè)上是從以甲醇為基質(zhì)的丙酸菌菌體中提取的。這樣的維生素B12主要用來制造藥品，但近年來，將維生素B12添加入食品中開發(fā)功能性食品或用于保健食品的需求量日漸增加，迫切需要降低成本。
背景技術(shù)：
以往由丙酸菌制造維生素B12是以甲醇為基質(zhì)的，同時由于這種菌是兼性厭氧菌，所以繁殖非常慢，而且因丙酸轉(zhuǎn)換成乙酸而由乙酸引起繁殖阻礙，導致發(fā)酵液中菌體密度不高，只能從菌體中提取大約1mg/L維生素B12，生產(chǎn)效率低。其后，永久史郎等人(生物工學會志、76(6)、447-455、1998)使用以甲醇作基質(zhì)的甲烷細菌固定床生物反應(yīng)器，甲烷細菌和丙酸菌的維生素B12的生成量相比，獲得量達到約10倍，主要成分為類鈷啉，但其中以鈷胺素的形式存在的很少，這種情況下和甲醇很難分離，維生素B12的收率無法提高，維生素B12的含量低，因而未能解決生產(chǎn)成本降低的問題。
本發(fā)明的研究課題有鑒于此，本發(fā)明致力于解決如上所述的以往技術(shù)中的問題，提供一種可以高效率制造含量高、收率高的維生素B12的新方法。
附圖的簡要說明

圖1舉例表示甲烷細菌體密度的增加。
圖2舉例表示菌體內(nèi)維生素B12和菌體外維生素B12的比率。
圖3舉例表示Co/Fe比和氰鈷胺密度的關(guān)系。
圖4表示1例生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)。
圖5表示另1例生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)。
圖6表示固定床發(fā)酵槽中甲烷細菌活性和維生素B12含量之間的關(guān)系。
其中，圖4和圖5中的符號表示如下1.多孔性陶瓷2.反應(yīng)器3.載體充填槽4.陰極5.散氣噴嘴6.電磁閥7.儲氣罐8.生物氣體或煤氣送氣管9.釋氧部10.陽極11.電磁閥12.電磁閥13.壓力檢測控制設(shè)備14.止逆閥15.泄出閥16.泄出閥17.電解槽18.超濾膜裝置19.壓力控制電磁閥20.氣體溫度檢測控制設(shè)備21.培養(yǎng)基用液供液噴嘴本發(fā)明的最佳實施方案本發(fā)明完成了上述課題，第1，提供維生素B12的制造方法，其特征在于將由消化污泥中得到的中溫甲烷細菌以H2/CO2作為培養(yǎng)基進行馴化，將馴化甲烷細菌在含有微量金屬元素的無機營養(yǎng)鹽的載體上經(jīng)固定床生物反應(yīng)器增殖，在煤氣和生物氣體的至少一種氣體中加入氫氣后得到混合氣體，用馴化甲烷細菌使其代謝并改性成為甲烷，同時將作為菌體外生成物、存在于發(fā)酵液中的鈷胺素用氰化鉀使其形成氰鈷胺后予以回收。
第2，提供維生素B12的制造方法，其特征在于將由消化污泥得到的中溫甲烷細菌以H2/CO2作為培養(yǎng)基進行馴化，將馴化甲烷細菌用含有微量金屬元素的使用超濾膜的懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器增殖，超濾膜的過濾液中所含細胞外鈷胺素用氰化鉀使其形成氰鈷胺后回收，使甲烷細菌經(jīng)超濾膜再回到培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)以使煤氣和生物氣體的至少一種氣體中加入氫氣所得的混合氣體發(fā)生代謝。
第3，上述方法中微量金屬濃度為標準組成的10～1000倍；第4，氫代謝甲烷細菌的培養(yǎng)基的微量元素鹽的濃度中，Co/Fe比是標準組成的10～100倍。
