專利名稱：：酸－穩(wěn)定性枯草蛋白酶在動(dòng)物飼料中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及酸-穩(wěn)定性枯草蛋白酶家族的絲氨酸蛋白酶在動(dòng)物飼料中的(體內(nèi))用途，以及這種蛋白酶處理植物蛋白質(zhì)的(體外)用途。蛋白質(zhì)是動(dòng)物和人必不可少的營(yíng)養(yǎng)因子。大多數(shù)牲畜和很多人從植物蛋白質(zhì)來(lái)源中攝取必需的蛋白質(zhì)。重要的植物蛋白質(zhì)來(lái)源是例如油料種子作物，豆類和谷類。例如，當(dāng)在單胃動(dòng)物，如豬和家禽的飼料中含有豆粉時(shí)，大部分豆粉固體不能被消化。例如，小豬和處于生長(zhǎng)期的豬地表觀回腸蛋白質(zhì)消化能力僅為80％左右。單胃動(dòng)物和多種魚的胃表現(xiàn)出強(qiáng)酸性pH。然而，大多數(shù)的蛋白質(zhì)消化發(fā)生在小腸。因此，需要一種在流經(jīng)胃之后仍能存活的酸-穩(wěn)定性蛋白酶。
背景技術(shù)：
：從下列文獻(xiàn)中可以了解蛋白酶在動(dòng)物飼料中的用途，或其處理植物蛋白質(zhì)的用途W(wǎng)O95/28850公開了一種含有植酸酶和蛋白酶的動(dòng)物飼料添加劑。第7頁(yè)詳細(xì)說(shuō)明了多種蛋白酶。WO96/05739公開了含有木聚糖酶和蛋白酶的酶飼料添加劑。第25頁(yè)列出了適當(dāng)?shù)牡鞍酌?。WO95/02044公開了得自棘孢曲霉(Aspergillusaceleatus)的蛋白酶及其在動(dòng)物飼料中的用途。US3966971公開了通過(guò)用酸性植酸酶并任選一種蛋白酶處理，由植物蛋白質(zhì)來(lái)源獲取蛋白質(zhì)的方法。第2欄中詳細(xì)說(shuō)明了適當(dāng)?shù)牡鞍酌浮S4073884，US5047240，US3868448，US3823072和US3683069描述了得自多個(gè)鏈霉菌(Streptomyces)屬菌株的蛋白酶制品及其在動(dòng)物飼料中的用途。然而，這些蛋白酶不是酸-穩(wěn)定性的和/或不是枯草蛋白酶家族的蛋白酶。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明鑒定出的幾種蛋白酶具有很好的酸-穩(wěn)定性，有望在動(dòng)物飼料中具有改良的性能。這些蛋白酶屬于已知為枯草蛋白酶的蛋白酶組。附圖簡(jiǎn)述以下將參照附圖進(jìn)一步闡明本發(fā)明，其中圖1顯示了4種蛋白酶(1種得自芽孢桿菌屬(Nocardiopsis)菌種NCIMB40484的酸-穩(wěn)定性枯草蛋白酶家族的蛋白酶(PD498)，和3種參照蛋白酶(得自解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的Sub.Novo和Sub.Novo(Y217L)，以及SAVINASETM))在溫度為37℃，pH值范圍為pH2至pH11的條件下保溫2小時(shí)之后的pH-穩(wěn)定性曲線，即殘留的蛋白酶活性；所述活性是相對(duì)于在pH9.0和5℃下保溫2小時(shí)之后的殘留活性而言的；圖2顯示了相同的4種蛋白酶在pH3至pH11的范圍內(nèi)的pH-活性曲線，即蛋白酶活性，所述活性是相對(duì)于最適pH時(shí)的蛋白酶活性而言的；和圖3顯示了相同的4種蛋白酶在15℃至80℃的范圍內(nèi)，pH為9.0時(shí)的溫度-活性曲線，即pH為9.0時(shí)的蛋白酶活性，所述活性是相對(duì)于最適溫度下的蛋白酶活性而言的；圖4顯示了類似于圖1的pH-穩(wěn)定性曲線，不同的是蛋白酶是6種其它的酸-穩(wěn)定性枯草蛋白酶家族的蛋白酶，它們得自嗜堿芽孢桿菌NCIMB10438，尖孢鐮孢IFO4471，PaecilmyceslilacinusCBS102449，曲霉屬菌種CBS102448，AcremoniumchrysogenumATCC48272，基利支頂孢ATCC20338；圖5顯示了類似于圖2的pH-活性曲線，但蛋白酶與圖4中的相同；和圖6顯示了類似于圖3的，pH為9.0時(shí)的溫度-活性曲線，但蛋白酶與圖4中的相同。發(fā)明詳述本文所用術(shù)語(yǔ)蛋白酶是水解肽鍵(具有蛋白酶活性)的酶。蛋白酶也被稱為例如肽酶，肽水解酶或蛋白水解酶。本發(fā)明優(yōu)選使用的蛋白酶是在多肽鏈內(nèi)部起作用的內(nèi)在endo-型蛋白酶(內(nèi)肽酶)。內(nèi)肽酶對(duì)N-和C-末端被封閉的肽底物顯示出活性，所述肽底物與所述蛋白酶的特異性相關(guān)。上述的蛋白酶定義中包括屬于EC目錄(源自NC-IUBMB的酶名稱1992版，1992)EC3.4酶組(包括其13種亞-亞類的每一種)的任何酶，該目錄被定期添加和更新，具體可參見環(huán)球網(wǎng)(www)，網(wǎng)址為http∥www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。基于蛋白酶的催化機(jī)理將其分為以下幾組絲氨酸蛋白酶(S)，半胱氨酸蛋白酶(C)，天冬氨酸蛋白酶(A)，金屬蛋白酶(M)和未知的，或未被分類的蛋白酶(U)，參見蛋白酶手冊(cè)，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F.Woessner(編)，AcademicPress(1998)，尤其是總引言部分。術(shù)語(yǔ)絲氨酸蛋白酶指的是上述手冊(cè)中定義的絲氨酸肽酶及其異種集團(tuán)。在1998年版的該手冊(cè)中，第1-175章涉及絲氨酸肽酶及其異種集團(tuán)。在特定的實(shí)施方案中，絲氨酸蛋白酶是肽酶，其催化機(jī)理依賴于絲氨酸殘基的羥基，所述羥基作為攻擊肽鍵的親核體起作用。本文所用術(shù)語(yǔ)枯草蛋白酶或枯草蛋白酶家族欲包括所有SB異種集團(tuán)的絲氨酸蛋白酶，尤其是其中的S8家族(上述手冊(cè)的第93章中涉及SB異種集團(tuán))。在枯草蛋白酶中，催化三聯(lián)體的順序是Asp-His-Ser。三級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋和β折疊。SB異種集團(tuán)包括內(nèi)肽酶和外肽酶。已知這些肽酶可得自細(xì)菌，古細(xì)菌和真核生物；只有一個(gè)代表性例子得自DNA病毒。為了測(cè)定給定的蛋白酶是否為枯草蛋白酶，可參考上述手冊(cè)和其中所述的原理。這些檢測(cè)可對(duì)所有類型的蛋白酶進(jìn)行，而不論它們是天然或野生型蛋白酶，還是經(jīng)基因工程改造的或合成的蛋白酶?；蛘撸捎肧SI(鏈霉菌屬枯草蛋白酶抑制劑)進(jìn)行抑制作用的研究，將枯草蛋白酶定義為當(dāng)用摩爾過(guò)量的SSI抑制時(shí)，殘留活性高達(dá)10％的蛋白酶。可按實(shí)施例8所述進(jìn)行該試驗(yàn)。在該定義的特定實(shí)施方案中，枯草蛋白酶具有高達(dá)8％，6％或5％的殘留活性。術(shù)語(yǔ)“高達(dá)”被認(rèn)為等于“低于或等于”?？墒褂萌魏螠y(cè)定法測(cè)定蛋白酶活性，所述測(cè)定法中利用了底物，底物中包括與所述蛋白酶的特異性相關(guān)的肽鍵。類似地，使pH-試驗(yàn)和溫度-試驗(yàn)適應(yīng)于所述蛋白酶。pH值-試驗(yàn)的例子是pH5，6，7，8，9，10或11。溫度-試驗(yàn)的例子是25，30，35，37，40，45，50，55，60，65或70℃。蛋白酶底物的例子是酪蛋白和pNA-底物，如Suc-AAPF-pNA(可得自例如SigmaS-7388)。該pNA-底物中的大寫字母指的是單字母氨基酸密碼。另一個(gè)例子是ProtazymeAK(由MegazymeT-PRAK制備成片劑的經(jīng)azurine染色的交聯(lián)酪蛋白)。pH-活性和pH-穩(wěn)定性研究?jī)?yōu)選pNA-底物，而溫度-活性研究?jī)?yōu)選ProtazymeAK底物。實(shí)驗(yàn)部分描述了蛋白酶檢測(cè)法的例子。對(duì)本發(fā)明所用蛋白酶的來(lái)源沒有限制。因此，術(shù)語(yǔ)蛋白酶不僅包括天然或野生型蛋白酶，也包括其表現(xiàn)出蛋白酶活性的任何突變體，變體，片段等，以及合成的蛋白酶，如經(jīng)改組的蛋白酶和共有蛋白酶?？梢园凑毡绢I(lǐng)域公知的技術(shù)，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變，PCR(使用含有所需突變的PCR片段作為PCR反應(yīng)中的一個(gè)引物)，或隨機(jī)誘變制備經(jīng)基因工程改造的蛋白酶。共有蛋白質(zhì)的制備描述于例如EP897985。本發(fā)明所用的枯草蛋白酶家族酸-穩(wěn)定性蛋白酶的例子是(i)得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484，嗜堿芽孢桿菌NCIMB10438，尖孢鐮孢IFO4471，PaecilomyceslilacinusCBS102449，曲霉屬菌種CBS102448，AcremoniumchrysogenumATCC48272和基利支頂孢ATCC20338的蛋白酶；(ii)與(i)中的任何蛋白酶具有至少70，75，80，85，90或至少95％的氨基酸同一性的蛋白酶；(iii)與SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO3或SEQIDNO4中的任何一個(gè)具有至少70，75，80，85，90或至少95％的同一性的蛋白酶；(iV)與SEQIDNO5(完整序列1-397，或其片斷28-397或118-397)，SEQIDNQ6(完整序列1-367，或其片斷70-367或84-367)或SEQIDNO7中的任何一個(gè)具有至少70，75，80，85，90或至少95％的氨基酸同一性的蛋白酶。為了計(jì)算同一性百分比，可以使用本領(lǐng)域已知的任何計(jì)算機(jī)程序，例如GCG第8版程序包中提供的GAP(ProgramManualfortheWisconsinPackage，Version8，GeneticsComputerGroup，575ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B和Wunsch，C.D.，(1970)，JournalofMolecularBiology，48，443-453)。使用具有下列設(shè)置的GAP進(jìn)行多肽序列比較GAP生成罰分為5.0，GAP延伸罰分為0.3。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的蛋白酶是微生物蛋白酶，術(shù)語(yǔ)微生物表示蛋白酶得自，或源自微生物，或是得自微生物的蛋白酶類似物，片段，變體，突變體，或合成的蛋白酶?？稍谠嫉囊吧臀⑸锞?，在另一個(gè)微生物菌株或在植物中產(chǎn)生或表達(dá)所述蛋白酶，即該術(shù)語(yǔ)覆蓋了表達(dá)野生型，天然蛋白酶，以及在任何宿主中表達(dá)重組的，經(jīng)基因工程改造的或合成的蛋白酶。本文所用術(shù)語(yǔ)微生物包括古細(xì)菌，細(xì)菌，真菌，病毒等。微生物的例子是細(xì)菌，例如芽孢桿菌屬細(xì)菌，如芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484，嗜堿芽孢桿菌NCIMB10438，或其表現(xiàn)出蛋白酶活性的突變體或變體。其它微生物的例子是真菌，例如酵母或絲狀真菌，如選自擬青霉屬，如PaecilomyceslilacinusCBS102449，曲霉屬，如曲霉屬菌種CBS102448，支頂孢屬，如AcremoniumchrysogenumATCC48272，基利支頂孢ATCC20338或鐮孢屬，如尖孢鐮孢IFO4471；或其表現(xiàn)出蛋白酶活性的突變體或變體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶是植物蛋白酶。源自植物的蛋白酶的例子是得自瓜果果肉的蛋白酶(Kaneda等，J.Biochem，78，1287-1296(1975))。術(shù)語(yǔ)動(dòng)物包括所有動(dòng)物，包括人。動(dòng)物的例子有非-反芻動(dòng)物和反芻動(dòng)物，如奶牛，綿羊和馬。在特定的實(shí)施方案中，動(dòng)物是非-反芻動(dòng)物。