專利名稱：脂質(zhì)成分的測(cè)定方法和腎病的檢查方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及尿中脂質(zhì)成分的測(cè)定方法和測(cè)定用試劑。本發(fā)明還涉及利用該測(cè)定方法的腎病檢查手段。
另外，在尿中出現(xiàn)的大型巨噬細(xì)胞是白血球的表面抗原CD14為陰性、25F9為陽(yáng)性，與通常的巨噬細(xì)胞CD14陽(yáng)性、25F9陰性有很大差異，而且，已知脂肪球、卵圓形脂肪體屬于大型巨噬細(xì)胞，測(cè)定其作為腎病的檢查是有用的(臨床病理、47卷、總會(huì)號(hào)73、1999)。
但是，這些測(cè)定中的任一種都是利用染色的鏡檢、使用單克隆抗體的熒光標(biāo)識(shí)免疫染色的鏡檢或流式細(xì)胞測(cè)量法等進(jìn)行的。這些方法，由于通過(guò)對(duì)每個(gè)檢體進(jìn)行鏡檢或流式細(xì)胞測(cè)量法等進(jìn)行檢查，因此操作煩雜，且對(duì)多個(gè)檢體的測(cè)定是困難的。
另外，由于尿中的脂質(zhì)成分與血清中含有的脂質(zhì)成分的量相比是微量的，因此需要敏感度好的脂質(zhì)成分的測(cè)定方法。本發(fā)明者們進(jìn)一步進(jìn)行研究的結(jié)果是，著眼于與腎病相關(guān)的尿中脂肪球和卵圓形脂肪含有的脂肪顆粒，發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用表面活性劑對(duì)其進(jìn)行可溶化，可對(duì)其中含有的脂質(zhì)成分進(jìn)行測(cè)定，并完成了本發(fā)明的測(cè)定尿中含有的脂質(zhì)成分的方法。另外，關(guān)于本發(fā)明中的“可溶化”的意思如后所述。
即，本發(fā)明是1.腎病的檢查手段，其特征在于測(cè)定尿中含有的脂質(zhì)成分。
2.前述1中記載的腎病的檢查手段，其特征在于，通過(guò)使用與脂質(zhì)成分作用的酶測(cè)定前述尿中含有的脂質(zhì)成分。
3.前述2中記載的腎病的檢查手段，其特征在于，前述與脂質(zhì)成分作用的酶是1種或2種以上選自催化分解反應(yīng)、脫氫反應(yīng)、或氧化反應(yīng)的酶。
4.前述1～3任一項(xiàng)中記載的腎病的檢查手段，其特征在于，前述脂質(zhì)成分是尿中的脂肪滴、脂肪體或脂肪球的至少任意之1或2以上中含有的脂質(zhì)成分。
5.前述1～4任一項(xiàng)中記載的腎病的檢查手段，其特征在于，前述脂質(zhì)成分是1種或2種以上選自中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、過(guò)氧化脂質(zhì)、固醇類、脂肪酸、脂肪酸鹽、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪醛、糖脂、鞘脂、前列腺素、類胡蘿卜素的脂質(zhì)成分。
6.尿中含有的脂質(zhì)成分的測(cè)定方法，其特征在于使用使尿中的不溶性脂肪可溶化或分散達(dá)到均質(zhì)的手段。
7.前述6中記載的測(cè)定方法，其特征在于，使前述尿中的不溶性脂肪可溶化或分散達(dá)到均質(zhì)的手段是使用表面活性劑。
8.前述6或7中記載的測(cè)定方法，其特征在于，前述尿中含有的脂質(zhì)成分是脂肪滴、脂肪體或脂肪球的至少任意之1或2以上中含有的脂質(zhì)成分。
9.前述6～8任一項(xiàng)中記載的測(cè)定方法，其特征在于，前述脂質(zhì)成分是1種或2種以上選自中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、過(guò)氧化脂質(zhì)、固醇類、脂肪酸、脂肪酸鹽、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪醛、糖脂、鞘脂、前列腺素、類胡蘿卜素的脂質(zhì)成分。
10.前述6～9任一項(xiàng)中記載的測(cè)定方法，其特征在于，前述脂質(zhì)成分至少是固醇類或磷脂中的任一種。
