專利名稱：肺炎支原體檢測(cè)用抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到作為一般的肺炎病原微生物屬于肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)的微生物檢測(cè)中有用的抗體、該微生物的檢測(cè)方法、該微生物的檢測(cè)用試劑盒、以及該微生物檢測(cè)用抗體的制造方法。
本發(fā)明在醫(yī)藥業(yè)，特別是在由肺炎支原體引起的非典型肺炎的診斷中很重要，在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)上是有用的。
本發(fā)明在諸如從咽喉棉簽、組織樣品、體液實(shí)驗(yàn)用溶液和培養(yǎng)物采集的檢測(cè)樣品中含有的微生物肺炎支原體的檢測(cè)中很有用。
感染癥病原菌的檢測(cè)一般分為經(jīng)過(guò)病原菌的分離培養(yǎng)、根據(jù)其生理學(xué)上、生物化學(xué)上或結(jié)構(gòu)上的特性對(duì)其進(jìn)行鑒定的培養(yǎng)鑒定法；通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或特異的核酸雜交使病原菌的基因擴(kuò)增，對(duì)該基因進(jìn)行檢測(cè)的基因診斷法以及利用抗體和病原菌的抗原標(biāo)記物的特異反應(yīng)檢測(cè)病原菌的免疫學(xué)方法。
然而使用培養(yǎng)鑒定法或基因診斷法時(shí)，要獲得結(jié)果花費(fèi)的時(shí)間長(zhǎng)。因此利用能夠在短時(shí)間內(nèi)、高靈敏度地對(duì)病原菌進(jìn)行檢測(cè)，迅速地與相應(yīng)患者的治療聯(lián)系起來(lái)的免疫學(xué)方法的診斷被廣泛采用。
以往在利用免疫學(xué)方法檢測(cè)感染癥病原菌時(shí)，使用因菌種各異的標(biāo)記抗原和抗體的組合。
肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)是肺炎、支氣管炎和咽喉炎的一般病原菌。是小的、類真菌的革蘭氏陰性菌，有選擇地侵入人體內(nèi)，引起疾病。一般在社會(huì)上集團(tuán)式發(fā)病的肺炎約15～20，以及被限定的集團(tuán)內(nèi)的肺炎達(dá)到50％，人們認(rèn)為是由肺炎支原體引起的(Ragnar Norrby1999)。
該細(xì)菌是非常微小的難以培養(yǎng)的微生物，在濃厚培養(yǎng)基中形成小的菌落。在富營(yíng)養(yǎng)化瓊脂培養(yǎng)基中肺炎支原體的生長(zhǎng)非常緩慢，能夠在培養(yǎng)基中鑒定到細(xì)菌至少需要21日(Granato，Poe，et al.1980)。來(lái)源于人體內(nèi)的幾種支原體屬(Mycoplasma)種微生物可引起同樣的生物化學(xué)反應(yīng)。另外由于沒(méi)有細(xì)胞壁，使得在明亮的顯微鏡下觀察更困難(Knudson和Macleod 1979)。因此作為迅速檢測(cè)病原菌的診斷方法不能使用革蘭氏染色法和培養(yǎng)法等。
肺炎支原體檢測(cè)基因序列中使用的DNA雜交分析探針由Hyman等人、Buck等人和Bernet等人(Hyman，Yogev et al.1987；Bernet，Garret等1993；Buck，O’Hara等1993)已有報(bào)道。肺炎支原體核糖體RNA(rRNA)檢測(cè)使用的探針由Tilton等人(Tilton，Dias等1980)、Yogev等人(Yogev，Halachmi等1988)、Gobel等人(Gobel，Geiser等1987)、ZiVin和Monahan(EPO 305145)以及Gobel和和Stanbridge(EPO 0250662)等都有報(bào)道。Kai等人(Kai，Kamiya等1987)和Jensen等人(Jensen，Songergard-和ersen等1993)等報(bào)道了肺炎支原體的16SrRNA序列的引物。這里敘述的所有探針都是針對(duì)肺炎支原體的DNA或肺炎支原體的DNA或尿殖道支原體(Mycoplasma genitalium)的DNA設(shè)計(jì)的。由于這些探針靈敏度比較高，通過(guò)最近成為可利用的技術(shù)PCR法可以捕捉它們。PCR法靈敏度非常高，而且可以在很短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行雜交。但是往往存在著培養(yǎng)肺炎支原體陰性的無(wú)癥狀的人以及病愈后的帶菌人表現(xiàn)出陽(yáng)性的假陽(yáng)性問(wèn)題。
特開昭63-298號(hào)公報(bào)報(bào)道了以使用抗大約43kDa的肺炎支原體膜抗原蛋白質(zhì)的單克隆抗體的Western印跡法作為基礎(chǔ)的免疫檢測(cè)法。但存在著上述抗體和使用該抗體的檢測(cè)法特異性非常低，針對(duì)肺炎支原體種的特異性診斷不充分的問(wèn)題。而且還存在著利用該診斷方法到得到結(jié)果至少要花費(fèi)5小時(shí)以上時(shí)間的問(wèn)題(Madsen et al.1988)。
發(fā)明概述本發(fā)明正是為了解決上述那樣的課題而形成的發(fā)明。即，本發(fā)明將提供能夠特異、而且高靈敏度迅速地檢測(cè)屬于肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)的微生物的方法，該檢測(cè)中使用的檢測(cè)用抗體、檢測(cè)用試劑盒作為課題。另外本發(fā)明還將提供檢測(cè)使用的抗體的制造方法作為課題。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了在所有微生物中保持同一功能的蛋白質(zhì)可作為有用的抗原。通常人們預(yù)想這樣的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化非常小。然而令人吃驚的是抗該蛋白質(zhì)抗體是微生物種或?qū)偬禺愋钥贵w，抗該蛋白質(zhì)抗體在用于微生物種或?qū)偬禺愋宰R(shí)別可能具有多樣性的同時(shí)，發(fā)現(xiàn)能夠檢測(cè)作為檢測(cè)對(duì)象的微生物的所有血清型。更詳細(xì)地講該蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)氨基酸序列的變化在同一種類間結(jié)構(gòu)完全相同，種類不同時(shí)，是表現(xiàn)出伴隨著結(jié)構(gòu)的變化的種特異性的有用的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明人著眼于以同一功能分子存在于所有微生物細(xì)胞的，而其氨基酸結(jié)構(gòu)在微生物間有一定差異的細(xì)胞內(nèi)分子、特別是一種核糖體蛋白-核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)。已知核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)是分子量約為13kDa的蛋白質(zhì)，是蛋白質(zhì)合成所必需的核糖體蛋白質(zhì)。特別是在包括肺炎支原體在內(nèi)的幾種微生物中的核糖體蛋白L7/L12的全部氨基酸序列已被解析。
