專利名稱：表達(dá)葡糖基轉(zhuǎn)移酶核酸的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及被葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTase)核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
背景技術(shù)：
GTase是一種酶，它在翻譯后水平上從活化的核糖轉(zhuǎn)移葡萄糖殘基至單體或多聚體受體分子，如其它糖、蛋白、脂質(zhì)和有機(jī)底物。這些葡糖基化的分子參與多種代謝途徑和過程。一部分葡糖基的轉(zhuǎn)移能夠改變細(xì)胞內(nèi)和遍及植物的受體的生物活性，可溶性和運(yùn)輸特性。一個高等植物的GTase家族通過存在C端共有區(qū)序列而被確定。此家族中的GTase在植物細(xì)胞的胞質(zhì)中行使功能，催化葡萄糖向小分子量的底物(如苯丙酮衍生物、香豆素、類黃酮、其它已知充當(dāng)植物激素的次級代謝物和分子)轉(zhuǎn)移。可獲得的證據(jù)表明GTase是高度專一的，如玉米和擬南芥GTase使吲哚-3-乙酸(IAA)葡糖基化。
在過去的十年中，紙張的生產(chǎn)和使用增長很快。例如，在1989到1999年間，英國的紙張和木板生產(chǎn)從460萬噸增至660萬噸。全世界的消費(fèi)也反映出了紙張使用的總增長。例如，在英國每人每年紙張的消費(fèi)超過200公斤。在美國，這一數(shù)字是每年超過300公斤。
造紙工業(yè)使用的木材在被轉(zhuǎn)變成可用來造紙的紙漿前先被粉碎，典型的是將木材削成碎片。在打成紙漿的過程中包括去除木質(zhì)素。木質(zhì)素是木材中一種主要的非碳水化合物組份，約占木材紙漿原材料的四分之一。由于所生產(chǎn)紙張的質(zhì)量在很大程度上取決于紙漿中木質(zhì)素的含量，因此，從紙漿中去除木質(zhì)素是人們所期望的。人們開發(fā)了許多高效率、低成本地從紙漿中去除木質(zhì)素的方法。這些方法可以是化學(xué)的、機(jī)械的或是生物學(xué)的方法。例如，WO9811294，EP0957198和WO0047812揭示的是采用化學(xué)的方法。雖然化學(xué)方法是將木質(zhì)素從紙漿中去除的非常有效率的方法，但是，人們知道化學(xué)處理能導(dǎo)致多糖的降解，并且成本高。而且，為了從紙漿中去除殘留的木質(zhì)素，必須使用很強(qiáng)的漂白劑，而它們本身在從紙漿轉(zhuǎn)變?yōu)榧垙堉靶枰ァ＿@些漂白劑對環(huán)境也造成了破壞。
除去木質(zhì)素的生物學(xué)方法是已知的，然而這種方法也伴隨著缺點(diǎn)，例如，需提供分泌只降解木質(zhì)素而不降解纖維素纖維的酶的微生物(如細(xì)菌和/或真菌)，這一點(diǎn)很重要。這種方法也非常耗時(需耗費(fèi)3～4星期)，同時，由于需提供生物反應(yīng)器而使這種方法變得昂貴。生物學(xué)處理也可包括對木材碎片的預(yù)處理，使它們變得更容易被用于更進(jìn)一步的生物學(xué)或化學(xué)制漿。
因此，合乎理想的是提供沒有先前方法所伴隨的缺點(diǎn)而能高效率和低成本地從紙漿中去除木質(zhì)素的其它手段。
為起到明確參考的目的，此處的轉(zhuǎn)基因表示的是一種被遺傳修飾的植物，它包含了在所述植物中非天然發(fā)現(xiàn)的核苷酸序列，例如，在植物中高表達(dá)單木質(zhì)素GTase，可能通過增加木質(zhì)素聚合物整合和組裝所必需的的生物合成中間體的流動來改變植物細(xì)胞壁的性質(zhì)，相反地，減少單木質(zhì)素葡糖苷庫，比如通過使用包括反義構(gòu)型GTase序列的核酸，可能導(dǎo)致通過特異中間體減少流動的性質(zhì)的改變。改變木質(zhì)素的組成，例如降低松柏醇對芥子醇的比例在造紙和制漿過程中是非常令人滿意的，因?yàn)樵谥茲{過程中，甲基化的木質(zhì)素(芥子醇)越多，越容易被去除(Chiang et al(1998)TAPPIJ.71，173-176)。
在一些實(shí)際應(yīng)用中，通過改變木質(zhì)素的組成和增加植物細(xì)胞木質(zhì)素的含量來增加木材的機(jī)械強(qiáng)度是可取的。這將在諸如建筑工業(yè)和家俱制造業(yè)中得到實(shí)際應(yīng)用。
在植物細(xì)胞壁中，木質(zhì)素含量和多糖聚合物的交聯(lián)程度這兩方面，也在通過改變細(xì)胞壁和組織機(jī)械性質(zhì)來制定原材料的質(zhì)地和質(zhì)量方面起著重要作用，例如，由于可防止過度軟化和喪失多汁性，而在減少可食用組織的細(xì)胞分離上相當(dāng)有益。酚類(phenolics)，如阿魏酸，在細(xì)胞壁的合成和氧化交聯(lián)期間被酯化成細(xì)胞壁多糖，由此增加細(xì)胞壁的剛性，因此它在細(xì)胞粘附方面扮演了一個重要的角色。通過改變與木質(zhì)素中相同的終極代謝途徑的流動，含有這些酚類組份的大多數(shù)非木質(zhì)素化組織和它們的水平能被改變。所以，以相同方式對木質(zhì)素組成和含量進(jìn)行操作，有義和或反義構(gòu)型的GTase核酸能用來影響在氧化交聯(lián)時起作用的阿魏酸和相關(guān)的類苯丙烷(phenyl propanoid)衍生物的水平。這些在含量上的改變已經(jīng)在食用植物組織的原料質(zhì)量控制方面得到應(yīng)用。
植物細(xì)胞壁中的木質(zhì)素和氧化交聯(lián)也在大多數(shù)植物種類的應(yīng)激和防御響應(yīng)方面起著重要作用。例如，當(dāng)非木質(zhì)組織受害蟲和病原體侵襲的挑戰(zhàn)，或受苦于非生物的應(yīng)激(如通過機(jī)械破壞或紫外輻射)時，植物通過細(xì)胞壁和胞質(zhì)內(nèi)性質(zhì)的局部和系統(tǒng)改變來響應(yīng)，包括改變木質(zhì)素的組成和含量以及其它細(xì)胞壁組份交聯(lián)的變化。因此，同樣可以預(yù)料，通過改變有關(guān)的GTase活性水平使細(xì)胞或組織特異性響應(yīng)發(fā)生變化，將在保護(hù)植物免受生物侵襲和生物/非生物的應(yīng)激方面得到應(yīng)用。
GTase也被應(yīng)用于關(guān)于抗氧化劑的修飾方面。所有的需氧有機(jī)體在呼吸期間產(chǎn)生活性氧，這些活性氧正常地存在于細(xì)胞中，與生化抗氧劑相平衡。環(huán)境的挑戰(zhàn)，比如污染物、氧化劑、有毒物質(zhì)、重金屬等等，能導(dǎo)致擾亂胞內(nèi)氧化還原平衡的過量活性氧的產(chǎn)生，可能導(dǎo)致很大范圍內(nèi)致病條件的形成。在人和動物中，心血管疾病、癌癥、炎癥和退行性疾病與由氧化損害引起的事件相關(guān)。
因?yàn)槟壳斑@些疾病的流行，在飲食方面消耗的或者在紫外線隔離劑中局部地使用的抗氧化劑受到相當(dāng)?shù)年P(guān)注。從蔬菜、水果、茶、草本植物和藥用植物中獲得的抗氧化劑微量營養(yǎng)素被認(rèn)為能為對抗由氧化應(yīng)激引起的健康問題提供重要的保護(hù)。已知的來源于植物組織的抗氧化劑包括，例如五烴黃酮，藤黃菌素，兒茶素(兒茶酸)，表兒茶酸和花青素類化合物。
咖啡酸(3，4-二烴基肉桂酸)是有治療用途的抗氧化劑的另一個例子。
眾所周知，某些植物物種、器官和組織含有相對高水平的一種或多種有抗氧化活性的化合物。這些化合物在那些物種中大量聚積，它們在農(nóng)作物植物和植物部分的廣泛分布已經(jīng)被用于食物和飲料的生產(chǎn)，抗氧化劑生物利用度(吸收、代謝轉(zhuǎn)換和排泄速率)的增加是三個被看作高度可取的特征。
很顯然，改變有關(guān)GTase的活性能夠使植物中的抗氧化劑化合物葡糖基化，而這將有利于具有有益性質(zhì)的抗氧化劑的生產(chǎn)。GTase的序列也同樣能在原核生物或者簡單真核生物如酵母中表達(dá)，來生產(chǎn)在那些細(xì)胞內(nèi)或體外加工系統(tǒng)中用于生物轉(zhuǎn)化的酶。
發(fā)明描述根據(jù)本發(fā)明的一個方面是提供含有編碼一種多肽的核苷酸分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，它，它具有i)葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性；ii)選自

圖1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A、10A、11A、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、
28、29、30、31、32的序列；iii)與上述(ii)中所述序列雜交的核酸；iv)作為遺傳密碼結(jié)果的與上述(i)和(ii)所定義的序列簡并的核酸序列。