非-反芻動(dòng)物包括單胃動(dòng)物，如豬(包括但不限于小豬，處于生長(zhǎng)期的豬和大母豬)；家禽，如火雞和雞(包括但不限于適于烤焙的小雞，蛋雞)；小牛；和魚(包括但不限于鮭魚)。術(shù)語(yǔ)飼料或飼料組合物指的是適于或給動(dòng)物攝入的任何化合物，制劑，混合物或組合物。在本發(fā)明的應(yīng)用中，可在喂食之前，之后或同時(shí)給動(dòng)物飼喂蛋白酶。優(yōu)選在喂食之后飼喂蛋白酶。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)酸-穩(wěn)定性指的是于37℃，在下列緩沖液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，pH3.5中保溫2小時(shí)之后，稀釋度相當(dāng)于A280＝1.0的純蛋白酶的蛋白酶活性至少為參照活性的40％，所述活性是使用本文實(shí)施例2C中所述的檢測(cè)法測(cè)定的(底物Suc-AAPF-pNA，pH9.0，25℃)。在上述酸-穩(wěn)定性定義的特定實(shí)施方案中，蛋白酶活性至少為參照活性的45，50，55，60，65，70，75，80，85或至少為參照活性的90％。術(shù)語(yǔ)參照活性指的是稀釋度相當(dāng)于A280＝1.0的純品形式的相同蛋白酶于5℃，在下列緩沖液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，pH9.0中保溫2小時(shí)之后的蛋白酶活性，其中按上文所述測(cè)定活性。換句話說(shuō)，測(cè)定酸-穩(wěn)定性的方法包括下列步驟a)將待測(cè)的蛋白酶樣品(純品形式，A280＝1.0)分成兩等份(I和II)；b)于37℃，pH3.5將等份I保溫2小時(shí)；c)測(cè)定等份I的殘留活性(pH9.0和25℃)；d)于5℃，pH9.0將等份II保溫2小時(shí)；e)測(cè)定等份II的殘留活性(pH9.0和25℃)；f)計(jì)算相對(duì)于等份II之殘留活性的等份I殘留活性的百分比?；蛘撸谏鲜鏊?穩(wěn)定性定義中，步驟b)緩沖液的pH值可以是2.0，2.5，3.0，3.1，3.2，3.3或3.4。在與上述可替換的步驟b)緩沖液的pH值相關(guān)的上述酸-穩(wěn)定性定義的其它可替換的實(shí)施方案中，與參照活性相比，殘留的蛋白酶活性至少為5，10，15，20，25，30，35，40，45或至少為50％。在其它實(shí)施方案中，步驟d)緩沖液的pH值可以是6.0，6.5，7.0，7.5，8.0或8.5。在上述酸-穩(wěn)定性定義中，術(shù)語(yǔ)A280＝1.0指的是在光程長(zhǎng)度為1cm的樣品池中，280nm下相對(duì)于緩沖液空白對(duì)照的光吸收值為1.0時(shí)的所述純蛋白酶濃度(稀釋度)。在上述酸-穩(wěn)定性定義中，術(shù)語(yǔ)純蛋白酶指的是A280/A260的比率大于或等于1.70(見實(shí)施例2E)，且通過(guò)掃描經(jīng)考馬斯-染色的SDS-PAGE凝膠測(cè)得其掃描強(qiáng)度至少約為對(duì)應(yīng)于所述蛋白酶之帶的掃描強(qiáng)度的95％(見實(shí)施例2A)的樣品?；蛘?，A280/A260的比率大于或等于1.50，1.60，1.65，1.70，1.75，1.80，1.85，或大于或等于1.90。然而，對(duì)于本發(fā)明的應(yīng)用而言，蛋白酶不必是純的；它可以例如包括其它酶，甚至其它蛋白酶，此時(shí)可將其稱為蛋白酶制品。然而，明確定義的蛋白酶制品是有利的。例如，正確確定飼料中的蛋白酶劑量則要容易得多，所述蛋白酶基本上不含干擾的或污染的其它蛋白酶。術(shù)語(yǔ)正確確定劑量特指獲得持久不變的結(jié)果的目的，和基于所需結(jié)果最優(yōu)化劑量的能力。在特定的實(shí)施方案中，明確定義了添加至飼料中的，或包含在飼料添加劑中的蛋白酶。明確定義指的是經(jīng)大小排阻層析測(cè)定，蛋白酶制品至少為50％純(見實(shí)施例12)。在其它特定的實(shí)施方案中，經(jīng)此方法測(cè)定，蛋白酶制品至少為60，70，80，85，88，90，92，94純或至少為95％純。在其它實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)明確定義指的是蛋白酶制品在適當(dāng)大小排阻柱上的分級(jí)分離僅顯示出一個(gè)主要的蛋白酶成分。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道如何選擇適當(dāng)?shù)拇笮∨抛鑼游鲋?。起初可以在例如AmershamPharmaciaBiotech的Hiload26/60Superdex75pg柱上分級(jí)分離蛋白酶制品(見實(shí)施例12)。如果不能清楚地分開峰，可以嘗試不同的柱(例如改變柱顆粒的大小和/或柱的長(zhǎng)度)，和/或改變樣品的體積。通過(guò)簡(jiǎn)單而常用的嘗試法，可以選擇出具有足夠分辨率(能清楚地分開峰)的柱，以此為基礎(chǔ)，按實(shí)施例12所述進(jìn)行純度的計(jì)算。蛋白酶制品可以(a)直接加入飼料中(或直接用于植物蛋白質(zhì)的處理方法)，或(b)用于生產(chǎn)一種或多種隨后要添加至飼料中(或用于處理方法)的中間體組合物，如飼料添加劑或預(yù)混物。上文所述的純度指的是上述(a)或(b)用途中的原始蛋白酶制品的純度。使用重組生產(chǎn)方法可以特別地獲得純度為此數(shù)量級(jí)的蛋白酶制品，而當(dāng)通過(guò)傳統(tǒng)的發(fā)酵法生產(chǎn)蛋白酶時(shí)，獲得它們卻并非易事，而且批與批之間的變化較大。當(dāng)然可以將這種蛋白酶制品與其它酶混合。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的蛋白酶除了具有酸-穩(wěn)定性外，還具有接近中性的pH-活性最適值。術(shù)語(yǔ)接近中性的pH-活性最適值指的是下列一個(gè)或多個(gè)pH-最適值范圍為pH6.0-11.0，或pH7.0-11.0，或pH6.0-10.0，或pH7.0-10.0，或pH8.0-11.0，或pH8.0-10.0(參見本文實(shí)施例2B和7以及圖2和5)。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明所用的蛋白酶除了具有酸-穩(wěn)定性外，還具有熱穩(wěn)定性。術(shù)語(yǔ)熱穩(wěn)定性指的是下列一個(gè)或多個(gè)溫度最適值至少為50℃，52℃，54℃，56℃，58℃，60℃，62℃，64℃，66℃，68℃，或至少為70℃，參見本文實(shí)施例2D和7以及圖3和6。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，根據(jù)本文實(shí)施例4的體外模型，本發(fā)明所用的蛋白酶能溶解植物蛋白質(zhì)。本文所用術(shù)語(yǔ)植物蛋白質(zhì)指的是包括至少一種得自或源自植物的蛋白質(zhì)，包括經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)衍生物的任何化合物，組合物，制品或混合物。在特定的實(shí)施方案中，植物蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)含量至少為10，20，30，40，50或60％(w/w)。植物蛋白質(zhì)可得自植物蛋白質(zhì)來(lái)源，例如豆類和谷類，例如豆科(Fabaceae)，十字花科(Cruciferaceae)，藜科(Chenopodiaceae)，禾本科(Poaceae)的植物材料，如大豆粉，羽扇豆粉和油菜籽粉。在特定的實(shí)施方案中，植物蛋白質(zhì)來(lái)源是豆科的一種或多種植物，如大豆，羽扇豆，豌豆或蠶豆的材料。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，植物蛋白質(zhì)來(lái)源是藜科的一種或多種植物，如甜菜，糖用甜菜，菠菜或奎奴亞藜的材料。植物蛋白質(zhì)來(lái)源的其它例子是油菜籽和甘藍(lán)。大豆是優(yōu)選的植物蛋白質(zhì)來(lái)源。植物蛋白質(zhì)來(lái)源的其它例子是谷類植物，如大麥，小麥，黑麥，燕麥，玉米，水稻和高粱。根據(jù)本發(fā)明，用至少一種酸-穩(wěn)定性枯草蛋白酶家族的蛋白酶處理植物蛋白質(zhì)，導(dǎo)致植物蛋白質(zhì)的溶解性增加。以下是使用本發(fā)明的蛋白酶可以獲得的溶解蛋白質(zhì)的百分比至少為76.8％，77.0％，77.2％，77.4％，77.6％，77.8％，78.0％，78.2％，78.4％，78.6％或至少為78.8％，參見本文實(shí)施例4的體外模型。術(shù)語(yǔ)溶解蛋白質(zhì)基本上指將蛋白質(zhì)釋放至溶液中。這種溶解可能是在蛋白酶的介導(dǎo)下，從通常為復(fù)合的天然組合物，如飼料的其它成分中釋放出蛋白質(zhì)而引起的。溶解可被測(cè)定為相對(duì)于未經(jīng)蛋白酶處理的樣品而言，可溶性蛋白質(zhì)量的增加(參見本文實(shí)施例4)。在處理方法的特定實(shí)施方案中，所述蛋白酶影響，或作用于植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來(lái)源，或?qū)λ鼈儼l(fā)揮其溶解作用。為此，一般將植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來(lái)源懸浮于溶劑，如含水溶劑，如水中，并根據(jù)所述酶的特征調(diào)節(jié)pH和溫度值。例如，可在使實(shí)際蛋白酶的相對(duì)活性至少為50，或60，或70，或80或90％的pH值下進(jìn)行處理。類似地，例如，可在使實(shí)際蛋白酶的相對(duì)活性至少為50，或60，或70，或80或90％(本文實(shí)施例2中定義了這些相對(duì)活性)的溫度下進(jìn)行處理。繼續(xù)進(jìn)行酶反應(yīng)，直至獲得所需結(jié)果，然后，通過(guò)例如經(jīng)熱-處理步驟滅活酶，終止或不終止酶反應(yīng)。在本發(fā)明處理方法的另一個(gè)特定實(shí)施方案中，蛋白酶的作用是持久的，這意味著例如蛋白酶被加入到植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來(lái)源中，但其溶解作用可以說(shuō)并未啟動(dòng)，直至后來(lái)在需要時(shí)，一旦建立適當(dāng)?shù)娜芙鈼l件，或一旦滅活任何酶抑制劑，或使用任何其它方法延遲酶的作用時(shí)才被啟動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，處理是對(duì)動(dòng)物飼料或動(dòng)物飼料中所用的植物蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，即在攝入前溶解蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)改善動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值指的是改善蛋白質(zhì)的可利用性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取物增加，蛋白質(zhì)產(chǎn)量提高，和/或蛋白質(zhì)的利用情況有所改善。因此增加飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善動(dòng)物的生長(zhǎng)速率和/或體重的增加和/或飼料的轉(zhuǎn)化(即相對(duì)于增加的體重而言所攝取飼料的重量)。在特定的實(shí)施方案中，與對(duì)照相比，重量至少增加101％，102％，103％，104％，105％，106％或至少增加106.6％(參見本文實(shí)施例10)。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，飼料轉(zhuǎn)化至多為(或不超過(guò))99％，98％，97.5％，97％，或至多為96.6％。這等同于飼料轉(zhuǎn)化高達(dá)99％，98％，97.5％，97％，或高達(dá)96.6％。同樣也可參照本文實(shí)施例10(與對(duì)照相比)?？