本發(fā)明人除了注意到該分子在微生物間類似之外，還注意到其一部分含有各個(gè)微生物固有的結(jié)構(gòu)部分，發(fā)現(xiàn)通過(guò)利用抗該肺炎支原體的核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)的抗體有可能對(duì)各種各樣的微生物、細(xì)菌的種特異的、而且所有同一菌種內(nèi)血清型進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明人通過(guò)得到的抗肺炎支原體的該蛋白的特異抗體，發(fā)現(xiàn)利用該抗體有可能對(duì)肺炎支原體進(jìn)行特異性檢測(cè)，直至完成了本發(fā)明。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)并開發(fā)了對(duì)肺炎支原體的核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)特異的單克隆抗體。該抗體是新的抗體，與以往眾所周知的任一抗體都不同，具有與上述蛋白質(zhì)進(jìn)行特異反應(yīng)的性質(zhì)。
序列表中序列1和2分別是肺炎支原體的核糖體蛋白L7/L12基因的DNA序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列(NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查詢碼#NC#000912)。另外序列表記載的氨基酸序列的左端和右端分別是氨基末端(以下稱為N端)和羧基末端(以下稱為C端)，而堿基序列的的左端和右端分別是5’端和3’端。序列比對(duì)測(cè)試的氨基酸序列用氨基酸單字母縮寫表示。而序列比對(duì)測(cè)試中「+」標(biāo)記表示有差別的氨基酸，但疏水性等性質(zhì)類似的氨基酸，「」中的空白表示包括性質(zhì)在內(nèi)都不相同的氨基酸。而本發(fā)明敘述的基因操作的一系列分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)根據(jù)通常實(shí)驗(yàn)書記載的方法進(jìn)行。作為上述一般的實(shí)驗(yàn)書如《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》[Molecular Cloning，Alaboratory manual，Cold Spring Harber Laboratory Press，Sambrook，J.等人(1989)]。表1序列比對(duì)測(cè)試Mp1 MAKLDKNQLIESLKEMTIMEIDEIIKAVEEAFGVSATPVVAAGAVGGTQEAASEVTVKVT601 M KLDK QLIESLKEMTI+EIDEIIKAVEEAFGV+ATP+VAAGA G TQEAASEV+VKVTMg1 MGKLDKKQLIESLKEMTIVEIDEIIKAVEEAFGVTATPIVAAGAAGATQEAASEVSVKVT60Mp61 GYTDNAKLAVLKLYREIAGVGLMEAKTAVEKLPCVVKQDIKPEEAEELKKRFVEVGATVE 120GY DNAKLAVLKLYREI GVGLMEAKTAVEKLPCVVKQDIKPEEAEELKKRFVEVGATVEMg61 GYADNAKLAVLKLYREITGVGLMEAKTAVEKLPCVVKQDIKPEEAEELKKRFVEVGATVE 120Mp121 IK 122+KMg121 VK 122本發(fā)明中所謂“微生物”指的是肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)，特別是指呼吸器官中有病原性作為支原體感染癥的病原菌有很高診斷意義的微生物。本發(fā)明中所謂“與微生物進(jìn)行特異反應(yīng)的抗體”指的是與微生物種或?qū)龠M(jìn)行特異反應(yīng)的抗體，在微生物感染癥的診斷中對(duì)微生物種進(jìn)行特異反應(yīng)的抗體特別有用。
本發(fā)明中的抗體指的是多克隆抗體或單克隆抗體，可以通過(guò)使用核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)或其部分肽制備。制備抗體用的肽的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限定，在制備抗核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)抗體時(shí)，只要是賦予該蛋白質(zhì)特征的長(zhǎng)度都可以，優(yōu)選是5個(gè)氨基酸以上，特別優(yōu)選使用8個(gè)氨基酸以上的肽。將該肽或全長(zhǎng)蛋白質(zhì)直接、或與稱之為KLH(匙孔鱟血藍(lán)蛋白keyhole-limpet hemocyanin)的載體蛋白質(zhì)搭橋后根據(jù)需要同時(shí)與佐劑一起接種動(dòng)物，通過(guò)回收該血清，可以獲得含有識(shí)別核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的抗體(多克隆抗體)的抗血清。也可以從抗血清中純化出抗體后再使用。作為接種的動(dòng)物有羊、馬、山羊、兔、小鼠、大鼠等，特別是在制備多克隆抗體時(shí)，優(yōu)選羊、兔等。另外利用制備骨髓瘤細(xì)胞的眾所周知的方法也可以獲得單克隆抗體，此時(shí)優(yōu)選小鼠。
對(duì)將該蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)或5個(gè)殘基以上、最好是8個(gè)殘基以上的氨基酸序列與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)等作成融合蛋白的產(chǎn)物進(jìn)行純化、或也可以不純化直接用作抗原。
可以通過(guò)已出版書(《抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》Antibodiesa laboratorymanual，E.Harlow等，Cold Spring Harbor Laboratory)給出的各種方法以及基因克隆法等使用分離到的免疫球蛋白基因，使其在培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)的基因重組抗體來(lái)制備。
可以用作本發(fā)明的標(biāo)記抗原的核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的抗體可以通過(guò)以下方法或其類似的其它方法獲得，但不限定于這些方法。a)對(duì)于核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的基因序列和氨基酸序列已知的微生物來(lái)說(shuō)，通過(guò)合成與其它微生物中該蛋白質(zhì)的氨基酸序列類似性少區(qū)域的肽段，以此作為免疫原制備多克隆抗體、或單克隆抗體來(lái)獲得目的抗體。
另外通過(guò)以已知的該基因的兩端部位的DNA序列作為探針的PCR法進(jìn)行的基因擴(kuò)增、以相同部分序列作為模板探針的雜交法等通常的基因操作手法可以獲得該基因的全長(zhǎng)序列。
