專利名稱：聚羥基丁酸生成缺陷的鞘氨醇單胞菌屬突變型細菌菌株和澄清鞘氨糖的方法及其組合物的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及因無效突變而內(nèi)部貯存聚合物聚羥基丁酸(polyhydroxybutyrate，“PHB”)生成缺陷但生成正常品質(zhì)的莢膜多糖鞘氨糖(sphingan)的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)突變型細菌菌株。本發(fā)明還涉及澄清由PHB生成缺陷的鞘氨醇單胞菌突變菌株生成的鞘氨糖的方法。本發(fā)明還涉及包含缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖的食品或工業(yè)產(chǎn)品。
相關(guān)技術(shù)的討論鞘氨糖是由鞘氨醇單胞菌屬的細菌分泌的囊狀多肽。鞘氨糖在結(jié)構(gòu)上相關(guān)但不相同。鞘氨醇單胞菌屬的常見成員及其生成的鞘氨糖包括生成吉蘭糖(gellan，S-60)的多沼鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaselodea)ATCC 31461；生成welan(S-130)的鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp.)ATCC 31555；生成rhamsan(S-194)的鞘氨醇單胞菌ATCC 31961；生成diutan(S-657)的鞘氨醇單胞菌ATCC 53159；生成尚未命名的多糖(S-88)的鞘氨醇單胞菌ATCC 31554；生成尚未命名的多糖(S-198)的鞘氨醇單胞菌ATCC 31853；生成尚未命名的多糖(S-7)的鞘氨醇單胞菌ATCC 21423；生成尚未命名的多糖(NW-11)的鞘氨醇單胞菌ATCC 53272；生成alcalan(Biopolymer B-16)的鞘氨醇單胞菌FERM-BP2015(以前稱廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligenes latus)B-16)；諸如此類。關(guān)于鞘氨醇單胞菌及其生成的多糖的描述可以參閱美國專利號4,377,636、4,326,053、4,326,052、和4,385,123(關(guān)于ATCC 31461及其S-60多糖)；美國專利號4,342,866(關(guān)于ATCC 31555及其S-130)；美國專利號4,401,760(關(guān)于ATCC 31961及其S-194)；美國專利號5,175,278(關(guān)于ATCC 53159及其S-657)；美國專利號4,331,440和4,535,153(關(guān)于ATCC 31554及其S-88)；美國專利號4,529,797(關(guān)于ATCC 31853及其S-198)；美國專利號3,960,832(關(guān)于ATCC 21423及其S-7)；美國專利號4,874,044(關(guān)于ATCC 53272及其NW-11)；美國專利號5,175,279(關(guān)于FERM BP-2015及其B-16)(將它們收入本文作為參考)。
鞘氨糖多糖在其主鏈的一級結(jié)構(gòu)上相關(guān)，包含糖D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、和L-鼠李糖(或L-甘露糖)。例如，吉蘭糖即S-60的一級結(jié)構(gòu)以2∶1∶1的分子比包含D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、和L-鼠李糖，它們連在一起以如下順序形成四糖重復(fù)單元葡萄糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、鼠李糖。在天然形式中，吉蘭糖在相同的葡萄糖殘基上受到乙?；透视突〈男揎棥Ｆ骄?，在吉蘭糖中，每個四糖重復(fù)單元具有一個甘油酸取代基，每兩個四糖重復(fù)單元具有一個乙酸取代基。另一種鞘氨糖，diutan即S-657的一級結(jié)構(gòu)與吉蘭糖不同，其中一個額外的L-鼠李糖二糖側(cè)鏈附著在一個葡萄糖殘基上，由此形成六聚糖重復(fù)單元。S-657在另一個葡萄糖殘基的位置2和/或6包含乙?；?。
鞘氨糖多糖(也稱為糖膠)主要用于使水溶液增稠或凝膠，且通常分成兩類增稠劑和膠凝劑。典型的增稠劑包括淀粉、瓜爾豆膠、羧甲基纖維素、藻酸、甲基纖維素、黃原膠、刺梧桐樹膠、和黃蓍膠。常見的膠凝劑包括吉蘭糖、明膠、淀粉、藻酸、果膠、角叉藻聚糖、瓊脂、和甲基纖維素。
膠凝劑在多種應(yīng)用中用于食品工業(yè)，包括糖果果凍，果醬、甜點膠凍、糖衣、奶制品、飲料、諸如此類。另外，膠凝劑可以用作微生物培養(yǎng)基的成分。膠凝劑在使用條件和凝膠質(zhì)地方面是不同的。凝膠的這些區(qū)別性特征導(dǎo)致某些膠凝劑在特定產(chǎn)品中(如淀粉在糖果果凍中、明膠在甜點膠凍、瓊脂在糖衣中、和藻酸在甘椒條(pimentostrips)中)的獨占使用。
盡管某些膠凝劑用于特定產(chǎn)品，然而常規(guī)食品配方存在缺點。例如，常用于甜點膠凍配方的明膠來自動物，需要冷卻來凝固，且因其在加熱后不穩(wěn)定而應(yīng)用受到限制。常用于甜點膠凍、糖果、和果醬/果凍配方的角叉藻聚糖、角叉藻聚糖和槐豆膠混合物、果膠通常限于質(zhì)地脆弱且無彈性的配方，儲存穩(wěn)定性差，且在有些國家(諸如日本)在使用上受到地理限制。常用于糖果配方的淀粉透明度差且香味釋放差。因此，希望開發(fā)可用于不受常規(guī)膠凝劑相關(guān)問題困擾的食品配方的膠凝劑。
一種特別有用的膠凝劑是吉蘭糖(S-60)，即由細菌多沼鞘氨醇單胞菌ATCC 31461生成的莢膜多糖。在商業(yè)上，這種糖膠是通過在好氣條件下用多沼鞘氨醇單胞菌接種發(fā)酵培養(yǎng)基而形成的。發(fā)酵培養(yǎng)基包含碳源、磷酸鹽、有機和無機氮源、和適當(dāng)?shù)奈⒘吭亍Ｔ跓o菌條件下進行發(fā)酵，嚴格控制通氣、攪動、溫度、和pH。發(fā)酵完成后，在回收糖膠之前，將粘稠的肉湯巴氏滅菌以殺死存活細胞。然而，用于生成吉蘭糖的最佳發(fā)酵條件還促進內(nèi)部貯存聚合物聚羥基丁酸(“PHB”)的生成，它妨礙吉蘭糖的最終澄清和回收。在發(fā)酵過程中，PHB合成和吉蘭糖合成競爭可獲得的碳源，而且PHB合成與吉蘭糖合成進行競爭。
根據(jù)由發(fā)酵肉湯進行回收的方法，吉蘭糖展示不同的特征。由發(fā)酵肉湯直接回收而生成的吉蘭糖處于天然或高?；问?，它受到多沼鞘氨醇單胞菌的修飾，在一個葡萄糖殘基上具有乙?；透视突〈?。以這種天然或高?；问椒蛛x的吉蘭糖生成柔軟、柔韌、有彈性的凝膠?？梢酝ㄟ^熱堿處理將吉蘭糖脫?；?，由此提供低?；问降募m糖。以這種脫?；问椒蛛x的吉蘭糖生成堅硬、堅固、脆弱的凝膠，這限制了它的商業(yè)應(yīng)用。天然和脫?；m糖混合物生成中間質(zhì)地的凝膠。
某些應(yīng)用需要清澈的吉蘭糖。然而，目前只能夠澄清脫酰基吉蘭糖。在脫酰基過程中，對吉蘭糖進行的高溫堿處理由吉蘭糖除去?；〈⒘呀舛嗾忧拾贝紗伟毎?。然后通過過濾除去固體和細胞碎片，生成清澈的、非?；募m糖。目前還不可能通過過濾來澄清天然或高?；问降募m糖，因為所要求的高凝固溫度(糖膠在冷卻后形成凝膠的溫度)和有機體的莢膜性質(zhì)，使得不能流暢的由多沼鞘氨醇單胞菌細胞分離吉蘭糖。為了需要天然吉蘭糖的應(yīng)用，可以通過化學(xué)或酶學(xué)方法裂解多沼鞘氨醇單胞菌細胞；然而終產(chǎn)物中將存在殘余PHB，并使得生成的溶液混濁而非清澈。
除了吉蘭糖作為膠凝劑的用途，其它鞘氨糖多糖也已找到有用的商業(yè)應(yīng)用。S-657多糖賦予極性溶劑(諸如水)以顯著的假塑性，使得S-657能夠作為流變學(xué)調(diào)節(jié)劑，從而能夠懸浮微粒、減小摩擦、穩(wěn)定乳劑和泡沫、處置濾餅、和控制過濾。因此，S-657已經(jīng)找到了工業(yè)用途，即作為流變學(xué)添加劑用于多種粘結(jié)系統(tǒng)，正如美國專利號6,110,271中所公開的(將其收入本文作為參考)。
除了削弱透明度，在鞘氨糖中發(fā)現(xiàn)的PHB還影響其糖膠的流變學(xué)特性。具體而言，S-657糖膠中的PHB影響多糖在多孔介質(zhì)流動系統(tǒng)中調(diào)節(jié)流變學(xué)的能力，諸如油田，其中流變學(xué)在油井鉆井、完成、和維修流體中發(fā)揮重要作用。另外，S-657中的PHB殘余可能在儲庫形成過程中引起損害，且可能降低油井的生產(chǎn)力。PHB的存在還限制S-657糖膠在家庭和個人護理產(chǎn)品中的應(yīng)用性，其中外觀對于獲得消費者的認可而言是至關(guān)重要的。
因此，試圖消除鞘氨糖中的PHB生成。減輕鞘氨醇單胞菌種中妨礙PHB生成的問題的一種方法是在菌株中化學(xué)誘導(dǎo)隨機突變以抑制PHB生成，諸如美國專利號5,300,429中所述，該專利公開了LPG-2，一種抑制PHB生成但仍能夠生成吉蘭糖的多沼鞘氨醇單胞菌突變菌株。多沼鞘氨醇單胞菌以前稱為多沼假單胞菌，且指相同生物體。LPG-2菌株保藏于American Type Culture Collection即美國典型培養(yǎng)物收藏中心，編號ATCC 53967。盡管LPG-2菌株生成吉蘭糖，但它的品質(zhì)是不一致的，可能是由于化學(xué)誘變時發(fā)生了額外突變。
遺傳工程是用于生成PHB生成缺陷的鞘氨醇單胞菌無效突變菌株的更有選擇性的誘變方法。遺傳工程能夠?qū)HB合成途經(jīng)中的一種基因進行選擇性突變或缺失，繼而能夠完全抑制PHB生成而不影響糖膠生成的品質(zhì)。
因此，非常希望開發(fā)合成PHB的能力缺陷，同時鞘氨糖生成最大化、因而可減輕要求由鞘氨糖除去PHB的努力的鞘氨醇單胞菌突變菌株。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及鞘氨醇單胞菌屬突變菌株，其中編碼參與聚羥基丁酸(“PHB”)合成的蛋白質(zhì)的至少一種基因受到選擇性突變或缺失，使得突變菌株生成鞘氨糖但不生成PHB。
本發(fā)明的另一個實施方案致力于由多種鞘氨醇單胞菌物種(即ATCC 31461和53159)的DNA分離的、編碼蛋白質(zhì)PHB合酶的分離DNA序列。
本發(fā)明的另一個實施方案致力于制備缺乏PHB的、澄清的鞘氨糖的方法，包括下列步驟將鞘氨醇單胞菌屬突變菌株發(fā)酵，并由發(fā)酵肉湯澄清缺乏PHB的鞘氨糖。
本發(fā)明的還有一個實施方案致力于制備澄清的鞘氨糖溶液的方法，包括下列步驟將鞘氨糖發(fā)酵肉湯加熱至澄清溫度大約30℃-大約70℃，用澄清劑處理鞘氨糖發(fā)酵肉湯，然后用酶處理發(fā)酵肉湯。
本發(fā)明的還有一個實施方案致力于制備澄清的鞘氨糖溶液的方法，包括下列步驟將鞘氨糖發(fā)酵肉湯加熱至澄清溫度大約30℃-大約70℃，用螯合劑處理發(fā)酵肉湯，用溶菌酶處理發(fā)酵肉湯，用苛性或氧化劑處理發(fā)酵肉湯，并用蛋白酶處理發(fā)酵肉湯。
本發(fā)明的另一個實施方案致力于能夠制備澄清的、缺乏PHB的、具有高凝膠強度的高?；?天然)吉蘭糖的多沼鞘氨醇單胞菌突變菌株。
本發(fā)明的還有一個實施方案致力于包含缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖的食品或工業(yè)產(chǎn)品。
圖的簡述

圖1描述了來自Rhizobium meliloti即苜蓿根瘤菌(U17227)(SEQID NO1)、Alcaligenes eutrophus即真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(J05003)(SEQID NO2)、Acinetobacter sp.即不動桿菌菌株RA3849(L37761)(SEQ ID NO3)、Rhodobacter spaeroides即類球紅細菌(L17049)(SEQ ID NO4)、和Methylobacterium extorquens即扭脫甲基桿菌(L07893)(SEQ ID NO5)的PHB合酶蛋白質(zhì)序列，使用LaserGene(Madison，WI)的軟件DNA star MegAlign進行比對。選擇區(qū)域1和2作為具有中等簡并性的保守區(qū)，并用于提供大約400堿基對(“bp”)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“PCR”)產(chǎn)物。
圖2顯示了質(zhì)粒pEB1中的408bp插入片段的序列(SEQ ID NO6)。
圖3的示意圖例示了用于在多沼鞘氨醇單胞菌phaC基因中克隆并構(gòu)建內(nèi)部缺失的步驟。
圖4描述了phaC區(qū)的序列(SEQ ID NO7)。下劃線標(biāo)注PstI的限制酶位點(CTGCAG)。箭頭指示引物結(jié)合位點。一部分phaC基因由第一個PstI位點延伸至TGA終止密碼子(粗體)。分開描述了突變體中缺失的堿基。XbaI位點(TCTAGA，雙下劃線)在突變體中替代了缺失區(qū)，正如正文中所述。
圖5是突變型phaC基因通過同源重組進入多沼鞘氨醇單胞菌染色體并切除整合載體，在染色體中只剩下完整的或突變的phaC基因的示意圖。