梢匀魏涡问皆陲暳现屑尤氲鞍酌福龅鞍酌甘窍鄬?duì)較純的蛋白酶，或者與欲添加至動(dòng)物飼料中的其它成分相混合，即為動(dòng)物飼料添加劑的形式，如所謂的動(dòng)物飼料預(yù)混物。動(dòng)物飼料添加劑除了酸-穩(wěn)定性的枯草蛋白酶家族蛋白酶外，本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑還含有至少一種脂溶性維生素，和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種痕量礦物質(zhì)，和/或至少一種宏量礦物質(zhì)。另外，任選的飼料-添加劑成分有生色劑，芳香化合物，穩(wěn)定劑和/或至少一種選自下列的其它酶植酸酶EC3.1.3.8或3.1.3.26；木聚糖酶EC3.2.1.8；半乳聚糖酶EC3.2.1.89；和/或β-葡聚糖酶EC3.2.1.4(EC指的是源自NC-IUBMB的酶名稱1992版，1992)，也可參見環(huán)球網(wǎng)(www)，網(wǎng)址為http∥www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。在特定的實(shí)施方案中，明確限定了這些其它酶(如同上文對(duì)蛋白酶制品所作的限定和舉例那樣，參見實(shí)施例12)。通常，脂溶性和水溶性維生素以及痕量礦物質(zhì)形成所謂的欲添加至飼料中的預(yù)混物的一部分，而宏量礦物質(zhì)通常被單獨(dú)加入到飼料中。當(dāng)加入本發(fā)明的酸-穩(wěn)定性蛋白酶時(shí)，這些組合物類型中的任一種都是本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑。在特定的實(shí)施方案中，動(dòng)物的食物或飼料中欲包含(或按規(guī)定必須包含)本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑，所述添加劑的水平為0.01-10.0％；更特別地為0.05-5.0％；或0.2-1.0％(％指的是每100克飼料中添加劑的克數(shù))。預(yù)混物中更是如此。因此，通過(guò)將相同成分在飼料中的終濃度分別乘以10-10000；20-2000；或100-500(指的是上述3個(gè)百分比包含的區(qū)間)，即可得出動(dòng)物飼料添加劑，如預(yù)混物中各個(gè)成分的濃度。下表A中顯示了各個(gè)飼料成分和飼料添加劑成分合乎需要的終濃度，即在飼料中的濃度。以下是這些成分實(shí)例非-排他性的列表脂溶性維生素的例子有維生素A，維生素D3，維生素E和維生素K，例如維生素K3。水溶性維生素的例子有維生素B12，生物素和膽堿，維生素B1，維生素B2，維生素B6，煙酸，葉酸和泛酸鹽，如D-泛酸鈣。痕量礦物質(zhì)的例子有錳，鋅，鐵，銅，碘，硒和鈷。宏量礦物質(zhì)的例子有鈣，磷和鈉。下表A中列出了對(duì)這些成分的營(yíng)養(yǎng)需求-以家禽和小豬/豬舉例。營(yíng)養(yǎng)需求指的是應(yīng)該在食物中提供所示濃度的這些成分。這些數(shù)據(jù)匯編自NRC，豬的營(yíng)養(yǎng)需求，第9次修訂版，1988，國(guó)立研究委員會(huì)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)委員會(huì)豬營(yíng)養(yǎng)學(xué)小組委員會(huì)。NationalAcademyPress，Washington.D.C.1988；和NRC，家禽的營(yíng)養(yǎng)需求，第9次修訂版，1994，國(guó)立研究委員會(huì)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)委員會(huì)家禽營(yíng)養(yǎng)學(xué)小組委員會(huì)。NationalAcademyPress，Washington，D.C.1994。在可替換的實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物飼料添加劑含有至少一種表A中特指的單個(gè)成分。至少一種指的是一種，或兩種，或三種，或四種，依此類推直至所有13種，或所有15種單個(gè)成分中的一種或多種。更具體地，在本發(fā)明的添加劑中包含至少一種單個(gè)成分，所述成分的量能使其在飼料中的濃度處于表A第4欄，或第5欄，或第6欄所示的范圍之內(nèi)。如上文所解釋的，通過(guò)將這些范圍的區(qū)限乘以10-10000；20-2000；或100-500，即可得出相應(yīng)的飼料添加劑的濃度。例如，考慮到維生素A的預(yù)混含量對(duì)應(yīng)于10-10000IU/kg的飼料-含量，此運(yùn)算會(huì)產(chǎn)生下列區(qū)間100-108IU；或200-2×107IU；或1000-5×106IU/kg添加劑。表A營(yíng)養(yǎng)需求-和優(yōu)選范圍動(dòng)物飼料組合物動(dòng)物飼料組合物或食物具有相對(duì)較高的蛋白質(zhì)含量。根據(jù)上文所述的國(guó)立研究委員會(huì)(NRC)出版物，家禽和豬的食物具有下表B第2-3欄所示的特征。魚食具有表B第4欄所示的特征。另外，這種魚食通常具有的粗脂肪含量為200-310g/kg。以鮭魚食舉例說(shuō)明這些魚食，所述魚食是在Aquaculture，principlesandpractices，T.VR.Pillay編，BlackwellScientificPublicationsLtd.1990；Fishnutrition，第2版，JohnE.Halver編，AcademicPressInc.1989的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的。本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物的粗蛋白含量為50-800g/kg，另外還含有至少一種本文所要求的蛋白酶。另外，或者在(上述粗蛋白含量的)替代實(shí)施方案中，本發(fā)明動(dòng)物飼料組合物所具有的可代謝能量的含量為10-30MJ/kg；和/或鈣含量為0.1-200g/kg；和/或可利用的磷的含量為0.1-200g/kg；和/或甲硫氨酸的含量為0.1-100g/kg；和/或甲硫氨酸加半胱氨酸的含量為0.1-150g/kg；和/或賴氨酸的含量為0.5-50g/kg。在特定的實(shí)施方案中，可代謝能量，粗蛋白，鈣，磷，甲硫氨酸，甲硫氨酸加半胱氨酸，和/或賴氨酸的含量在下表B的范圍2，3，4或5(R.2-5)的任一個(gè)之內(nèi)。如AnimalNutrition，第4版，第13章(P.McDonald，R.A.Edwards和J.F.D.Greenhalgh編，LongmanScientificandTechnical，1988，ISBN0-582-40903-9)所述，粗蛋白被計(jì)算為氮(N)乘以系數(shù)6.25，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。通過(guò)Kjeldahl法(A.O.A.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis14thed.，AssociationofOfficialAnalyticalChemists，WashingtonDC)測(cè)定氮含量?？稍贜RC出版物NutrientRequirementsofSwine(1988)pp.2-6和EuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs，Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension，7361DABeekbergen，TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv，Wageningen.ISBN90-71463-12-5的基礎(chǔ)上計(jì)算出可代謝的能量?？稍陲暳媳淼幕A(chǔ)上計(jì)算出全部的動(dòng)物食物中鈣，可利用的磷和氨基酸的食物含量，所述飼料表如Veevoedertable1997，gegevensoverchemischesamenstelling，verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen，CentralVeevoederbureau，Runderweg6，8219pkLelystad.ISBN90-72839-13-7。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物含有至少一種如上文所定義的植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來(lái)源。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的動(dòng)物飼料組合物含有0-80％玉米；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麥；和/或0-70％大麥；和/或0-30％燕麥；和/或0-40％豆粉；和/或0-10％魚粉；和/或0-20％乳清。例如，可將動(dòng)物食物制備成搗碎的飼料(非-粒狀)或粒狀飼料。一般將磨碎的飼料相混合，再根據(jù)所需類別的詳細(xì)說(shuō)明添加足夠量的必需維生素和礦物質(zhì)。加入固體或液體酶制劑。例如，一般在混合步驟之前或之中加入固體酶制劑；一般在成粒步驟之后加入液體酶制品。也可以將酶摻入飼料添加劑或預(yù)混物中。食物中最終的酶濃度范圍為0.01-200mg酶蛋白質(zhì)/kg食物，例如5-30mg酶蛋白質(zhì)/kg動(dòng)物食物。實(shí)施例11中顯示了動(dòng)物飼料組合物的例子。表B動(dòng)物食物中能量，蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)的數(shù)值范圍在本發(fā)明處理植物蛋白質(zhì)的方法的特定實(shí)施方案中，還包括另一個(gè)步驟，即加入植酸酶。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，除了聯(lián)合使用植酸酶和蛋白酶進(jìn)行處理以外，也可以加入其它酶，其中這些酶選自含有其它蛋白酶，植酸酶，脂解酶和葡糖苷酶/糖酶的組。WO95/28850中描述了這些酶的例子。當(dāng)然，應(yīng)該使用有效量的蛋白酶，即所述量足以改善飼料的溶解性和/或改善飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前，希望以下列的一種或多種量(劑量范圍)使用酶0.01-200；或0.01-100；或0.05-100；或0.05-50；或0.10-10，所有這些范圍皆為每kg飼料中蛋白酶的mg數(shù)(ppm)。為了測(cè)定每kg飼料中蛋白酶的mg數(shù)，從飼料組合物中純化出蛋白酶，使用相關(guān)測(cè)定法(參見蛋白酶活性，底物和測(cè)定法一節(jié))測(cè)定純化蛋白酶的比活。也使用相同的測(cè)定法測(cè)定所述飼料組合物的蛋白酶活性，在這兩個(gè)測(cè)定結(jié)果的基礎(chǔ)上，計(jì)算出以每kg飼料中所含蛋白酶的mg數(shù)計(jì)的劑量。使用相同的原理測(cè)定飼料添加劑中蛋白酶的mg數(shù)。當(dāng)然，如果可獲得制備飼料添加劑或飼料所用的蛋白酶樣品，可測(cè)定該樣品的比活(而不必從飼料組合物或添加劑中純化蛋白酶)。很多植物含有抗-營(yíng)養(yǎng)因子，如凝集素和胰蛋白酶抑制劑。最重要的大豆抗-營(yíng)養(yǎng)因子是凝集素大豆凝集素(SBA)和大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)。凝集素是以相當(dāng)強(qiáng)的特異性與特定的含糖分子結(jié)合的蛋白質(zhì)，當(dāng)其被消化時(shí)，可與小腸上皮結(jié)合。這可能導(dǎo)致上皮細(xì)胞的存活力下降，從而使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的吸收減少。SBA是糖基化的四聚體凝集素，其亞單位的分子量約為30kDa，并對(duì)N-乙酰半乳糖胺具有高親和力。胰蛋白酶抑制劑影響小腸蛋白酶解，降低其消化蛋白質(zhì)的能力，也會(huì)使胰腺分泌的消化酶增加，導(dǎo)致以消化酶的形式損失氨基酸。