11.前述6～10任一項(xiàng)中記載的測(cè)定方法，其特征在于，前述表面活性劑是具有可溶化脂肪滴、脂肪體或脂肪球中至少任意之1或2以上作用的，可使脂肪滴、脂肪體或脂肪球任一中含有的脂質(zhì)成分可溶化·分散·游離成為均質(zhì)的物質(zhì)。
12.前述6～11任一項(xiàng)中記載的測(cè)定方法，其特征在于，前述表面活性劑是非離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑、或配糖體。
13.前述6～12任一項(xiàng)中記載的測(cè)定方法，其特征在于，前述表面活性劑是2種以上并用。
14.前述1中記載的腎病的檢查手段，其特征在于是利用前述6～13任一項(xiàng)中記載的方法。
15.權(quán)利要求1中記載的腎病的檢查手段，其特征在于，是在前述2或3記載的檢查手段中，進(jìn)一步利用前述6～13任一項(xiàng)中記載的方法。
16.前述1～3、14或15任一項(xiàng)中記載的腎病的檢查手段，其特征在于，至少與尿中脂蛋白類或尿中脫輔基蛋白類中的任意之1或2以上的測(cè)定組合進(jìn)行。
17.前述1～3、14～16任一項(xiàng)中記載的腎病的檢查手段，其特征在于，與尿中含有的白血球的表面抗原的測(cè)定或檢出組合進(jìn)行。
18.尿中脂質(zhì)成分測(cè)定用試劑，是將前述6～13任一項(xiàng)中記載的測(cè)定方法中必須的試劑試劑盒化或以單獨(dú)產(chǎn)品構(gòu)成的。
本發(fā)明是腎病的檢查手段，其特征在于測(cè)定尿中含有的脂質(zhì)成分。這里，手段是指為達(dá)到目的的方法和/或介質(zhì)。
另外，作為測(cè)定尿中微量的脂質(zhì)成分的方法，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用足夠的表面活性劑，使尿中的不溶性脂肪可溶化或分散達(dá)到均質(zhì)化，可進(jìn)行尿中脂質(zhì)成分的測(cè)定。
通過(guò)本發(fā)明的尿中含有的脂質(zhì)成分的測(cè)定方法測(cè)定的尿中的脂質(zhì)成分，主要是脂肪滴、脂肪體和/或脂肪球中含有的脂質(zhì)成分，而且是1種或2種以上選自中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、過(guò)氧化脂質(zhì)、固醇類、脂肪酸、脂肪酸鹽、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪醛、糖脂、鞘脂、前列腺素、類胡蘿卜素的脂質(zhì)成分。
在本發(fā)明的尿中含有的脂質(zhì)成分的測(cè)定方法中使用的酶，可以是1種或2種以上選自催化分解反應(yīng)、脫氫反應(yīng)、或氧化反應(yīng)的酶。
在本發(fā)明的尿中含有的脂質(zhì)成分的測(cè)定方法中使用的表面活性劑，可以是具有可溶化或分散脂肪滴、脂肪體或脂肪球進(jìn)行均質(zhì)化作用的，可使脂肪滴、脂肪體或脂肪球任一中含有的脂質(zhì)成分可溶化·分散·游離成為均質(zhì)的物質(zhì)。表面活性劑可以2種以上組合使用，且可以是非離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑或配糖體。
本發(fā)明的腎病檢查手段的特征在于利用前述本發(fā)明的尿中含有的脂質(zhì)成分的測(cè)定方法，測(cè)定的脂質(zhì)成分可以是尿中的脂肪滴、脂肪體和/或脂肪球中含有的脂質(zhì)成分，而且可以是1種或2種以上選自中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、過(guò)氧化脂質(zhì)、固醇類、脂肪酸、脂肪酸鹽、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪醛、糖脂、鞘脂、前列腺素、類胡蘿卜素的脂質(zhì)成分。
本發(fā)明的腎病的檢查手段，可以是前述本發(fā)明的尿中含有的脂質(zhì)成分的測(cè)定方法與尿中脂蛋白和/或尿中脫輔基蛋白的測(cè)定或尿中含有的白血球的表面抗原的測(cè)定或檢出組合進(jìn)行。