另外，第5，本發(fā)明提供甲烷的發(fā)酵方法，在煤氣或生物氣體加入氫氣的方法就是在固定床或懸浮型生物反應(yīng)器的底部插入多孔性陶瓷，陰極在上、陽極在下，通直流電，使培養(yǎng)液中的水發(fā)生電解，將產(chǎn)生的氫氣用于微量元素強化載體固定床或膜復合型甲烷發(fā)酵生物反應(yīng)器，氧氣釋放到大氣中去。第6，本發(fā)明提供氣體的改性方法，其特征在于，將菌體外產(chǎn)物——鈷胺素用氰化鉀使其形成氰鈷胺并提取出來，對殘留液通直流電使其電解，由此得到的氫氣提供給含有一氧化碳或二氧化碳的煤氣或生物氣體，利用膜復合生物反應(yīng)器或固定床反應(yīng)器進行甲烷化反應(yīng)。
也就是說，發(fā)明人在含有微量元素的無機營養(yǎng)鹽的載體(專利申請平9-140181，專利公告平10-327850)的開發(fā)中嘗試往生物氣體中的CO2(約40％)中加入H2發(fā)生甲烷化(methanation)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以前的報告結(jié)果是如果用甲烷生成菌以外的菌，那么大部分維生素B12存在于菌體中，而甲烷化實驗中通過計算維生素B12的質(zhì)量平衡發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中全部維生素B12的70％發(fā)生菌體外溶出，甲烷細菌體中只含有30％，而且將中溫甲烷細菌以氫氣和二氧化碳的混合氣體作為基質(zhì)、用馴化培養(yǎng)來進行選擇培養(yǎng)得到的甲烷細菌，能夠從發(fā)酵液中以氰鈷胺的形式提取高濃度的鈷胺素(維生素B12的類似化合物)，依據(jù)這些事實，完成了本發(fā)明。
首先，本發(fā)明方法的基本要點為1)用H2/CO2作為培養(yǎng)基馴化消化污泥中得來的中溫甲烷細菌；2)使馴化甲烷細菌在含有微量金屬元素無機營養(yǎng)鹽的載體上通過固定床生物反應(yīng)器發(fā)生增殖；3)在煤氣、生物氣體中加入氫氣后形成混合氣體，使混合氣體代謝并改性成為甲烷；4)同時將發(fā)酵液中存在的菌體外生成物——鈷胺素通過氰化鉀使其形成氰鈷胺、即維生素B12并加以回收。
此方法中，對上述載體而言，將微量金屬濃度提高到以前的10-1000倍是有效的。
還有，對于同時使用超濾膜的膜復合型生物反應(yīng)器中進行的懸浮培養(yǎng)等，將微量金屬鹽濃度和營養(yǎng)鹽濃度提高比到以往的方法10～1000倍是有效的。所謂同時使用超濾膜的懸浮培養(yǎng)，具體而言，本發(fā)明提供了這樣一種維生素B12的制造方法，如前所述，將由消化污泥而來的中溫甲烷細菌用H2/CO2作為培養(yǎng)基進行馴化，用含有微量金屬元素的同時使用超濾膜的懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器使馴化甲烷細菌增殖，超濾膜過濾液中所含細胞外鈷胺素用氰化鉀使其形成氰鈷胺并加以回收，并使甲烷細菌通過超濾膜回到培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)以使煤氣和生物氣體的至少一種氣體中加入氫氣后得到的混合氣體發(fā)生代謝。