然后構(gòu)建與其它蛋白質(zhì)基因的融合基因，以大腸桿菌為宿主通過(guò)眾所周知的基因?qū)敕▽⒃撊诤匣虿迦氲剿拗鲀?nèi)，使其大量表達(dá)后，利用抗融合蛋白質(zhì)的抗體親和柱法等純化表達(dá)蛋白質(zhì)，可以獲得目的蛋白質(zhì)抗原。此時(shí)由于核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)作為抗原，所以即便獲得了針對(duì)微生物間保守氨基酸部分的抗體也不符合本發(fā)明的目的。因此，對(duì)于按照本方法獲得的抗原，通過(guò)眾所周知的手法可以獲得產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，通過(guò)選擇只與該微生物反應(yīng)的抗體的克隆可以獲得目的抗體。b)對(duì)于核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的氨基酸序列未知的微生物來(lái)說(shuō)，其一，由于核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的氨基酸序列在微生物種間有50～60％同源性，首先以該氨基酸序列相同部分的序列為基礎(chǔ)利用PCR法對(duì)特定序列部分進(jìn)行擴(kuò)增和通過(guò)以同源部分序列作為探針的雜交法等通常的基因操作手法可以很容易地獲得該蛋白質(zhì)的基因。
然后構(gòu)建與其它蛋白質(zhì)基因的融合基因，以大腸桿菌為宿主通過(guò)眾所周知的基因?qū)敕▽⒃撊诤匣虿迦氲剿拗鲀?nèi)，使其大量表達(dá)，利用抗融合蛋白質(zhì)的抗體親和柱法等純化表達(dá)蛋白質(zhì)，可以獲得目的蛋白質(zhì)抗原。此時(shí)由于核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)作為抗原，所以即便獲得了針對(duì)微生物間保守氨基酸部分的抗體也不符合本發(fā)明的目的。因此，對(duì)于按照本方法獲得的抗原，通過(guò)眾所周知的手法可以獲得產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，通過(guò)選擇只與該微生物反應(yīng)的抗體的克隆可以獲得目的抗體。c)或者作為核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的氨基酸序列未知的情況下的其它方法，可以制備相當(dāng)于在已知的對(duì)于核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的氨基酸序列中微生物間保守的共同序列部分5～30氨基酸的合成肽，利用眾所周知的方法制備針對(duì)該肽序列的多克隆抗體或單克隆抗體。通過(guò)使用該抗體的親和柱層析通過(guò)對(duì)目的微生物的細(xì)胞破碎液進(jìn)行純化，可以獲得高度純化的核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)的純度不夠時(shí)可以通過(guò)眾所周知的純化手法-離子交換層析、疏水層析、凝膠過(guò)濾等手法純化后通過(guò)利用制作的抗體的Western印跡等方法對(duì)核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的洗脫級(jí)分進(jìn)行鑒定，可以獲得純化的蛋白質(zhì)。以得到的純化的核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)抗原作為基礎(chǔ)通過(guò)眾所周知的方法獲得雜交瘤，通過(guò)選擇與目的微生物進(jìn)行特異反應(yīng)的雜交瘤可以獲得目的抗體。
通過(guò)上述方法a)、b)和c)得到的對(duì)各種微生物特異的本發(fā)明的抗體可以用于使用對(duì)靶微生物特異的各種診斷試劑和試劑盒的各種免疫學(xué)分析方法中。例如，該抗體可以用于作為眾所周知測(cè)定方法的使該抗體吸附于聚苯乙烯膠乳粒子上的凝集反應(yīng)、在微滴板中進(jìn)行的眾所周知技術(shù)ELISA法、已有的免疫層析法、使用著色粒子或具有發(fā)色能力的粒子、或被捕捉(capture)抗體和用酶或熒光物標(biāo)記的該抗體一起包被的磁微粒子等夾層分析等已知的所有的免疫測(cè)定手法。
所謂使用抗體的微生物診斷方法指的是利用使該抗體吸附于聚苯乙烯膠乳粒子上的凝集反應(yīng)、在微滴板中進(jìn)行的眾所周知技術(shù)ELISA法、已有的免疫層析法、使用著色粒子或具有發(fā)色能力的粒子、或使用被捕捉(capture)抗體和用酶或熒光物標(biāo)記的該抗體一起包被的磁微粒子等夾層分析等已知的所有免疫測(cè)定手法的診斷方法。
另外，作為使用抗體的特別有用的微生物診斷方法通過(guò)在由特表平7-509565號(hào)公報(bào)記載的硅、氮化硅等形成的光學(xué)薄膜上進(jìn)行的抗體反應(yīng)通過(guò)光干涉原理等進(jìn)行檢測(cè)的所謂光免疫分析法(OIA，OpticalImmunoassay)等作為高靈敏度的診斷方法很有用。
而在該檢測(cè)方法中所必需的來(lái)自微生物細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記抗原的提取方法可以利用通過(guò)使用TritonX-100，Tween-20為代表的各種表面活性劑的萃取試劑的處理法、使用適當(dāng)?shù)牡鞍酌傅让傅拿柑幚矸?、通過(guò)物理方法使微生物細(xì)胞破碎等已知的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破碎方法。希望通過(guò)表面活性劑等的組合對(duì)于每種微生物設(shè)定使用試劑進(jìn)行的最適萃取條件。
而所謂本發(fā)明中利用抗體的微生物檢測(cè)用試劑盒相當(dāng)于利用該檢測(cè)方法的檢測(cè)用試劑盒。
肺炎支原體的核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的氨基酸序列及其DNA序列如序列表所示。因此，可以將該微生物的核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的氨基酸序列與序列表記為序列比對(duì)的類似的微生物的同種蛋白質(zhì)進(jìn)行比較。合成同源性低部分的肽，制備抗該肽多克隆抗體或單克隆抗體有可能省略對(duì)微生物具有特異性的抗體的選擇。
特別是多克隆抗體的情況，將免疫的動(dòng)物的抗血清利用Protein A柱進(jìn)行純化，獲得IgG級(jí)分之后，希望進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物免疫用合成肽的親和層析進(jìn)行純化。
另外根據(jù)來(lái)自該微生物的核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的DNA序列的N末端和C末端的序列制備PCR引物。
利用該P(yáng)CR引物的同源性，使用基因組DNA通過(guò)PCR法使DNA片段擴(kuò)增，對(duì)DNA片段進(jìn)行萃取，按照常規(guī)方法可以獲得肺炎支原體的核糖體蛋白質(zhì)L7/L12基因的片段。肺炎支原體的核糖體蛋白質(zhì)L7/L12基因的全長(zhǎng)通過(guò)分析這些片段的DNA序列信息可以確定。