在本發(fā)明的較佳實(shí)施例中，所述核酸分子在與圖1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A、10A、11A、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32所示序列嚴(yán)格雜交的條件下退火。
更好的所述核酸分子選自圖7A、8A、9A、10A、15、18、19、28或31。
嚴(yán)格的雜交/清洗條件在本領(lǐng)域是眾所周知的。例如，在60℃，用0.1×SSC，0.1％SDS溶液洗滌后，核酸雜交是穩(wěn)定的。本領(lǐng)域中公知，如果核酸序列是已知的，則最佳的雜交條件可以被計算出來。比如，通過要進(jìn)行雜交核酸的鳥苷和胞苷(GC)含量，就能夠確定雜交條件。具體請參閱Sambrook等人(1989)撰寫的分子克隆—實(shí)驗(yàn)室方法。對于達(dá)到特異同源性核酸之間雜交所需的嚴(yán)格條件，有一個通式加于計算Tm＝81.5℃+16.6Log[Na-]+0.41[％G+C]-0.63(％甲酰胺)在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是真核細(xì)胞。所述的真核細(xì)胞以植物細(xì)胞或是酵母細(xì)胞為佳。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是原核細(xì)胞。
在本發(fā)明的較佳實(shí)施方案中，所述的核酸分子選自圖1C、2C、3C、4C、5C、6C、7C、8C、9C、10C和11C任一圖中序列的反義序列或其部分，或圖12～32中描述的有義序列的反義序列。更為可取的，所述的反義序列選自圖7C或9C。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的核酸是環(huán)狀DNA(cDNA)。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述的核酸是基因組DNA。
在本發(fā)明的較佳實(shí)施方案中，所述的植物是選自楊樹屬植物、桉樹屬植物、道格拉斯樅樹、松樹、胡桃屬植物、梣樹、樺樹、櫟屬植物，柚木樹、云杉屬植物的木本植物。所述的木本植物是在造紙工業(yè)中典型使用的植物，如白楊樹。
轉(zhuǎn)化木本植物的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，在US4795855和WO9118094中揭示了白楊樹的轉(zhuǎn)化方法。桉樹屬植物的轉(zhuǎn)化在EP1050209和WO9725434中得到描述。這些專利文獻(xiàn)中的每一篇均以全文引入作為參考。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的植物選自玉米(Zea mays)，canola(Brassica napus，Brassica rapa ssp)，苜蓿(Medicago sativa)，稻(Oryza sativa)，黑麥(Secale cerale)，高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)，向日葵(helianthusannuas)，小麥(Tritium acstivum)，大豆(Glycine max)，煙草(Nicotiana tabacum)，土豆(Solanum tuberosum)，花生(Arachis hypogaea)，棉花(Gossypiumhirsutum)，甜土豆(lopmoea batatus)，木薯(Manihot esculenta)，咖啡(Cofeaspp.)，椰子果(Cocos nucifera)，菠蘿(anana comosus)，柑橘樹(Citrus spp.)，可可(Theobroma cacao)，茶(Camellia senensis)，香蕉(Musa spp.)，avacado(Persea americana)，無花果樹(Ficus casica)，番石榴(Psidium guajava)，芒果樹(Mangifer indica)，橄欖樹(Olea europaea)，番木瓜樹(Carica papaya)，漆樹(Anacardium occidentale)，macadamia(Macadamia intergrifolia)，杏仁(Prunus amygdalus)，糖甜菜(Beta vulgaris)，燕麥，大麥，蔬菜和觀賞植物。
更好的，本發(fā)明所述的植物是農(nóng)作物植物，如谷類和豆類植物，玉米，小麥，土豆，木薯淀粉，稻，高粱，小米，木薯，大麥，豌豆，和其它根莖、塊莖和種子作物。重要的種子作物是油籽油菜，糖甜菜，玉米，向日葵，大豆和高粱。本發(fā)明適用的園藝植物可包括萵苣、菊苣和包括卷心菜、甘藍(lán)、花椰菜在內(nèi)的Brassicas蔬菜，還有石竺和天竺葵。本發(fā)明還可適用于煙草，葫蘆，胡蘿卜，草莓，向日葵，番茄，辣椒，菊花等植物。
能提供有價值種子的谷物植物包括油籽植物和豆科植物。有價值的種子包括谷物的種子，如玉米，小麥，大麥，稻，高粱，黑麥等。油籽植物包括棉花，黃豆，紅花，向日葵，Brassica，玉米，苜蓿，棕櫚，椰子等。豆科植物包括大豆和豌豆。大豆包括guar，洋槐豆，葫蘆巴，黃豆，菜豆，豇豆，綠豆，利馬豆，蠶豆，小扁豆，鷹嘴豆等。
按照本發(fā)明的另一個方面是提供包含可操作地與啟動子連接的本發(fā)明核酸的載體。
“載體”特別包括以能或不能自我傳遞或者遷移的雙鏈或單鏈線性或環(huán)狀形式存在的任何質(zhì)粒、粘粒噬菌體或者是農(nóng)桿菌雙體載體，它們或是通過整合進(jìn)入細(xì)胞基因組或以存在于染色體外的形式轉(zhuǎn)化原核或真核宿主(例如，有復(fù)制起始位點(diǎn)的自主復(fù)制型質(zhì)粒，即附加型載體)。
合適的載體能構(gòu)建，包含特有的調(diào)控序列，包括啟動子序列，終止子片段，聚腺苷酸化序列，增強(qiáng)子序列，標(biāo)記基因和其它固有的序列。進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，請參閱如《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》第二版，Sambrook等，1989，Cold Spring HaborLaboratory Press，或《最新分子生物學(xué)方法》第二版，Ausubel等編著，John Wily& Sons，1992。
上述載體還特別包括穿梭載體，借助它，DNA載體天然地或是通過設(shè)計，能在兩種不同的宿主有機(jī)體內(nèi)復(fù)制。穿梭載體可以選自放線菌及相關(guān)菌種，細(xì)菌和真核生物(如高等植物、哺乳動物、酵母或真菌細(xì)胞)。
按照本發(fā)明的包含核酸的載體不必含有啟動子或是其它調(diào)控序列，尤其當(dāng)載體被用于為重組進(jìn)入基因而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞時。
更好的，載體中的核酸在合適的啟動子或宿主細(xì)胞如微生物(如細(xì)菌)或植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的其它調(diào)控元件控制之下并可操作性地與其連接。這種載體可以是在多種宿主中發(fā)揮作用的雙功能表達(dá)載體。假如這是GTase基因組DNA，它可能包含自己的啟動子或其它調(diào)控元件，如果這是cDNA，它可能在一個合適的啟動子或宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的其它調(diào)控元件的控制之下。
“啟動子”是指在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的一段核苷酸序列，它包括了轉(zhuǎn)錄所需的所有調(diào)控區(qū)域。合適的啟動子包括組成型、組織特異型、誘導(dǎo)型、發(fā)育型或是植物中所包含的依靠設(shè)計的用于在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的其它啟動子。這些啟動子包括能在植物細(xì)胞中發(fā)揮作用的病毒的、真菌的、細(xì)菌的、動物的和植物來源的啟動子。
組成型啟動子包括，如CaMV 35S啟動子(Odelll et al.(1985)Nature313，9810-812)；稻肌動蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2163-171)；遍在蛋白(Christian et al.(1989)Plant Mol.Biol.18(675-689)；pEMU(Last et al.(1991)Theor Appl.Genet.81581-588)；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3.2723-2730)；ALS啟動子(U.S.Application Seriel No.08/409,297)，和類似的啟動子。其它組成型的啟動子包括以下專利中公開的美國專利Nos.5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463和5,608,142。