胰蛋白酶抑制劑的例子有Bowman-Birk抑制劑，其分子量約為8kDa，含有7個(gè)二硫鍵，并具有兩個(gè)特異于胰蛋白酶-樣和胰凝乳蛋白酶-樣蛋白酶的抑制性環(huán)。其它例子有所謂Kunitz抑制劑因子(例如大豆Kunitz胰蛋白酶抑制劑，其含有一個(gè)胰蛋白酶-樣蛋白酶的結(jié)合位點(diǎn)，分子量約為20kDa)。已證實(shí)本發(fā)明所用的蛋白酶可以水解抗-營(yíng)養(yǎng)因子，如SBA凝集素，胰蛋白酶抑制劑BowmanBirk抑制劑和大豆Kunitz因子。參見實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)部分。因此，本發(fā)明還涉及酸-穩(wěn)定性蛋白酶水解，或減少抗-營(yíng)養(yǎng)因子的量的用途，所述抗-營(yíng)養(yǎng)因子如SBA凝集素和胰蛋白酶抑制劑，如BowmanBirk抑制劑和Kunitz因子，如大豆Kunitz因子。實(shí)施例1篩選酸-穩(wěn)定性蛋白酶分析多種蛋白酶在pH3時(shí)的穩(wěn)定性，目的是鑒定出具有必要的穩(wěn)定性，從而能流經(jīng)單胃動(dòng)物酸性胃的蛋白酶。通過(guò)常規(guī)的層析法，如離子交換層析，疏水作用層析和大小排阻層析(參見例如ProteinPurification，Principles，HighResolutionMethods，andApplications，Jan-ChristerJanson，LarsRyden編，VCHPublishers，1989)純化蛋白酶。按下述測(cè)定蛋白酶活性于25℃，pH9.5中將蛋白酶與1.67％Hammarsten酪蛋白保溫30分鐘，然后加入TCA(三氯醋酸)至終濃度為2％(w/w)，過(guò)濾混合物以除去沉淀物，分析濾液的游離一級(jí)氨基(在基于OPA(鄰苯二醛)的比色試驗(yàn)中，通過(guò)使用絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定340nm處的光吸收值來(lái)進(jìn)行檢測(cè)(BiochemischeTaschenbuchteilII，Springer-Verlag(1964)，p.93和p.102))。一個(gè)酪蛋白蛋白酶單位(CPU)被定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下，即25℃和pH9.5，每分鐘釋放1mmolTCA-可溶性一級(jí)氨基所需酶的量。用水將蛋白酶稀釋至活性為0.6CPU/l，分成兩等份，然后分別用100mM檸檬酸鹽緩沖液，pH3和100mM磷酸鹽緩沖液，pH7將每等份進(jìn)一步稀釋至0.3CPU/l。將稀釋的樣品置于37℃保溫1小時(shí)，將20μl樣品上樣于含有1％脫脂奶的1％瓊脂糖平板的孔中。37℃保溫平板(pH7.0)過(guò)夜，測(cè)量清亮的區(qū)域。在此試驗(yàn)中，42種蛋白酶表現(xiàn)較好。已鑒定出其中的多種蛋白酶，參見實(shí)施例2，6，7和8。這些蛋白酶都屬于絲氨酸蛋白酶的枯草蛋白酶家族。實(shí)施例2得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的枯草蛋白酶的鑒定和比較研究按WO93/24623的實(shí)施例1所述，制備得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶。鑒定的目的是研究它們相對(duì)于Sub.Novo，Sub.Novo(Y217L)和SAVINASETM而言的pH-穩(wěn)定性，pH-活性和溫度-活性分布圖。Sub.Novo是得自解淀粉芽孢桿菌的枯草蛋白酶，而Sub.Novo(Y217L)是其突變體，該突變體公開于WO96/05739中。使用常規(guī)方法從野生型菌株的培養(yǎng)物中制備和純化Sub.Novo，并按照EP130756的實(shí)施例1-2和15-16所述制備突變體。SAVINASETM是得自克勞氏芽孢桿菌(以前是遲緩芽孢桿菌NCIB10309)的枯草蛋白酶，可購(gòu)自丹麥，NovozymesA/S，Krogshoejvej，DK-2880Bagsvaerd。美國(guó)專利號(hào)3723250中描述了它的制備。實(shí)施例2A測(cè)定蛋白酶樣品的SDS-PAGE純度通過(guò)下列方法測(cè)定蛋白酶樣品的SDS-PAGE純度在置于冰上的Eppendorf管中混合40μl蛋白酶溶液(A280濃度＝0.025)與10μl50％(w/v)TCA(三氯醋酸)。在冰上放置半小時(shí)之后，離心Eppendorf管(5分鐘，0℃，14,000×g)，小心取出上清液。在沉淀中加入20μlSDS-PAGE樣品緩沖液(200μlTris-甘氨酸SDS樣品緩沖液(2×)(125mMTris/HCl，pH6.8，4％(w/v)SDS，50ppm溴酚藍(lán)，20％(v/v)甘油，得自NOVEXTM的LC2676)+160μl蒸餾水+20μlβ-巰基乙醇+20μl3M未緩沖的TrisBase(SigmaT-1503))，將管煮沸3分鐘。短暫離心Eppendorf管，將10μl樣品上樣于得自NOVEXTM的4-20％梯度Tris-甘氨酸預(yù)制凝膠(基于Laemmli化學(xué)的聚丙烯酰胺梯度凝膠，但凝膠中不含SDS(Laemmli，U.K.，(1970)自然，vol.227，pp.680-685)，EC60255)。在兩種緩沖液的槽中，用Tris-甘氨酸電泳緩沖液(2.9gTrisBase，14.4g甘氨酸，1.0gSDS，加蒸餾水至1升)，以150V的恒定電壓進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)示蹤染料到達(dá)凝膠的底部。電泳之后，通過(guò)緩慢振蕩，用100ml蒸餾水將凝膠浸洗3次，每次5分鐘。然后用Gelcode_BlueStainReagent(得自PIERCE的膠狀ComassieG-250產(chǎn)品，PIERCE目錄號(hào)為24592)緩慢振蕩凝膠1小時(shí)，再用蒸餾水緩慢振蕩清洗8至16小時(shí)，其間更換幾次蒸餾水。最后，在兩片玻璃紙之間干燥凝膠。用裝配有Fotolook95v2.08軟件，得自AGFA的ArcusII掃描儀掃描干燥的凝膠，并通過(guò)具有下列(Fotolook95v2.08)設(shè)置的File/Acquire命令，將掃描圖像引入Windows介面下的圖像評(píng)價(jià)軟件CREAMTM(目錄號(hào)990001和990005，Kem-En-Tec，丹麥)Original＝Reflective，Mode＝ColorRGB，Scanresolution＝240ppi，Outputresolution＝1201pi，Scalefactor＝100％，Range＝HistogramwithGlobalselection和Min＝0和Max＝215，ToneCurve＝None，Sharpness＝None，Descreen＝None和Flavor＝None，從而產(chǎn)生SDS-PAGE凝膠的*.img圖形文件，用于在CREAMTM中進(jìn)行評(píng)價(jià)。用菜單命令A(yù)nalysis/1-D評(píng)價(jià)*.img圖形文件。用LanePlaceTool將兩條掃描線置于*.img圖形文件上一條為樣品掃描線，一條為背景掃描線。將樣品掃描線置于自上樣狹槽最下方至溴酚藍(lán)示蹤染料位置最上方的樣品泳道(含所述蛋白酶)的中間。將背景掃描線置于與樣品掃描線平行的位置，但此位置是圖形化的SDS-PAGE凝膠上沒有上樣樣品的位置，背景掃描線的起點(diǎn)和終點(diǎn)垂直于樣品掃描線的起點(diǎn)和終點(diǎn)。背景掃描線代表真實(shí)的凝膠背景。掃描線的寬度和外形未經(jīng)調(diào)節(jié)。用具有中度敏感性的1-D/Scan菜單命令紀(jì)錄沿著掃描線的強(qiáng)度。使用1-D/Editor菜單命令，從樣品掃描中扣除背景掃描。然后選擇1-D/Results菜單命令，將通過(guò)CREAMTM軟件計(jì)算出的蛋白酶峰面積的百分比用作蛋白酶的SDS-PAGE純度。獲得下列結(jié)果實(shí)施例2BpH-活性試驗(yàn)使用Suc-AAPF-pNA(Sigma_S-7388)獲得pH-活性分布圖。試驗(yàn)緩沖液100mM琥珀酸(Merck1.00682)，100mMHEPES(SigmaH-3375)，100mMCHES(SigmaC-2885)，100mMCABS(C-5580)，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)至pH值為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0或11.0。檢測(cè)溫度25℃。在各個(gè)pH值下，將300μl蛋白酶樣品(用0.01％Triton_X-100稀釋)與1.5ml試驗(yàn)緩沖液混合，使混合物的pH達(dá)到試驗(yàn)緩沖液的pH。通過(guò)加入1.5mlpNA底物(50mg溶解于1.0mlDMSO中，再用0.01％Triton_X-100稀釋45倍)以開始反應(yīng)，混合之后，用分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)A450的增加，作為在所述pH下蛋白酶活性的測(cè)量結(jié)果。用其它pH值的試驗(yàn)緩沖液重復(fù)進(jìn)行試驗(yàn)，將活性的測(cè)量結(jié)果作圖為針對(duì)pH的相對(duì)活性。用最高活性(pH-最適值)使相對(duì)活性歸一化，即將pH-最適值下的活性設(shè)置為1，或100％。稀釋蛋白酶樣品以確保所有的活性測(cè)量結(jié)果都能落入該試驗(yàn)的劑量-反應(yīng)曲線的線性部分。實(shí)施例2CpH-穩(wěn)定性試驗(yàn)使用Suc-AAPF-pNA(Sigma_S-7388)獲得pH-穩(wěn)定性分布圖。試驗(yàn)緩沖液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)至pH值為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0或11.0。用各個(gè)受試pH值下的試驗(yàn)緩沖液稀釋各個(gè)蛋白酶樣品(溶于1mM琥珀酸，2mMCaCl2，100mMNaCl，pH6.0，A280光吸收值＞10)至A280＝1.0。于37℃將經(jīng)稀釋的蛋白酶樣品保溫2小時(shí)。保溫之后，用100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，pH9.0稀釋蛋白酶樣品，使所有樣品的pH為pH9.0。在以下的活性測(cè)定中，溫度為25℃。將300μl經(jīng)稀釋的蛋白酶樣品與1.5mlpH9.0試驗(yàn)緩沖液混合。通過(guò)加入1.5mlpNA底物(50mg溶解于1.0mlDMSO中，再用0.01％Triton_X-100稀釋45倍)以開始活性反應(yīng)，混合之后，用分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)A450的增加，作為(殘留)蛋白酶活性的測(cè)量結(jié)果。在不同pH-值下進(jìn)行37℃保溫，將活性的測(cè)量結(jié)果作圖為針對(duì)pH的殘留活性。用平行保溫的活性(對(duì)照)使殘留活性歸一化，其中在測(cè)定活性之前用pH9.0的檢測(cè)緩沖液將蛋白酶稀釋至A280＝1.0，5℃保溫2小時(shí)以作為其它的保溫。在測(cè)定活性之前稀釋蛋白酶樣品，以確保所有的活性測(cè)量結(jié)果都能落入該試驗(yàn)的劑量-反應(yīng)曲線的線性部分。實(shí)施例2D溫度-活性試驗(yàn)使用ProtazymeAK片劑獲得溫度分布圖。ProtazymeAK片劑是由Megazyme制備成片劑的經(jīng)azurine染色的交聯(lián)酪蛋白。試驗(yàn)緩沖液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，用NaOH調(diào)節(jié)至pH值為9.0。通過(guò)緩慢攪拌將ProtazymeAK片劑懸浮于2.0ml0.01％Triton_X-100。在Eppendorf管中混合500μl該懸浮液和500μl試驗(yàn)緩沖液，將管置于冰上。加入20μl蛋白酶樣品(用0.01％Triton_X-100稀釋)。