另外，本發(fā)明提供將前述尿中含有的脂質(zhì)成分的測(cè)定方法中必須的試劑試劑盒化或以單品構(gòu)成的尿中脂質(zhì)成分測(cè)定用試劑。
另外，作為新的測(cè)定方法，可列舉特征在于使尿中不溶性脂肪可溶化或分散達(dá)到均質(zhì)中，包含使用充分的表面活性劑，和使用與脂質(zhì)成分作用的酶的尿中脂質(zhì)成分的測(cè)定方法。
這里，使之可溶化，或使之可溶化或分散達(dá)到均質(zhì)化是指，使在尿中不溶的脂質(zhì)成分在尿中穩(wěn)定且均質(zhì)地存在。即，使用使脂質(zhì)成分可溶化，或使之可溶化或分散達(dá)到均質(zhì)化的尿，即使采用尿的任一部分進(jìn)行脂質(zhì)的測(cè)定，脂質(zhì)成分以幾乎相同的濃度存在。另外，作為其它意思，使脂質(zhì)成分可溶化或，使之可溶化或分散達(dá)到均質(zhì)化是指，通過(guò)表面活性劑的作用，脂質(zhì)通過(guò)與酶反應(yīng)達(dá)到可定量的狀態(tài)，可以是任一種意思，或者是兩方面的意思。脂質(zhì)成分的測(cè)定，可使用后述公知的方法。
作為尿中的脂質(zhì)成分，是以脂肪滴、脂肪體和/或脂肪球中含有的物質(zhì)為主要測(cè)定對(duì)象。在血清中，脂質(zhì)雖然以可溶化的狀態(tài)存在，但在尿中，多數(shù)為用顯微鏡可看到的程度的粒子。對(duì)于這些形成不溶性脂肪塊的物質(zhì)，用本發(fā)明可通過(guò)酶反應(yīng)定量其脂質(zhì)成分量。
(作為對(duì)象的脂質(zhì)成分)作為本發(fā)明測(cè)定對(duì)象的尿中的脂質(zhì)成分，是1種或2種以上選自例如，中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、過(guò)氧化脂質(zhì)、固醇類、脂肪酸、脂肪酸鹽、脂肪酸酯、脂肪族醇、脂肪族醛、糖脂、鞘脂、前列腺素、類胡蘿卜素等的脂質(zhì)成分，其濃度或含量通過(guò)使用與脂質(zhì)成分作用的酶測(cè)定。脂質(zhì)成分中特別重要的對(duì)象是固醇類和/或磷脂。
(測(cè)定試樣的處理)尿試樣可以是尿本身，也可以是將尿離心分離得到的尿沉渣部分或上清部分。本發(fā)明的脂質(zhì)成分的測(cè)定方法不僅可以不對(duì)尿試樣做任何處理直接測(cè)定，也可以離心分離尿，分離尿沉渣部分，測(cè)定該部分的脂質(zhì)成分。
(表面活性劑的添加)本發(fā)明是使尿試樣中含有的脂質(zhì)成分，在表面活性劑的存在下，與脂質(zhì)成分作用的酶作用進(jìn)行測(cè)定的。表面活性劑只要是具有可使尿中不溶性脂肪可溶化或分散達(dá)到均質(zhì)作用的物質(zhì)都可以，對(duì)此沒(méi)有特別的限制，但是優(yōu)選具有使脂肪滴、脂肪體或脂肪球可溶化作用，使這些中含有的脂質(zhì)成分可溶化·分散·游離達(dá)到均質(zhì)的物質(zhì)。另外，也可單獨(dú)通過(guò)超聲波處理或與表面活性劑組合處理，使脂質(zhì)成分可溶化·分散·游離達(dá)到均質(zhì)。
在本發(fā)明的具體例中，作為非離子表面活性劑可列舉屈立通X-100，但并不特別限于這些物質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員，按照本發(fā)明公開(kāi)的結(jié)果，通過(guò)反復(fù)進(jìn)行單純的試驗(yàn)進(jìn)行效果比較，可得到在尿中含有的脂質(zhì)成分的測(cè)定中有效的，可使不溶性脂肪可溶化或分散達(dá)到均質(zhì)的表面活性劑。除了非離子表面活性劑以外，當(dāng)然也可適當(dāng)使用陽(yáng)離子、陰離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑或配糖體。另外，也可通過(guò)并用2種以上的表面活性劑，達(dá)到更確實(shí)地使之可溶化或分散的均質(zhì)化效果。