得到的肺炎支原體的核糖體蛋白質(zhì)L7/L12基因構(gòu)建成例如與GST等的融合蛋白質(zhì)基因，使用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)用質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)載體后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，可以使該蛋白質(zhì)大量表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌進(jìn)行適當(dāng)培養(yǎng)，通過(guò)使用GST的親和柱對(duì)菌體破碎液進(jìn)行純化，可以得到肺炎支原體的核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)與GST的融合蛋白質(zhì)。
可以將該蛋白質(zhì)直接、或切斷GST部分后作為抗原蛋白質(zhì)利用眾所周知的手法建立多個(gè)雜交瘤克隆，通過(guò)選擇對(duì)肺炎支原體菌體或菌體破碎液或肺炎支原體的核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)表現(xiàn)出特異反應(yīng)的抗體，也可以得到目的特異單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明制作的抗體可以用于作為眾所周知的測(cè)定方法的使該抗體吸附于聚苯乙烯膠乳粒子上的凝集反應(yīng)、作為微滴板中進(jìn)行的眾所周知技術(shù)ELISA法、已有的免疫層析法、著色粒子或具有發(fā)色能力的粒子、或使用被捕捉抗體和用酶或熒光物標(biāo)記的該抗體一起被包被的磁微粒子等夾層分析等已知的所有免疫測(cè)定手法。
根據(jù)本發(fā)明制作的抗體在所有免疫測(cè)定手法中可以作為在固相或液相中捕獲該抗原蛋白質(zhì)的所謂捕捉抗體發(fā)揮作用的同時(shí)，通過(guò)利用眾所周知的方法對(duì)過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶等酶進(jìn)行修飾的酶標(biāo)記抗體也可作為檢測(cè)用抗體發(fā)揮作用。
來(lái)自肺炎支原體的核糖體蛋白質(zhì)L7/L12基因的克隆將適當(dāng)量的肺炎支原體(ATCC 15531、從ATCC購(gòu)入)接種于加了Mycoplasma Supplement(DIFCO，0836-68-9)的PPLO瓊脂培養(yǎng)基(DIFCO，0412-17-3)上，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)5小時(shí)。將生成的菌落懸浮于TE(和光純藥工業(yè)生產(chǎn))緩沖液，使最終濃度達(dá)到5×109CFU/ml左右。將約1.5ml該懸浮液移至微量離心管中于10,000rpm下離心2分鐘。棄掉上清，沉淀部分再懸浮于567μl的TE緩沖液。然后加入30μl的10％SDS和3μl的20mg/ml的蛋白酶K溶液，充分混合，于37℃下溫育1小時(shí)。懸浮液再于56℃下溫育1小時(shí)。然后加入80μl的10％的十六烷基三甲基銨溴化物/0.7M NaCl溶液，充分混合之后，于65℃下溫育10分鐘。加入700μl的同一體積的24∶1的氯仿-異戊醇混合液，充分?jǐn)嚢琛?br> 將該溶液用微量離心機(jī)于12000rpm、4℃下離心5分鐘之后，將水相級(jí)分移至新的微量離心管中。然后向該離心管中加入0.6倍量的異丙醇，充分振蕩離心管，形成DNA沉淀。用玻璃棒將白色的DNA沉淀?yè)瞥?，移至加?ml的70％乙醇(-20℃冷卻的)的另一個(gè)微量離心管中。然后將該離心管于10,000rpm下離心5分鐘，將上清輕輕地除去。追加1ml的70％乙醇，將混合物再離心5分鐘。
再將上清除去之后，將沉淀溶解于100μl的TE緩沖液中，得到DNA溶液。根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》Molecular Cloning，A laboratory manual，1989，Eds.Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，和Maniatis，T.，Cold SpringHarber Laboratory Press的E5，DNA或RNA量的分光光度法測(cè)定(Spectrophotometric Determiantion of the Amount of DNA or RNA)對(duì)該基因組DNA溶液的濃度進(jìn)行定量。
從該基因組DNA中取出10ng進(jìn)行PCR(polymerase chain reaction)。PCR使用Taq聚合酶(寶酒造公司生產(chǎn)、編號(hào)R001A)。將酶附帶的緩沖液5μl、酶附帶的dNTP混合物4μl和各200pmol的寡核苷酸(序列表中序列3和4所示)加到酶中。加水使總?cè)莘e達(dá)到50μl。
使用TaKaRa PCR Thermal Cycler 480，對(duì)該混合物進(jìn)行5次95℃1分鐘、50℃2分鐘、72℃3分鐘的循環(huán)之后，再進(jìn)行25次95℃1分鐘、60℃2分鐘、72℃3分鐘的循環(huán)。使用一部分PCR產(chǎn)物，于1.5％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。用溴乙錠(日本基因公司生產(chǎn))染色后，于紫外線下觀察，確認(rèn)約400bp的DNA被擴(kuò)增了。使用限制酶BamHI和XhoI進(jìn)行酶切后，再于1.5％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳和用溴乙錠染色。從凝膠中切出約400bp的帶。該帶用Suprec01(寶酒造株式會(huì)社生產(chǎn))純化，插入作為一般載體的pGEX-6P-1(Pharmacia公司生產(chǎn))中。該載體通過(guò)將目的基因片段整合到適當(dāng)?shù)南拗泼傅奈稽c(diǎn)，可以作為能夠表達(dá)與GST蛋白質(zhì)融合的融合蛋白質(zhì)的目的分子表達(dá)載體發(fā)揮作用。
具體來(lái)說(shuō)是將載體pGEX-6P-1和先前的DNA以摩爾比為1∶3那樣比例混合，通過(guò)T4DNA連接酶(Invitrogen公司生產(chǎn))將DNA整合到載體中。整合了DNA的載體pGEX-6P-1通過(guò)基因手法導(dǎo)入到大腸桿菌的瞬時(shí)感受態(tài)細(xì)胞，然后接種到含有50μg/ml的氨芐青霉素(Sigma公司)的半固體狀培養(yǎng)板的LBL-肉湯瓊脂(寶酒造株式會(huì)社)。將培養(yǎng)板于37℃下溫育12小時(shí)，對(duì)生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行隨機(jī)選擇，接種到含有同濃度的氨芐青霉素的L-肉湯培養(yǎng)液中。于37℃下振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，收集菌體后，使用Wizard Miniprep，根據(jù)附帶的說(shuō)明書分離質(zhì)粒。該質(zhì)粒用限制酶BamHI/XhoI進(jìn)行酶切處理。通過(guò)對(duì)約370bp的DNA進(jìn)行酶切確認(rèn)PCR產(chǎn)物插入。使用上述克隆確定插入的DNA堿基序列。
利用Applied Biosystems公司生產(chǎn)的熒光測(cè)序儀確定插入DNA片段的堿基序列。