化學(xué)調(diào)控的啟動子能被用于通過引入外源化學(xué)調(diào)節(jié)劑來調(diào)節(jié)植物中基因的表達(dá)。取決于具體對象，這種啟動子可能是一種化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，用于化學(xué)誘導(dǎo)基因的表達(dá)，或是一個化學(xué)阻遏型啟動子，用于化學(xué)阻遏基因的表達(dá)。化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子在本領(lǐng)域是眾所周知的，包括但不限于由苯磺酰胺除草劑安全劑激活的玉米In2-2啟動子，由被作為芽前除草劑使用的疏水親電化合物激活的玉米GST啟動子，和被水楊酸激活的煙草PR-1a啟動子。其它感興趣的化學(xué)調(diào)控啟動子包括類固醇響應(yīng)啟動子(參閱如Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810421-10425和McNellis et al.(1998)Plant J.14(2)247-257中的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的啟動子)和四環(huán)素誘導(dǎo)及四環(huán)素阻遏啟動子(參閱如Gatz etal.(1991)Mol.Gen.Genet.227229-237和美國專利Nos.5,814,618及5,789,156)，它們引入本文作為參考。
當(dāng)希望在特定組織中促進(jìn)表達(dá)時，可利用組織特異性啟動子。組織特異性啟動子包括那些被Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)255-265；Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol.38(7)792-803；Hansen et al.(1997)Mol.Gen.Genet.254(3)337-343；Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2)157-168；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3)1331-1341；Van Camp et al.(1996)Plant Physiol.112(2)525-535；Canevascni et al.(1996)Plant Physiol.112(2)513-524；Yamamotoet al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5)773-778；Lam(1994)Results Probl.CellDiffer.20181-196；Orozco et al.(1993)Plant Mol.Biol.23(6)1129-1138；Mutsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)9586-9590；和Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3)495-50中所描述的啟動子。
“可操作地連接”表示作為相同的核酸分子的部分連接，占據(jù)合適的位置和和方向從啟動子開始轉(zhuǎn)錄。DNA可操作地連接至啟動子是指它在啟動子轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控之下。作為更好的一個方面，這種啟動子是誘導(dǎo)型啟動子或是發(fā)育調(diào)控型啟動子。
在本說明書中特別令人感興趣的是作為植物載體操作的核酸的構(gòu)建。以往在植物中得到廣泛成功使用的特殊的方法載體在Guerineau和Mullineaux(1993)《植物轉(zhuǎn)化和表達(dá)載體》，Plant Molecualr Biology Labfax(Croy RRD ed)Oxford，BIOS Scientific Publishers，pp 121-148中描述。合適的載體可能包括植物的病毒衍生載體(參閱如EP-A-194809)。如果需要的話，可在構(gòu)建物中包含選擇的基因標(biāo)記，比如那些賦予可選擇表型的基因標(biāo)記，如抗生素或除草劑抗性(例如卡那霉素，潮霉素，膦絲菌素(phosphinotricin)，chlorsulfuron，氨甲喋呤，慶大霉素，壯觀霉素，咪唑啉酮類和glyphosate)。
按照本發(fā)明另一個方面，是提供了在植物中促進(jìn)單木質(zhì)醇(monolignol)葡糖苷合成的方法，包括引起或允許至少一種本發(fā)明的GTase核酸在植物中表達(dá)。優(yōu)選的植物是木本植物種系。
按照本發(fā)明另一個方面，是提供了在植物中抑制單木質(zhì)醇葡糖苷合成的方法，包括引起或允許至少一種本發(fā)明的GTase反義核苷酸在植物中表達(dá)。更好的植物是木本植物種系。
抑制GTase的表達(dá)，可以例如通過使用反義技術(shù)達(dá)到。
在使用反義基因或部分基因序列來負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)時，一種核苷酸序列被置于“反向取向”中的啟動子的控制之下，那么，與正常mRNA互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA從目標(biāo)基因的“有義”鏈開始轉(zhuǎn)錄。參閱如Rothstein et al.1987；Smithet al，(1998)，Nature 334，724-726；Zhang et al(1992)The Plant Cell 4，1575-1588，English et al.(1996)The Plant Cell 8，179-188。反義技術(shù)在Bourque(1995)，PlantScience 105，125-149和Flavell(1994)PNAS USA 91，3490-3496中同樣有綜述。
按照本發(fā)明的另一個方面，是提供編碼反義RNA分子的核苷酸序列，這種RNA分子與編碼植物木質(zhì)素生物合成中至少一種單木質(zhì)醇葡糖苷生物合成時具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的有義mRNA分子是互補(bǔ)的，這種核苷酸序列在啟動子和終止子的轉(zhuǎn)錄控制之下，啟動子和終止子均能在植物細(xì)胞中行使功能。
合適的啟動子和終止子參見上文所述。
按照本發(fā)明的另一個方面，是提供包含轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的本發(fā)明的核苷酸序列，它是一種受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的序列，是編碼由多個亞序列組成的RNA的，其特征是，RNA亞序列是在植物細(xì)胞木質(zhì)素生物合成途徑中有GTase活性的蛋白的mRNA的反義RNA。
尤其是，所述的RNA亞序列是在植物細(xì)胞木質(zhì)素生物合成途徑中有GTase活性的GTase的mRNA的反義RNA，如圖1～11(C)中的GTase。
上述的核苷酸序列可編碼含有任何數(shù)量亞序列的RNA。
更好的是，亞序列的數(shù)量介于2～7(包括2和7)，再更好的是介于2～4之間。
按照本發(fā)明的另一個方面，是提供關(guān)于以本發(fā)明中的核酸或載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，較佳為植物或微生物細(xì)胞。微生物細(xì)胞可以是原核細(xì)胞(如大腸桿菌，枯草芽孢桿菌)或是真核細(xì)胞(如釀酒酵母)。
在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)基因可以是在外源基因組載體上或更好的是穩(wěn)定整合入基因組。每一個單倍體基因組里，可能存在有多于一個的異源核苷酸序列。
按照本發(fā)明的再一個方面，是提供一種轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，包括將載體導(dǎo)入植物細(xì)胞及引起或允許載體和植物細(xì)胞基因組之間發(fā)生重組而將本發(fā)明所述核苷酸序列插入基因組。