以上不管何種方法，在本發(fā)明中只要稍微改變一下培養(yǎng)基，尤其是將培養(yǎng)基中的Co/Fe比提高10～100倍，就可以提高培養(yǎng)鹽中鈷胺素的濃度。因此，本發(fā)明中，通過使含有CO2和CO的煤氣或生物氣體100％CH4化的甲烷化反應(yīng)實現(xiàn)煤氣或生物氣體成分的改性，同時此培養(yǎng)液用氰化鉀形成氰鈷胺(維生素B12)，這種維生素B12的回收與以往的從菌體回收的方法相比非常簡單，維生素B12的濃度與丙酸菌相比也要高50～100倍，相當于由甲醇代謝甲烷細菌(永井史郎1996，生物工學會志74(6)，447-455)的回收方法的2-10倍，可大幅降低維生素B12的制造成本。
下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明作進一步說明。
圖1中，將中溫甲烷細菌以氫氣80％、二氧化碳20％組成的混合氣體為基質(zhì)并用液態(tài)標準合成培養(yǎng)基進行充分馴化得到甲烷細菌、然后在同樣中溫(35℃～36℃)下用營養(yǎng)鹽或含微量金屬鹽濃度比以往高10～1000倍的無機營養(yǎng)鹽的載體(專利申請平9-140181，專利公開平10-327850，微量元素·無機營養(yǎng)鹽類擴散型菌體培養(yǎng)載體)連續(xù)培養(yǎng)，此時的甲烷細菌菌體密度的增加用圖1表示。甲烷細菌菌體密度達到26g-dry/L時維生素B12的濃度達到了185mg/L。這個結(jié)果相當于用丙酸菌來制備的方法的50～100倍。
圖2中，微量金屬濃度是以往的方法的10倍，此合成培養(yǎng)基中通入氫氣80％、二氧化碳20％作為基質(zhì)，觀察懸浮培養(yǎng)液中的菌體內(nèi)V.B12和菌體外V.B12的比率。結(jié)果表明分別達到了30％和70％，由此可知，用含有微量元素·營養(yǎng)鹽的載體分離菌體外溶出V.B12，是可以實現(xiàn)高效率的制造的。
另外，圖3中，以二氧化碳濃度為40％～60％、氫氣濃度為60％組成的混合氣體作為基質(zhì)，以含微量元素·營養(yǎng)鹽的載體中的微量元素鈷和鐵的比率為參數(shù)運行生物反應(yīng)器，氰鈷胺的濃度如圖3所示?？梢?，鈷胺素是維生素B12的類似化合物，對鈷的要求很高。
如圖4，在二氧化碳或生物氣體中不斷加入氫氣是采用如下方法，在生物氣體反應(yīng)器中將多孔性陶瓷1置于反應(yīng)器2底部，其下和反應(yīng)器2最下面的液體中放置相當于陽極10的金屬電極(鈦、鐵)，在多孔性陶瓷1的正上方的散氣噴嘴正上方放置鉑或鈦制的陰極4電極板，加電壓20～100V。這樣氫氣在陰極4的板上產(chǎn)生，氧氣在陽極10的電極板上產(chǎn)生，而由于設(shè)有氧氣排放部分9因此氧氣可通過鼓風機B2擴散至大氣中。如果多孔性陶瓷1的間隙大小保持在只相當于產(chǎn)生的氧氣的氣泡直徑的1/20～1/100，由于鼓風機的作用壓力一直保持高于大氣壓，那么電解產(chǎn)生的氧氣就不會通過多孔性陶瓷1進入反應(yīng)器2，從而可以保證生物反應(yīng)器內(nèi)的絕對厭氧性。載體充填槽3結(jié)合在反應(yīng)器2中從而使含有微量元素的載體形成固定床。其容積充填至有效容積的30～60％。煤氣或生物氣體根據(jù)壓力檢測控制器13的指示，由煤氣或生物氣體送氣管8進入，而通過打開電磁閥11和12不斷啟動鼓風機B1，使得二氧化碳濃度降低和甲烷濃度升高，此時電磁閥6得到氣體濃度檢測控制器20的指示而打開，往儲氣罐7中輸送甲烷氣體。而當生物反應(yīng)器2內(nèi)壓力降低時電磁閥6和12關(guān)閉，新的氣體就從生物氣體或煤氣送氣管8輸送進來。