圖6是質(zhì)粒pLO2的示意圖。
圖7的示意圖演示了包含phaC缺失的載體整合進入多沼鞘氨醇單胞菌染色體。
圖8以圖表方式顯示了通過將來自10升發(fā)酵的肉湯樣品涂板而測定的細胞計數(shù)。
圖9顯示了經(jīng)EcoRI消化并與ATCC 53159 phaC基因的探針雜交的鞘氨醇單胞菌基因組DNA制劑的Southern雜交。泳道1和2包含大小標(biāo)準(zhǔn)(分別是λHindIII和λHindIII+EcoRI)。泳道3-6包含分別來自鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 53159、31461、31551、和31961的基因組DNA消化物。
圖10是ATCC 53159(SEQ ID NO13)的phaC基因及側(cè)翼區(qū)的DNA序列。下劃線標(biāo)注BamHI(ggatc)、EcoRI(gaattc)、和NotI(gcggccgc)的限制酶位點，雙下劃線標(biāo)注交疊引物位點。箭頭指示引物位點。粗體突出phaC基因。
圖11描述了phaC區(qū)的遺傳圖譜和用于PCR擴增的引物。
圖12描述了克隆策略，其中將PCR用于構(gòu)建只包含phaC側(cè)翼區(qū)并去掉整個phaC基因的產(chǎn)物。
圖13是氫氧化鉀濃度對透光率的影響的示意圖。
圖14是氫氧化鉀濃度對凝膠強度的影響的示意圖。
圖15是Calgon濃度對透光率的影響的示意圖。
圖16是Calgon濃度對凝膠強度的影響的示意圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及經(jīng)遺傳工程改造、因滅活內(nèi)部貯存聚合物聚羥基丁酸(“PHB”)合成的無效突變而合成PHB的能力缺陷的鞘氨醇單胞菌屬菌株。本發(fā)明的缺乏PHB的鞘氨醇單胞菌突變菌株能夠合成在商業(yè)上有用的鞘氨糖，根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的比濁法定性測定它不含PHB(見下文實施例4和美國專利號5,300,429,將它們的內(nèi)容收入本文作為參考)。PHB是在高碳和低氮條件(與生成最佳水平的鞘氨糖的條件相同)下在鞘氨醇單胞菌細胞內(nèi)積累的貯存聚合物。
已經(jīng)在許多生物體中研究了PHB合成，而且已經(jīng)鑒定了PHB合成的至少三種基因(Anderson，A.J.和Dawes，E.A.，Microbiol.Rev.，54450-472，1990)。PHB以三步衍生自乙酰輔酶A(CoA)。第一步是由3-酮硫解酶(phaA)催化的，導(dǎo)致乙酰乙酰CoA的形成。在第二步中，酶乙酰乙酰CoA還原酶(phaB)將乙酰乙酰CoA轉(zhuǎn)變成β-羥基丁酰CoA。最后，β-羥基丁酰CoA在第三步中由PHB合酶(phaC)聚合而形成PHB。編碼參與聚羥基丁酸合成的蛋白質(zhì)的至少一種基因受到選擇性突變或缺失的突變可能導(dǎo)致缺乏PHB的鞘氨醇單胞菌菌株。
例如，本文所述的鞘氨醇單胞菌突變菌株是至少兩種突變的結(jié)果(1)編碼PHB合酶的phaC基因的整個或部分缺失，這意外的導(dǎo)致鞘氨糖產(chǎn)量的降低；和(2)恢復(fù)鞘氨糖產(chǎn)量的自發(fā)突變。本發(fā)明還提供了任選的預(yù)備突變，包括增加鞘氨醇單胞菌突變體攝取質(zhì)粒DNA的能力的自發(fā)突變，即多沼鞘氨醇單胞菌中的S-60wtc突變。
另外，本發(fā)明公開了使用螯合劑、苛性或氧化劑、和用于裂解細胞和消化蛋白質(zhì)的酶來澄清由鞘氨醇單胞菌突變菌株生成的缺乏PHB的吉蘭糖和其它鞘氨糖的方法。本發(fā)明還公開了包含缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖的食品或工業(yè)產(chǎn)品。
為了例示本發(fā)明的細節(jié)，描述了通過遺傳工程改造多沼鞘氨醇單胞菌和鞘氨醇單胞菌ATCC 53159所涉及的步驟，但是，正如下文所述，本發(fā)明不限于改造多沼鞘氨醇單胞菌和鞘氨醇單胞菌ATCC 53159，也不限于編碼參與PHB合成的蛋白質(zhì)的任何特定基因。
使用根據(jù)phaC所編碼蛋白質(zhì)的兩個保守區(qū)設(shè)計的簡并引物，通過PCR獲得多沼鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 31461 phaC基因的內(nèi)部片段。將該片段的核苷酸序列(顯示于圖2)用于設(shè)計反向PCR引物，從而能夠分離phaC基因的更大部分和3’側(cè)翼序列。一般而言，反向PCR技術(shù)以天然取向的相反方向克隆目的核苷酸的側(cè)翼區(qū)(見圖3)。將反向PCR片段排列成它們的天然取向的克隆過程導(dǎo)致232堿基對(“bp”)的缺失。該片段與染色體phaC基因的等位基因交換消除了多沼鞘氨醇單胞菌中的PHB生成。內(nèi)部232bp缺失意外的會降低吉蘭糖產(chǎn)量。
由突變型多沼鞘氨醇單胞菌的大規(guī)模培養(yǎng)分離吉蘭糖產(chǎn)量得到恢復(fù)的自發(fā)衍生物。本發(fā)明的缺乏PHB的衍生物不含外源DNA、但具有來自天然染色體的232bp缺失、和未表征的自發(fā)突變。PDG-1和PDG-3菌株保藏于American Type Culture Collection即美國典型培養(yǎng)物收藏中心，編號分別是ATCC______和ATCC_______。
用于生成用于PHB生產(chǎn)的鞘氨醇單胞菌突變體的具體分子生物學(xué)技術(shù)(即反向PCR和缺失突變)不是至關(guān)重要的。使用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)來生成鞘氨醇單胞菌突變體屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。可用于在不同鞘氨醇單胞菌菌株中突變phaC樣基因的其它有用的分子生物學(xué)技術(shù)包括但不限于轉(zhuǎn)座子誘變、點突變、和插入元件突變。
phaC基因只是PHB合成途經(jīng)中的一個基因；因而有可能通過選擇性突變或缺失參與PHB合成途經(jīng)的其它基因來生成具有期望表型(即PHB生成缺陷)的鞘氨醇單胞菌突變體。可以選擇性突變以生成期望表型的目的基因包括但不限于phaA(3-酮硫解酶)和phaB(乙酰乙酰CoA還原酶)。
一旦生成鞘氨醇單胞菌突變體，使它們在稱為發(fā)酵肉湯的水溶液中生長或發(fā)酵，并以莢膜多糖形式向發(fā)酵肉湯中分泌鞘氨糖。在使缺乏PHB的鞘氨醇單胞菌突變體發(fā)酵之后，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)將肉湯巴氏滅菌并用醇(諸如異丙醇)沉淀鞘氨糖，由此制備鞘氨糖。
優(yōu)選的是，在發(fā)酵之后，可以將鞘氨糖澄清并與懸浮固體和細胞碎片(發(fā)酵肉湯環(huán)境的一部分)分離以生成缺乏PHB的、澄清的鞘氨糖。另外，本發(fā)明的澄清方法可應(yīng)用于上文所述缺乏PHB的鞘氨糖以外的任何鞘氨糖菌株。正如本文所述，澄清方法包括將發(fā)酵肉湯加熱，并用一種或多種螯合劑、一種或多種苛性或氧化劑、或其混合物處理發(fā)酵肉湯，隨后用任何溶菌酶和/或任何蛋白酶進行處理。
就吉蘭糖而言，將PHB生成缺陷的多沼鞘氨醇單胞菌突變體與本發(fā)明的澄清方法聯(lián)合，從而能夠生成高?；问降某吻寮m糖。由這種突變體和方法生成的吉蘭糖展示高透明度和高凝膠強度，這對于制作甜點膠凍、糖果、飲料、諸如此類是有用的。
在本發(fā)明的一個實施方案中(以下稱為“第一方案”)，可以通過包括下列步驟的方法來澄清鞘氨糖水溶液用一種或多種任選的表面活性劑、一種或多種螯合劑、一種或多種苛性或氧化劑、或其混合物處理鞘氨糖溶液，然后用任何溶菌酶和/或任何蛋白酶進行處理。
在本發(fā)明的另一個實施方案中(以下稱為“第二方案”)，可以通過包括下列步驟的方法來澄清鞘氨糖水溶液用一種或多種螯合劑處理鞘氨糖溶液，隨后用任何溶菌酶，隨后是一種或多種苛性或氧化劑、隨后是任何蛋白酶或蛋白酶混合物進行處理。
在第一方案中，可以逐步方式進行本發(fā)明的方法，其中首先用螯合劑、任選表面活性劑、苛性或氧化劑、或其混合物處理鞘氨糖溶液，然后用任何溶菌酶和/或任何蛋白酶進行處理。在第二方案中，可以進行逐步方法，其中首先用螯合劑處理鞘氨糖溶液，然后是任何溶菌酶，然后是苛性或氧化劑，然后是任何蛋白酶(以此順序)進行處理。
有利的是，本文所述用于生成澄清的鞘氨糖溶液的方法提供了可以(如果需要)在適當(dāng)稀釋后使用、無需任何進一步的化學(xué)或機械處理(除了巴氏滅菌和沉淀)的鞘氨糖溶液。對于有些應(yīng)用，可以依照常規(guī)技術(shù)由這些澄清的鞘氨糖肉湯分離鞘氨糖，包括將肉湯巴氏滅菌，將肉湯調(diào)至期望pH，并用醇(即異丙醇)沉淀鞘氨糖。
這種鞘氨糖在水中的再水化和溶解提供了基本上清澈的鞘氨糖溶液。依照本發(fā)明，基本上清澈的鞘氨糖溶液(1％w/w)具有超過大約60％、優(yōu)選超過70％、最優(yōu)選超過80％的透光率。可以使用常規(guī)技術(shù)和設(shè)備(如商品化的分光光度計)在可見光譜的任何波長處測量透光率。通常測量波長大約600nm-大約650nm處的透光率?？梢詼y定幾種類型的鞘氨糖溶液的透光率未處理的肉湯、部分處理的肉湯(如只用螯合劑、苛性或氧化劑、螯合/苛性或螯合/氧化劑混合物處理的肉湯，或者只用溶菌酶和/或蛋白酶處理的肉湯)、處理后的肉湯、或重建的鞘氨糖溶液。本文所述基本上清澈的溶液(具有超過大約60％的透光率)是包含大約1％(質(zhì)量比)鞘氨糖的水溶液，所述鞘氨糖是由依照本發(fā)明的方法處理后的肉湯分離的。
可以使用本發(fā)明的方法澄清的鞘氨糖溶液包括包含鞘氨糖的整個發(fā)酵肉湯(所述鞘氨糖是通過在營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)鞘氨糖的微生物而獲得的)、通過向水性介質(zhì)中加入分離的鞘氨糖而獲得的溶液、和部分純化的鞘氨糖溶液。包含非期望的發(fā)酵固體、可用于本發(fā)明方法的鞘氨糖水溶液可以包含大約0.01％-大約10％鞘氨糖(相對于溶液總重的質(zhì)量比)。包含任何已知鞘氨糖的任何水溶液都可用于本發(fā)明的實踐。
本發(fā)明兩種澄清方法的第一步包括通過常規(guī)技術(shù)將鞘氨糖溶液加熱至澄清溫度，諸如夾套罐中的溫度控制、直接蒸氣注入、諸如此類。優(yōu)選直接蒸氣注入，以使加熱時間縮至最短。澄清溫度的范圍是大約30℃-大約70℃，優(yōu)選大約50℃-大約60℃。將鞘氨糖溶液加熱至期望溫度所需時間可以隨著待處理鞘氨糖溶液的大小和體積而顯著變化。例如，將小體積(如50ml)鞘氨糖溶液由室溫升高至大約60℃可能只需要幾分鐘，而將40,000升溶液(如分批加工中可能存在)升高相似溫度可能需要幾小時。
依照本發(fā)明的兩個方案之一，本發(fā)明方法的下一步包括用選自至少一種螯合劑、至少一種苛性或氧化劑、或其混合物的澄清劑處理鞘氨糖水溶液。或者，可以在如上所述將鞘氨糖肉湯加熱至澄清溫度的同時加入澄清劑。
在第一方案中，下一步是在存在苛性或氧化劑時向鞘氨糖溶液中加入螯合劑。通常，螯合劑和腐蝕/氧化劑的接觸時間的范圍是每種大約0.5小時-大約2小時，優(yōu)選螯合劑大約1小時、苛性或氧化劑大約0.5小時-大約1.0小時。通常，向鞘氨糖溶液中加入苛性或氧化劑的濃度范圍是大約0g/L-大約2g/L，優(yōu)選大約0.5g/L-大約1.5g/L。通常，向鞘氨糖溶液中加入螯合劑的濃度范圍是大約0百萬分之一(“ppm”)-大約3000ppm，優(yōu)選大約1000ppm-大約2000ppm。
在第一方案的澄清劑處理之后，將鞘氨糖肉湯進行酶處理步驟，其中分開或同時向鞘氨糖溶液中加入溶菌酶和/或蛋白酶。通常，酶接觸鞘氨糖肉湯的時間范圍是每種至少大約0.5小時-8小時，優(yōu)選每種至少1小時，最優(yōu)選每種至少2小時。通常，溶菌酶的濃度范圍是大約11,000MCG單位/L-44,000MCG單位/L，優(yōu)選大約20,000MCG單位/L-25,000MCG單位/L；通常，蛋白酶的濃度范圍是大約65,000Delft單位/L-260,000Delft單位/L，優(yōu)選大約100,000Delft單位/L-150,000Delft單位/L。在用于本申請時，“MCG單位”指pH6.6和37℃時溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)相對于參照標(biāo)準(zhǔn)的裂解速率(正如Genencor International Inc.所述)；相似的，“Delft單位”指涉及樣品在由賣主Genencor提供的溶液中的消光比率的具體測定法。