以本發(fā)明的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的植物可以以本領(lǐng)域已知的、用于植物遺傳操作的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來制備。DNA能用任何合適的技術(shù)導(dǎo)入植物細(xì)胞，如農(nóng)桿菌(Agrobacterium)攜帶的利用自身天然基因轉(zhuǎn)移能力的雙臂Ti質(zhì)粒載體(EP-A-270355，EP-A-0116718，NAR12(22)8711-87215(1984)，Townsend et al.，美國專利No.5,563,055)；顆?；蛭⒘＾Z擊(美國專利No.5,100,792，EP-A-444882，EP-A-434616；Sanford et al，美國專利No.4,945,050；Tomes et al.(1995)《DNA直接導(dǎo)入完整植物細(xì)胞微粒轟擊法》《植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)基本方法》Gamborg和Philips編著(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe et al.(1988)Biotechniques 4320-334；微注射(WO92/09696，WO94/00583，EP 331083，EP175966，Green et al.91987)，《植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)》，Academic Press，Crosswayet al.(1986)Biotechnology 4320-334；電穿孔(EP290395，WO8706614，Riggset al.(1986)Proc.Natl.Sci.USA 835602-5606；D’Halluin et al.91992，Plant Cell41495-1505)。其它直接DNA攝取方式(DE4005152，WO9012096，美國專利No.4,684,611，Paszkowski et al.(1984)EMBO J.32717-2722)；脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA攝取(如Freeman et al(1984)Plant Cell Physiol，291353)；或旋轉(zhuǎn)方法(如Kindle(1990)Proc.Nat.Acid.Sci.USA 871228)。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的物理方法在如下文獻(xiàn)中有綜述Oard(1991)Biotech.Adv.91-11；Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22421-477Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology527-37；Christou dr(1988)Plant Physiol.87671-674；Mccabe等人(1988)Bio/Technology 6923-926；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P175-182；Singh et al.(1988)Theor.Appl.Genet.96319-324；Datta et al.(1990)Biotechnology 8736-740；Klein et al.(1988)Proc.Nat.Acid.Sci.USA 854305-4309；Klein et al.(1988)Biotechnology 6559-563；Tomes，美國專利No.5,240,885；Buising et al.美國專利No.5,322,783和5,324,646；Klein et al.(1988)Plant Physiol 91440-444；Fromm等人(1990)Biotechnology 8833-839；Hooykaas-Von Slogteren等人91984)。Nature(London)311763-764；Bytebier etal.(1987)Proc.Natl.Sci.USA 845345-5349；De Wet等人.(1985)TheExperimental Manipulation of Ovule Tissues ed.Chapman等人編著.(Longman，New York)，pp.197-209；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports 9415-418和Kaeppler等人.(1992)Theor.Appl.Genet.84560-566；Li等人.(1993)Plant CellReports 12250-255和Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75407-413；Osjoda等人.(1996)Nature Biotechnology 14745-750。以上文獻(xiàn)均引入本文作為參考。
農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化被本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛地用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物種系。近來，在對于幾乎所有經(jīng)濟(jì)單子葉植物中穩(wěn)定的、能生育的轉(zhuǎn)基因植物的常規(guī)生產(chǎn)方面取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)步。(Toriyama et al.(1988)Bio/Technology 61072-1074；Zhang et al.(1988)Plant Cell rep.7379-384；Zhang et al.(1988)Theor.Appl.Genet.76835-840；Shimamoto et al.(1989)Nature 338274-276；Datta et al.(1990)Bio/Technology 8736-740；Christou et al.(1991)Bio/Technology 9957-962；Penget al.(1991)International Rice Research Institute.Manila，Philippines，pp.563-574；Cao et al.(1992)Plant Cell Rep.11585-591；Li et al.(1993)Plant Cell Rep.12250-255；Rathore et al.(1993)Plant Mol.Biol.21871-884；Fromm et al(1990)Bio/Technology 8833-839；Gordon Kamm et al.(1990)Plant Cell 2603-618；D’Halluin et al.(1992)Plant Cell 41495-1505；Walters et al.(1992)Plant Mol.Biol.18189-200；Koziel et al.(1993)Biotechnology 11194-200；Vasil.I.K.(1994)Plant Mol.Biol.25925-937；Weeks et al.(1993)Plant Physiol.1021077-1084；Somers et al.(1992)Bio/Technology 101589-1594；WO92/14828)。尤其是也作為單子葉植物的高效轉(zhuǎn)化方法的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化正在出現(xiàn)(Hiei，et al.(1994)ThePlant Journal 6271-282)。也可以參閱Shimamoto，K.(1994)Current Opinion inBiotechnology 5158-162；Vasil，et al.(1992)Bio/Technology 10667-674；Vain etal.(1995)Biotechnology Advances 13(4)653-671；Vasil，et al.(1996)NatureBiotechnology 14702〕。
當(dāng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法效率不夠或無效時，則微粒轟擊法、電穿孔法和直接DNA攝入法是更好的方法?；蛘?，可以采用各種技術(shù)的組合來增加轉(zhuǎn)化效率，如農(nóng)桿菌包裹的微粒轟擊技術(shù)(EP-A-486234)或者先微粒轟擊誘發(fā)損傷后接著與農(nóng)桿菌聯(lián)合培養(yǎng)的技術(shù)(EP-A-486233)。
本發(fā)明也提供了包括本發(fā)明的植物細(xì)胞的植物。
除再生植物以外，本發(fā)明包含了所有以下方面此類植物的克隆，種子，自體雜交的子孫和后代(如F1和F2后代)。
按照本發(fā)明的另一個方面，是提供一種從擬南芥(Arabidopsis thaliana)分離得到的核酸分子，它包含編碼一種多肽的核酸序列，所述多肽具有(1)GTase的功能；和(2)能通過O-葡糖苷鍵的連接增加一個葡糖苷基團(tuán)來形成(a)至少一種下列物質(zhì)的葡糖基酯肉桂酸；p-香豆酸；咖啡酸；阿魏酸和芥子酸；和或(b)至少一種以下物質(zhì)的4-O-葡糖苷肉桂酸；p-香豆酸；咖啡酸；阿魏酸；芥子酸；p-香豆醛；松柏醛；芥子醛；p-香豆醇；松柏醇；和芥子醇。