使用PRISM，Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司生產(chǎn))制備測(cè)序樣品。首先將9.5μl的反應(yīng)液、4.0μl的0.8pmol/μl的T7啟動(dòng)子引物(Gibco BRL)和6.5μl的0.16μg/μl模板DNA加到0.5ml的微量管中，進(jìn)行混合。該混合物用2層的100μl礦物油覆蓋后，進(jìn)行25循環(huán)PCR擴(kuò)增處理。每一循環(huán)為96℃處理30秒、55℃處理15秒和60℃處理4分鐘。生成物于4℃下保存5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，加80μl的無(wú)菌純化水，攪拌。將生成物離心，水相用苯酚-氯仿混合液萃取3次。將10μl的3M醋酸鈉pH5.2和300μl的乙醇加到100μl的水相中，攪拌。然后于14,000rpm、室溫下離心15分鐘，回收沉淀。用75％乙醇洗沉淀，真空下靜置2分鐘，使其干燥，作為測(cè)序樣品。測(cè)序樣品溶解在含有4μl的10mM的含有EDTA的甲酰胺之后，于90℃下變性2分鐘。該變性溶液于冰中冷卻之后供測(cè)序用。
隨機(jī)選擇的5個(gè)克隆中的2個(gè)與PCR使用的探針有序列上的同源性。而與核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的基因序列一致的DNA序列已經(jīng)清楚。該結(jié)構(gòu)基因部分的全堿基序列以及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列是序列表中序列1和2所示的那樣序列。顯然該基因片段是編碼肺炎支原體的核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的基因。
然后使上述上清液吸附于用PBS平衡的谷胱甘肽瓊脂糖柱。用含有20mM Tris緩沖液pH7.4、4.2mMMgCl2、1mM二硫蘇糖醇(DTT)洗滌液(2倍柱體積)洗柱子，用含有5mM谷胱甘肽的50mM pH9.6 Tris緩沖液進(jìn)行洗脫，洗脫級(jí)分的蛋白質(zhì)含有量用色素結(jié)合法(Bradford法；BioRadCo.)確定，得到主要級(jí)分。
得到的純化的GST融合核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的純度通過(guò)電泳方法確認(rèn)，純度約為75％，作為免疫原可確保有充分純度。實(shí)施例3抗肺炎支原體核糖體蛋白L7/L12單克隆抗體的制備首先在免疫小鼠時(shí)，將肺炎支原體的GST融合核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)抗原100μg溶解于200μl的PBS后，加入200μl弗氏完全佐劑，進(jìn)行混合。乳化后向腹腔內(nèi)注入200μl。2周后、4周后和6周后向腹腔內(nèi)注入同樣的乳化抗原。10周后和14周后向腹腔內(nèi)注入2倍濃度的乳化抗原。最后免疫結(jié)束后3天摘取脾臟，進(jìn)行細(xì)胞融合。
相對(duì)于無(wú)菌摘取的108個(gè)小鼠脾細(xì)胞加入骨髓瘤細(xì)胞2×107個(gè)，用玻璃管充分混合之后，于1500rpm離心5分鐘，棄掉上清，然后將細(xì)胞充分混合。
細(xì)胞融合使用的骨髓瘤細(xì)胞使用NS-1系的細(xì)胞株于含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從細(xì)胞融合2周前開始用含有0.13mM的氮雜鳥嘌呤、0.5μg/ml的MC-210、10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后，再用含有10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)1周。
將保持在37℃的RPMI 1640培養(yǎng)液50ml加到混合細(xì)胞樣品中，經(jīng)15,000rpm離心分離，除去上清液，加入保持在37℃的50％聚乙二醇1ml，攪拌1分鐘。加入保持在37℃的RPMI1640培養(yǎng)液10ml，通過(guò)用滅菌的吸液管對(duì)混合液進(jìn)行大約5分鐘的吸、吹，進(jìn)行更激烈攪拌。
于1,000rpm下離心分離5分鐘，除去上清后，加入30mL HAT培養(yǎng)液使細(xì)胞濃度達(dá)到5×106/ml。對(duì)該混合液進(jìn)行攪拌直至均一為止，然后加入到96孔板中，每孔0.1ml，于37℃、7％二氧化碳氛圍下進(jìn)行培養(yǎng)。在第1天、第1周和第2周每孔各加入0.1ml的HAT培養(yǎng)基，通過(guò)ELISA法篩選產(chǎn)生目的抗體的細(xì)胞。
溶解在含有0.05％疊氮鈉的PBS中的GST融合核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)和GST蛋白質(zhì)分別稀釋到10μg/ml濃度后的稀釋液分別加到96孔板中，每孔100μl，于4℃下吸附過(guò)夜。
除去上清后，添加1％牛血清白蛋白溶液(PBS中)200μl，于室溫反應(yīng)1小時(shí)，進(jìn)行封閉。除去上清后，生成物用洗滌液(0.02％Tween，PBS)洗凈。然后加入融合細(xì)胞的培養(yǎng)液100ml，于室溫反應(yīng)2小時(shí)。除去上清，用洗滌液洗沉淀。然后加入濃度為50ng/ml的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體溶液100μl，使混合物于室溫下反應(yīng)1小時(shí)。除去上清，生成物再用洗滌液洗凈。各加入100μl的TMB溶液(KPL公司生產(chǎn))，使混合物于室溫下反應(yīng)20分鐘。顯色時(shí)加入100μl 1N硫酸終止反應(yīng)，測(cè)定450nm的吸光度。
結(jié)果表明出現(xiàn)了只對(duì)GST融合核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)反應(yīng)，而對(duì)GST蛋白質(zhì)不反應(yīng)的陽(yáng)性孔，這樣的孔含有抗核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)抗體。
然后分別回收陽(yáng)性孔中的細(xì)胞，加到24孔的塑料板中用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
用HT培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)的融合培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使細(xì)胞數(shù)達(dá)到約20個(gè)/ml，取其中的50μl與懸浮于HT培養(yǎng)基的6周齡的小鼠胸腺細(xì)胞106個(gè)于96孔板中進(jìn)行混合?；旌虾螅?％CO2、37℃條件下培養(yǎng)2周。
使用上述的ELISA法對(duì)培養(yǎng)上清中的抗體活性進(jìn)行同樣的測(cè)定，回收與核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)反應(yīng)呈陽(yáng)性的細(xì)胞。再反復(fù)進(jìn)行同樣的稀釋測(cè)定、克隆操作，得到5個(gè)克隆的雜交瘤MPRB-1～5。
具體來(lái)說(shuō)，將用RPMI1640培養(yǎng)基(含有10％FCS)進(jìn)行傳代培養(yǎng)的細(xì)胞5×106個(gè)(PBS中)注射到2周前預(yù)先已向腹腔內(nèi)注射了0.5ml的降植烷的Balb/C小鼠的腹腔內(nèi)。3周后回收腹水，獲得該腹水的離心上清。