如圖5，將含有鈷胺素的發(fā)酵液用電解裝置17分解，僅向生物反應(yīng)器2送氫氣，利用繁殖在載體充填槽3的固定床上的甲烷細菌發(fā)生甲烷化過程，由生物氣體或煤氣送氣管8送入的二氧化碳因電解裝置17送來的氫氣反應(yīng)產(chǎn)生甲烷。生物反應(yīng)器內(nèi)甲烷濃度升高，當濃度接近100％時氣體檢測控制裝置20就打開閥6，向儲氣罐7輸送甲烷。一旦生物反應(yīng)器內(nèi)的壓力降低時，電磁閥6和12就關(guān)閉，電磁閥11打開，就可以由生物氣體或煤氣送氣管8再送入新氣體。如此圖4、5就都形成了以氣體為基質(zhì)的半連續(xù)操作。另一方面，液體中鈷胺素濃度升高，所以用泄出閥15和16隨時檢測濃度，一旦達到最大濃度就引流出一定量的液體并由此液體來回收維生素B12。一邊由8供應(yīng)新的氣體一邊用泄出閥15和16引流出液體、這樣的操作過程可防止氧氣進入生物反應(yīng)器2內(nèi)。然后通過圖4、5所示的培養(yǎng)基用液供液噴嘴21用泵供應(yīng)培養(yǎng)基溶液。
圖4和圖5中舉出的這些方法、裝置對本發(fā)明的第1到第4項中任何一種方案的實施都是很有用的。
以下就本發(fā)明的實施例加以說明。實施例<1>微量元素濃度為以往方法的10倍，進行使其中的氯化鈷濃度升高的間歇式懸浮培養(yǎng)實驗，以20％CO2和80％H2組成的合成氣體為基質(zhì)，這種情況下培養(yǎng)液中維生素B12的濃度經(jīng)過48小時后為25.2mg/L。以往文獻中從丙酸菌得到的維生素B12的濃度值為0.5～1mg/L，因此使用本發(fā)明的方法，確實可以得到高收率的維生素B12且氰鈷胺很容易溶出到菌體外再由培養(yǎng)液中回收。
<2>溶液的濃度是以往方法的1000倍，將其和封閉在含有微量元素·營養(yǎng)鹽的固定載體中的物質(zhì)充填入容積為5L的固定床生物反應(yīng)器，在CO240％、CH460％的生物氣體中用電解法連續(xù)供氫氣給培養(yǎng)液，連續(xù)進行生物氣體的改性，從而可以改性成為98～99％的CH4。而且同時培養(yǎng)液中的維生素B12的濃度達到了180mg/L。這個結(jié)果是由丙酸菌生產(chǎn)的方法的50～100倍，生產(chǎn)速度也達到了它的25-50倍。
由此，實施例的具體作用和特定效果匯總?cè)缦?.由強化微量元素的培養(yǎng)液中回收維生素B12，不是由菌體本身中回收維生素B12，所以可以保持高密度的菌體，回收菌體外產(chǎn)物鈷胺素的量大大超過了以往的方法，維生素B12的收率得以提高。
2.氫氣能夠通過電解生物反應(yīng)器中的溶液本身來供氣，從而得以實現(xiàn)生物氣體或煤氣的改性以及高能量化。
3.維生素B12可以用氰化鉀直接以氰鈷胺的形式來回收，進一步降低了維生素B12的制備成本。
<3>微量元素濃度為以往方法的1000倍的溶液封閉在包含營養(yǎng)鹽的載體中，充填入如圖5所示的容積5L的固定床生物反應(yīng)器中，濃度為以往方法的100倍的溶液作為培養(yǎng)基，平均停留時間(HRT)設(shè)定為3天和6天這兩個條件，進行連續(xù)加液實驗。此時在CO240％、CH460％組成的生物氣體中，電解流出物一側(cè)的培養(yǎng)基，產(chǎn)生的氫氣不斷供給，連續(xù)進行生物氣體的改性30天，結(jié)果如圖6所示。