本發(fā)明的另一個方面是，提供一種由分離到的本發(fā)明的核酸分子編碼的多肽，這里所述的多肽選自圖1B、2B、3B、4B、5B、6B、7B、8B、9B、10B和11B或其功能性變種和/或其中的一部分。優(yōu)選的多肽是選自圖2B、3B、4B、6B、7B和9B中的多肽或是其功能性變種和/或其中的一部分。更進(jìn)一步優(yōu)選的多肽是選自圖2B、3B、7B和9B或是其功能性變種和/或其中的一部分。最優(yōu)選的多肽是圖2B、3B、7B或9B中所示的多肽中的一種。本發(fā)明還提供由圖12～32中所示的有義核苷酸序列編碼的多肽并很容易地從這些有義序列衍生出來。
與本發(fā)明中的GTase分子在序列上有相當(dāng)?shù)囊恢滦院屯吹淖兎N可以用于本發(fā)明的實(shí)施。那就是說，圖1A～11A中的GTase可以被修飾但仍保留功能。通常，GTase將至少與本發(fā)明說明書附圖1A～32中的GTase核苷酸序列有約40％～60％，更好地約60％～80％，再更好約80％～95％的序列一致性。
功能變種多肽的活性可以通過轉(zhuǎn)化入能表達(dá)本發(fā)明中核酸的宿主細(xì)胞來評價。關(guān)于這種轉(zhuǎn)化方法學(xué)的更多細(xì)節(jié)將在下面描述。
按照本發(fā)明的另一個方面，是揭示一種產(chǎn)生衍生核酸的方法，包括修飾上述任一序列的步驟。尤其是圖1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A、10A、11A、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32中的編碼序列。
或者，通過在核酸中增加、插入、缺失或替代一個或多個核苷酸的一種或多種方式導(dǎo)致在編碼的多肽中增加、插入、缺失或替代一個或多個氨基酸，這樣的序列改變可產(chǎn)生衍生物。
為了改變編碼多肽的活性(如專一性)或穩(wěn)定性，或是產(chǎn)生可以通過改變木質(zhì)素生物合成途徑流動來改變在木質(zhì)素生物合成途徑中的木質(zhì)素或中間體的數(shù)量的優(yōu)勢負(fù)向變種，其它所希望的突變可以是隨機(jī)的或是定點(diǎn)突變。
本發(fā)明將參照如下附圖和實(shí)施例進(jìn)行描述，這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)看作對本發(fā)明的限制。
附圖的簡要說明圖1木質(zhì)素生物合成途徑中的主要中間體圖1AA062的有義核苷酸序列，編碼區(qū)域始于第一個核苷酸，結(jié)束于最后一個核苷酸；圖1BA062的氨基酸序列；圖1CA062的反義核苷酸序列；圖2AA320的有義核苷酸序列，編碼區(qū)域始于第一個核苷酸，結(jié)束于最后一個核苷酸；圖2BA320的氨基酸序列；圖2CA320反義核苷酸序列；圖3AA41的有義核苷酸序列，編碼區(qū)域始于第一個核苷酸，結(jié)束于最后一個核苷酸；圖3BA41的氨基酸序列；圖3CA41的反義核苷酸序列；圖4AA42的有義核苷酸序列，編碼區(qū)域始于第一個核苷酸，結(jié)束于最后一個核苷酸；圖4BA42的氨基酸序列；圖4CA42的反義核苷酸序列；圖5AA43的有義核苷酸序列，編碼區(qū)域始于第一個核苷酸，結(jié)束于最后一個核苷酸；圖5BA43的氨基酸序列；圖5CA43的反義核苷酸序列；圖6AA911的有義核苷酸序列，編碼區(qū)域始于第一個核苷酸，結(jié)束于最后一個核苷酸；圖6BA911的氨基酸序列；圖6CA911的反義核苷酸序列；
圖7AA119的有義核苷酸序列，編碼區(qū)域始于第一個核苷酸，結(jié)束于最后一個核苷酸；圖7BA119的氨基酸序列；圖7CA119的反義核苷酸序列；圖8AA233的有義核苷酸序列，編碼區(qū)域始于第一個核苷酸，結(jié)束于最后一個核苷酸；圖8BA233的氨基酸序列；圖8CA233的反義核苷酸序列；圖9AA407的有義核苷酸序列，編碼區(qū)域始于第一個核苷酸，結(jié)束于最后一個核苷酸；圖9BA407的氨基酸序列；圖9CA407的反義核苷酸序列；圖10AA961的有義核苷酸序列，編碼區(qū)域始于第一個核苷酸，結(jié)束于最后一個核苷酸；圖10BA961的氨基酸序列；圖10CA961的反義核苷酸序列；圖11AA962的有義核苷酸序列，編碼區(qū)域始于第一個核苷酸，結(jié)束于最后一個核苷酸；圖11BA962的氨基酸序列；圖11CA962的反義核苷酸序列；圖12UGT71B5的有義核苷酸序列；圖13UGT71C3的有義核苷酸序列；圖14UGT71C5的有義核苷酸序列；圖15UGT71D1的有義核苷酸序列；圖16UGT73B1的有義核苷酸序列；圖17UGT73B2的有義核苷酸序列；圖18UGT73B4的有義核苷酸序列；圖19UGT73B5的有義核苷酸序列；圖20UGT73C1的有義核苷酸序列；圖21UGT731C的有義核苷酸序列；圖22UGT73C5的有義核苷酸序列；
圖23UGT73C6的有義核苷酸序列；圖24UGT73C7的有義核苷酸序列；圖25UGT74F2的有義核苷酸序列；圖26UGT76E1的有義核苷酸序列；圖27UGT76E11的有義核苷酸序列；圖28UGT76E12的有義核苷酸序列；圖29UGT76E2的有義核苷酸序列；圖30UGT78D1的有義核苷酸序列；圖31UGT89B1的有義核苷酸序列；圖32UGT72B3的有義核苷酸序列；圖33顯示的是用谷胱甘肽偶聯(lián)的Sepharose從大腸桿菌中純化的重組GST-UGT71C1融合蛋白。蛋白(5μg)用10％SDS-PAGE分析并用考馬斯亮藍(lán)顯色。
圖34顯示的是三種不同的咖啡酸葡萄糖偶聯(lián)物(咖啡酰-3-O-葡糖苷，咖啡酰-4-O-葡糖苷，1-O-咖啡酰葡糖)，分別從含重組UGT71C1，UGT73B3和UGT84A1的葡糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中得到。每次測定含有1～2μg重組UGT，1mM咖啡酸，5mM UDP-葡萄糖，1.4mM 2-巰基乙醇和50mM TRIS-HCl，pH7.0?；旌衔镌?0℃孵育30分鐘，接著用反相HPLC來分析。以1毫升/分鐘，超過20分鐘的乙腈/水線性梯度(10～16％)將葡萄糖偶聯(lián)物與咖啡酸分離。
圖35A顯示的是UGT71C1葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的最佳pH，反應(yīng)測定的范圍從pH5.5～8.0，反應(yīng)體系中含50mM緩沖液，1μg UGT71 C1，1mM咖啡酸，5mM UDP-葡萄糖和1.4mM 2-巰基乙醇?；旌衔镌?0℃孵育30分鐘。添加20μl三氯乙酸(240mg/ml)終止反應(yīng)，接著用反相HPLC來分析。專一的酶活性以30℃、30分鐘反應(yīng)時間中1mg蛋白每秒葡糖基化的咖啡酸納摩爾數(shù)(nkat)來表示。圖35B通過測定在50mM TRIS-HCl(pH7.0)中1μgUGT71C1葡糖基化的咖啡酸量來研究UGT71C1的葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性的時間過程。如A中描述的那樣進(jìn)行反應(yīng)和分析。
圖36顯示了UGT71C1轉(zhuǎn)基因的擬南芥植物(Arabidopsis thaliana)和它們的咖啡酸葡糖基化的能力；和圖37概括了對于不同抗氧化劑底物的不同GTase多肽的GTase活性。
實(shí)施例的詳細(xì)說明材料和方法木本植物種系的轉(zhuǎn)化木本植物種系的轉(zhuǎn)化是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參閱US4795855和WO9118094；EP1050209和WO9725434。這些專利中的每一篇均以全文引入以供參考。
非木本植物種系的轉(zhuǎn)化所使用的非木本植物種系的植物轉(zhuǎn)化的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，在這里被廣泛參考。
GTase序列的識別GTase序列識別采用GCG軟件(Wisconsin package version 8.1)。用Blasta程序在EMBL和GenBank序列數(shù)據(jù)庫中搜索包含PSPG(植物次級產(chǎn)物UDP-葡萄糖葡糖基轉(zhuǎn)移酶)特征基元(Hughes和Hughes(1994)DNA Sequence 5，41-49)的擬南芥(Arabidopsis)蛋白序列。本發(fā)明所述GTase的數(shù)據(jù)庫信息在表1中列出。