使得到的抗體溶液吸附于Protein A柱(5ml，Pharmacia生產(chǎn))上，用3倍量的PBS洗滌。然后用pH3檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫?；厥湛贵w級(jí)分，得到由各個(gè)雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體。通過(guò)ELISA法對(duì)來(lái)自這5株雜交瘤的單克隆抗體進(jìn)行評(píng)價(jià)。
在單克隆抗體的評(píng)價(jià)中使用夾層分析法。通過(guò)使制備的單克隆抗體與過(guò)氧化物酶結(jié)合，用作檢測(cè)用抗體。
酶標(biāo)記使用辣根過(guò)氧化物酶(Sigma grade VI)，結(jié)合中使用試劑S-乙酰硫代醋酸N-羥基琥珀酰亞胺，根據(jù)Analytical Bio-chemistry132(1983)，68-73報(bào)道的方法進(jìn)行。在ELISA反應(yīng)中將市售的抗肺炎支原體多克隆抗體(兔)以10μg/ml濃度稀釋后的稀釋液100μl分別注入96孔板中，于4℃下吸附過(guò)夜。
除去上清后，添加1％牛血清白蛋白溶液(PBS中)200μl，于室溫反應(yīng)1小時(shí)，進(jìn)行封閉。除去上清后，生成物用洗滌液(0.02％Tween 20，PBS)洗凈。然后向上述洗凈的生成物加入100μl抗原溶液(該抗原溶液是通過(guò)向各個(gè)微生物培養(yǎng)液加入濃度達(dá)到0.3％的量的Triton X-100，于常溫下萃取5分鐘得到的)，于室溫反應(yīng)2小時(shí)。除去上清，生成物再用洗滌液洗凈。然后加入濃度為5μg/ml的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)抗體溶液100μl，于室溫下反應(yīng)1小時(shí)。除去上清，生成物再用洗滌液洗。各加入100μl的TMB溶液(KPL公司生產(chǎn))，使混合物于室溫下反應(yīng)20分鐘。顯色時(shí)加入100μl 1N硫酸終止反應(yīng)，測(cè)定450nm的吸光度。
作為標(biāo)記抗體使用來(lái)自雜交瘤MPRB-1的單克隆抗體時(shí)，通過(guò)使用在106個(gè)/ml的靈敏度下檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的肺炎支原體所有菌株的同時(shí)，而對(duì)其它的流感嗜血桿菌Haemophilus influenzae，肺炎克氏桿菌Klebsiellapneumoniae，肺炎支原體Chlamydia Mycoplasma pneumoniae以及腦膜炎奈瑟球菌Neisseria meningitides等微生物即使在108個(gè)/ml的高濃度也沒(méi)有反應(yīng)性的抗核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)單克隆抗體，可以明確地確認(rèn)獲得具有肺炎支原體特異的反應(yīng)性的抗體。該抗體被命名為AMMP-1。表2只給出了使用AMMP-1的結(jié)果。使用與別的微生物表現(xiàn)交叉反應(yīng)的其它抗體的結(jié)果這里沒(méi)有涉及。表2

(+陽(yáng)性，-陰性)
抗體效價(jià)的確認(rèn)通過(guò)ELISA法實(shí)施。溶解在含有0.05％疊氮鈉的PBS中的肺炎支原體核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)以10μg/ml稀釋后的稀釋液分別加到96孔板中，每孔100μl，于4℃下吸附過(guò)夜。除去上清后，添加1％牛血清白蛋白溶液(PBS中)200μl，于室溫反應(yīng)1小時(shí)，進(jìn)行封閉。除去上清后，生成物用洗滌液(0.02％Tween 20，PBS)洗凈。然后加入正常的兔血清和免疫的兔的抗血清經(jīng)稀釋后得到的溶液100μl，于室溫反應(yīng)2小時(shí)。除去上清，生成物再用洗滌液洗凈。然后加入濃度為50ng/ml的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG抗體溶液100μl，于室溫下反應(yīng)1小時(shí)。除去上清，生成物再用洗滌液洗。各加入100μl的OPD溶液(Sigma公司生產(chǎn))，使混合物于室溫下反應(yīng)20分鐘。顯色時(shí)加入100μl 1N硫酸終止反應(yīng)，測(cè)定492nm的吸光度。
確認(rèn)抗體效價(jià)上升后，實(shí)施大量采血。從耳動(dòng)脈將血液采集到玻璃離心管中，于37℃放置1小時(shí)后，于4℃下靜置過(guò)夜。然后于3000rpm離心5分鐘，回收上清。得到的抗血清保存在4℃下。
制備固定了肺炎支原體核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)親和柱。使用HiTrapNHS活化柱(1ml，Pharmacia公司生產(chǎn))。用1mM HCl置換柱子后立即加入核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)的PBS溶液(1mg/ml)。將柱子靜置30分鐘后，加入封閉試劑，用PBS進(jìn)行平衡。
使用這個(gè)肺炎支原體核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)固定化親和柱，對(duì)用肺炎支原體經(jīng)Triton X-100處理的菌體的上清作為抗原得到的抗血清中的多克隆抗體進(jìn)行純化。將該抗血清用PBS稀釋5倍，用0.45μm的膜過(guò)濾后，以流速0.5ml/min吸附于肺炎支原體核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)固定化柱。然后用0.1M pH2.1甘氨酸緩沖液從柱子上洗脫出來(lái)后，立即用1M pH9.0 Tris緩沖液中和后，通過(guò)與抗體效價(jià)測(cè)定方法同樣的ELISA法回收目的抗體的洗脫級(jí)分。
這樣得到的多克隆抗體通過(guò)特表平7-509565號(hào)公報(bào)記載的OIA法進(jìn)行評(píng)價(jià)。
純化的抗體作為OIA法的捕捉抗體使用。作為檢測(cè)抗體使用實(shí)施例4記載的AMCT-1單克隆抗體經(jīng)過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體。酶標(biāo)記使用辣根過(guò)氧化物酶(Sigma grade VI)，結(jié)合中使用試劑S-乙酰硫代醋酸N-羥基琥珀酰亞胺，根據(jù)Analytical Bio-chemistry 132(1983)，68-73報(bào)道的方法進(jìn)行。
在OIA反應(yīng)中含有0.05％疊氮鈉的PBS中的純化多克隆抗體用0.1MpH8.0 HEPES緩沖液稀釋到10μg/ml后的稀釋液(50μl)分別加到硅晶片上，于室溫下反應(yīng)30分鐘后，用蒸餾水洗凈，用含有蔗糖以及堿處理干酪素的包被溶液進(jìn)行包被后使用。
然后向上述硅晶片加入通過(guò)向上述操作得到的各個(gè)微生物培養(yǎng)液加入濃度達(dá)到0.5％的量的Triton X-100，于常溫下萃取5分鐘得到的抗原溶液15μl，于室溫反應(yīng)10分鐘。然后加入20μg/ml的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體溶液15μl，于室溫下反應(yīng)15分鐘。用蒸餾水洗凈后，各加入15μl的TMB溶液(KPL公司生產(chǎn))，使混合物于室溫下反應(yīng)5分鐘。生成物用蒸餾水洗凈，用肉眼可以觀察到通過(guò)酶反應(yīng)生成的藍(lán)色。