通過(guò)將Eppendorf管轉(zhuǎn)移至設(shè)置為檢測(cè)溫度的Eppendorf熱混合儀來(lái)啟動(dòng)試驗(yàn)。在處于最高振蕩速率的Eppendorf熱混合儀上將管保溫15分鐘。通過(guò)將管移回冰浴以終止試驗(yàn)性保溫。在冰冷的離心機(jī)中將管離心幾分鐘，用分光光度計(jì)讀出上清液的A650。在此試驗(yàn)中包括空白緩沖液(替代酶)。A650(蛋白酶)-A650(空白)為蛋白酶活性的測(cè)量結(jié)果。在不同溫度下進(jìn)行試驗(yàn)，將活性的測(cè)量結(jié)果作圖為針對(duì)保溫溫度的相對(duì)活性。用最高活性(溫度最適值)使相對(duì)活性歸一化。稀釋蛋白酶樣品，以確保所有的活性測(cè)量結(jié)果都能落入該試驗(yàn)的劑量-反應(yīng)曲線的接近線性部分。表1為活性最適值(pH-和溫度活性)的一覽表。圖1-3為pH-穩(wěn)定性，pH-活性和溫度-活性的分布圖，表2為蛋白酶在酸性pH-值下的pH-穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的詳細(xì)比較。表1多種蛋白酶的pH-和溫度最適值表2多種蛋白酶在pH2.0至5.0之間的pH-穩(wěn)定性實(shí)施例2E純化的蛋白酶樣品的光吸收純度測(cè)定A280/A260比率按下述測(cè)定純化的蛋白酶樣品的A280/A260比率。A260指的是在光程長(zhǎng)度為1cm的樣品池中，蛋白酶樣品在260nm下相對(duì)于緩沖液空白的光吸收值。A280指的是在光程長(zhǎng)度為1cm的樣品池中，相同蛋白酶樣品在280nm下相對(duì)于緩沖液空白的光吸收值。用緩沖液稀釋實(shí)施例2和6中所得的純化蛋白酶樣品，直至分光光度計(jì)的A280讀數(shù)落入其反應(yīng)曲線的線性部分。由讀數(shù)測(cè)定A280/A260比率。獲得下列結(jié)果實(shí)施例3得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶降解大豆粉(SRM)不溶性部分的能力檢測(cè)得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶使SBM的不溶性/不能被消化的部分靠近消化酶和/或添加的外源性酶的能力。將該蛋白酶的性能與兩種按照WO95/02044所述制備的天冬氨酸蛋白酶，ProteaseI和ProteaseII相比較。所述文獻(xiàn)還公開了這兩種酶在飼料中的用途。ProteaseI是II型曲霉胃蛋白酶(Aspergillopepsin)類蛋白酶，ProteaseII是I型曲霉胃蛋白酶類蛋白酶(它們都是天冬氨酸蛋白酶，即非-枯草蛋白酶類的蛋白酶)，它們皆得自Aspergillusaculeatus(參見上文所述的HandbookofProteolyticEnzymes)。在模擬單胃動(dòng)物消化道(包括在pH2時(shí)用胃蛋白酶處理，在pH7時(shí)用胰酶制劑處理)的過(guò)程中產(chǎn)生了受試底物，即所謂的豆粉殘留物。在用胰酶制劑處理的步驟中，加入了一系列高劑量的商品酶，以降解可靠近現(xiàn)存商品酶的SBM成分。加入以下皆可購(gòu)自丹麥，NovozymesA/S的酶ALCALASETM2.4L，NEUTRASETM0.5L，F(xiàn)LAVOURZYMETM1000L，ENERGEXTML，BIOFEEDTMPlusL，PHYTASENOVOTML。所用SBM是粒狀的飼料用標(biāo)準(zhǔn)48％蛋白質(zhì)SBM。處理后，所得豆粉殘留物中僅剩下5％的總蛋白質(zhì)。FITC標(biāo)記方法隨后，按下述用FITC(MolecularProbes，F(xiàn)-143)標(biāo)記殘留物將豆粉殘留物(濕重為25g，干重約為5g)懸浮于100ml0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9中，40℃攪拌1小時(shí)。使懸浮液冷卻至室溫，黑暗中用5-異硫氰酸熒光素(FITC)處理過(guò)夜。通過(guò)超濾(截留分子量為10,000)除去未結(jié)合的探針。FITC-試驗(yàn)使用下列測(cè)定法，用經(jīng)FITC標(biāo)記的豆粉殘留物檢測(cè)蛋白酶降解豆粉殘留物的能力于37℃混合0.4ml蛋白酶樣品(A280＝0.1)與0.4mlFITC-豆粉殘留物(0.2M磷酸鈉緩沖液pH6.5中的10mg/ml懸浮液)，在0小時(shí)之后，和保溫22小時(shí)之后測(cè)定相對(duì)熒光單位(RFU485/535nm；激發(fā)/監(jiān)測(cè)波長(zhǎng))。測(cè)定RFU之前，以20,000×g離心樣品1分鐘，將250微升上清液轉(zhuǎn)移至黑色的微滴盤中。使用VICTOR1420Multilabel計(jì)數(shù)器(體外，丹麥)進(jìn)行測(cè)定。RFU的一般性描述可參見IainD.Johnson，IntroductiontoFluorescenceTechniques，HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals，MolecularProbes，RichardP.Haugland，第6版，1996(ISBN0-9652240-0-7)。通過(guò)加入0.4ml緩沖液替代酶樣品來(lái)制備空白對(duì)照樣品。RFU樣品＝ΔRFU樣品-ΔRFU空白對(duì)照，其中ΔRFU＝RFU(22小時(shí))-RFU(0小時(shí))所得FITC值(RFU樣品值)示于下表3。FITC值的誤差容限一般為+/-20,000。與ProteaseI和ProteaseII形成對(duì)照的是，得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶能顯著降解豆粉殘留物。表3蛋白酶降解豆粉殘留物的能力實(shí)施例4體外檢測(cè)得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶在自動(dòng)化的體外消化系統(tǒng)(模擬單胃動(dòng)物的消化)中檢測(cè)以下蛋白酶溶解玉米-SBM(玉米-豆粉)蛋白質(zhì)的能力，所述蛋白酶是得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶，和其它枯草蛋白酶，如Sub-Novo，SubNovo(Y217L)，SAVINASETM和ALCALASETM。在缺乏外源性枯草蛋白酶-樣蛋白酶時(shí)保溫玉米-SBM以用作空白對(duì)照。體外系統(tǒng)由30個(gè)燒瓶組成，其中，先將玉米-SBM底物與HCl/胃蛋白酶保溫-模擬胃消化，隨后，與胰酶制劑保溫-模擬腸消化。在胃-保溫期結(jié)束時(shí)，取出體外消化樣品，分析溶解的蛋白質(zhì)。底物使用10g玉米-SBM食物，其中玉米-SBM的比例為6∶4(w/w)。SBM中的蛋白質(zhì)含量為43％(w/w)，玉米粉中的蛋白質(zhì)含量為8.2％(w/w)。10g玉米-SBM食物中的蛋白質(zhì)總量為2.21g。消化酶胃蛋白酶(SigmaP-7000；539U/mg，固體)，胰酶制劑(SigmaP-7545；8xU.S.P(USPharmacopeia))。體外消化方法概況酶蛋白質(zhì)的測(cè)定使用S.C.Gill&PH.vonHippel，AnalyticalBiochemistry182，319-326(1989)概述的原理，基于A280值和氨基酸序列(氨基酸組成)計(jì)算蛋白酶酶蛋白質(zhì)的量。體外模型的實(shí)驗(yàn)方法1.稱取10g底物置于100ml燒瓶中。2.于0分鐘，在燒瓶中邊混合邊加入46ml含胃蛋白酶(3000U/g食物)的HCl(0.1M)和1ml蛋白酶(0.1mg酶蛋白質(zhì)/g食物)。將燒瓶置于40℃下保溫。3.于30分鐘，測(cè)定pH。4.于45分鐘，加入16mlH2O。5.于60分鐘，加入7mlNaOH(0.39M)。6.于90分鐘，加入5ml含胰酶制劑(8.0mg/g食物)的NaHCO3(1M)。7.于120分鐘，測(cè)定pH。8.于300分鐘，測(cè)定pH。9.于330分鐘，取出30ml樣品，置于冰上，然后離心(10000×g，10分鐘，4℃)。取出上清液，儲(chǔ)存于-20℃。通過(guò)凝膠過(guò)濾HPLC估計(jì)溶解的蛋白質(zhì)通過(guò)使用凝膠過(guò)濾HPLC定量粗蛋白(CP)，估計(jì)出體外消化樣品上清液中的溶解蛋白質(zhì)含量。融化上清液，流經(jīng)0.45μm的聚碳酸酯濾器(Sartorius)過(guò)濾，并用H2O稀釋(1∶50，v/v)。通過(guò)使用SuperdexPeptidePE(7.5×300mm)凝膠過(guò)濾柱(Global)的HPLC層析經(jīng)稀釋的樣品。用于等度洗脫的洗脫劑是含有150mMNaCl的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)。每次層析所需洗脫劑的總體積是26ml，流速為0.4ml/min。紀(jì)錄214nm處的洗脫分布圖，通過(guò)積分法測(cè)定分布圖下的總面積。為了由經(jīng)積分的面積估計(jì)蛋白質(zhì)含量，用經(jīng)連續(xù)稀釋的，具有已知總蛋白質(zhì)含量的體外消化玉米-SBM參照樣品繪制出校準(zhǔn)曲線(R2＝0.9993)。通過(guò)Kjeldahl法(測(cè)定氮的百分比；A.O.A.C.(1984)，OfficialMethodsofAnalysis，第14版，WashingtonDC)進(jìn)行該參照樣品的蛋白質(zhì)測(cè)定。結(jié)果下表4顯示了結(jié)果，即多種蛋白酶在體外對(duì)蛋白質(zhì)溶解性的作用。根據(jù)體外消化反應(yīng)過(guò)程中，溶解于總體積為75ml中的10g玉米-SBM食物(2.21g蛋白質(zhì))的蛋白質(zhì)總量，計(jì)算出溶解蛋白質(zhì)的相對(duì)量。假定蛋白質(zhì)完全溶解(100％)，上清液中的蛋白質(zhì)含量將為2.95％(w/v)。通過(guò)單向分析方差(p＝0.0001)來(lái)分析結(jié)果。SD＝標(biāo)準(zhǔn)差；n＝每次處理重復(fù)的次數(shù)(n＝5)。與其它蛋白酶相比，得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)溶解性的作用要好得多。表4A，B，C上標(biāo)子母不相同的值顯者不同(P＜0.05)。實(shí)施例5降解凝集素SBA和大豆Bowman-Birk及Kunitz抑制劑檢測(cè)得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶水解大豆凝集素(SBA)和大豆Bowman-Birk及Kunitz胰蛋白酶抑制劑的能力。于37℃，pH6.5中將純的SBA(Fluka61763)，Bowman-Birk抑制劑(SigmaT-9777)或Kunitz抑制劑(大豆胰蛋白酶抑制劑，BoehringerMannheim109886)與蛋白酶保溫2小時(shí)(蛋白酶∶抗-營(yíng)養(yǎng)因子＝1∶10，基于A280)。保溫緩沖液50mM二甲基戊二酸，150mMNaCl，1mMCaCl2，0.01％TritonX-100，pH6.5。由SDS-PAGE凝膠上本來(lái)有的SBA或胰蛋白酶抑制劑帶的消失，和低分子量降解產(chǎn)物的出現(xiàn)估計(jì)蛋白酶降解SBA和蛋白酶抑制劑的能力。用考馬斯藍(lán)染色凝膠，通過(guò)掃描測(cè)定帶的強(qiáng)度。下表5顯示了結(jié)果，即所降解的抗-營(yíng)養(yǎng)因子的百分比。也期望在保溫豆粉與候選蛋白酶之后，能應(yīng)用Westem技術(shù)，用抗SBA，Bowman-Birk抑制劑或Kunitz抑制劑的抗體估計(jì)蛋白酶降解大豆中的抗-營(yíng)養(yǎng)因子的能力(參見WO98/56260)。表5實(shí)施例6制備其它酸-穩(wěn)定性的枯草蛋白酶制備嗜堿芽孢桿菌蛋白酶將嗜堿芽孢桿菌NCIMB10438的凍干培養(yǎng)物接種于搖瓶中，所述搖瓶各含有100ml具有下列組成的BPX培養(yǎng)基土豆淀粉100g/l，大麥粉50g/l，BAN800MG(得自NovozymesA/S)0.05g/l，酪蛋白酸鈉10g/l，豆粉20g/l，磷酸氫二鈉9g/l，PluronicPE61000.1ml/l，自來(lái)水若干。