用于酶處理步驟的酶將固體細胞碎片降解成可溶性化合物，從而改進鞘氨糖溶液的透光率并有助于澄清方法。適用于這種方法的蛋白酶可以是來自細菌、真菌、或植物來源的酸性、中性、或堿性蛋白酶。可用于本發(fā)明方法的例示性酸性蛋白酶包括但不限于由曲霉屬微生物(諸如黑曲霉)生成的蛋白酶。可用于本發(fā)明方法的中性蛋白酶包括但不限于由芽孢桿菌屬微生物諸如解淀粉芽孢桿菌生成的蛋白酶?？捎糜诒景l(fā)明方法的堿性蛋白酶包括但不限于由芽孢桿菌屬微生物諸如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、和短小芽孢桿菌生成的蛋白酶，由鏈霉菌屬物種諸如弗氏鏈霉菌、灰色鏈霉菌、和直絲鏈霉菌生成的蛋白酶，由枯草桿菌蛋白酶諸如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg獲得的蛋白酶，包括蛋白酶諸如枯草桿菌肽酶A和枯草桿菌肽酶B。適用于該方法的溶菌酶包括購自Genencor International Inc.(Rochester，紐約)的Multifect溶菌酶或可以由植物、動物、或微生物衍生來源獲得的任何溶菌酶。可用于本發(fā)明的任何蛋白酶或溶菌酶的來源不是至關(guān)重要的。這些酶及獲得它們的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。
正如上文第一方案所述，可以同時或分開加入酶處理(用溶菌酶和/或蛋白酶進行的處理)所包括的酶。同時處理指以任意順序向鞘氨糖溶液中加入蛋白酶和溶菌酶并度過任意時間，條件是處理過程中鞘氨糖溶液中存在這兩種酶。當(dāng)同時加入時，在溶菌酶和蛋白酶都有活性并提供期望酶功能的條件下進行本發(fā)明的酶處理方法。可以在溫度大約30℃-大約70℃、pH大約5-大約9(優(yōu)選大約6-大約8)進行這個實施方案的同時酶處理方法。雖然這個實施方案的具體溫度和pH范圍可以隨著所用的酶而變化，但是在這種同時實施方案中，在相對溫和的溫度和近中性的條件下進行本發(fā)明的方法，使得溶菌酶和蛋白酶(酸性、中性、或堿性)都將展示可接受水平的活性以澄清鞘氨糖溶液。
優(yōu)選的是，如下進行酶處理，即向鞘氨糖溶液中分開加入任何溶菌酶和/或蛋白酶。最優(yōu)選的是，分別在其最佳pH條件(對于溶菌酶為酸性至中性pH范圍即pH范圍大約3-大約7.5，對于蛋白酶為中性至堿性pH范圍即pH范圍大約6.5-大約9)下向sphigan溶液中加入每一種酶。不同溶菌酶和蛋白酶展示最佳澄清活性的溫度和pH范圍可能不同。另外，若必須在用于酶處理的溶菌酶或蛋白酶之間做出選擇，則優(yōu)選的是酶處理包括一種或多種蛋白酶。
在第二方案中，螯合步驟之后是任何溶菌酶的酶處理，隨后是一種或多種苛性或氧化劑的處理，隨后是任何蛋白酶的酶處理。如上所示，酶處理可以是溶菌酶與蛋白酶處理。這種可變順序使得任何溶菌酶能夠在其優(yōu)選的中性至酸性pH條件下發(fā)揮作用，并使得任何蛋白酶能夠在其優(yōu)選的中性至堿性pH條件下發(fā)揮作用?？梢詫⑸衔牡谝环桨杆龅南嗤芫负偷鞍酌福万蟿?、表面活性劑、和苛性或氧化劑用于實踐第二方案。
不必攪動鞘氨糖溶液，當(dāng)然，方便時可以溫和的或間歇的攪動鞘氨糖溶液，以避免固體沉降和促進酶的接觸。
適用于本發(fā)明方法的螯合劑是能夠通過與多價金屬離子形成多配位基復(fù)合物、與金屬離子形成沉淀、或吸附金屬離子而螯合鞘氨糖溶液中的多價金屬離子(如Mg2+、Ca2+、等)的化合物或組合物。優(yōu)選的是，螯合劑是可溶于水或水-醇的化合物或組合物，而且是有機和/或無機酸的堿金屬或堿土金屬鹽或者堿性(含胺)有機化合物的有機/無機酸鹽，以及有機和/或無機酸或堿性化合物自身?？捎糜诒景l(fā)明方法的其它螯合劑是陽離子交換樹脂和碳酸和碳酸鹽。在本發(fā)明方法中特別有用的鹽化合物和組合物包括乙二胺四乙酸、磷酸、偏磷酸、碳酸、檸檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、谷氨酸、焦磷酸、多磷酸、偏磷酸、葡糖二酸、乙二醇二(β-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)、乙二胺、2，3-二氨基丁烷、1，2-二氨基環(huán)己烷、三氨基三乙胺、諸如此類的鹽。適當(dāng)?shù)模杏玫柠}可以包括上述酸的單、二、三、和/或四金屬鹽和上述堿的單、二、或三酸鹽。優(yōu)選的是，用于本發(fā)明方法的螯合劑包括乙二胺四乙酸、檸檬酸、磷酸、焦磷酸、多磷酸、碳酸、焦磷酸、和乙二胺的鹽。有用螯合劑的范例包括但不限于乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀、乙二胺四乙酸四鈉、乙二胺四乙酸四鉀、檸檬酸三鈉、檸檬酸三鉀、六偏磷酸鈉、六偏磷酸鉀、多磷酸鈉、多磷酸鉀、焦磷酸鈉、焦磷酸鉀、磷酸單鈉、磷酸單鉀、磷酸二鈉、磷酸二鉀、磷酸三鈉、磷酸三鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀、陽離子交換樹脂、乙二胺二氫氯酸、乙二胺二醋酸、乙二胺鋰鹽、乙二胺二氫碘酸、諸如此類。更優(yōu)選的是，將六偏磷酸鈉用作螯合劑。
正如上文實施方案所述，表面活性劑可以任選的與苛性、氧化、和螯合劑聯(lián)合使用，從而進一步改進最終吉蘭糖產(chǎn)品的透光率。適用于本發(fā)明方法的表面活性劑是能夠在存在親水和疏水物質(zhì)(固體或液體)時形成水乳濁液的化合物或組合物。優(yōu)選的是，表面活性劑可溶于水或水-醇的化合物或組合物。有用表面活性劑的范例包括但不限于SDS、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(吐溫80，ICI Americas Inc.，Bridgewater，NJ)、卵磷脂、單甘油酯、酒石酸單甘油酯、磷酸化單甘油酯(如單鈉鹽)、乳酰化單甘油酯、乙?；瘑胃视王?、琥珀?；瘑胃视王ァ⒁已趸瘑胃视王?、脫水山梨糖醇酯、聚山梨酸酯(polysorbate)、聚甘油酯、蔗糖酯、硬脂酰乳酸鈉、丙二醇酯、諸如此類。
在螯合劑、苛性或氧化劑處理過程中的任何時間向鞘氨糖肉湯中加入任選的表面活性劑，接觸時間的范圍是每種大約0.5小時-大約8小時，優(yōu)選大約2小時。通常，向鞘氨糖溶液中加入表面活性劑的濃度范圍是大約0.0g/L-大約3.0g/L，優(yōu)選大約0.1g/L-大約1.0g/L。通常，向鞘氨糖溶液中加入表面活性劑的濃度范圍是大約0百萬分之一(“ppm”)-大約3000ppm，優(yōu)選大約300ppm-大約1000ppm。
適用于本發(fā)明方法的苛性劑包括但不限于氫氧化鉀、氫氧化鈉、磷酸三鈉、諸如此類。氫氧化鉀是優(yōu)選的苛性劑?；蛘?，可以使用氧化劑來代替苛性劑?？捎糜诒景l(fā)明澄清方法的氧化劑包括次氯酸鈉或其它次氯酸鹽、二氧化氯(chloride dioxide)、過氧化氫、過乙酸、臭氧、和本領(lǐng)域眾所周知的其它氧化劑。在本發(fā)明中，優(yōu)選的氧化劑是次氯酸鈉。
應(yīng)當(dāng)注意，通過用螯合劑、表面活性劑、苛性或氧化劑、或其混合物處理鞘氨糖溶液而實現(xiàn)的澄清程度可能影響完成后繼酶處理所需要的酶濃度或時間。例如，增加用于這種方法的螯合劑、表面活性劑、苛性或氧化劑、或其混合物的量可以降低實現(xiàn)澄清鞘氨糖溶液所需要的酶量和/或時間。為了獲得鞘氨糖溶液，優(yōu)選調(diào)整和平衡螯合劑、表面活性劑、苛性或氧化劑、或其混合物的濃度和處理時間和/或溶菌酶和/或蛋白酶的濃度和處理時間，以優(yōu)化本文所述缺乏PHB的、澄清的鞘氨糖的生產(chǎn)。
本文所述缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖可用于多種食品或工業(yè)應(yīng)用。例如，缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖諸如天然(高?；?吉蘭糖可用于改進食品產(chǎn)品諸如甜點膠凍、糖果、果醬和果凍、飲料、薄膜、糖衣、諸如此類的味道、質(zhì)地、穩(wěn)定性、和外觀。作為額外的范例，缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖諸如S-657可以更有效的作為流變學(xué)調(diào)節(jié)劑用于工業(yè)應(yīng)用諸如油田鉆井或粘結(jié)系統(tǒng)。本發(fā)明的其它缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖還將在食品產(chǎn)品和工業(yè)中更大范圍的應(yīng)用。
下列實施例提供了本發(fā)明的例示，而不應(yīng)當(dāng)誤解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1生成多沼鞘氨醇單胞菌phaC片段為了鑒定PHB合酶基因的高度保守區(qū)，由National Center forBiotechnology Information即國家生物技術(shù)信息中心(“NCBI”)的基因庫檢索來自不同生物體的PHB合酶序列。選擇并研究來自苜蓿根瘤菌(gbU17227)(SEQ ID NO1)、類球紅細菌(gbL17049)(SEQ ID NO4)、扭脫甲基桿菌(gb07893)(SEQ ID NO5)、真氧產(chǎn)堿菌(gbJ05003)(SEQ ID NO2)、和不動桿菌菌株RA3849(gbL37761)(SEQ ID NO3)的序列。比對選定PHB合酶基因的蛋白質(zhì)序列，正如圖1所示。在保守區(qū)中，根據(jù)其位置和相對較低的簡并性，選擇區(qū)域1(苜蓿根瘤菌第411-417位密碼子)和區(qū)域2(苜蓿根瘤菌第535-541位密碼子)來提供大約408bp的PCR產(chǎn)物。
根據(jù)保守蛋白質(zhì)序列和多沼鞘氨醇單胞菌ATCC 31461的表觀密碼子偏愛，設(shè)計簡并PCR引物來擴增區(qū)域1與區(qū)域2之間的序列。密碼子偏愛是由來自多沼鞘氨醇單胞菌ATCC 31461的外多糖(exopolysaccharide)生物合成酶編碼區(qū)域(由Luis Ielpi博士測序，未發(fā)表)的五種基因和來自密切相關(guān)的鞘氨醇單胞菌ATCC 31554(它生成S-88糖膠)(Yamazaki等人，J.Bacteriol.，1782676-2687，1996)的完整外多糖生物合成酶基因簇的密碼子使用率推斷的。
稱為PHADG5(SEQ ID NO9)的N端引物包含5’-AGTT夾子區(qū)、TCTAGAXbaI位點、和靶向區(qū)域1的TTC GAY CTS CTS TAY TGG AAY3’簡并雜交區(qū)。稱為PHADG7(SEQ ID NO10)的C端引物包含5’-GTAT夾子、ACTAGTSpeI位點、和靶向區(qū)域2的CCA III SGG CCA CCA GCT GCC簡并區(qū)。在SEQ ID NO10中，“I”指次黃苷，一種與任何其它堿基(即A、C、T、或G)相容的核苷酸。
將引物PHADG5(SEQ ID NO9)和PHADG7(SEQ ID NO10)用于以來自非粘液樣菌株Gps31的染色體DNA為模板的PCR反應(yīng)。Gps31是不生成吉蘭糖的S-60突變體。Taq聚合酶與Taq Start抗體(ClontechLaboratories Inc.，Palo Alto，CA)為PCR提供了熱啟動，在100μl反應(yīng)體系中包含2.5mM每種dNTP、4mM MgCl2、和50pmol每種引物。溫度程序是96℃5min；30個循環(huán)的96℃1min、58℃1min、72℃1min；再72℃5min，然后通過冷卻至4℃來終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)導(dǎo)致位于預(yù)期416bp大小(408bp+夾子)的單一條帶。XbaI和SpeI消化后，將片段克隆到經(jīng)XbaI消化、小牛腸堿性磷酸酶(“CIAP”)處理的pUC19載體中，以生成質(zhì)粒pEB1。來自兩條鏈的408bp插入片段的DNA序列(SEQID NO6)顯示于圖2。該片段包含EcoRI、KpnI、和PvuII的限制性位點。翻譯后的克隆片段與其它PHB合酶蛋白質(zhì)的比對證明已經(jīng)克隆了PHB合酶。
實施例2通過反向PCR構(gòu)建phaC缺失將Southern雜交用于確定將提供鞘氨醇單胞菌S-60 phaC基因較大片段的適當(dāng)限制酶，它仍未大得易于通過反向PCR回收。依照QIAGEN(巴倫西亞，加利福尼亞)DNA純化試劑盒描述的方法，由Gps31分離染色體DNA。使用由克隆到pEB1中的408bp插入片段(SEQ ID NO6)生成的探針進行的Southern分析證明，在多沼鞘氨醇單胞菌DNA的PstI消化物中，408bp phaC片段(SEQ ID NO6)位于大約2kb的片段上。
將408bp鞘氨醇單胞菌S-60 phaC片段的序列(SEQ ID NO6)用于選擇向外讀碼的PCR引物，正如圖2所示。引物PHAC12(SEQ ID NO11)讀向phaC所編碼蛋白質(zhì)的N末端，具有夾子5’-GTTC、XbaI位點TCTAGA、和雜交區(qū)GGC GCG ATC AGC TTG TTG TC3’。引物PHAC11(SEQID NO12)讀向phaC所編碼蛋白質(zhì)的C末端，具有夾子5’-GTTC、XbaI位點TCTAGA、和雜交區(qū)GAG TCG CTC GAA TCC TTT GTC3’。用PstI消化多沼鞘氨醇單胞菌染色體DNA，并在200μl體積中連接0.5μg DNA以進行環(huán)化。將用于生成線性DNA分子的KpnI消化物作為模板用于反向PCR反應(yīng)，以生成408bp phaC片段(SEQ ID NO6)側(cè)翼區(qū)的1.7kb片段，正如圖3所示。