結(jié)果就象表3所示的那樣，表明通過(guò)將純化多克隆抗體APMP-1作為捕捉抗體使用，可以以108個(gè)/ml的靈敏度檢測(cè)肺炎支原體，但不能檢測(cè)其它微生物的反應(yīng)性。因此可以通過(guò)固定了肺炎支原體核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)的親和柱，確認(rèn)獲得了對(duì)肺炎支原體特異反應(yīng)的多克隆抗體。表3

(+陽(yáng)性，-陰性)
通過(guò)本發(fā)明不僅可以利用針對(duì)在微生物進(jìn)化過(guò)程中保持功能的細(xì)胞內(nèi)分子的抗體對(duì)特定種類的微生物進(jìn)行特異檢測(cè)，而且可以高精度地檢測(cè)同一種內(nèi)的所有血清型微生物。
作為這樣的抗體可以使用針對(duì)微生物核糖體蛋白質(zhì)、核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)的抗體對(duì)肺炎支原體進(jìn)行高精度地檢測(cè)。
另外通過(guò)使用這樣抗體為組成成分的微生物檢測(cè)試劑盒，可以對(duì)微生物進(jìn)行更廣泛、精度更高地檢測(cè)。
引用文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)*美國(guó)專利No.5,552,279、Weisburg，et al.，1996年9月3日，「肺炎支原體和尿殖道支原體檢測(cè)用核酸探針」。*EPO 305145，申請(qǐng)?zhí)?8307793.5 Zivin和Monahn.1989年3月1日.檢測(cè)核酸的方法和探針。*EPO 250662，申請(qǐng)?zhí)?6304919，3 Gobel和Stanbridge.1988年1月7日，DNA雜交檢測(cè)支原體。*特開昭63(1988)-298其它專利文獻(xiàn)*Bernet，C.，M.Garret，等，(1993)「利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)肺炎支原體」J Clin Microbiol 31(4)，1013-5*Buck，G.E.，LC.O’Hara等(1993)「利用DNA增殖迅速且高靈敏度地檢測(cè)有疑問(wèn)的臨床樣品中肺炎支原體的方法」J Clin Microbiol 31(4)，1013-5*Gobel，U、B.，A.Geiser等1987「與Mycoplasma種間的核糖體RNA有差別可變區(qū)互補(bǔ)的多核苷酸探針」*Granato.P.A.，L.Poe，等，(1980)「有關(guān)在肺炎支原體生長(zhǎng)中利用改進(jìn)的New York City培養(yǎng)基的報(bào)告書」Zh Mikrobiol EpidemiolImmunobiol(8)，50-3*Hyman，H.，D.Yogev等(1987)「肺炎支原體和肺炎支原體的檢測(cè)和鑒定用DNA探針」*Jensen，J.S.，J.Songergard-和ersen等(1993)「利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)有疑問(wèn)的臨床樣品中的肺炎支原體」*Kai，M.，S.Kamiya等(1987)「利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)迅速檢測(cè)肺炎支原體的方法」J Gen Microbiol 133(Pt7)，1969-74*Knudson，D.L.和R.Macleod(1979)「肺炎支原體和唾液支原體(Mycoplasma salivarium)在瓊脂中菌落生長(zhǎng)的電子顯微鏡照片」SciRep Res Inst Tohoku Univ[Med]26(3-4)，71-91*Madsen RD，Weiner LB，Mcmillan JA，Saeed JA，North JA，Coates SR.(1988).通過(guò)單克隆抗體免疫印跡分析直接檢測(cè)臨床樣本中的肺炎支原體抗原Am J Clin Pathol 89(1)95-9*Rannar Norrby，S.(1999)「北歐諸國(guó)的代表性肺炎、其病因與氟羅沙星以及多西環(huán)素的臨床比較結(jié)果」J Med Microbiol 48(12)，1115-22*Tilton，R.C.，F(xiàn).Dias，等，(1980)「臨床樣品中的肺炎支原體檢測(cè)用DNA探針和培養(yǎng)」J Clin Microbiol 12(6)，748-52*Yogev，D.，D.Halachmi，等(1988)「利用rRNA基因探針和基因組DNA指紋圖檢測(cè)Mycoplasma種和Mycoplasma株(mollicutes)」J ClinMicrobiol 26(11)，2266-9*Chan ED，Kalayanamit T，Lynch DA，Tuder R，Arndt P，WinnR.Schwarz MI.「引起成年人重度肺病與肺炎支原體有關(guān)的細(xì)支氣管炎-文獻(xiàn)綜述」Chest.，1999；115(4)，1188-94*NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)#NC#000912.Himmelreich，R.，Hilbelt，H.，Plagens，H.，Pirkl，E.，Li，B.C.，和Herrmann，R.*Cimolai N.「由肺炎支原體引起的呼吸器官感染癥」Pediatr Rev.，1998；19(10)，327-31*Harlow，E.，和D.Lane(1988)「抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)」NewYork.，Cold SpringHarbor Laboratory Press*Shambrook.J.，E.F.Fritsch，和T.Maniatis.，(1989)「分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第2版」Cold Spring Harbor Laboratory Press