最初9天就是啟動時必須的HRT的3倍時間。因這個時期很不穩(wěn)定，故測定了9～30天內(nèi)的甲烷產(chǎn)生速度和氰鈷胺維生素B12(完全型)。結(jié)果顯示，HRT6天的情況下，完全型維生素B12的濃度保持在約37.5mg/L，甲烷產(chǎn)生速度為11.5L/Lh。完全型維生素B12的生成速度按HRT來看，是由丙酸菌制備的速度的110-160倍，和以甲醇為基質(zhì)的TAPPAN等人(1987Applied Microbiology and Biotechnology，26511-516)的結(jié)果相比，如圖6結(jié)果顯示完全型維生素B12的生成速度是其20倍。
另外，如圖6所示的實驗中，可以看到甲烷細菌的密度達到40g/L，完全型維生素B12由甲烷細菌中大量溶出，因此肯定可以以低廉的成本實現(xiàn)維生素B12的穩(wěn)定的工業(yè)化生產(chǎn)。
工業(yè)應(yīng)用可能性綜上所述，利用本發(fā)明，可以高收率、高含量、比以往的方法高效率地生產(chǎn)維生素B12。
權(quán)利要求
1.一種維生素B12的制造方法，其特征在于由消化污泥而來的中溫甲烷細菌用H2/CO2作為培養(yǎng)基進行馴化，將馴化甲烷細菌在含有微量金屬元素無機營養(yǎng)鹽的載體上經(jīng)固定床生物反應(yīng)器增殖，在煤氣和生物氣體的至少一種氣體中加入氫氣后得到的混合氣體經(jīng)此馴化甲烷細菌代謝而改性成為甲烷，同時作為菌體外生成物存在于發(fā)酵液中的鈷胺素用氰化鉀使其形成氫鈷胺，并予以回收。
2.一種維生素B12的制造方法，其特征在于由消化污泥而來的中溫甲烷細菌用H2/CO2作為培養(yǎng)基進行馴化，通過含有微量元素、合并使用超濾膜的懸浮培養(yǎng)反應(yīng)器使馴化甲烷細菌發(fā)生增殖，將超濾膜過濾液中所含細胞外鈷胺素用氰化鉀形成氰鈷胺后加以回收，并將甲烷細菌通過超濾膜回到培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)以便使煤氣或生物氣體的至少一種氣體中加入氫氣后得到的混合氣體進行代謝。
3.如權(quán)利要求1或2記載的方法，其中微量金屬濃度為標準組成的10～1000倍。
4.如權(quán)利要求1或2記載的方法，其中氫代謝甲烷細菌的培養(yǎng)基的微量金屬鹽的濃度中Co/Fe比為標準組成比的10～100倍。
5.一種甲烷的發(fā)酵方法，其特征在于在固定床和懸浮型生物反應(yīng)器的底部插入多孔性陶瓷，陰極在上，陽極在下，施加直流電壓，通過電解培養(yǎng)液中的水，將產(chǎn)生的氫氣用于微量元素強化型載體固定床或膜復合型甲烷發(fā)酵生物反應(yīng)器，并將氧氣釋放入大氣中去。
6.一種氣體的改性方法，其特征在于將作為菌體外生成物的鈷胺素用氰化鉀使其形成氰鈷胺后提取出來，再對殘留的溶液施加直流電壓，使其電解，所得氫氣供給含有一氧化碳和二氧化碳的煤氣或生物氣體，通過膜復合生物反應(yīng)器或固定床反應(yīng)器發(fā)生甲烷化反應(yīng)。
全文摘要
由消化污泥而來的中溫甲烷細菌用H
文檔編號C12M1/40GK1396956SQ01804425
公開日2003年2月12日 申請日期2001年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月1日
發(fā)明者前川孝昭, 張振亞 申請人:科學技術(shù)振興事業(yè)團