表面活性劑的添加量，一般為0.1～5w/v％，但是考慮到脂質(zhì)成分的可溶化或分散的均質(zhì)化程度，可通過(guò)適當(dāng)增量·減量進(jìn)行選擇。由于作為處理?xiàng)l件的溫度·時(shí)間等，依存于脂質(zhì)成分與酶的反應(yīng)條件，優(yōu)選選擇作為測(cè)定對(duì)象的脂質(zhì)成分和酶的更合適的條件，這可通過(guò)單純的反復(fù)試驗(yàn)來(lái)決定。另外，優(yōu)選作為預(yù)處理添加預(yù)表面活性劑，進(jìn)行脂質(zhì)成分的可溶化或分散均質(zhì)化處理。此時(shí)，在10～40℃的溫度，進(jìn)行數(shù)秒至數(shù)分鐘左右的處理是充分的。當(dāng)然，該表面活性劑處理，也可與酶反應(yīng)處理同時(shí)進(jìn)行。處理可進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾A段處理，更優(yōu)選自動(dòng)化條件或一次處理。
(使用酶的脂質(zhì)成分的定量)如上所述通過(guò)添加表面活性劑可溶化或分散均質(zhì)化的尿中脂質(zhì)成分的測(cè)定，可進(jìn)行使用酶的脂質(zhì)成分的定量方法，該方法只要是公知的方法就可以，對(duì)此沒(méi)有特別的限制。可列舉例如，HPLC法、氣相色譜法、電泳法、化學(xué)方法、使用酶的方法。其中，使用酶的方法，從操作性、敏感度等方面優(yōu)選使用。本發(fā)明的脂質(zhì)成分的測(cè)定方法，如下述具體例所示，利用1種或2種以上選自催化分解反應(yīng)、脫氫反應(yīng)、或氧化反應(yīng)的酶，可進(jìn)行脂質(zhì)成分的測(cè)定。尿中的脂質(zhì)成分，與血清中的脂質(zhì)成分相比僅以微量存在，通過(guò)使用酶可進(jìn)行高敏感度的測(cè)定。
具體地說(shuō)，作為測(cè)定中性脂肪的例子，使用脂肪酶將中性脂肪分解為甘油和脂肪酸，通過(guò)酶反應(yīng)測(cè)定生成的甘油。通過(guò)酶反應(yīng)對(duì)甘油的測(cè)定，可使用使甘油激酶與甘油-3-磷酸脫氫酶作用，測(cè)定從輔酶NAD向NADH的轉(zhuǎn)化速度的方法，測(cè)定使甘油激酶和甘油磷酸氧化酶作用生成的過(guò)氧化氫的方法，使甘油激酶和甘油-3-磷酸脫氫酶和甘油磷酸氧化酶作用通過(guò)循環(huán)反應(yīng)測(cè)定甘油的高敏感度測(cè)定法，使甘油脫氫酶作用的測(cè)定方法等。
測(cè)定磷脂時(shí)，可使用使磷脂酶和甘油磷酸膽堿二酯酶作用，生成甘油-3-磷酸，該甘油-3-磷酸可使用與中性脂肪同樣的測(cè)定方法，其他的用酶測(cè)定磷脂可使用公知的方法。
在測(cè)定作為生物體中代表性固醇的膽固醇時(shí)，已知使膽固醇氧化酶作用，生成過(guò)氧化氫，通過(guò)過(guò)氧化物酶測(cè)定該過(guò)氧化氫的測(cè)定方法，或使膽固醇脫氫酶作用，測(cè)定從輔酶NAD向NADH的轉(zhuǎn)化速度或轉(zhuǎn)化量的方法，另外，使用同樣的膽固醇脫氫酶，通過(guò)使用輔酶NADH和硫NAD兩種輔酶的在平衡增幅反應(yīng)中更高敏感度地測(cè)定膽固醇的方法(特開(kāi)平08-70894號(hào)公報(bào))。另外，還報(bào)告了在將通過(guò)膽固醇氧化酶等轉(zhuǎn)換的氧化型輔酶再生為還原型輔酶的第二脫氫酶的還原型基質(zhì)存在下，以膽固醇為基質(zhì)進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)的測(cè)定方法(特開(kāi)平11-18797號(hào)公報(bào))。
在膽固醇的脂肪酸酯的情況下，通過(guò)使膽固醇酯酶等分解酶作用，轉(zhuǎn)化為游離膽固醇，可用上述方法測(cè)定。
對(duì)于脂肪酸，可使用測(cè)定?；o酶A合成酶和?；o酶A氧化酶作用生成的過(guò)氧化氫的方法。
對(duì)于前列腺素，可使前列腺素脫氫酶作用測(cè)定。
對(duì)于糖脂質(zhì)，使糖脂質(zhì)分解脂肪酶和其他脂肪酶作用，可測(cè)定生成的甘油。
在鞘脂質(zhì)的情況下，可使鞘脂質(zhì)分解脂肪酶作用進(jìn)行測(cè)定。
在脂蛋白的情況下，對(duì)于脂蛋白中含有的脂質(zhì)成分可適當(dāng)使用上述方法進(jìn)行測(cè)定。