1.7kb片段包含在它們的PstI末端以相對于天然取向的相反反向連接的兩個側(cè)翼區(qū)。PstI位點處的切割指示側(cè)翼區(qū)具有相似大小，為850bp和980bp。為了將片段改回天然取向并同時生成缺失最初408bp克隆的大部分的片段，用XbaI消化1.7kb片段，在稀釋條件下自身連接以進行環(huán)化，然后用PstI消化。將生成的片段克隆到經(jīng)PstI消化、CIAP處理的pUC19中，稱為pEB4。
實施例3phaC克隆的測序?qū)EB4中的1.7kb插入片段測序，并聯(lián)合408bp片段(SEQ ID NO6)的序列。合并的1920bp DNA序列(SEQ ID NO7)描述于圖4。該序列的一部分，即由PstI位點至TGA終止密碼子(第1-1200位堿基)，編碼與其它phaC基因羧基端2/3同源的蛋白質(zhì)(SEQ ID NO8)。序列比對確認克隆了正確基因。
該phaC克隆在408bp片段中具有232bp缺失和對應(yīng)于XbaI位點的6bp即TCTAGA插入。這一缺失和插入引起了改變羧基末端的移碼突變，并在第1102位堿基對處導(dǎo)入新的終止密碼子。
實施例4構(gòu)建整合載體并通過同源重組轉(zhuǎn)移至鞘氨醇單胞菌為將phaC缺失突變轉(zhuǎn)移至多沼鞘氨醇單胞菌中，使用能夠在適用于質(zhì)粒構(gòu)建的宿主(例如大腸桿菌)中復(fù)制但不能在鞘氨醇單胞菌中復(fù)制的“自殺”載體。在鞘氨醇單胞菌中對由質(zhì)粒表面的抗生素抗性進行選擇，鑒定了那些質(zhì)粒通過同源重組整合到染色體中的菌落。正如圖5所示，對抗生素抗性喪失的選擇鑒定了那些重復(fù)區(qū)被重組掉而可能導(dǎo)致突變(即缺失)或野生型基因的保留的菌落?？梢酝ㄟ^表型表達(PHB合成)來測定具有缺失的克隆與具有野生型DNA的克隆之間的差異。為了測量PHB的表型表達，使用定性比濁法將一些肉湯(大約1ml)加到9倍體積的Clorox(Clorox公司，Oakland，CA)中，并于37℃保溫至少4小時或過夜。白色沉淀的出現(xiàn)指示存在PHB。
為了便于檢測第二交換重組事件，將陽性選擇系統(tǒng)修改用于多沼鞘氨醇單胞菌?？梢詫⒖莶菅挎邨U菌基因sacB(編碼果聚糖蔗糖酶)轉(zhuǎn)移到革蘭氏陰性細菌中(Kamoun，S.等人，Mol.Microbiol.，6809-816，1985)。在蔗糖中培養(yǎng)這些細菌可以促進果聚糖的合成，而果聚糖對細菌是有毒的。因此，若載體上存在sacB基因，則可以將蔗糖培養(yǎng)用于鑒定那些喪失了載體的分離菌。
由Cereon，Monsanto的Steven Slater處獲得pLO2質(zhì)粒。正如圖6所示，pLO2質(zhì)粒在具有卡那霉素抗性、ColE1復(fù)制起點、和RP4轉(zhuǎn)移起點的載體上包含sacB基因(Lenz，O.等人，J.Bacteriol.，1764385-4393，1994)。pLO2質(zhì)?？捎糜谕ㄟ^天然接合過程來轉(zhuǎn)移基因。該質(zhì)粒能夠在大腸桿菌中復(fù)制，但是不能在鞘氨醇單胞菌中復(fù)制；且包含用于帶動質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的位點，但是不含轉(zhuǎn)移功能。即pLO2質(zhì)粒是可帶動的，但不可自身傳遞。在第二種質(zhì)粒上提供用于接合轉(zhuǎn)移功能的基因，并以反式發(fā)揮作用。雖然此實施例使用pLO2質(zhì)粒，但是它的使用不是至關(guān)重要的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將知道如何設(shè)計和改造合適的其它質(zhì)粒，并使用常規(guī)技術(shù)(諸如電穿孔、轉(zhuǎn)化、諸如此類)將它轉(zhuǎn)移到鞘氨醇單胞菌中。相似的，使用卡那霉素作為選擇標(biāo)記不是至關(guān)重要的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將知道如何選擇適當(dāng)?shù)钠渌x擇標(biāo)記。
將包含phaC缺失的1.7kb PstI片段連接到經(jīng)PstI消化的pLO2中，稱為pLO2-phaC或pEB11，并通過使用電穿孔的轉(zhuǎn)化而轉(zhuǎn)移到大腸桿菌YMC9(F-ΔlacU169 thi endA hsdR)中。純化大腸桿菌菌株，并與多沼鞘氨醇單胞菌菌株S-60wtc及攜帶質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌菌株JZ279混和，后者提供了接合轉(zhuǎn)移的功能(Ditta等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，777347-7351，1980)。S-60wtc是菌株多沼鞘氨醇單胞菌ATCC 31461的衍生物，它是作為攝取質(zhì)粒DNA的能力增加的自發(fā)分離菌而選擇的。使用穩(wěn)定期(過夜)培養(yǎng)物進行接合轉(zhuǎn)移，即1ml YMC9/pLO2-phaCΔ、1ml JZ279/pRK2013、和2-3ml多沼鞘氨醇單胞菌?；旌团囵B(yǎng)物并在濾器上濃縮，繼而置于TYE培養(yǎng)皿(8g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、和5g/L氯化鈉)上，并于37℃保溫7小時。然后將細胞懸于去離子水并置于選擇培養(yǎng)基上。保溫大約7小時后，在添加25μg/ml鏈霉素(為了反選擇大腸桿菌)和7.5μg/ml卡那霉素(為了選擇質(zhì)粒)的YM培養(yǎng)基(3g/L酵母提取物、3g/L麥芽提取物、5g/L蛋白胨、和10g/L葡萄糖)上選擇S-60wtc的卡那霉素抗性轉(zhuǎn)接合子。根據(jù)卡那霉素抗性衡量，整合的發(fā)生頻率是1.5×10-6。
實施例5選擇第二交換缺失菌株純化兩個卡那霉素抗性整合體，并在非選擇性YEME培養(yǎng)基(0.25％酵母提取物、0.025％麥芽提取物)中傳代三次，然后涂布在7.5％蔗糖上以選擇交換體。獲得了七個卡那霉素敏感性交換體，但都是PHB陽性的。將PCR測試用于確認載體phaC插入了染色體的phaC區(qū)和確定插入片段相對于野生型phaC基因的位置。設(shè)計了與缺失側(cè)翼區(qū)和載體末端同源的引物。正如圖7所示，重組可以兩種取向進行，分別導(dǎo)致(1)在載體的左邊具有缺失、右邊是phaC基因片段的phaC基因，這將生成PHB陰性克隆；或(2)載體的左邊是完整的phaC基因、右邊是phaC，這將生成PHB陽性克隆。
對六個pLO2phaC單一交換整合體的測試證明都是第二種、可能偏愛的、PHB陽性的取向。可能強烈偏愛在缺失的一側(cè)發(fā)生重組，或者PHB陽性菌株生長得比PHB陰性重組體好。質(zhì)粒以較不優(yōu)選方式即第一種、PHB陰性的取向進行整合的菌落或許更可能在優(yōu)選位點進行第二重組事件，導(dǎo)致保留突變表型的雙重交換。
通過PCR篩選轉(zhuǎn)接合子，并測試PHB表達，以鑒定處于第一種或PHB陰性取向的轉(zhuǎn)化體。在測試的24個菌落中，PCR結(jié)果證明21個是PHB陽性整合體，3個是PHB陰性整合體。PHB測試證實了這些結(jié)果。選擇這3個PHB陰性菌株(3、15、和22)，純化，在非選擇性條件下培養(yǎng)三代，并涂布在蔗糖上。在來自每個親本的五個卡那霉素敏感菌落中，一個是PHB陰性的。由此，分離得到三個缺乏PHB的、卡那霉素敏感的突變體，稱為NPG-1、NPG-2、和NPG-3。
實施例6表征突變體的吉蘭糖生物合成通過在14L發(fā)酵罐中進行10L發(fā)酵來測試NPG-1、NPG-2、和NPG-3，并與LPG-2進行比較，LPG-2是通過化學(xué)誘變分離得到的缺乏PHB型突變體(美國專利號5,300,429)。發(fā)酵階段和所用培養(yǎng)基與美國專利號5,300,429所述相似，只是將第二階段培養(yǎng)基用于所有種子階段。在接種最終培養(yǎng)基之前使用三個種子階段。轉(zhuǎn)移體積是2.5-5％。使用不同的有機氮(Quest Nzamine EKC，芝加哥，伊利諾斯州，0.41g/L)代替promosoy(0.5g/L)。種子階段中的玉米漿水平是3％而非3.75％。最終10L發(fā)酵與種子培養(yǎng)基相似，但是包含較少的磷酸鹽(0.5g/LK2HPO4)，而且根據(jù)需要通過添加KOH來控制pH。有機氮(1.1g/L)和無機氮NaNO3(1.5g/L)均更高。添加消泡劑H-60-K至0.6ml/L。玉米漿水平是3.85％。在去離子水中配制最終階段的培養(yǎng)基，并添加鈣和鎂。
正如表1所示，根據(jù)總沉淀物(“TPM”)和粘度，NPG突變體生成的吉蘭糖顯著少于LPG-2。肉湯濃度是在Brookfield粘度計中用4號軸以60rpm測定的。總沉淀物是通過將肉湯在高壓鍋中加熱10分鐘、然后用2倍體積的異丙醇沉淀并干燥來測定的。這些結(jié)果具有可重復(fù)性。對發(fā)酵過程中肉湯樣品的分析指示生成了大量的有機酸。因此，NPG突變體的吉蘭糖低產(chǎn)量與在缺乏PHB合成時大量的碳水化合物水解成二碳和三碳中間物和二氧化碳有關(guān)。
實施例7分離恢復(fù)了吉蘭糖生產(chǎn)力的突變體因PHB合成的阻斷而積累的代謝中間物(如有機酸)可能對吉蘭糖合成具有不利影響。預(yù)計在促進吉蘭糖合成的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)過程中，能夠發(fā)生補償突變，使得吉蘭糖合成達到正常水平。涂布來自10L發(fā)酵(實施例6)的一些發(fā)酵肉湯以測定細胞計數(shù)(圖8)。觀察到，在發(fā)酵快要結(jié)束時(即44和69小時)，大約0.5％-2％的菌落比NPG更大且更粘。純化這些菌落，并在搖瓶發(fā)酵中測試PHB和吉蘭糖生成。新的分離菌是缺乏PHB的，且吉蘭糖產(chǎn)量高于最初的NPG突變體。最佳補償突變體的總可沉淀物與LPG-2可比，且≥野生型的80％(預(yù)計TPM降低大約10-15％，可能是由于PHB質(zhì)量的喪失所致)。將這些菌株稱為PDG突變體PDG-1衍生自NPG-1，而PDG-3衍生自NPG-3。在搖瓶發(fā)酵中評價每種菌株的PHB和吉蘭糖生成。
表2、實驗1缺乏PHB菌株的搖瓶發(fā)酵
另外，使用Brookfield粘度計用4號軸以60rpm測定第二批S60-wtc、LPG-2、PDG-1、和PDG-3的肉湯粘度。下文表3顯示了肉湯粘度。
用于搖瓶的培養(yǎng)基與美國專利號5,300,429所示相似。第一種子包含YM培養(yǎng)基。第二和最終階段是每個500ml搖瓶裝有100ml先前所述培養(yǎng)基，只是用于緩沖的磷酸鹽更高(K2HPO4是2.8g/L；KH2PO4是1.2g/L)且有機氮是1.0g/L。
不限于理論，新的突變可以是限制葡萄糖降解成有機酸的自發(fā)突變體。對來自發(fā)酵罐的循環(huán)內(nèi)樣品的分析指示，PDG-1和PDG-3的有機酸生成與對照菌株S-60wtc和LPG-2大致相同。
菌株P(guān)DG-1一致性地生成大量的高粘度吉蘭糖，且TPM＞14g/L。
評價這些培養(yǎng)物在平板上的菌落形態(tài)以檢查菌株的穩(wěn)定性，特別是比較自發(fā)PDG-1突變體與具有低吉蘭糖產(chǎn)量的原始NPG菌株。在YM瓊脂上于大約37℃培養(yǎng)大約60小時后，PDG-1顯示與其親本NPG-1顯著不同的形態(tài)。在來自PDG-1發(fā)酵的肉湯中沒有觀察到具有NPG-1型形態(tài)的菌落，指示菌株的穩(wěn)定性。
實施例8多沼鞘氨醇單胞菌以外的鞘氨醇單胞菌菌株中同源phaC基因的存在在多沼鞘氨醇單胞菌以外的鞘氨醇單胞菌菌株中鑒定到phaC的同源基因，由此證明在多沼鞘氨醇單胞菌以外的鞘氨醇單胞菌菌株中生成缺乏PHB突變體的可行性。
對四種鞘氨醇單胞菌菌株進行Southern DNA雜交生成diutan(S-657)的ATCC 53159；生成welan(S-130)的ATCC 31555；生成rhamsan(S-194)的ATCC 31961；和生成吉蘭糖(S-60)的ATCC 31461作為對照。由每種菌株分離基因組DNA，并用酶EcoRI進行消化。將消化后的基因組DNA樣品(1μg)在1％瓊脂糖凝膠上分開，并使用Schleicher和Schuell Turboblotter(Keene，New Hampshire)在中性條件下通過毛細作用轉(zhuǎn)移至尼龍膜。
使用簡并引物PHADG5和PHADG7(見實施例1)，通過鞘氨醇單胞菌S-657phaC基因內(nèi)部區(qū)域的PCR擴增，用洋地黃毒苷-11-dUTP依照制造商的方案(Roche Molecular Biochemicals，瑞士)制備洋地黃毒苷標(biāo)記的探針。使用來自Roche Diagnostics(曼海姆，德國)的DigEasyHyb依照制造商的方案在中性條件下進行雜交。于44℃(比計算得到的T最佳低10℃)對濾膜進行雜交。預(yù)計這些條件將導(dǎo)致超過90％同一的DNA分子發(fā)生雜交(Birren，B.等人編，《Genomic Analysis，A Laboratory Manual》即基因組分析，實驗室手冊，1997)。在用于本文時，術(shù)語T最佳定義為Tm-20，其中Tm是由公式“50+0.41(％GC)-600/探針長度”定義的，其中％GC是65％，探針長度是400個核苷酸。將濾膜在2×SSC、0.1％SDS中于44℃清洗兩次15分鐘，并使用抗洋地黃毒苷-堿性磷酸酶綴合物和洋地黃毒苷檢測試劑盒依照制造商的方案(Roche Molecualr Biochemicals)進行顯色。