GTase序列的擴(kuò)增和克隆運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)(Sambrook et al(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》第二版，Cold Spring Habor Laboratory，Cold Spring Habor，NY)，用特異引物(表2)從擬南芥Columbia基因組DNA擴(kuò)增GTase序列。50ng從擬南芥Columbia分離到的基因組DNA與1×pfu PCR緩沖液(Stratagene)，250μM dNTPS每一末端的50pmole引物和5單位的pfu DNA聚合酶(Stratagene)以100μl的總體積孵育。PCR反應(yīng)按照表3中所描述的簡述程序來進(jìn)行。
PCR擴(kuò)增之后，所得產(chǎn)物以表2(粗體字)中所列合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙消化。被消化的DNA片段用一種電洗脫方法純化(Sambrook et al(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》第二版，Cold Spring Habor Laboratory，Cold SpringHabor，NY)并在16℃過夜條件下，通過T4 DNA連接酶(NEB)與pGEX2T質(zhì)粒DNA(Pharmacia)上的相關(guān)克隆位點(diǎn)進(jìn)行連接。所得到的重組質(zhì)粒DNA在大腸桿菌XL1-blue細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，并用在Sambrook et al(1989)《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》第二版(Cold Spring Habor Laboratory，Cold Spring Habor，NY)中所描述的方法，以表2(粗體字)中列出的限制性內(nèi)切酶來進(jìn)行確認(rèn)。
葡糖基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的制備上面所描述的含有重組質(zhì)粒DNA的大腸桿菌細(xì)胞，于37℃，在含有50μg/ml氨芐青霉素的2YT(每升含16g bacto胰蛋白酶，10g bacto-酵母提取物，5gNaCl)瓊脂平板上生長過夜。挑取單克隆放入含有相同濃度氨芐青霉素的2毫升2YT培養(yǎng)基中。細(xì)菌培養(yǎng)物在37℃平穩(wěn)振蕩培養(yǎng)6小時。接著，將細(xì)菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入1L 2YT培養(yǎng)基，在20℃進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物到達(dá)對數(shù)生長期時(A600nm～0.5)，加入0.1mM的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。在4℃，7,000×g離心5分鐘收集細(xì)胞并重新懸浮于5ml球狀細(xì)胞(Spheroblast)緩沖液中(0.5mM EDTA，750mM蔗糖，200mM Tris，pH8.0)。加入溶菌酶溶液至終濃度為1mg/ml。立即將7倍體積的0.5×球狀細(xì)胞緩沖液倒入懸浮液，輕微搖晃下在4℃孵育30分鐘。在4℃，12,000×g離心5分鐘收集球狀細(xì)胞，并重新懸浮于5ml冰冷的PBL緩沖液(140mM NaCl，80mM NA2HPO4，15mM KH2PO4)中。立即往懸浮液中加入2mM的PMSF，并在4℃，12,000×g離心20分鐘以除去細(xì)胞碎片。離心后，將上清轉(zhuǎn)移至一15ml試管中，加入200μl 50％(v/v)的谷胱甘肽偶聯(lián)的Sepharose 4B漿料，將混合物在室溫下輕柔混合30分鐘。然后，將混合物以非常慢的速度(500×g)離心1分鐘，棄去上清液。以5ml冰冷的PBS緩沖液洗滌珠子三次。在每次清洗之后，象上面描述的那樣短時間的離心來沉淀Sepharose珠。為從Sepharose珠中回收表達(dá)的蛋白，用100μl 20mM的還原型谷胱甘肽重新懸浮珠子。在室溫下孵育10分鐘后，收集珠子和含有表達(dá)蛋白的上清。洗脫步驟重復(fù)一次，兩次上清組份進(jìn)行合并，于4℃儲存，用于蛋白測定和更進(jìn)一步的研究。
蛋白濃度測定將10μl蛋白溶液加入900μl蒸餾水和200μl Bio-Rad蛋白測定染料中進(jìn)行蛋白測定。讀取595nm處的吸收值。用一系列不同濃度的BSA(牛血清白蛋白)作標(biāo)準(zhǔn)?；贐SA濃度對595nm吸收值的坐標(biāo)畫出回歸線。因此從蛋白測定后的回歸線上估算出蛋白樣品的蛋白濃度。
酶活性測定將2μg重組蛋白和14mM 2-巰基乙醇、5mM UDP-葡萄糖、1mM不同的木質(zhì)素或抗氧化劑底物、100mM Tris(pH7.0)混合至總體積為200μl來建立標(biāo)準(zhǔn)的葡糖基化反應(yīng)。反應(yīng)在30℃進(jìn)行30分鐘，然后添加20μl三氯乙酸(240mg/ml)終止。在液相色譜分析前，所有的樣品儲藏于-20℃。
高效液相層析反相HPLC(Waters 2690分離器和Waters 486可調(diào)吸收檢測器，WatersLimited，Herts，UK)使用Columbus 5μC18柱(250×4.60mm，Phenomenex)。以1ml/min，用超過20分鐘的乙腈/水線性梯度(所有溶液均含0.1％三氟醋酸)將葡萄糖偶聯(lián)物與其糖苷配基分離。HPLC方法描述如下肉桂酸，λ288nm，10～55％乙腈；p-香豆酸，λ311nm；10～25％乙腈；咖啡酸，λ311nm，10～16％乙腈；阿魏酸，λ311nm，10～35％乙腈；芥子酸，λ306nm，10～40％乙腈；p-香豆醛，λ315nm，10～46％乙腈；松柏醛，λ283nm，10～47％乙腈；芥子醛，λ280nm，10～47％乙腈；p-香豆醇，λ283nm，10～27％乙腈；松柏醇，λ306nm，10～25％乙腈；芥子醇，λ285nm，10～25％乙腈。葡萄糖偶聯(lián)物保留時間(Rt)的分析列表如下肉桂酰葡萄糖，Rt＝12.3分鐘；p-香豆酰葡萄糖，Rt＝10.6分鐘；咖啡酰葡萄糖，Rt＝8.5分鐘；阿魏酰葡萄糖，Rt＝10.3分鐘；芥子酰葡萄糖，Rt＝9.7分鐘；咖啡酰-4-葡糖苷，Rt＝6.8分鐘；阿魏酰-4-O-葡糖苷，Rt＝7.8分鐘；芥子酰-4-O-葡糖苷，Rt＝8.2分鐘；松柏苷，Rt＝8.2分鐘；丁香苷，Rt＝9.1分鐘。
對于木質(zhì)素生物合成途徑的主要中間體，重組GTase已顯示出具有GTase的活性(表5和表6)。從這些結(jié)果很明顯可以看出，相對于每一個所利用的各種木質(zhì)素前體底物，GTase顯示出不同的比活性反應(yīng)特性。
對于幾個針對各自最佳底物的GTase也進(jìn)行了Michaelis-Menten動力學(xué)研究(表7和表8)。從這些結(jié)果很明顯可以看出，對于不同底物，GTase顯示出不同的酶動力學(xué)。
結(jié)果(所有的)表明，某些GTase在改變植物中木質(zhì)素生物合成方面，較其它的GTase顯示出更大的使用潛力。
減少植物中單木質(zhì)醇葡糖苷的形成在一種減少植物中單木質(zhì)醇葡糖苷形成的方法中，使用一種反義策略(A)，將A119和A407負(fù)調(diào)控。A119和A407反義序列的表達(dá)是由基因本身的啟動子驅(qū)動的。另外一種方法(B)是通過體外誘變的方法來修飾UDP-葡萄糖的結(jié)合基元(Lim et al.，1998)，這樣，突變蛋白能夠結(jié)合單木質(zhì)素底物但失去了它的催化活性。這種突變蛋白被認(rèn)為是通過特異地和單木質(zhì)素結(jié)合來同有功能的天然蛋白競爭。
反義方法A119和A407啟動子序列的擴(kuò)增和克隆約2kb的A119和A407的5’旁側(cè)序列通過PCR直接從基因組DNA擴(kuò)增出來。然后，將啟動子片段克隆入pBluescript質(zhì)粒載體(Sambrook et al.，1989)。
構(gòu)建A119和A407啟動子和它們反義起始ORF區(qū)的嵌合基因用PCR從pGEXA119和pGEXA407擴(kuò)增A119和A407 cDNA片段。然后將片段相關(guān)連接至在(A)-(1)中描述的有反義起始ORF區(qū)的A119和A407啟動子結(jié)構(gòu)中。
包含A119和A407反義嵌合基因雙體結(jié)構(gòu)的制備包含A119和A407反義嵌合基因的DNA片段通過PCR從在(A)-(2)中描述的嵌合結(jié)構(gòu)中擴(kuò)增出來。然后將該片段連接入一種雙體載體(Sambrooket al.，1989)。接著將最終的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化入植物。