另一方面，關(guān)于脫輔基蛋白的測(cè)定，可使用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定，例如，在脫輔基B蛋白中，使用抗脫輔基B蛋白抗體，免疫比濁法、粒子凝集免疫測(cè)定法，酶免疫測(cè)定法等公知的測(cè)定法是適用的。作為其他的脫輔基蛋白的例子，有脫輔基A-I、脫輔基A-II、脫輔基C、脫輔基E、脫輔基LP(a)等。另外，根據(jù)脫輔基蛋白的種類的脂質(zhì)成分也可使用公知的方法進(jìn)行測(cè)定。
脂質(zhì)成分的測(cè)定法，并不限于上述列舉的方法，根據(jù)已知的脂質(zhì)成分的測(cè)定方法可進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兏ぷ芳印?br> 在本發(fā)明中提供，將上述本發(fā)明的尿中脂質(zhì)成分測(cè)定方法中必要的試劑試劑盒化或以單獨(dú)產(chǎn)品構(gòu)成的尿中脂質(zhì)成分測(cè)定用試劑。本發(fā)明的尿中脂質(zhì)成分測(cè)定用試劑中含有使尿中不溶性脂肪可溶化或分散均質(zhì)化的表面活性劑、和定量脂肪成分的試劑。另外，也可以是使載體中含有測(cè)定中必要的試劑的形成的簡(jiǎn)單型的測(cè)定用設(shè)備。
(腎病檢查手段)本發(fā)明課題解決手段的另一方面是以測(cè)定尿中含有的脂質(zhì)成分為特征的腎病的檢查手段。以前，為檢出腎病的尿中脂肪粒等的檢查是通過(guò)顯微鏡觀察等煩雜的手段進(jìn)行的。在本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)使用上述本發(fā)明的簡(jiǎn)便的尿中脂質(zhì)成分的測(cè)定方法得到的尿中含有的脂質(zhì)、和尿中脂蛋白和/或尿中脫輔基蛋白類的測(cè)定結(jié)果，顯示與腎疾病有明顯關(guān)聯(lián)性，因此完成了本發(fā)明的使用尿中脂質(zhì)成分的測(cè)定方法的簡(jiǎn)便的腎病檢查手段。另外，將尿中脂質(zhì)成分的量記分化，通過(guò)分?jǐn)?shù)可判定被檢者的腎病程度。
在本發(fā)明的腎病檢查手段中，可利用上述尿中脂質(zhì)成分的測(cè)定方法。作為測(cè)定對(duì)象的尿中含有的脂質(zhì)成分，主要含在尿中的脂肪滴、脂肪體和/或脂肪球中。因此，將尿中脂肪滴、脂肪體和/或脂肪球中含有的脂質(zhì)成分中的至少1種或2種以上選自中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、過(guò)氧化脂質(zhì)、固醇類、脂肪酸、脂肪酸鹽、脂肪酸酯、脂肪族醇、脂肪族醛、糖脂、鞘脂、前列腺素、類胡蘿卜素的脂質(zhì)成分作為對(duì)象。
在實(shí)驗(yàn)例中，雖然測(cè)定了腎病患者的膽固醇值和磷脂值，這些與正常人相比是具有明顯差的高值，從該結(jié)果可判定，定量尿中含有的脂質(zhì)成分、至少是膽固醇和/或磷脂，在腎病的發(fā)現(xiàn)中是有用的。
另外，在本發(fā)明，除了尿中脂質(zhì)的測(cè)定，與尿中脂蛋白和/或尿中脫輔基蛋白類的測(cè)定組合是本發(fā)明的優(yōu)選方案，可獲得更優(yōu)選的判斷。
這樣本發(fā)明提供，測(cè)定尿中的1種或2種以上的脂質(zhì)、以及尿中脂蛋白和/或脫輔基蛋白類等脂質(zhì)成分，通過(guò)解析其結(jié)果，可進(jìn)行腎病的檢出和判斷其程度的腎病檢查手段。
本發(fā)明公開(kāi)了，為判定腎病的檢出和障礙程度，除了該尿中脂質(zhì)成分的測(cè)定，組合進(jìn)行尿中含有的白血球的表面抗原的測(cè)定或檢出的方法。特別是只對(duì)于尿中脂質(zhì)成分顯示高值(將脂質(zhì)，和脂蛋白類和/或脫輔基蛋白類的測(cè)定結(jié)果記分化)的試樣，可導(dǎo)入進(jìn)行尿中含有的白血球的表面抗原的測(cè)定或檢出的方法。通過(guò)該組合，可更好地進(jìn)行腎病的檢查。即，通過(guò)與尿中的脂質(zhì)成分的測(cè)定合并，組合尿中含有的白血球表面抗原的測(cè)定或檢出，可更好地進(jìn)行腎病的檢出和其程度的判定。