圖9顯示了雜交結(jié)果。在鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 31461中檢測到具有預(yù)期大小(2.6kb)的EcoRI消化條帶。鞘氨醇單胞菌菌株ATCC 53159和ATCC 31961生成具有完全相同大小的條帶。鞘氨醇單胞菌菌株ATCC31555包含與phaC探針雜交的2.4kb片段。因而，Southern DNA雜交確認了這三種菌株包含phaC樣基因，而且能夠依照本文所述方法生成缺乏PHB菌株。
實施例9構(gòu)建具有phaC缺失的ATCC 53159突變菌株使用重組DNA技術(shù)，構(gòu)建完成缺失phaC基因的鞘氨醇單胞菌ATCC53159突變菌株。如下進行突變菌株的構(gòu)建通過PCR擴增phaC基因的側(cè)翼DNA區(qū)，并克隆到自殺載體中，通過接合將包含側(cè)翼PCR產(chǎn)物的自殺載體轉(zhuǎn)移到ATCC 53159細胞中，然后通過對卡那霉素抗性(由載體編碼)的選擇來實現(xiàn)整個質(zhì)粒在鞘氨醇單胞菌ATCC 53159染色體中緊挨phaC上游或下游的同源基因座處的整合。由染色體切除phaC基因座和載體DNA是通過載體上編碼的蔗糖敏感性來選擇的后繼第二交換事件的結(jié)果。
為了分離包含phaC基因和側(cè)翼區(qū)的克隆，制備基因組DNA文庫，并使用PHADG5和PHADG7引物(見上文實施例1)通過PCR進行篩選。構(gòu)建了兩個基因組文庫，一個是在載體pZERO-2(Invitrogen，Carlsbad，CA)中插入NotI限制酶片段，第二個是在pLAFR3(Staskawicz等人，J.Bacteriol.，1695789-5794，1987)中插入Sau3A部分消化片段。由每個文庫分離一個陽性克隆。亞克隆來自這些質(zhì)粒的BamHI-NotI片段，并對適當(dāng)片段測序以測定phaC基因和5’和3’側(cè)翼區(qū)的DNA序列。質(zhì)粒p21-7和pJCS104-2分別包含phaC基因的5’和3’端和側(cè)翼區(qū)。
圖10顯示了phaC基因和側(cè)翼區(qū)的DNA序列。圖11顯示了遺傳圖譜。開放讀碼框是通過存在的起始和終止密碼子以及聯(lián)合了使用來自GeneMark的Borodovsky分析(Lasergene GeneQuest模塊)和P_aeruginosa_3.mat矩陣預(yù)測的編碼區(qū)的BLAST分析而確定的。序列是由克隆p21-7和pJCS104-2中的插入片段序列連接得到的。兩種序列之間的接合位于NotI位點。
圖12描述了如何將PCR用于生成只包含phaC側(cè)翼區(qū)、缺失了整個phaC基因(1737bp，由起始密碼子的第一個核苷酸至終止密碼子的最后一個核苷酸)的產(chǎn)物pJCS105 112-1。將兩種外部引物(引物1Xba和引物4Xba)與跨越phaC上游和下游區(qū)之間的期望接合的引物(交疊1)組合使用。表4顯示了引物序列。
依照制造商的方案，將質(zhì)粒pJCS104-2和p21-7(每種200ng)與引物1Xba和4Xba(每種50pmol)、交疊1引物(2pmol)、dNTP、和來自Clontech Laboratories公司(Palo Alto，CA)的Advantage HighFidelity 2 PCR kit即高級高保真2PCR試劑盒中的Taq聚合酶混和。然后在Matrix熱循環(huán)儀中進行擴增95℃1min；5個循環(huán)的95℃30sec、44℃30sec、68℃2min；20個循環(huán)的95℃30sec、53-68℃30sec、68℃2min；68℃3min。由凝膠純化擴增的DNA片段，并用相同引物再次擴增以生成更多產(chǎn)物。擴增條件是95℃1min；25個循環(huán)的95℃30sec、64℃30sec、68℃2min；68℃3min。然后使用SNAP凝膠純化試劑盒(Invitrogen)由凝膠分離1.1kb條帶，并使用拓撲異構(gòu)酶、具有3’T突出端的載體、和化學(xué)感受態(tài)TOP10細胞依照Invitrogen的方案克隆到載體pCRII-TOPO(Invitrogen)中，以生成pJC105-112-1，正如圖12所示。
凝膠純化來自pJCS105-112-1的包含phaC缺失構(gòu)建物的1.1kbXbaI片段，并克隆到經(jīng)XbaI消化的pLO2中。回收兩種取向的插入片段，稱為pJCS106-5和pJC106-16。
將標(biāo)記交換用于構(gòu)建ATCC 53159的缺乏PHB菌株。如上文實施例4所述，通過轉(zhuǎn)接合將質(zhì)粒pJCS106-5和pJC106-16導(dǎo)入ATCC 53159。如上文實施例4和5所述，進行對第一和第二交換缺失菌株的選擇，即首先選擇由卡那霉素抗性顯示的整合，然后涂布在蔗糖上以選擇對卡那霉素敏感的交換體。通過診斷PCR檢測得到缺失交換體(相對野生型)，稱為NPD-3(衍生自pJCS106-5)和NPD-6(衍生自pJCS106-16)。
生成的NPD-3和NPD-6菌株具有精確的phaC染色體缺失而不剩余外源DNA。然而，這些缺失菌株的糖膠產(chǎn)量得到極大降低，但是隨后在發(fā)酵培養(yǎng)后分離得到恢復(fù)糖膠產(chǎn)量的抑制基因。
在促進S-657合成的條件下培養(yǎng)NPD-3和NPD-6，并選擇具有大型、粘液樣菌落的抑制基因菌株，正如上文實施例7對吉蘭糖合成所進行的。根據(jù)衍生它們的菌落將這些大型、粘液樣菌落稱為PDD-3和PDD-6，并分析PHB和S-657生成。PDD-3和PDD-6菌株保藏于American TypeCulture Collection即美國典型培養(yǎng)物收藏中心，編號分別是ATCC______和ATCC_______。下文表5指示了PDD-6提供比其祖先NPD-6菌株高的糖膠產(chǎn)量，同時定性的看不生成PHB。
實施例10氫氧化鉀濃度對透光率和凝膠強度的影響在包括上文概述為第一方案的步驟的澄清方法中評價苛性劑氫氧化鉀(“KOH”)濃度的影響。將包含缺乏PHB突變體的吉蘭糖發(fā)酵肉湯預(yù)處理，并與不同濃度的KOH混和15分鐘，隨后是作為螯合劑的1000ppm Calgon達1小時，隨后依次是22ppm溶菌酶和220ppm蛋白酶于55℃各2小時。測試的KOH濃度在大約0.0g/L與大約0.45g/L之間變化。正如圖13所示，當(dāng)KOH濃度增加至0.45g/L時，透光率增加了近20％(31％相對增加)。
TA-TX2Texture Analyzer(Texture Technologies公司，Scarsdale，NY)以兩種指數(shù)即用壓力感覺柱塞使制備的凝膠表面的破裂所需要的打孔力度和距離的乘積來測量凝膠強度數(shù)據(jù)。在測壓元件檢測到凝膠編碼的破裂時測量打孔力度，且以高度變化的百分比來測量打孔力度。正如圖14所示，在測試的相同KOH范圍，凝膠強度就打孔力度而言降低了280g或32％，這可能要歸功于吉蘭糖的部分脫?；?。然而，凝膠強度就距離百分比而言似乎沒有受到顯著影響，只反映1.5％的變化。
依照第一方案澄清方法進行2×2小因子研究。將包含缺乏PHB突變體的吉蘭糖發(fā)酵肉湯預(yù)處理，并與不同濃度的KOH混和15分鐘，隨后是作為螯合劑的2000ppm Calgon達1小時，隨后是依次22ppm溶菌酶和220ppm蛋白酶于55℃各2小時。在此研究中研究透光率百分比、打孔力度、和距離百分比，因為認為它們與動力學(xué)相關(guān)。KOH濃度在大約0.225g/L與大約0.45g/L之間變化，且溫度在大約55℃與大約60℃之間變化，而得到下表(顯示透光率百分比、打孔力度、和距離百分比結(jié)果)顯示的結(jié)果，以評價KOH濃度和溫度對吉蘭糖透明度的影響。
如表中所示，在分別增加KOH濃度或溫度后，透光率變化不大。然而，當(dāng)KOH濃度和溫度都增加時，透光率增加了大約6％，這指示這兩個參數(shù)對實現(xiàn)透光率增加是至關(guān)重要的且疊加的。相似的，凝膠強度也顯示疊加效應(yīng)。在分別增加溫度或KOH濃度后，打孔力度降低了大約130g-大約190g；然而，在溫度和KOH濃度都增加時，打孔力度降低了大約326g，從而說明凝膠強度易受溫度和KOH濃度二者變化的影響。
實施例11六偏磷酸鈉對吉蘭糖特性的影響依照上文實施例10描述的澄清方法，評價六偏磷酸鈉(“SHMP”，也稱為Calgon)對透光率、打孔力度、和距離百分比的影響。將包含缺乏PHB突變體的吉蘭糖發(fā)酵肉湯預(yù)處理，并與0.45g/L KOH混和15分鐘，隨后是不同濃度的Calgon達1小時，隨后是依次22ppm溶菌酶和220ppm蛋白酶于55℃各2小時。SHMP濃度在大約1000ppm與大約3000ppm之間變化，而且正如圖15所示，在此范圍內(nèi)，SHMP濃度與透光率之間存在線性關(guān)聯(lián)。SHMP增加大約1000ppm導(dǎo)致透光率增加大約5％。如圖16所示，SHMP似乎不影響凝膠強度，因為在測試范圍內(nèi)，打孔力度和距離百分比相對不受SHMP濃度增加的影響。
實施例12SHMP的其它澄清順序在2升規(guī)模在天然吉蘭糖肉湯上進行澄清方法的兩種變通形式。依照制造商Genencor International公司(Rochester，紐約)提供的信息，Multifect溶菌酶在酸性-中性pH水平是穩(wěn)定的，而且能夠在堿性pH在短時間內(nèi)滅活。在依照澄清方法加入0.45g/L KOH后，pH通常超過pH8，這對于溶菌酶并不是最佳的，而蛋白酶據(jù)說在這些條件下發(fā)揮很好。因而，依照第二方案修改澄清方法，在溶菌酶處理后添加KOH(順序概述溶菌酶，然后KOH，然后蛋白酶)。無論是在溶菌酶處理之前或之后添加KOH，都觀察到5.5％的相對標(biāo)準(zhǔn)誤差(“RSD”)，正如下表所示。
****指未測量數(shù)據(jù)RSD指相對于平均值百分比的相對標(biāo)準(zhǔn)誤差實施例13糖果配方此實施例演示了可用于生成展示極好透明度和穩(wěn)定性的彈性耐嚼糖果的配方。
在加熱容器中混和包含部分A的成分并加熱至40℃。
在干燥狀態(tài)下混和部分B的成分，倒到加熱容器中快速混和，并加熱至沸騰。將混合物降至72％固體?；旌筒糠諧的成分，加入調(diào)味劑和顏料，并混和至均質(zhì)。
將材料置于容器中并填充到預(yù)制的淀粉模具中。然后將填滿的淀粉模具保存于30℃和35％相對濕度達3-4天，直至固體水平達到大約82％-85％。將材料脫模，上蠟，并保存于密封袋中。
可以向部分A成分中加入額外的水以便于完成親水膠體的水合。
實施例14甜點膠凍配方此配方可用于生成具有極好透明度和穩(wěn)定性的彈性甜點膠凍。
以干燥狀態(tài)混合干燥的調(diào)味劑和顏料以及部分A的成分，散布到部分B中并混勻；加熱至90℃。然后將混合物倒到合適的容器中，并使之于室溫凝固。
實施例15果凍配方此配方提供了具有極好透明度、保存穩(wěn)定性、味道釋放、和涂抹能力的果凍。
混和部分A的成分。在干燥狀態(tài)混和部分B的成分，并在混和時分散到部分A的成分中。在混和時將生成的混合物加熱至沸騰，并在沸騰狀態(tài)下保持大約1分鐘-大約3分鐘，此時將部分C的成分攪拌到混合物中。然后將混合物倒到滅菌后的容器中并封口。
上文已經(jīng)通過目前認為的優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于上文所述。相反，本發(fā)明意欲覆蓋包括在所附權(quán)利要求的精神和范圍之內(nèi)的各種修改和等同安排。
序列表<110>Bower，StanBurke，EllenHarding，Nancy E.
Patel，Yamini N.
Schneider，J.CarrieMeissner，DagmarMorrison，NeilBezanson，Ralph<120>聚羥基丁酸生成缺陷的鞘氨醇單胞菌屬突變型細菌菌株和澄清鞘氨糖的方法及其組合物<130>2047.144<140>
<141>
<150>60/186,433<151>2000-03-02<160>16<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>577<212>PRT<213>苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)<400>1Met Ala Arg Ala Ala Glu Gln Leu Gly Lys Ala Ala Ser Ala Trp Leu1 5 10 15Ala Pro Arg Glu Ala Gly Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ala Glu Pro Val20 25 30Ser Asp Met Val Lys Thr Leu Ser Lys Val Ser Glu Tyr Trp Leu Ser35 40 45Asp Pro Arg Arg Thr Leu Glu Ala Gln Thr His Leu Leu Gly Ser Phe50 55 60Phe Asp Met Trp Ser Arg Thr Leu Gln Arg Met Ala Ala Asp Ala Val65 70 75 80