基因突變方法在A119和A407中修飾UDP-葡萄糖結(jié)合基元的體外點(diǎn)突變用PCR進(jìn)行體外點(diǎn)突變，以修飾在A119和A407中編碼UDP-葡萄糖結(jié)合基元的序列(Lim et al.，1998)。在PCR反應(yīng)中，pGEXA119和pGEXA407的結(jié)構(gòu)作為DNA模板使用。
構(gòu)建由A119和A407啟動子調(diào)控的嵌合突變基因用PCR從(B)-(1)中描述的pGEXA119和pGEXA407突變結(jié)構(gòu)擴(kuò)增A119和A407突變基因。然后將A119和A407突變基因片段連接至(A)-(1)中描述的有反義起始ORF區(qū)的A119和A407啟動子結(jié)構(gòu)中。
包含A119和A407嵌合突變基因的雙體結(jié)構(gòu)的制備用PCR從(B)-(2)中描述的嵌合結(jié)構(gòu)擴(kuò)增包含A119和A407嵌合突變基因的DNA片段。然后，將這些片段連接至一種雙體載體(Sambrook et al.，1989)。接著將最終的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化到植物中。
促進(jìn)植物中單木質(zhì)醇葡糖苷的形成用CaMV 35S啟動子片段驅(qū)動A119和A497的表達(dá)。用PCR從pGEXA119和pGEXA407相應(yīng)地擴(kuò)增包含A119和A407 ORF序列的DNA片段。將這些DNA片段連接至CaMV 35S啟動子的下游。用這種結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化植物，由此改變木質(zhì)素的含量和組成。
表1十一種擬南芥(Arabidopsis)GTase基因數(shù)據(jù)庫信息
所使用的用于搜索上述擬南芥序列的參數(shù)和程序如下NETBLAST缺省設(shè)置Infile2＝nrMatrix＝Blosum 62Translate＝1Dbtranslate＝1表2 從基因組DNA擴(kuò)增11種擬南芥GTase序列所使用的DNA序列和引物中限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與任一ORFs末端互補(bǔ)的序列用下劃線標(biāo)出。用于構(gòu)建表達(dá)結(jié)構(gòu)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)以粗體形式標(biāo)出。
引物 DNA序列(5’→3’) 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)A062 5’CGGGTGATCAGGTACCATGGCGCCACCGCATTTTCBell和KpnlA062 3’CGGAATTCGTCGACTTACTTTACTTTTACCTCCTCEcoRl和SallA320 5’CCCCCGGGTACCATGGAGCTAGAATCTTCTCTCCSmal和KpnlA320 3’CGGAATTCTCGAGTTAAAAGCTTTTGATTGATCCBamHlA41 5’TGGGATCCATATCAGAAATGGTGTTCEcoRIA41 3’GGGAATTCCTAGTATCCATTATCTTTAGTCBamHIA42 5’GGGGATCCATGGACCCGTCTCGTCATACTCEcoRl
A42 3’GGGAATTCCACTAGTGTTCTCCGTTGTCTTCKpnl和BellA43 5’GGGGATCCAATATGGAGATGGAATCGTCGTTACBamHlA43 3’GGGAATTCCTTACACGACATTATTAATGTTTGEcoRlA911 5’GGGGTACCTGATCAATAATGGGCAGTAGTGAGGGKpnl和BellA911 3’CGGAATTCGTCGACGAGTTAGGCGATTGTGATATCEcoRl和SallA119 5’CGGGATCCGGTACCATGCATATCACAAAACCACACBamHI和KpnlA119 3’CGGAATTCGCTAGCTAAGCACCACGTGACAAGTCCEcoRl和NhelA233 5’CGGGATCCGGTACCATGAGTAGTGATCCTCATCGTBamHl和KpnlA233 3’CGGGATCCGAATTCTACGAGGTAAACTCTTCTATGBamHl和EcoRlA407 5’CGGGATCCGGTACCATGCATATCACAAAACCACBamHl和KpnlA407 3’CGGAATTCGTCGACCTAAGCACCACGTCCCAAGEcoRl和SallA961 5’GGGTGATCAGGTACCATGGGGAAGCAAGAAGATGBell和KpnlA961 3’CGGAATTCGTCGACTACTTACTTATAGAAACGCCGEcoRl和SallA962 5’GAAGATCTGGTACCATGGCGAAGCAGCAAGAAGBglII和KpnlA962 3’CGGAATTCGTCGACCGATCAAAGCCCATCTATGEcoRl和Sall表3 PCR程序時期I(1個循環(huán))時期II(40個循環(huán)) 時期III(1個循環(huán))95℃ 5分鐘95℃1分鐘 95℃ 2分鐘55℃ 2分鐘55℃1分鐘 55℃ 2分鐘72℃ 3分鐘72℃2分鐘 72℃ 5分鐘表4 HPLC條件木質(zhì)素前體乙腈梯度(％) 檢測波長(nm)肉桂酸 10-55 288p-香豆酸 10-25 311咖啡酸 10-16 311阿魏酸 10-35 311芥子酸 10-40 306p-香豆醛 10-46 315松柏醛 10-47 283芥子醛 10-47 280
p-香豆醇 10-27283松柏醇10-25306芥子醇10-25285表5 針對木質(zhì)素前體產(chǎn)生葡萄糖酯的重組GTase的比活性每次測定總體積為200μl，包含0.5mM潛在底物，5mM UDPD和0.2μg重組GTase。反應(yīng)物在20℃孵育30分鐘，然后添加20μl三氯乙酸(240mg/ml)終止反應(yīng)。然后用HPLC分析每種反應(yīng)混合物。重組GTase的比活性(nkat/mg)用在20℃、上述反應(yīng)條件下1mg蛋白每秒轉(zhuǎn)化底物至葡萄糖酯的底物量(nmol)來表示。
A41A320 A42 A43A911A062肉桂酸 0.30 0.06 14.21 0.02 8.771.62p-香豆酸 13.53 0.05 4.690.03 4.312.54咖啡酸 2.61 0.05 0.620.01 0.770.26阿魏酸 6.64 0.54 15.63 0.04 2.880.08芥子酸 5.35 15.58 11.97 0.05 0.150.1表6 針對木質(zhì)素前體產(chǎn)生O-葡糖苷的重組GTase的比活性采用表1中描述的條件建立反應(yīng)。所有的反應(yīng)，除了那些含有醛的，均添加TCA予以終止。反應(yīng)結(jié)束后立即將醛測定混合物注射入HPLC。重組GTase的比活性(nkat/mg)用在30℃、上述反應(yīng)條件下1mg蛋白每秒轉(zhuǎn)化底物至4-O-葡糖苷的底物量(nmol)來表示。
A233 A119A407A961A962肉桂酸NDaND ND ND NDp-香豆酸 0.09 0.020.010.010.01咖啡酸0.48 0.130.070.07ND阿魏酸0.37 14.48 0.25ND ND芥子酸0.39 102.56 65.39 0.010.01p-香豆醛 ND0.03ND 0.01 0.02松柏醛ND1.08ND 0.16 0.34芥子醛ND4.55ND 0.57 0.50p-香豆醇 NDND ND ND ND松柏醇0.46 67.53 2.78 0.57 0.49芥子醇0.05 126.16 114.76 0.35 0.45aND，未測定表7對于針對木質(zhì)素前體產(chǎn)生葡萄糖酯的重組GTase的動力學(xué)研究A41 A320A42 A911 A062KmVmaxKmVmaxKmVmaxKmVmaxKmVmaxMM nkat/mg mM nkat/mg mM nkat/mg mMnkat/mg mMnkat/mg1.51- 1.80 -0.72 -1.05 - 2.36 -- - - -0.49 19.420.05 9.064.33 2.870.1016.13 - -0.40 6.67 0.39 11.10 5.05 4.910.0620.24 - -0.20 1.67 0.23 1.18- -0.3511.35 - -0.36 18.350.34 6.91- -0.246.780.06 8.37 0.13 12.80- - - -表8 對于針對木質(zhì)素前體產(chǎn)生O-葡糖苷的重組GTase的動力學(xué)研究A119 A407KmVmaxKmVmaxmM nkat/mg mM nkat/mgUPDG 0.93 - 0.89-阿魏酸0.25 18.87 - -芥子酸0.51 131.580.1475.19松柏醇0.26 92.59 - -芥子醇1.10 322.581.07357.10