在組合尿中脂質(zhì)成分的測(cè)定和尿中含有的白血球表面抗原的測(cè)定或檢出進(jìn)行腎病的檢查時(shí)，在使用尿的一部分測(cè)定上述脂質(zhì)、和脂蛋白類和/或脫輔基蛋白類，同時(shí)，將一部分通過(guò)離心分出尿沉渣成分，通過(guò)公知的鏡檢或流式細(xì)胞測(cè)量法等可測(cè)定檢出白血球的表面抗原，例如，CD14、CD16、25F9等。另外，可使用尿沉渣組分的一部分，測(cè)定脂質(zhì)、和脂蛋白和/或脫輔基蛋白類，用剩余的一部分可用鏡檢或流式細(xì)胞測(cè)量法等可測(cè)定檢出白血球的表面抗原。另外，可將尿的一部分通過(guò)離心分離分出尿沉渣，測(cè)定檢出白血球表面抗原，另一方面，將尿的一部分單獨(dú)或組合使用凍結(jié)溶解和/或表面活性劑處理等，經(jīng)由使尿中細(xì)胞破壞的步驟進(jìn)行尿檢體的脂質(zhì)、和脂蛋白和/或脫輔基蛋白類的測(cè)定。
隨時(shí)組合解析本發(fā)明的腎病檢查手段中包括的，從尿中脂質(zhì)的測(cè)定，和尿中脂蛋白和/或尿中脫輔基蛋白類的測(cè)定，或這些與尿中含有的白血球的表面抗原的測(cè)定或檢出中得到的結(jié)果，可更好地進(jìn)行腎病判斷?？梢赃m宜地選定用作解析的測(cè)定結(jié)果。例如，可將膽固醇和磷脂的比作為指標(biāo)，其比可與CD14的測(cè)定檢出結(jié)果組合。尿中含有的白血球表面抗原的測(cè)定檢出結(jié)果也可以是組合多個(gè)結(jié)果。(實(shí)施例)下面列舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。(實(shí)施例1)分別對(duì)正常人的尿和腎病患者的尿測(cè)定膽固醇濃度。尿預(yù)先與10％屈立通X-100以9∶1的比例混合，作為尿檢體。
膽固醇的測(cè)定是，調(diào)制下述組成的2種測(cè)定試劑，對(duì)于尿檢體10μL，加入250μL的試劑-1，在37℃反應(yīng)5分鐘后，加入100μL的試劑-2，添加后，求出從第1分鐘到第3分鐘在波長(zhǎng)415nm的1分鐘左右的吸收光度變化量，求出膽固醇的濃度。其結(jié)果如表1所示。試劑-1PIPES 20mmol/LKCL 150mmol/L屈立通X-100 0.3w/v％膽酸鈉 0.3w/v％硫NAD 1.25mmol/L牛血清白蛋白0.1w/v％膽固醇脫氫酶3U/ml膽固醇酯酶 5U/mlpH 7.0試劑-2CHES175mmol/L屈立通X-100 0.3w/v％膽酸鈉 0.3w/v％β-NADH 3.5mmol/LpH 9.1(實(shí)施例2)對(duì)于實(shí)施例1調(diào)制的尿檢體，測(cè)定磷脂濃度。磷脂的測(cè)定是，調(diào)制下述組成的2種測(cè)定試劑，對(duì)于尿檢體10μL，加入250μL的試劑-1，在37℃反應(yīng)5分鐘后，加入100μL的試劑-2，添加后，求出從第1分鐘到第3分鐘在波長(zhǎng)546nm的1分鐘左右的吸收光度變化量，求出磷脂的濃度。其結(jié)果如表1所示。試劑-1HEPES 50mmol/LCaCl21.0mmol/L屈立通X-100 0.2w/v％甘油-3-磷酸脫氫酶 1.5U/ml磷脂酶A12.0U/ml磷脂酶A22.0U/ml甘油磷酸膽堿磷酸二酯酶 0.6U/ml
NADH0.5mM苯酚0.05％抗壞血酸氧化酶 3U/LpH 8.0試劑-2磷酸緩沖液 20mmol/L甘油-3-磷酸氧化酶 200U/mlPOD 10U/ml4-氨基安替比林 2.0mMpH 7.5從該結(jié)果可判定，腎病患者尿中膽固醇和磷脂的濃度是比正常人明顯高的值，至少通過(guò)測(cè)定尿中膽固醇和/或磷脂，可檢查腎病。(表1)正常人和腎病患者尿中膽固醇和磷脂

(實(shí)施例3)測(cè)定122例尿檢體(IgA腎病[IgAN]51例，糖尿病性腎病[DMN]10例，腎小球硬化癥[Nephroscrelosis]9例，膜性腎病[MN]6例，膜性增殖性腎小球腎炎[MPGN]7例，急性進(jìn)行性腎病[RPGN]12例，微小變化型腎變病綜合征[MCN]3例，巢狀腎小球硬化癥[FGS]12例，慢性腎衰竭[CFR]5例，正常7例)中的磷脂、游離膽固醇、膽固醇、脫輔基A1的濃度。