Glu Asp Pro Ala Asn Leu Gln His Asn Asp Lys Arg Phe Ala Asp Glu85 90 95Asp Trp Val Lys Asn Pro Phe Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ala Tyr Phe100 105 110Val Thr Ser Asp Trp Ala Glu Arg Met Val Lys Asp Ala Glu Gly Leu115 120 125Asp Asp His Thr Arg His Lys Ala Ala Phe Tyr Val Arg Gln Ile Ala130 135 140Ser Ala Leu Ser Pro Thr Asn Phe Ile Thr Thr Asn Pro Gln Leu Tyr145 150 155 160Arg Glu Thr Val Ala Ser Ser Gly Ala Asn Leu Val Lys Gly Met Gln165 170 175Met Leu Ala Glu Asp Ile Ala Ala Gly Arg Gly Glu Leu Arg Leu Arg180 185 190Gln Thr Asp Thr Ser Lys Phe Ala Ile Gly Glu Asn Ile Ala Ile Thr195 200 205Pro Gly Lys Val Ile Ala Gln Asn Asp Val Cys Gln Val Leu Gln Tyr210 215 220Glu Ala Ser Thr Glu Thr Val Leu Lys Arg Pro Leu Leu Ile Cys Pro225 230 235 240Pro Trp Ile Asn Lys Phe Tyr Val Leu Asp Leu Asn Pro Glu Lys Ser245 250 255Phe Ile Lys Trp Ala Val Asp Gln Gly Gln Thr Val Phe Val Ile Ser260 265 270Trp Val Asn Pro Asp Glu Arg His Ala Ser Lys Asp Trp Glu Ala Tyr275 280 285Ala Arg Glu Gly Ile Gly Phe Ala Leu Asp Ile Ile Glu Gln Ala Thr290 295 300Gly Glu Arg Glu Val Asn Ser Ile Gly Tyr Cys Val Gly Gly Thr Leu305 310 315 320Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu His Ala Ala Glu Gly Asp Glu Arg Ile325 330 335
Arg Ser Ala Thr Leu Phe Thr Thr Gln Val Asp Phe Thr His Ala Gly340 345 350Asp Leu Lys Val Phe Val Asp Asp Asp Gln Ile Arg His Leu Glu Ala355 360 365Asn Met Ser Ala Thr Gly Tyr Leu Glu Gly Ser Lys Met Ala Ser Ala370 375 380Phe Asn Met Leu Arg Ala Ser Glu Leu Ile Trp Pro Tyr Phe Val Asn385 390 395 400Asn Tyr Leu Lys Gly Gln Asp Pro Leu Pro Phe Asp Leu Leu Tyr Trp405 410 415Asn Ser Asp Ser Thr Arg Met Pro Ala Ala Asn His Ser Phe Tyr Leu420 425 430Arg Asn Cys Tyr Leu Glu Asn Arg Leu Ser Arg Gly Glu Met Met Leu435 440 445Ala Gly Arg Arg Val Ser Leu Gly Asp Val Lys Ile Pro Ile Tyr Asn450 455 460Leu Ala Thr Lys Glu Asp His Ile Ala Pro Ala Lys Ser Val Phe Leu465 470 475 480Gly Ser Ser Ser Phe Gly Gly Lys Val Thr Phe Val Leu Ser Gly Ser485 490 495Gly His Ile Ala Gly Val Val Asn Pro Pro Ala Arg Ser Lys Tyr Gln500 505 510Tyr Trp Thr Gly Gly Ala Pro Lys Gly Asp Ile Glu Thr Trp Met Gly515 520 525Lys Ala Lys Glu Thr Ala Gly Ser Trp Trp Pro His Trp Gln Gly Trp530 535 540Val Glu Arg Leu Asp Lys Arg Arg Val Pro Ala Arg Lys Ala Gly Gly545 550 555 560Pro Leu Asn Ser Ile Glu Glu Ala Pro Gly Ser Tyr Val Arg Val Arg565 570 575Ala
<210>2<211>589<212>PRT<213>真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrophus)<400>2Met Ala Thr Gly Lys Gly Ala Ala Ala Ser Thr Gln Glu Gly Lys Ser1 5 10 15Gln Pro Phe Lys Val Thr Pro Gly Pro Phe Asp Pro Ala Thr Trp Leu20 25 30Glu Trp Ser Arg Gln Trp Gln Gly Thr Glu Gly Asn Gly His Ala Ala35 40 45Ala Ser Gly Ile Pro Gly Leu Asp Ala Leu Ala Gly Val Lys Ile Ala50 55 60Pro Ala Gln Leu Gly Asp Ile Gln Gln Arg Tyr Met Lys Asp Phe Ser65 70 75 80Ala Leu Trp Gln Ala Met Ala Glu Gly Lys Ala Glu Ala Thr Gly Pro85 90 95Leu His Asp Arg Arg Phe Ala Gly Asp Ala Trp Arg Thr Asn Leu Pro100 105 110Tyr Arg Phe Ala Ala Ala phe Tyr Leu Leu Asn Ala Arg Ala Leu Thr115 120 125Glu Leu Ala Asp Ala Val Glu Ala Asp Ala Lys Thr Arg Gln Arg Ile130 135 140Arg Phe Ala Ile Ser Gln Trp Val Asp Ala Met Ser Pro Ala Asn phe145 150 155 160Leu Ala Thr Asn Pro Glu Ala Gln Arg Leu Leu Ile Glu Ser Gly Gly165 170 175Glu Ser Leu Arg Ala Gly Val Arg Asn Met Met Glu Asp Leu Thr Arg180 185 190Gly Lys Ile Ser Gln Thr Asp Glu Ser Ala Phe Glu Val Gly Arg Asn195 200 205Val Ala Val Thr Glu Gly Ala Val Val Phe Glu Asn Glu Tyr Phe Gln
210 215 220Leu Leu Gln Tyr Lys Pro Leu Thr Asp Lys Val His Ala Arg Pro Leu225 230 235 240Leu Met Val Pro Pro Cys Ile Asn Lys Tyr Tyr Ile Leu Asp Leu Gln245 250 255Pro Glu Ser Ser Leu Val Arg His Val Val Glu Gln Gly His Thr Val260 265 270Phe Leu Val Ser Trp Arg Asn Pro Asp Ala Ser Met Ala Gly Ser Thr275 280 285Trp Asp Asp Tyr Ile Glu His Ala Ala Ile Arg Ala Ile Glu Val Ala290 295 300Arg Asp Ile Ser Gly Gln Asp Lys Ile Asn Val Leu Gly Phe Cys Val305 310 315 320Gly Gly Thr Ile Val Ser Thr Ala Leu Ala Val Leu Ala Ala Arg Gly325 330 335Glu His Pro Ala Ala Ser Val Thr Leu Leu Thr Thr Leu Leu Asp Phe340 345 350Ala Asp Thr Gly Ile Leu Asp Val Phe Val Asp Glu Gly His Val Gln355 360 365Leu Arg Glu Ala Thr Leu Gly Gly Gly Ala Gly Ala Pro Cys Ala Leu370 375 380Leu Arg Gly Leu Glu Leu Ala Asn Thr Phe Ser Phe Leu Arg Pro Asn385 390 395 400Asp Leu Val Trp Asn Tyr Val Val Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Asn Thr405 410 415Pro Val Pro Phe Asp Leu Leu Phe Trp Asn Gly Asp Ala Thr Asn Leu420 425 430Pro Gly Pro Trp Tyr Cys Trp Tyr Leu Arg His Thr Tyr Leu Gln Asn435 440 445Glu Leu Lys Val Pro Gly Lys Leu Thr Val Cys Gly Val Pro Val Asp450 455 460Leu Ala Ser Ile Asp Val Pro Thr Tyr Ile Tyr Gly Ser Arg Glu Asp
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Ser Gly Asp Arg Arg Phe Asn Ser Pro Leu Trp Gln Glu His Pro Asn100 105 110Phe Asp Leu Leu Ser Gln Ser Tyr Leu Leu Phe Ser Gln Leu Val Gln115 120 125Asn Mer Val Asp Val Val Glu Gly Val Pro Asp Lys Val Arg Tyr Arg130 135 140Ile His Phe Phe Thr Arg Gln Met Ile Asn Ala Leu Ser Pro Ser Asn145 150 155 160Phe Leu Trp Thr Asn Pro Glu Val Ile Gln Gln Thr Val Ala Glu Gln165 170 175Gly Glu Asn Leu Val Arg Gly Met Gln Val Phe His Asp Asp Val Met180 185 190Asn Ser Gly Lys Tyr Leu Ser Ile Arg Met Val Asn Ser Asp Ser Phe195 200 205Ser Leu Gly Lys Asp Leu Ala Tyr Thr Pro Gly Ala Val Val Phe Glu210 215 220Asn Asp Ile Phe Gln Leu Leu Gln Tyr Glu Ala Thr Thr Glu Asn Val225 230 235 240Tyr Gln Thr Pro Ile Leu Val Val Pro Pro Phe Ile Asn Lys Tyr Tyr245 250 255Val Leu Asp Leu Arg Glu Gln Asn Ser Leu Val Asn Trp Leu Arg Gln260 265 270Gln Gly His Thr Val Phe Leu Met Ser Trp Arg Asn Pro Asn Ala Glu275 280 285Gln Lys Glu Leu Thr Phe Ala Asp Leu Ile Thr Gln Gly Ser Val Glu290 295 300Ala Leu Arg Val Ile Glu Glu Ile Thr Gly Glu Lys Glu Ala Asn Cys305 310 315 320Ile Gly Tyr Cys Ile Gly Gly Thr Leu Leu Ala Ala Thr Gln Ala Tyr325 330 335Tyr Val Ala Lys Arg Leu Lys Asn His Val Lys Ser Ala Thr Tyr Met340 345 350