接種前，用10ml1M碳酸氫三鈉將每個(gè)搖瓶的pH調(diào)節(jié)至9.7。于30℃，以300rpm將菌株發(fā)酵4天。將此培養(yǎng)物接種于含100mlBPX培養(yǎng)基的新?lián)u瓶中發(fā)酵3天。純化在1升燒杯中，以10000×g將培養(yǎng)液離心30分鐘?；旌仙锨逡海ㄟ^(guò)流經(jīng)SeitzK-250縱深濾板(depthfilterplate)進(jìn)行過(guò)濾以進(jìn)一步澄清上清液。通過(guò)在截留分子量為3kDa的聚醚砜盒(Filtron)上進(jìn)行超濾以濃縮已澄清的濾液。將濃縮的酶轉(zhuǎn)移至G25Sephadex柱(AmershamPharmaciaBiotech)上的50mMH3BO3，5mM3，3′-二甲基戊二酸，1mMCaCl2，pH7(緩沖液A)中，并上樣于已用緩沖液A平衡的Bacitracin瓊脂糖柱(UpfrontChromatographyA/S)。用緩沖液A清洗Bacitracin柱以除去未結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后使用添加有25％2-丙醇和1M氯化鈉的緩沖液A從柱上洗脫蛋白酶。集中得自Bacitracin柱的，具有蛋白酶活性的級(jí)分，通過(guò)G25Sephadex層析，將級(jí)分轉(zhuǎn)移至20mMCH3COOH/NaOH，1mMCaCl2，pH5(緩沖液B)中。將緩沖液交換的蛋白酶收集物上樣于已用緩沖液B平衡的SOURCE30S柱(AmershamPharmaciaBiotech)。用緩沖液B清洗SOURCE30S柱，然后用緩沖液B中線性遞增的NaCl梯度(0至0.5M)洗脫蛋白酶。檢測(cè)柱級(jí)分的蛋白酶活性，通過(guò)SDS-PAGE分析含蛋白酶的級(jí)分。集中純的級(jí)分，用于進(jìn)一步鑒定。制備其它酸-穩(wěn)定性枯草蛋白酶按照上文關(guān)于制備得自嗜堿芽孢桿菌NCIMB10438的蛋白酶的一般性描述，使用常規(guī)方法制備尖孢鐮孢(FusariumOxysporum)IFO4471，嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)NCIMB10438，PaecilomyceslilacinusCBS102449，曲霉屬菌種(Aspergillussp.)CBS102448，AcremoniumchrysogenumATCC48272和基利支頂孢(Acremoniumkiliense)ATCC20338的蛋白酶。序列測(cè)定下列部分氨基酸序列SEQTDNO1得自AcremoniumchrysogenumATCC48272的蛋白酶的N-末端ALVTQNGAPWGLGTISHRQPGSTSYIY；SEQIDNO2得自嗜堿芽孢桿菌NCIMB10438的蛋白酶的N-末端NQVTPWGITRVQAPTAW；SEQIDNO3得自PaecilomyceslilacinusCBS102449的蛋白酶的N-末端AYTQQPGAPWGLGRISH；SEQIDNO4得自尖孢鐮孢IFO4471的蛋白酶的N-末端ALTTQSGATWGLGTVSHRSRGS。得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶的氨基酸序列，即本文中的SEQIDNO5先前已被測(cè)定(參見美國(guó)專利5650326，SEQIDNO4，6和8)。在公開的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索相關(guān)序列，揭示出以下結(jié)果SEQIDNO6Geneseqp/r65936(指的是EP6236/2甲的得自Paecilo-myceslilacinusCBS143.75的蛋白酶)-與SEQIDNO3相關(guān)；SEQIDNO7Geneseqp/r74334(指的是JP-07095882中的得自芽孢桿菌屬菌種THS-1001的蛋白酶)-與SEQIDNO2相關(guān)。根據(jù)有關(guān)用于專利程序的微生物保藏的國(guó)際認(rèn)可的布達(dá)佩斯條約，按下述將Paecilomyceslilacinus和曲霉屬菌種的菌株保藏于荷蘭的CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)，P.OBox273，3740AGBaam保藏日2000年1月17日CBS保藏號(hào)曲霉屬菌種102448保藏日2000年1月17日CBS保藏號(hào)Paecilomyceslilacinus102449由NovoNordiskA/S進(jìn)行保藏，后來(lái)轉(zhuǎn)讓給了Hoffmann-LaRocheAG。實(shí)施例7其它枯草蛋白酶的鑒定和比較研究制備自嗜堿芽孢桿菌NCIMB10438，尖孢鐮孢IFO4471，PaecilomyceslilacinusCBS102449，曲霉屬菌種CBS102448，AcremoniumchrysogenumATCC48272和基利支頂孢ATCC20338的蛋白酶都是枯草蛋白酶。按實(shí)施例2所述測(cè)定蛋白酶樣品的純度。獲得下列結(jié)果n.d.＝未檢測(cè)測(cè)定法實(shí)施例2中描述了pH-活性，pH-穩(wěn)定性和溫度-活性的測(cè)定法(pNA底物Suc-AAPF-pNA(SigmaS-7388)被用于所有蛋白酶的pH-活性和-穩(wěn)定性分布圖，而ProtazymeAK片劑被用于溫度分布圖)?；钚?pH-和溫度活性)最適值的概況見表6。pH-穩(wěn)定性，pH-活性和溫度-活性的分布圖見圖4-6，蛋白酶在酸性pH-值下pH-穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的詳細(xì)比較見表7。表6多種蛋白酶的pH-和溫度最適值表7多種蛋白酶在pH2.0至5.0之間的pH-穩(wěn)定性實(shí)施例8用鏈霉菌屬枯草蛋白酶抑制劑(SSI)抑制蛋白酶pNA底物抑制后，使用Suc-AAPF-pNA(Sigma_S-7388)測(cè)定殘留活性。試驗(yàn)緩沖液100mM琥珀酸(Merck1.00682)，100mMHEPES(SigmaH-3375)，100mMCHES(SigmaC-2885)，100mMCABS(C-5580)，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，pH9.0。檢測(cè)溫度25℃。通過(guò)層析從白淺灰鏈霉菌FERMP-1205(S-3253)發(fā)酵上清液中純化SSI。所用SSI制品的純度超過(guò)95％-純度是通過(guò)實(shí)施例2A所述的方法測(cè)定的?；蛘?，可從日本的Wako公司獲得SSI，其目錄號(hào)為303-05201，這種SSI是由DaiwaKaseiK.K.生產(chǎn)的(參見例如http∥search.wako-chem.cojp/lifedb_e/lifedocs_e/44834.asp)。在進(jìn)行下述抑制試驗(yàn)之前，用0.01％TritonX-100將SSI稀釋至A280濃度＝0.01。蛋白酶所用蛋白酶的純度超過(guò)95％-純度是通過(guò)實(shí)施例2A所述的方法測(cè)定的。在進(jìn)行下述抑制試驗(yàn)之前，用0.01％TritonX-100將蛋白酶稀釋至A280濃度＝0.010。通過(guò)下列方法測(cè)定鏈霉菌屬枯草蛋白酶抑制劑(SSI)對(duì)蛋白酶的抑制作用。將300μl蛋白酶樣品(A280濃度＝0.010)與300μlSSI(A280濃度＝0.010)和1.5ml試驗(yàn)緩沖液混合。室溫下保溫15分鐘，然后通過(guò)加入1.5mlpNA底物(50mg溶解于1.0mlDMS0中，再用0.01％Triton_X-100稀釋45倍)，混合之后，用分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)A450的增加，從而測(cè)定殘留活性。作為對(duì)照(無(wú)SSI)，使用300μl0.01％TritonX-100替代SSI。用對(duì)照活性(無(wú)SSI)使殘留活性歸一化，即未被SSI抑制給出100％殘留活性，完全被SSI抑制給出0％殘留活性。獲得下列結(jié)果*未測(cè)定實(shí)施例9其它酸-穩(wěn)定性枯草蛋白酶降解大豆粉(SBM)不溶性部分的能力按實(shí)施例3所述，檢測(cè)按實(shí)施例6所述制備的其它酸-穩(wěn)定性枯草蛋白酶使SBM的不溶性/不能被消化的部分靠近消化酶和/或添加的外源性酶的能力。所得結(jié)果示于下表8。為了進(jìn)行比較，將實(shí)施例3中所得的ProteasesI和II的結(jié)果也包括在表8中。表8其它蛋白酶降解豆粉殘留物的能力實(shí)施例10得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的酸-穩(wěn)定性枯草蛋白酶對(duì)適于烤焙的小雞的生長(zhǎng)特性的作用根據(jù)法國(guó)官方指導(dǎo)活動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的說(shuō)明，在Roche動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究中心(CRNA，F(xiàn)-68305Village-Neuf，法國(guó))進(jìn)行試驗(yàn)。性別分離的一日齡小雞(“RossPM3”)由商業(yè)孵化所提供。將小雞圈養(yǎng)在用鐵絲網(wǎng)作地面的多層雞籠中，這些雞籠被置于環(huán)境受控的室內(nèi)。隨意供給飼料和自來(lái)水。第8天，按體重將小雞分組，6只小雞為一組，對(duì)它們進(jìn)行對(duì)照處理，即接受不含酶的實(shí)驗(yàn)食物，或進(jìn)行酶處理，即接受每kg飼料添加100mg芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484蛋白酶酶蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)食物。用12組重復(fù)每種處理，每個(gè)性別6組。在第8和29天給各組稱重。測(cè)定中間期(intermedrateperiod)的飼料消耗，計(jì)算體重增加量和飼料轉(zhuǎn)化率。實(shí)驗(yàn)食物基于以玉米淀粉和豆粉(44％粗蛋白)為主要成分(表9)，所述食物由CRNA生產(chǎn)。在約70℃使飼料成為粒狀(壓模形狀3×20mm)。以固定量的水稀釋適當(dāng)量的芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484蛋白酶，噴灑在粒狀的飼料上。對(duì)對(duì)照處理而言，用相同的方式使用足夠量的水進(jìn)行處理。為了進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)，使用SAS包(SASInstituteInc.，1985)中的GLM程序進(jìn)行方差的雙因子分析(因子處理和性別)。當(dāng)表現(xiàn)出顯著的處理效果(p＜0.05)時(shí)，用Duncan試驗(yàn)分析處理方式之間的差異。由于技術(shù)上的原因，從統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)中排除一籠酶處理。表2中列出了適于烤焙的小雞自第8天至第29天的生長(zhǎng)表現(xiàn)的結(jié)果。在處理和性別之間不存在相互作用，因此，提供了兩種性別合并的總結(jié)果。添加有芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484蛋白酶的實(shí)驗(yàn)食物改善了體重增加，以數(shù)字表示為增加了6.6％。添加蛋白酶也略微增加了飼料攝入(3.1％)。芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484蛋白酶顯著改善了適于烤焙的小雞的飼料轉(zhuǎn)化(3.4％)。考慮到玉米淀粉是很容易消化的成分，可以假定所觀察到的結(jié)果主要是由酶對(duì)豆粉的作用引起的。因此，結(jié)果表明芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484蛋白酶改善了豆粉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值?？