其結(jié)果如

圖1～5所示。這些任一個(gè)脂質(zhì)關(guān)聯(lián)標(biāo)記物在上述任意的疾病組與正常尿相比都顯示明顯的高值，由此可知，通過(guò)測(cè)定尿中脂質(zhì)成分，可進(jìn)行腎病的檢查、診斷。另外，其它的用途是測(cè)定崛田等報(bào)告的油紅0陽(yáng)性顆粒(尿中的脂肪球)的個(gè)數(shù)(5mL)中(Takashi Oda，Osamu Hotta et al.kidney International，Vol.53，1190-1200，(1998))。
尿中的脂肪球，在IgAN、RPGN、FGS顯示特別高的值，但是相反，在MCN等與正常尿沒(méi)有變化。與其相比，可判定用本發(fā)明的方法，不僅對(duì)IgAN、RPGN、FGS，對(duì)其它腎病也可敏感度良好地檢出，確認(rèn)本發(fā)明是有用的。
另外，膽固醇的測(cè)定是實(shí)施例1所示的方法，磷脂的測(cè)定是實(shí)施例2所示的測(cè)定方法，游離膽固醇的測(cè)定可用實(shí)施例1所示試劑-1中除去膽固醇酯酶外與實(shí)施例1同樣的操作進(jìn)行。
脫輔基A1的測(cè)定，可使脫輔基A-I免疫試劑·ND[コクサイ]進(jìn)行測(cè)定。
將尿預(yù)先與10％屈立通X-100以9∶1的比例混合，作為尿檢體。對(duì)于尿檢體10μL，以160μL的第1試劑，40μL的第2試劑的比例測(cè)定以外，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。(實(shí)施例4)使用從定期接受健康檢查者采取的尿檢體175例，按照實(shí)施例1中記載的方法測(cè)定尿中膽固醇，求出正常人尿中的膽固醇參照值。健康正常人血清中的膽固醇值通常為130～250mg/dL，與此相對(duì)，尿中膽固醇值為血清膽固醇值的1000分之1以下，為0.01～0.25mg/dL。
作為對(duì)照，使用市售的血清膽固醇測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定，但是對(duì)于任何檢體也不能測(cè)定膽固醇。由此可知，尿中膽固醇的測(cè)定，必須使用本發(fā)明實(shí)施例1中記載的方法等的高敏感度測(cè)定方法。
產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明提供了可更簡(jiǎn)便確實(shí)地測(cè)定尿中含有的脂質(zhì)成分的方法，利用該方法，發(fā)現(xiàn)了腎病與尿中含有的脂質(zhì)成分量的相關(guān)性，為檢出腎病，發(fā)現(xiàn)尿中脂質(zhì)、和尿中脂蛋白類和/或尿中脫輔基蛋白類等的測(cè)定是極其有效的。另外，提供了在該尿中脂質(zhì)成分的測(cè)定中，通過(guò)解析多個(gè)脂質(zhì)成分、和脂蛋白類和/或脫輔基蛋白類的測(cè)定結(jié)果，或通過(guò)與尿中含有的白血球的表面抗原的測(cè)定組合，更確實(shí)地檢查腎病程度的手段。
權(quán)利要求
1.腎病的檢查手段，其特征在于測(cè)定尿中含有的脂質(zhì)成分。
2.權(quán)利要求1中記載的腎病的檢查手段，其特征在于，通過(guò)使用與脂質(zhì)成分作用的酶測(cè)定前述尿中含有的脂質(zhì)成分。
3.權(quán)利要求2中記載的腎病的檢查手段，其特征在于，前述與脂質(zhì)成分作用的酶是1種或2種以上選自催化分解反應(yīng)、脫氫反應(yīng)、或氧化反應(yīng)的酶。
4.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)中記載的腎病的檢查手段，其特征在于，前述脂質(zhì)成分是尿中的脂肪滴、脂肪體或脂肪球的至少任意之1或2以上中含有的脂質(zhì)成分。