Ala Thr Ile Ile Asp Phe Glu Asn Pro Gly Ser Leu Gly Val Phe Ile355 360 365Asn Glu Pro Val Val Ser Gly Leu Glu Asn Leu Asn Asn Gln Leu Gly370 375 380Tyr Phe Asp Gly Arg Gln Leu Ala Val Thr Phe Ser Leu Leu Arg Glu385 390 395 400Asn Thr Leu Tyr Trp Asn Tyr Tyr Ile Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Lys405 410 415Glu Pro Ser Asp Phe Asp Ile Leu Tyr Trp Asn Ser Asp Gly Thr Asn420 425 430Ile Pro Ala Lys Ile His Asn Phe Leu Leu Arg Asn Leu Tyr Leu Asn435 440 445Asn Glu Leu Ile Ser Pro Asn Ala Val Lys Val Asn Gly Val Gly Leu450 455 460Asn Leu Ser Arg Val Lys Thr Pro Ser Phe Phe Ile Ala Thr Gln Glu465 470 475 480Asp His Ile Ala Leu Trp Asp Thr Cys Phe Arg Gly Ala Asp Tyr Leu485 490 495Gly Gly Glu Ser Thr Leu Val Leu GIy Glu Ser Gly His Val Ala Gly500 505 510Ile Val Asn Pro Pro Ser Arg Asn Lys Tyr Gly Cys Tyr Thr Asn Ala515 520 525Ala Lys Phe Glu Asn Thr Lys Gln Trp Leu Asp Gly Ala Glu Tyr His530 535 540Pro Glu Ser Trp Trp Leu Arg Trp Gln Ala Trp Val Thr Pro Tyr Thr545 550 555 560Gly Glu Gln Val Pro Ala Arg Asn Leu Gly Asn Ala Gln Tyr Pro Ser565 570 575Ile Glu Ala Ala Pro Gly Arg Tyr Val Leu Val Asn Leu Phe580 585 590<210>4<211>601
<212>PRT<213>類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)<400>4Met Ala Thr Glu Glu Gln Ser Pro Gly Ser Gly Arg Asp Ala Gln Phe1 5 10 15Glu Arg Leu Asn Ala Asn Leu Thr Arg Ile Asp Glu Leu Ser Lys Arg20 25 30Leu Thr Ala Ala Leu Thr Lys Arg Lys Leu Ser Asp Pro Ala Leu His35 40 45Gly Pro Ser Gly Asp Val Phe Leu Lys Ala Met Thr Ala Tyr Met Ala50 55 60Glu Met Met Gln Asn Pro Ala Lys Ile Leu Glu His Gln Ile Ser Phe65 70 75 80Trp Gly Lys Ser Leu Lys His Tyr Val Glu Ala Gln His Gln Leu Val85 90 95Lys Gly Glu Leu Lys Pro Pro Pro Asp Val Thr Pro Lys Asp Arg Arg100 105 110Phe Ser Asn Pro Leu Trp Gln Thr His Pro Phe Phe Asn Tyr Leu Lys115 120 125Gln Gln Tyr Leu Met Asn Ala Glu Ala Val Asn Gln Ala Val Glu Gly130 135 140Leu Glu His Ile Glu Pro Ser Asp Lys Lys Arg Val Glu Tyr Phe Ser145 150 155160Arg Gln Ile Val Asp Leu Phe Ser Pro Thr Asn Phe Phe Gly Thr Asn165 170 175Pro Asp Ala Leu Glu Arg Ala Ile Ala Thr Asp Gly Glu Ser Leu Val180 185 190Gln Gly Leu Glu Asn Leu Val Arg Asp Ile Glu Ala Asn Asn Gly Asp195 200 205Leu Leu Val Thr Leu Ala Asp Pro Glu Ala Phe Gln Val Gly Gln Asn210 215 220Leu Ala Thr Thr Glu Gly Ser Val Val Tyr Arg Asn Arg Met Phe Glu225 230 235 240
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100 105 110Pro Pro Thr Asp Lys Arg Phe Ala His Ala Asp Trp Ser Ala Asn Pro115 120 125Val Phe Asp Leu Ile Lys Gln Ser Tyr Leu Leu Leu Gly Arg Trp Ala130 135 140Glu Glu Met Val Glu Thr Ala Glu Gly Ile Asp Glu His Thr Arg His145 150 155 160Lys Ala Glu Phe Tyr Leu Arg Gln Leu Leu Ser Ala Tyr Ser Pro Ser165 170 175Asn Phe Val Met Thr Asn Pro Glu Leu Leu Arg Gln Thr Leu Glu Glu180 185 190Gly Gly Ala Asn Leu Met Arg Gly Met Lys Met Leu Gln Glu Asp Leu195 200 205Glu Ala Gly Gly Gly Gln Leu Arg Val Arg Gln Thr Asp Leu Ser Ala210 215 220Phe Thr Phe Gly Lys Asp Val Ala Val Thr Pro Gly Glu Val Ile Phe225 230 235 240Arg Asn Asp Leu Met Glu Leu Ile Gln Tyr Ala Pro Thr Thr Glu Thr245 250 255Val Leu Lys Arg Pro Leu Leu Ile Val Pro Pro Trp Ile Asn Lys Phe260 265 270Tyr Ile Leu Asp Leu Asn Pro Gln Lys Ser Leu Ile Gly Trp Met Val275 280 285Ser Gln Gly Ile Thr Val Phe Val Ile Ser Trp Val Asn Pro Asp Glu290 295 300Arg His Arg Asp Lys Asp Phe Glu Ser Tyr Met Arg Glu Gly Ile Glu305 310 315 320Thr Ala Ile Asp Met Ile Gly Val Ala Thr Gly Glu Thr Asp Val Ala325 330 335Ala Ala Gly Tyr Cys Val Gly Gly Thr Leu Leu Ala Val Thr Leu Ala340 345 350Tyr Gln Ala Ala Thr Gly Asn Arg Arg Ile Lys Ser Ala Thr Phe Leu
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<210>6<211>408<212>DNA<213>多沼鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas elodea)<400>6tctagattcg atctcctcta ctggaattcg gacgtcacca acctgccggc gacctggcac 60ctcagctacc tgaccgacct ctaccgcgac aacaagctga tcgcgcccgg cgcgctcagc 120atcggcggta ccccgatcga cctgtcgaag gtagaaacgc cgtcctatat ccaggccggg 180cgcgaagatc acatcgcacc gccccgcagc gtctggaaga tgacggagca tttccgcggg 240ccgcacaagt tcgtgctggc cggttccggc catatcgccg gcgtaatcaa tccgccttcg 300gcaaagaaat accaatactg gaccaatgcc gggccggccg agtcgctcga atcctttgtc 360gaaaacgcga cggaacatgc cggcagctgg tggcccccct ggactaga 408<210>7<211>1925<212>DNA<213>多沼鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas elodea)<400>7ctgcaggaca tggccaaggg ccagatgacg cagaccgccg ccggcgcgtt cgagctcggc 60cgcaacctgg cgatgacgcc gggcaaggtg gtgaagcgca cgccgctgta cgaactgatc 120cagtattcgc cgacgacgga cacggtgctg gaaacgccgc tgatcatctt cccgccctgg 180atcaaccgct tctacattct cgacctgacg ccggagaaga gcttcatccg ctgggcggtg 240gcgcagggga tcaccgtgtt cgtcgtgtcg tggcgctcgg ccgatgcgag catgaaggac 300gtggtgtggg acgattatgt cgagcgcggc cagatcgacg cgatcgacac cgtgcgcgag 360ctgctcggcg tggaaagcgt ccacacgatc ggctattgcg tggcgggcac cacgctggcg 420gcgacgctgg cggtgctcgc ggcgcgcggg gaggcggcga aggtggcgag cgcgaccttc 480ttcaccgccc aggtcgactt caccgaggcg ggcgacctgc gcgtgttcgt cgacgacgac 540cagctggcga tgatccgcag cctcggcgcc gacgggttcc tcgacgggcg ctacatggcg 600gcgacgttca acctgctgcg cgggcgcgac ctgatctgga actacgtcac caacaactat 660ctgatggggc aggaatatgc gccgttcgac ctgctccact ggaactcgga cgtcaccaac 720ctgccggcgr cctggcacct cagctacctg accgacctct accgcgacaa caagctgatc 780gcgcctctag acggcgcgct cagcatcggc ggtaccccga tcgacctgtc gaaggtagaa 840acgccgtcct atatccaggc cgggcgcgaa gatcacatcg caccgccccg cagcgtctgg 900aagatgacgg agcatttccg cgggccgcac aagttcgtgc tggccggttc cggccatatc 960gccggcgtaa tcaatccgcc ttcggcaaag aaataccaat actggaccaa tgccgggccg 1020gccgagtcgc tcgaatcctt tgtcgaaaac gcgacggaac atgccggaag ctggtggccg 1080gactgggtgg actggttggt tgcgttgaac agtgcaaagg ttgcgacgaa aggtgcgcgg 1140cttcccggca gtggaaacct ttgtgcaatc gccgacgcgc ccggcgaata tgttagaatg 1200cgctgacggg aaggccgaat tttcgcgggt ttgacgattt ttgtgcactg cacaatggcg 1260ccttgcaaaa tggccgtcga gcctttatat gttgcagcca gcaattggca gggaaagcta 1320gtcacatggc cagcaaagga cctaagacga cggccaaacc ggcggcacgc ggtgctacca 1380agcccgcgac tctggccgaa gctgccgcgg cgaagccgac gcctgcaccc gcccttgccg 1440agacgatcgt cccggcagcg gcgccggtgc cggcgcctgc cgaagccgct gcaccgcagg 1500acgtgaagac caacatcgaa gaggcgatca ccgccccggt ggaaacggca gccgccgtca 1560ccgagcaggc gatcgaagcc gcagagaccg tcgcgccggc ggtcaccacc agcaccgcga 1620