傊?，研究表明在含有大量豆粉的小雞飼料中以100mg酶蛋白質(zhì)/kg飼料的量添加芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484蛋白酶可導(dǎo)致體重在數(shù)字上的增加，并能顯著改善飼料轉(zhuǎn)化。參考文獻(xiàn)EEC(1986)DirectivedelaCommissiondu9avril1986fixantlaméthodedecalculdelavaleurénérgetiquedesalimentscomposésdestinésàlavolaille.JournalOfficieldesCommunautésEuropéennes，L130，53-54。SASInstituteInc.(1985)SAS_User’sGuide，Version5Edition.CaryNC。表9實(shí)驗(yàn)食物的組成1所分析的含量90.6％干物質(zhì)，45.3％粗蛋白，2.0％粗脂肪，4.9粗纖維2相當(dāng)于90mg拉沙里菌素-Na/kg飼料作為抗球蟲劑(anticoccidial)3基于所分析的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量進(jìn)行計(jì)算(EC-等式；EEC，1986)飼料成分的供貨商玉米淀粉法國(guó)RoquettesFrères，F(xiàn)-62136Lestrem豆粉44德國(guó)RekasanGmbH，D-07338Kaulsdorf動(dòng)物脂法國(guó)FondoirsGachotSA，F(xiàn)-67100Strasbourg豆油法國(guó)EwocoSarl，F(xiàn)-68970GuemarDL-甲硫氨酸法國(guó)ProduitRocheSA，F(xiàn)-92521Neuilly-sur-SeineMCP法國(guó)BrenntagLorraine，F(xiàn)-54200Toul鹽法國(guó)MinoterieModeme，F(xiàn)-68560Hirsingue結(jié)合劑法國(guó)MinoterieModeme，F(xiàn)-68560Hirsingue預(yù)混物(AMvolchairNS4231)法國(guó)Agrobase，F(xiàn)-01007Bourg-en-BresseAvatec法國(guó)ProduitRocheSA，F(xiàn)-92521Neuilly-sur-Seine表10適于烤焙的小雞自第8天至第29天的表現(xiàn)兩種性別合并的結(jié)果；平均值±st.dev.一行內(nèi)的平均值，如上標(biāo)不同，則平均值顯著不同(p＜0.05)1由于技術(shù)上的原因，從統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)中排除一籠實(shí)施例11用于火雞和屬于鮭科的魚的，添加有酸-穩(wěn)定性枯草蛋白酶的預(yù)混物和食物制備具有下列組成的預(yù)混物(每千克的含量)5000000IE維生素A1000000IE維生素D313333mg維生素E1000mg維生素K3750mg維生素B12500mg維生素B21500mg維生素B67666mg維生素B1212333mg煙酸33333mg生物素300mg葉酸3000mgD-泛酸鈣1666mgCu16666mgFe16666mgZn23333mgMn133mgCo66mgI66mgSe5.8％鈣在此預(yù)混物中加入按實(shí)施例2所述制備的，得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶，加入量相當(dāng)于10g蛋白酶酶蛋白質(zhì)/kg。按下述制備粒狀火雞起始和飼養(yǎng)食物，所述食物具有下表所示的組成(基于Leeson和Summers，1997，但通過(guò)使用最優(yōu)化程序AGROSOFT_重新計(jì)算過(guò)，不含肉粉)，且每kg含100mg蛋白酶酶蛋白質(zhì)在級(jí)聯(lián)混合器中混合磨碎的玉米，豆粉，魚粉和植物油。以10g/kg食物的量加入石灰石，磷酸鈣和鹽，以及上述預(yù)混物，接著進(jìn)行混合。將所得混合物制成粒狀(用蒸汽調(diào)節(jié)，然后進(jìn)行成粒步驟)。也按上文的一般性概述制備鮭魚的兩種食物。實(shí)際的組成示于下表(匯編自Refstie等(1998)，Aquaculture，vol.162，p.301-302)。通過(guò)使用Agrosoft_飼料最優(yōu)化程序重新計(jì)算估計(jì)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量。在食物中加入按實(shí)施例2所述制備的，得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶，加入的量相當(dāng)于每kg食物100mg蛋白酶酶蛋白質(zhì)。實(shí)施例12測(cè)定含蛋白酶的酶產(chǎn)品的純度可通過(guò)基于含蛋白酶的酶產(chǎn)品在大小排阻層析柱上的分級(jí)分離的方法，測(cè)定含蛋白酶的酶產(chǎn)品，例如商購(gòu)的多-組分酶產(chǎn)品之類的蛋白酶制品的純度。大小-排阻層析也被稱為凝膠過(guò)濾層析，它基于多孔的凝膠基質(zhì)(填充于柱中)，其孔徑大小的分布與待分離的蛋白質(zhì)分子的大小相當(dāng)。相對(duì)較小的蛋白質(zhì)分子可從外圍的溶液中擴(kuò)散至凝膠中，而較大的分子因其大小的關(guān)系而不能以相同的程度擴(kuò)散至凝膠中。結(jié)果，根據(jù)大小即可分離蛋白質(zhì)分子，較大的分子比較小的分子先從柱中洗脫出來(lái)。蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定用購(gòu)自PIERCE的BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒(等同于PIERCE目錄號(hào)為23225)測(cè)定含蛋白酶的酶產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)濃度。雙辛可寧酸的鈉鹽(BCA)是穩(wěn)定的水溶性化合物，它能與堿性環(huán)境中的一價(jià)銅離子(Cu1+)形成深紫色復(fù)合物。BCA試劑形成BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒的基礎(chǔ)，該試劑盒能監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)與堿性Cu2+反應(yīng)(Biuret反應(yīng))產(chǎn)生的一價(jià)銅離子。此反應(yīng)產(chǎn)生的顏色是穩(wěn)定的，并且隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，而成比例的加深(Smith，P.K.(1985)，AnalyticalBiochemistry，vol.150，pp.76-85)。BCA工作溶液由50份試劑A與1份試劑B混合而成(試劑A是PIERCE目錄號(hào)23223，它在堿性的碳酸鹽緩沖液中含有BCA和酒石酸鹽；試劑B是PIERCE目錄號(hào)23224，它含有4％CuSO4*5H2O)。將300μl樣品與3.0mlBCA工作溶液混合。于37℃保溫30分鐘，然后將樣品冷卻至室溫，讀出A490值作為樣品中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)量結(jié)果。在試驗(yàn)中包括牛血清白蛋白(PIERCE目錄號(hào)23209)的稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)。樣品預(yù)-處理如果含蛋白酶的酶產(chǎn)品是固體，首先于5℃將產(chǎn)品溶解于/懸浮于20倍體積的100mMH3BO3，10mM3，3′-二甲基戊二酸，2mMCaCl2，pH6(緩沖液A)至少15分鐘，如果此階段的酶是懸浮液，則流經(jīng)0.45μ的濾器以過(guò)濾懸浮液，給出清亮的溶液。從此時(shí)起，溶液即被處理成含蛋白酶的液體酶產(chǎn)品。如果含蛋白酶的酶產(chǎn)品是液體，首先于5℃將產(chǎn)品置于6-8000Da截留分子量的SpectraPor透析管(得自SpectrumMedicalIndustries，目錄號(hào)為132670)，對(duì)著100倍體積的緩沖液A+150mMNaCl(緩沖液B)透析至少5小時(shí)，以除去使含蛋白酶的液體酶產(chǎn)品具有高粘度的制劑化合物，所述化合物對(duì)大小-排阻層析不利。如果在透析過(guò)程中形成沉淀物，則需流經(jīng)0.45μ的濾器以過(guò)濾經(jīng)透析的含蛋白酶的酶產(chǎn)品。用上述蛋白質(zhì)濃度測(cè)定法測(cè)定經(jīng)透析的酶產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)濃度，用緩沖液B稀釋酶產(chǎn)品，得到準(zhǔn)備進(jìn)行大小-排阻層析的，蛋白質(zhì)濃度為5mg/ml的樣品。如果經(jīng)透析的酶產(chǎn)品的蛋白質(zhì)濃度低于5mg/ml，也可以使用。大小-排阻層析用緩沖液B(流速1ml/min)平衡300mlHiLoad26/60Superdex75pg柱(AmershamPharmaciaBiotech)。將1.0ml含蛋白酶的酶樣品上樣于柱，用緩沖液B(流速1ml/min)洗脫柱。從柱的流出液中收集2.0ml級(jí)分，直至所有上樣的樣品都從柱上洗脫下來(lái)。通過(guò)適當(dāng)?shù)臋z測(cè)法分析收集的級(jí)分的蛋白質(zhì)濃度(參見上述蛋白質(zhì)濃度測(cè)定法)和蛋白酶活性。適當(dāng)檢測(cè)法的例子是Suc-AAPF-pNA試驗(yàn)(參見實(shí)施例2B)。其它適當(dāng)?shù)臋z測(cè)法是例如CPU試驗(yàn)(參見實(shí)施例1)和ProtazymeAK試驗(yàn)(參見實(shí)施例2D)。調(diào)節(jié)蛋白酶活性試驗(yàn)的條件，例如pH，以盡可能多地測(cè)定經(jīng)分級(jí)分離的樣品中的蛋白酶。上文所提及的檢測(cè)法的條件是適當(dāng)條件的例子。其它適當(dāng)?shù)臈l件也在上文有關(guān)測(cè)定蛋白酶活性的章節(jié)中提到。將一個(gè)或多個(gè)蛋白酶檢測(cè)法中具有活性的蛋白質(zhì)峰定義為蛋白酶峰。蛋白酶峰純度的計(jì)算方法為用峰中的蛋白質(zhì)量除以所有被鑒定的蛋白酶峰中的總蛋白質(zhì)量。使用上述方法將含蛋白酶的酶產(chǎn)品純度計(jì)算為用酸-穩(wěn)定性蛋白酶峰中的蛋白質(zhì)量除以所有被鑒定的蛋白酶峰中的蛋白質(zhì)量。序列表序列表<110>霍夫曼-拉羅奇有限公司(F.Hoffmann-laRocheAG)<120>酸穩(wěn)定性枯草蛋白酶在動(dòng)物飼料中的用途<130>6092.204-wo<140>DK200000200<141>2000-02-08<160>7<170>PatentInversion3.0<210>1<211>27<212>PRT<213>AcremoniumchrysogenumATCC48272<400>1AlaLeuValThrGlnAsnGlyAlaProTrpGlyLeuGlyThrIleSer151015HisArgGlnProGlySerThrSerTyrIleTyr2025<210>2<211>17<212>PRT<213>嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)NCIMB10438<400>2AsnGlnValThrProTrpGlyIleThrArgValGlnAlaProThrAla151015Trp<210>3<211>17<212>PRT<213>PaecilomyceslilacinusCBS102449<400>3AlaTyrThrGlnGlnProGlyAlaProTrpGlyLeuGlyArgIleSer151015His<210>4<211>25<212>PRT<213>尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)IFO4471<400>4AlaLeuThrThrGlnSerGlyAlaThrTrpGlyLeuGlyThrValSer151015HisArgSerArgGlySer20<210>5<211>397<212>PRT<213>芽孢桿菌屬菌株(Bacillussp.)NCIMB40484<220><221>SIGNAL<222>(1)..