5.權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)中記載的腎病的檢查手段，其特征在于，前述脂質(zhì)成分是1種或2種以上選自中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、過(guò)氧化脂質(zhì)、固醇類、脂肪酸、脂肪酸鹽、脂肪酸酯、脂肪族醇、脂肪族醛、糖脂、鞘脂、前列腺素、類胡蘿卜素的脂質(zhì)成分。
6.尿中含有的脂質(zhì)成分的測(cè)定方法，其特征在于使用使尿中的不溶性脂肪可溶化或分散達(dá)到均質(zhì)的手段。
7.權(quán)利要求6中記載的測(cè)定方法，其特征在于，使前述尿中的不溶性脂肪可溶化或分散達(dá)到均質(zhì)的手段是使用表面活性劑。
8.權(quán)利要求6或7中記載的測(cè)定方法，其特征在于，前述尿中含有的脂質(zhì)成分是脂肪滴、脂肪體或脂肪球的至少任意之1或2以上中含有的脂質(zhì)成分。
9.權(quán)利要求6～8任一項(xiàng)中記載的測(cè)定方法，其特征在于，前述脂質(zhì)成分是1種或2種以上選自中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、過(guò)氧化脂質(zhì)、固醇類、脂肪酸、脂肪酸鹽、脂肪酸酯、脂肪族醇、脂肪族醛、糖脂、鞘脂、前列腺素、類胡蘿卜素的脂質(zhì)成分。
10.權(quán)利要求6～9任一項(xiàng)中記載的測(cè)定方法，其特征在于，前述脂質(zhì)成分至少是固醇類或磷脂中的任一種。
11.權(quán)利要求6～10任一項(xiàng)中記載的測(cè)定方法，其特征在于，前述表面活性劑是具有可溶化脂肪滴、脂肪體或脂肪球中至少之1或2以上作用的，可使脂肪滴、脂肪體或脂肪球任一中含有的脂質(zhì)成分可溶化·分散·游離成為均質(zhì)的物質(zhì)。
12.權(quán)利要求6～11任一項(xiàng)中記載的測(cè)定方法，其特征在于，前述表面活性劑是非離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑、或配糖體。
13.權(quán)利要求6～12任一項(xiàng)中記載的測(cè)定方法，其特征在于，前述表面活性劑是2種以上并用。
14.權(quán)利要求1中記載的腎病的檢查手段，其特征在于是利用權(quán)利要求6～13任一項(xiàng)中記載的方法。
15.權(quán)利要求1中記載的腎病的檢查手段，其特征在于，是在權(quán)利要求2或3記載的檢查手段中，進(jìn)一步利用權(quán)利要求6～13任一項(xiàng)中記載的方法。
16.權(quán)利要求1～3、14或15任一項(xiàng)中記載的腎病的檢查手段，其特征在于，至少與尿中脂蛋白類或尿中脫輔基蛋白類中的任意之1或2以上的測(cè)定組合進(jìn)行。
17.權(quán)利要求1～3、14～16任一項(xiàng)中記載的腎病的檢查手段，其特征在于，與尿中含有的白血球的表面抗原的測(cè)定或檢出組合進(jìn)行。
18.尿中脂質(zhì)成分測(cè)定用試劑，是將權(quán)利要求6～13任一項(xiàng)中記載的測(cè)定方法中必須的試劑試劑盒化或以單獨(dú)產(chǎn)品構(gòu)成的。
全文摘要
本發(fā)明的課題是提供簡(jiǎn)便的腎病檢查手段，提供在該檢查手段中利用的尿中脂質(zhì)成分的測(cè)定方法。本發(fā)明的課題的解決手段是，提供了測(cè)定尿中含有的脂質(zhì)成分的方法，是特征在于包括使用使尿中不溶性脂肪可溶化的充分的表面活性劑，和使用在脂肪成分作用的酶的脂質(zhì)成分的測(cè)定方法和測(cè)定用試劑。另外，通過(guò)測(cè)定尿中含有的脂質(zhì)成分，進(jìn)一步除了該測(cè)定，通過(guò)組合進(jìn)行尿中脂蛋白類和/或尿中脫輔基蛋白類的測(cè)定、或尿中含有的白血球表面抗原的測(cè)定，提供了簡(jiǎn)便的腎病檢查手段。
文檔編號(hào)C12Q1/25GK1398350SQ01804716
公開(kāi)日2003年2月19日 申請(qǐng)日期2001年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月8日
發(fā)明者堀田修, 白波瀨泰史, 日裹久英 申請(qǐng)人:國(guó)際試藥株式會(huì)社