表9 在氘化甲醇中，分別于500MHz和125MHz記錄1H和13C核磁共振光譜。以TMS為內(nèi)標(biāo)在δ標(biāo)尺上給出化學(xué)位移。芳香環(huán)位置始于連接丙酸的碳。d，雙峰；dd，雙聯(lián)體的雙峰；m，多重峰；J.偶聯(lián)常數(shù)。位置 咖啡酸 咖啡酰-3-O-葡糖苷δHδCδHδCC1 -128.1 - 127.6C2 7.02(1H，d，J＝2.0Hz)115.27.47(1H，d，J＝2.0Hz)117.0C3 -146.7 - 146.0C4 -149.4 - 150.6C5 6.77(1H，d，J＝8.0Hz)116.66.84(1H，d，J＝8.5Hz)117.8C6 6.92(1H，dd，J＝8.0，2.0Hz) 122.87.13(1H，dd，J＝8.5，2.0Hz) 125.6C7 7.53(1H，d，J＝16.0Hz) 146.97.45(1H，d，J＝14.5Hz) 146.6C8 6.21(1H，d，J＝15.5Hz) 116.36.33(1H，d，J＝14.5Hz) 116.1C9 -171.5 - 170.4Glc-1 ～4.86(信號中斷) 103.9 Glc-6 3.93(1H，dd，J＝12.0，2.0Hz) 62.43.71(1H，dd，J＝12.0，5.5Hz)表10 每次測定含有1μg，UGT71C1，1mM酚化合物，5mM UDP-葡萄糖，1.4mM 2-巰基乙醇和50mM TRIS-HCl，pH7.0?；旌衔镌?0℃孵育30分鐘，然后添加20μl三氯乙酸(240mg/ml)終止反應(yīng)。接著用反相HPLC進(jìn)行分析。結(jié)果用三次實(shí)驗(yàn)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。
底物比活性nkat/mgo-香豆酸1.5±0.2m-香豆酸1.2±0.2p-香豆酸0咖啡酸 2.9±0.8阿魏酸 0芥子酸 0七葉亭 34.8±4.2莨菪亭 29.4±3.9水楊酸 04-羥基苯甲酸03，4-二羥基苯甲酸 0圣草酚 0藤黃菌素0.7±0.1五羥黃酮1.4±0.4兒茶酸 0花青素 0
權(quán)利要求
1.包含編碼一種多肽的核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物i)具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性；ii)選自圖1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A、10A、11A、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32的序列；iii)與上述(ii)中描述的序列雜交的核酸分子；和iv)作為遺傳密碼結(jié)果的與上述(ii)和(iii)所定義的序列簡并的核酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，核酸分子是在與圖1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A、10A、11A、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32所示序列嚴(yán)格雜交條件下進(jìn)行退火。
3.如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，核酸分子選自圖7A或9A。
4.一種包含核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，核酸分子是選自i)反義序列，所述反義序列選自圖1C、2C、3C、4C、5C、6C、7C、8C、9C、10C和11C中的序列或其部分，或圖12-32中描述的有義序列的反義序列；ii)抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性與權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述有義序列雜交的反義序列。
5.如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，反義序列是選自圖7C或9C。
6.如權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，核酸是cDNA。
7.如權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，核酸是基因組DNA。
8.如權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，植物是木本植物，選自白楊屬植物，桉樹屬植物，道格拉斯樅樹，松樹，胡桃屬植物，梣樹，樺樹，櫟屬植物，柚木樹，云杉屬植物。
9.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，植物是典型用于造紙工業(yè)的木本植物，如白楊屬植物。
10.如權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，植物是非木本植物種系。
11.一種制造紙張或板的方法，包括i)將從權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因木本植物得到轉(zhuǎn)基因木質(zhì)材料制漿；和ii)從所述已制漿的轉(zhuǎn)基因木質(zhì)材料生產(chǎn)紙張。
12.具有以權(quán)利要求11的方法制造的紙張?zhí)匦缘募垺?br> 13.含有權(quán)利要求12的紙的產(chǎn)品。
14.包含編碼一種多肽的核酸分子的轉(zhuǎn)基因真核細(xì)胞i)具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性；ii)選自圖1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A、10A、11A、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32的序列；iii)與上述(ii)中所述序列雜交的核酸；和iv)作為遺傳密碼結(jié)果的與上述(ii)和(iii)所定義的序列簡并的核酸序列。
15.如權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)基因真核細(xì)胞，其特征在于，核酸序列選自圖1A、3A、4A、5A、8A、10A、11A、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、32。
16.如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因真核細(xì)胞，其特征在于，核酸序列為圖1A、3A、4A、5A、7A、8A、9A、10A所列出的。
17.如權(quán)利要求14～16中任一項(xiàng)所述的真核細(xì)胞在咖啡酸，藤黃菌素，五羥黃酮，兒茶酸，花青素葡糖基化上的用途。
18.包含編碼一種多肽的核酸分子的轉(zhuǎn)基因原核細(xì)胞i)具有葡糖基轉(zhuǎn)移酶活性；ii)選自圖1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A、9A、10A、11A、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32的序列；iii)與在上述(ii)中所述序列雜交的核酸；和作為遺傳密碼結(jié)果的與上述(i)和(ii)所定義的序列簡并的核酸。
19.如權(quán)利要求18所述的轉(zhuǎn)基因原核細(xì)胞，其特征在于，核酸序列選自圖1A、3A、4A、5A、8A、10A、11A、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、28、29、30、31、32。
20.如權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因原核細(xì)胞，其特征在于，核酸序列為圖1A、3A、4A、5A、7A、8A、9A、10A所列出的。
21.如權(quán)利要求18～20中任一項(xiàng)所述的原核細(xì)胞在咖啡酸，藤黃菌素，五羥黃酮，兒茶酸，花青素葡糖基化上的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及以編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶多肽(GTase)的核酸轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及所述細(xì)胞轉(zhuǎn)化中使用的載體。
文檔編號C12N15/82GK1404528SQ01804734
公開日2003年3月19日 申請日期2001年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月9日
發(fā)明者D·J·鮑爾斯, Y·李, E·－K·林 申請人:約克大學(xué)