(27)<220><221>peptide<222>(118)..(397)<220><221>mat_peptide<222>(28)..()<400>5MetLysPheLysLysIleAlaAlaLeuSerLeuAlaThrSerLeuAla-25-20-15LeuPheProAlaPheGlyGlySerSerLeuAlaLysGluAlaProLys-10-5-115ProPheGlnProIleAsnLysThrLeuAspLysGlyAlaPheGluSer101520GlyGluValIleValLysPheLysAspGlyValSerLysLysAlaGln253035GlySerAlaLeuAsnLysAlaGluAlaAsnGluGlnLysAlaSerAla404550LysAspProPheGlnValLeuGluValAlaAspValAspGlnAlaVal556065LysAlaLeuGluAsnAsnProAsnValGluTyrAlaGluProAsnTyr70758085ThrPheGlnAlaThrTrpSerProAsnAspProTyrTyrSerAlaTyr9095100GlnTyrGlyProGlnAsnThrSerThrProAlaAlaTrpAspValThr105110115ArgGlySerSerThrGlnThrValAlaValLeuAspSerGlyValAsp120125130TyrAsnHisProAspLeuAlaArgLysValIleLysGlyTyrAspPhe135140145IleAspArgAspAsnAsnProMetAspLeuAsnGlyHisGlyThrHis150155160165ValAlaGlyThrValAlaAlaAspThrAsnAsnGlyIleGlyValAla170175180GlyMetAlaProAspThrLysIleLeuAlaValArgValLeuAspAla185190195AsnGlySerGlySerLeuAspSerIleAlaSerGlyIleArgTyrAla200205210AlaAspGlnGlyAlaLysValLeuAsnLeuSerLeuGlyCysGluCys215220225AsnSerThrThrLeuLysSerAlaValAspTyrAlaTrpAsnLysGly230235240245AlaValValValAlaAlaAlaGlyAsnAspAsnValSerArgThrPhe250255260GlnProAlaSerTyrProAsnAlaIleAlaValGlyAlaIleAspSer265270275AsnAspArgLysAlaSerPheSerAsnTyrGlyThrTrpValAspVal280285290ThrAlaProGlyValAsnIleAlaSerThrValProAsnAsnGlyTyr295300305SerTyrMetSerGlyThrSerMetAlaSerProHisValAlaGlyLeu310315320325AlaAlaLeuLeuAlaSerGlnGlyLysAsnAsnValGlnIleArgGln330335340AlaIleGluGlnThrAlaAspLysIleSerGlyThrGlyThrAsnPhe345350355LysTyrGlyLysIleAsnSerAsnLysAlaValArgTyr360365370<210>6<211>367<212>PRT<213>PaecilomyceslilacinusCBS143.75<220><221>peptide<222>(70)..(367)<220><221>peptide<222>(84)..(367)<400>6AlaArgAlaProLeuLeuThrProArgGlyAlaSerSerSerSerThr151015AlaSerThrLeuSerSerSerArgThrAlaCysProSerProLeuSer202530ThrArgLeuSerAlaLeuCysProArgArgProThrAlaSerThrThr354045ThrPheSerGluAlaSerArgAsnLeuAsnAlaAsnAspLeuLysThr505560LeuArgAspHisProAspValGluTyrIleGluGlnAspAlaIleIle65707580ThrIleAsnAlaTyrThrGlnGlnProGlyAlaProTrpGlyLeuGly859095ArgIleSerHisArgSerLysGlySerThrThrTyrGluTyrAspThr100105110SerGlyGlySerGlyThrCysAlaTyrValIleAspThrGlyValGlu115120125AlaSerHisProGluPheGluGlyArgAlaSerGlnIleLysSerPhe130135140IleSerGlyGlnAsnThrAspGlyAsnGlyHisGlyThrHisCysAla145150155160GlyThrIleGlySerLysThrTyrGlyValAlaLysLysThrLysIle165170175TyrGlyValLysValLeuAspAsnSerGlySerGlySerTyrSerGly180185190IleIleSerGlyMetAspPheAlaValGlnAspSerLysSerArgSer195200205CysProLysGlyValValAlaAsnMetSerLeuGlyGlyGlyLysAla210215220GlnSerValAsnAspGlyAlaAlaAlaMetIleArgAlaGlyValPhe225230235240LeuAlaValAlaAlaGlyAsnAspAsnAlaAsnAlaAlaAsnTyrSer245250255ProAlaSerGluProThrValCysThrValGlyAlaThrThrSerSer260265270AspAlaArgSerSerPheSerAsnTyrGlyAsnLeuValAspIlePhe275280285AlaProGlySerAsnIleLeuSerThrTrpIleGlyGlyThrThrAsn290295300ThrIleSerGlyThrSerMetAlaThrProHisIleValGlyLeuGly305310315320AlaTyrLeuAlaGlyLeuGluGlyPheProGlyAlaGlnAlaLeuCys325330335LysArgIleGlnThrLeuSerThrLysAsnValLeuThrGlyIlePro340345350SerGlyThrValAsnTyrLeuAlaPheAsnGlyAsnProSerGly355360365<210>7<211>269<212>PRT<213>芽孢桿菌屬菌株(Bacillussp.)THS-1001<400>7AsnGlnValThrProTrpGlyIleThrArgValGlnAlaProThrAla151015TrpThrArgGlyTyrThrGlyThrGlyValArgValAlaValLeuAsp202530ThrGlyIleSerThrHisProAspLeuAsnIleArgGlyGlyValSer354045PheValProGlyGluProSerTyrGlnAspGlyAsnGlyHisGlyThr505560HisValAlaGlyThrIleAlaAlaLeuAsnAsnSerIleGlyValVal65707580GlyValAlaProAsnAlaGluLeuTyrAlaValLysValLeuGlyAla859095AsnGlySerGlySerValSerSerIleAlaGlnGlyLeuGlnTrpThr100105110AlaGlnAsnAsnIleHisValAlaAsnLeuSerLeuGlySerProVal115120125GlySerGlnThrLeuGluLeuAlaValAsnGlnAlaThrAsnAlaGly130135140ValLeuValValAlaAlaThrGlyAsnAshGlySerGlyThrValSer145150155160TyrProAlaArgTyrAlaAsnAlaLeuAlaValGlyAlaThrAspGln165170175AsnAsnAsnArgAlaSerPheSerGlnTyrGlyThrGlyLeuAsnIle180185190ValAlaProGlyValGlyIleGlnSerThrTyrProGlyAsnArgTyr195200205AlaSerLeuSerGlyThrSerMetAlaThrProHisValAlaGlyVal210215220AlaAlaLeuValLysGlnLysAsnProSerTrpSerAsnThrGlnIle225230235240ArgGlnHisLeuThrSerThrAlaThrSerLeuGlyAsnSerAsnGln245250255PheGlySerGlyLeuValAsnAlaGluAlaAlaThrArg26026權(quán)利要求1.至少一種酸-穩(wěn)定性蛋白酶在動(dòng)物飼料中的用途，其中所述蛋白酶(i)是屬于枯草蛋白酶家族；和/或(ii)當(dāng)用SSI抑制時(shí)，殘留活性低于10％。2.至少一種酸-穩(wěn)定性蛋白酶在制備用于動(dòng)物飼料的組合物中的用途，其中所述蛋白酶(i)是屬于枯草蛋白酶家族；和/或(ii)當(dāng)用SSI抑制時(shí)，殘留活性低于10％。3.權(quán)利要求1的用途，其中所述蛋白酶的劑量是每kg飼料0.01-200mg蛋白酶酶蛋白質(zhì)。4.權(quán)利要求2的用途，其中蛋白酶的所需劑量是每kg飼料0.01-200mg蛋白酶酶蛋白質(zhì)。5.改善動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法，其中在所述飼料中添加至少一種酸-穩(wěn)定性蛋白酶，其中所述蛋白酶(i)是屬于枯草蛋白酶家族；和/或(ii)當(dāng)用SSI抑制時(shí)，殘留活性低于10％。6.動(dòng)物飼料添加劑，其含有(a)至少一種酸-穩(wěn)定性蛋白酶；和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(c)至少一種水溶性維生素，和/或(d)至少一種痕量礦物質(zhì)，和/或(e)至少一種宏量礦物質(zhì)；其中所述蛋白酶(i)是屬于枯草蛋白酶家族；和/或(ii)當(dāng)用SSI抑制時(shí)，殘留活性低于10％。7.權(quán)利要求6的動(dòng)物飼料添加劑，其中蛋白酶的量相當(dāng)于每kg飼料需添加0.01-200mg蛋白酶蛋白質(zhì)。8.權(quán)利要求6-7中任一項(xiàng)的動(dòng)物飼料添加劑，其進(jìn)一步含有植酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，和/或β-葡聚糖酶。9.動(dòng)物飼料組合物，其粗蛋白含量為50-800g/kg，且含有至少一種酸-穩(wěn)定性蛋白酶，其中所述蛋白酶(i)是屬于枯草蛋白酶家族；和/或(ii)當(dāng)用SSI抑制時(shí)，殘留活性低于10％。10.權(quán)利要求9的動(dòng)物飼料組合物，其中所述蛋白酶的量為每kg飼料0.01-200mg蛋白酶蛋白質(zhì)。11.處理植物蛋白質(zhì)的方法，包括在至少一種植物蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)來(lái)源中添加至少一種酸-穩(wěn)定性蛋白酶的步驟，其中所述蛋白酶(i)是屬于枯草蛋白酶家族；和/或(ii)當(dāng)用SSI抑制時(shí)，殘留活性低于10％。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述至少一種植物蛋白質(zhì)來(lái)源中包括大豆。全文摘要枯草蛋白酶家族的酸－穩(wěn)定性蛋白酶，它們?cè)诤兴龅鞍酌傅膭?dòng)物飼料，飼料－添加劑和飼料組合物中的用途，以及使用所述蛋白酶處理植物蛋白質(zhì)的方法。文檔編號(hào)A23J3/34GK1398161SQ0180470公開日2003年2月19日申請(qǐng)日期2001年2月5日優(yōu)先權(quán)日2000年2月8日發(fā)明者彼得·R·奧斯特加爾德,卡斯滕·肖霍姆,安娜－瑪麗·克倫特申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司