序列表<110>旭化成株式會(huì)社<120>肺炎支原體檢測(cè)用抗體<130>ASAHI-8<150>JP 2000-062729<151>2000-01-31<160>4<210>1<211>369<212>DNA<213>肺炎支原體Mycoplasma pneumoniae<400>1atg gca aaa cta gat aaa aac caa tta att gaa tcg ttg aag gaa atg 48Met Ala Lys Leu Asp Lys Asn Gln Leu Ile Glu Ser Leu Lys Glu Met1 5 10 15acc atc atg gaa atc gat gaa atc att aag gct gta gaa gaa gct ttt 96Thr Ile Met Glu Ile Asp Glu Ile Ile Lys Ala Val Glu Glu Ala Phe2025 30gga gta tcg gca aca cct gta gta gct gct ggt gct gtt ggt ggt aca 144Gly Val Ser Ala Thr Pro Val Val Ala Ala Gly Ala Val Gly Gly Thr3540 45caa gaa gct gct agc gaa gtg act gtg aaa gtt act ggt tac act gac 192Gln Glu Ala Ala Ser Glu Val Thr Val Lys Val Thr Gly Tyr Thr Asp5055 60aac gct aaa tta gct gtg tta aag ctt tac cgc gaa att gct ggt gtt 240Asn Ala Lys Leu Ala Val Leu Lys Leu Tyr Arg Glu Ile Ala Gly Val65 70 75 80ggt tta atg gaa gct aaa act gct gtg gaa aaa ctt cct tgt gtt gtt 288Gly Leu Met Glu Ala Lys Thr Ala Val Glu Lys Leu Pro Cys Val Val85 90 95aag caa gac atc aaa cct gaa gaa gct gaa gaa ctt aaa aag cgt ttc 336Lys Gln Asp Ile Lys Pro Glu Glu Ala Glu Glu Leu Lys Lys Arg Phe100105 110gtt gaa gtt gga gca act gtt gaa atc aaa taa 369Val Glu Val Gly Ala Thr Val Glu Ile Lys115 120<210>2<211>122<212>PRT<213>肺炎支原體Mycoplasma pneumoniae<400>2Met Ala Lys Leu Asp Lys Asn Gln Leu Ile Glu Ser Leu Lys Glu Met1 510 15Thr Ile Met Glu Ile Asp Glu Ile Ile Lys Ala Val Glu Glu Ala Phe2025 30Gly Val Ser Ala Thr Pro Val Val Ala Ala Gly Ala Val Gly Gly Thr3540 45Gln Glu Ala Ala Ser Glu Val Thr Val Lys Val Thr Gly Tyr Thr Asp50 55 60Asn Ala Lys Leu Ala Val Leu Lys Leu Tyr Arg Glu Ile Ala Gly Val65 70 75 80Gly Leu Met Glu Ala Lys Thr Ala Val Glu Lys Leu Pro Cys Val Val85 90 95Lys Gln Asp Ile Lys Pro Glu Glu Ala Glu Glu Leu Lys Lys Arg Phe100105 110Val Glu Val Gly Ala Thr Val Glu Ile Lys115120<210>3<211>29<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于從肺炎支原體獲得核糖體蛋白質(zhì)L7/L12基因使用的PCR引物DNA<400>3aatggatcca tggcaaaact agataaaaa29<210>4<211>30<212>DNA<213>人工合成序列<220><223>用于從肺炎支原體獲得核糖體蛋白質(zhì)L7/L12基因使用的PCR引物DNA<400>4tgactcgagt tatttgattt caacagttgc30
權(quán)利要求
1.抗屬于肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)的微生物的核糖體蛋白質(zhì)的抗體，是對(duì)該微生物特異反應(yīng)的抗體。
2.權(quán)利要求1記載的抗體，其中屬于肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)的微生物的核糖體蛋白質(zhì)是核糖體蛋白質(zhì)L7/L12。
3.權(quán)利要求1或2記載的抗體，其中抗體是單克隆或多克隆抗體。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)記載的抗體，其中抗體是與酶結(jié)合的抗體。
5.屬于肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)微生物的檢測(cè)方法，其特征是使用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)記載的抗體。
6.屬于肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)微生物的檢測(cè)方法，該方法由以下a)、b)和c)構(gòu)成a)通過(guò)使檢測(cè)樣品與溶解液接觸，從微生物中提取核糖體蛋白質(zhì)、b)提取的檢測(cè)樣品通過(guò)與捕捉抗體，即權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)記載的抗體被固定于固體表面上的抗體接觸，在核糖體蛋白質(zhì)和捕捉抗體之間形成抗原抗體復(fù)合物以及c)使用檢測(cè)用抗體、即權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)記載的抗體對(duì)抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)。
7.權(quán)利要求6記載的方法，其中檢測(cè)用抗體是與酶結(jié)合的抗體，抗原抗體復(fù)合物是通過(guò)該酶的特異底物可被檢測(cè)的復(fù)合物。
8.屬于肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)微生物的檢測(cè)用試劑盒，其特征是使用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)記載的抗體。
9.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)記載的抗體的制造方法，其特征是將通過(guò)基因操作或從微生物分離純化得到的屬于肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)微生物的核糖體蛋白質(zhì)L7/L12蛋白質(zhì)、其部分肽、或相當(dāng)于其部分肽的合成肽作為免疫原。
全文摘要
本發(fā)明提供能夠特異、而且高靈敏度迅速地檢測(cè)屬于肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)的微生物的方法，該檢測(cè)中使用的檢測(cè)用抗體、檢測(cè)用試劑盒、以及檢測(cè)中使用的抗體的制造方法。作為抗屬于肺炎支原體的微生物的核糖體蛋白質(zhì)的抗體是可特異與該微生物反應(yīng)的抗體。使用該抗體檢測(cè)樣品中的該微生物的方法以及含有該抗體的檢測(cè)用試劑盒。作為核糖體蛋白質(zhì)如核糖體蛋白L7/L12蛋白質(zhì)，用于肺炎病原微生物的感染檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12P21/08GK1406279SQ01805728
公開日2003年3月26日 申請(qǐng)日期2001年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月31日
發(fā)明者M·拉曼, 江藤高志 申請(qǐng)人:旭化成株式會(huì)社