aggaaacgac tatcatggct accactttcg aaaacgcgac tacccaggcc cagaccgttt 1680tcgccgacct gaatgagcgc accaaggccg ccgtcgagaa gtcgaccaag ctggtcgagg 1740aagccaacga gttcgccaag ggcaacatcg aagccctggt cgaatcgggc cgcatcgccg 1800ccaagggctt cgagagcctg ggccaggaag ctgccgatta cagccgccgc tcgttcgaga 1860gcgcgaccgc cgcgctgaag ggcctgtcgt cggtcaagtc gccgaccgaa ttcttcaagc 1920tgcag 1925<210>8<211>399<212>PRT<213>多沼鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas elodea)<400>8Leu Gln Asp Met Ala Lys Gly Gln Met Thr Gln Thr Ala Ala Gly Ala1 5 10 15Phe Glu Leu Gly Arg Asn Leu Ala Met Thr Pro Gly Lys Val Val Lys20 25 30Arg Thr Pro Leu Tyr Glu Leu Ile Gln Tyr Ser Pro Thr Thr Asp Thr35 40 45Val Leu Glu Thr Pro Leu Ile Ile Phe Pro Pro Trp Ile Asn Arg Phe50 55 60Tyr Ile Leu Asp Leu Thr Pro Glu Lys Ser Phe Ile Arg Trp Ala Val65 70 75 80Ala Gln Gly Ile Thr Val Phe Val Val Ser Trp Arg Ser Ala Asp Ala85 90 95Ser Met Lys Asp Val Val Trp Asp Asp Tyr Val Glu Arg Gly Gln Ile100 105 110Asp Ala Ile Asp Thr Val Arg Glu Leu Leu Gly Val Glu Ser Val His115 120 125Thr Ile Gly Tyr Cys Val Ala Gly Thr Thr Leu Ala Ala Thr Leu Ala130 135 140Val Leu Ala Ala Arg Gly Glu Ala Ala Lys Val Ala Ser Ala Thr Phe145 150 155 160Phe Thr Ala Gln Val Asp Phe Thr Glu Ala Gly Asp Leu Arg Val Phe165 170 175Val Asp Asp Asp Gln Leu Ala Met Ile Arg Ser Leu Gly Ala Asp Gly
180 185 190Phe Leu Asp Gly Arg Tyr Met Ala Ala Thr Phe Asn Leu Leu Arg Gly195 200 205Arg Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Val Thr Asn Asn Tyr Leu Met Gly Gln210 215 220Glu Tyr Ala Pro Phe Asp Leu Leu His Trp Asn Ser Asp Val Thr Asn225 230 235 240Leu Pro Ala Xaa Trp His Leu Ser Tyr Leu Thr Asp Leu Tyr Arg Asp245 250 255Asn Lys Leu Ile Ala Pro Gly Ala Leu Ser Ile Gly Gly Thr Pro Ile260 265 270Asp Leu Ser Lys Val Glu Thr Pro Ser Tyr Ile Gln Ala Gly Arg Glu275 280 285Asp His Ile Ala Pro Pro Arg Ser Val Trp Lys Met Thr Glu His Phe290 295 300Arg Gly Pro His Lys Phe Val Leu Ala Gly Ser Gly His Ile Ala Gly305 310 315 320Val Ile Asn Pro Pro Ser Ala Lys Lys Tyr Gln Tyr Trp Thr Asn Ala325 330 335Gly Pro Ala Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Glu Asn Ala Thr Glu His340 345 350Ala Gly Ser Trp Trp Pro Asp Trp Val Asp Trp Leu Val Ala Leu Asn355 360 365Ser Ala Lys Val Ala Thr Lys Gly Ala Arg Leu Pro Gly Ser Gly Asn370 375 380Leu Cys Ala Ile Ala Asp Ala Pro Gly Glu Tyr Val Arg Met Arg385 390 395<210>9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述與多沼鞘氨醇單胞菌phaC基因片段退火的PCR引物PHADG5<400>9agtttctaga ttcgayctst aytggaay 28<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述與多沼鞘氨醇單胞菌phaC基因片段退火的PCR引物PHADG7<400>10gtatactagt ccaiiisggc caccagctgc c 31<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述與多沼鞘氨醇單胞菌phaC基因片段退火的PCR引物PHAC12<400>11gttctctaga ggcgcgatca gcttgttgtc 30<210>12<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述與多沼鞘氨醇單胞菌phaC基因片段退火的PCR引物PHAC11<400>12gttctctaga gagtcgctcg aatcctttgt c 31
<210>13<211>3180<212>DNA<213>鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)ATCC 53159<400>13gatccacacc ttgttctcgc gcgcccaggc gacgaggcgc tcgtagaagg cgaggtccac 60cgtctccgcc gtcgggttcg acggatagtt gacgacgagg atcgacgggc gcggcacggt 120gaagttcatt gcccgctcga ggctttcgaa ataggcgtcg tcgggcgtgg tcggcaccgc 180gcggatcgtc gcgccggcga tgatgaagcc gaaggtgtgg atcgggtagc tggggttggg 240cgcgagcacc acgtcgcccg gcgcggtgat cgcggtggcg aggctggcaa ggccctcctt 300cgagcccatc gtgacgacga cctcggtctc gggatcgagc tcgacgccga atcggcggcc 360ataataattg gcctgggcgc ggcgcaggcc cggaatgccc ttggactgcg aatagccgtg 420cgcgtcgggc ttgcgcgcca cttcgcacag tttctcgatc acatggtcgg gcggcggcag 480gtccggattg cccatgccga ggtcgataat gtcctctccg cccgcgcgtg ccgctgcccg 540catcgcgttc acttcggcga tgacataggg aggcaagcgc ttgatgcggt agaattcttc 600ggacatttcc tcgactttca agggttttga cacgcgacac aaaattgtgt cgtgcgcgcg 660ttctacgcca taatcgcgca tccgggaatg acgcattgct ccgcctgcgc taagccgggg 720cgaaggagag gaccgaatgg ccgatacgct cacgccgacc ctgccccgac tggaagacct 780gcagcattgg acctgggtgc tgggccgcgc gcagcagatg atgctggagc atgggctgga 840cctgatggag catgtgcccg ccgcgccccc cttcggcatg ctgctcgatc cgaccccggc 900aatgcgggcg agcgcggacc tctgggcgga cacgatgcag ctgtggcagc gcttcctcga 960tcccgcccat gccgagccgt tcgtcgaatc gcccgagcag gcgcgcgaca agcgcttcaa 1020ggcgccgcaa tggcgcgagg agccggtgtt cgatttcctg cggcagagct atttcgtgat 1080cgccgaccac atgctcaggc aggtcgaggc gctcgagcat gtcgacgagc ggcagcggga 1140ccagatccgc ttcgccacca agggcttcat cgacgcgatc agccccacca acttccccgc 1200caccaatccg caggtgatcg agaagatcgt cgagaccaag ggggaaagcc tgctcaaggg 1260cctgcagcat atgctgcagg acatggccaa gggccagatg acgcagaccg ccgccggtgc 1320gttcgagctc ggccgcaacc tggcgatgac gcccggcaag gtggtgaagc gcaccccgct 1380ctacgaactg atccagtatt cgccgaccac cgagaccgtg ctggaaacgc cgctgatcat 1440cttcccgccc tggatcaacc gcttctacat cctcgacctg acgcccgaga aaagcttcat 1500ccgctgggcg gtggagcagg ggatcaccgt gttcgtcgtc tcctggcgct cggccgatgc 1560gagcatgaag gacgtggtgt gggacgatta tgtcgagcgc ggccagatcg acgcgatcga 1620cacggtgcgc gcgctgctcg gcgtcgagag cgtccatacc atcggctatt gcgtggcggg 1680caccacgctg gcggcgacgc tggcggtgct cgccgcgcgc gggcaggcgg cgaaggtggc 1740gagcgcgacc ttcttcaccg cgcaggtcga tttcaccgag gcgggcgacc tgcgcgtgtt 1800cgtcgatgac gaccagctgg cgatgatccg cagcctcagc gccgacggct tcctcgacgg 1860gcgctacatg gcggcgacct tcaacctgct gcgcggccgc gacctgatct ggaactacgt 1920caccaacaac tatctgatgg ggcaggaata tgcgccgttc gacctgctcc actggaactc 1980ggacgtcacc aacctgccgg cgacctggca tctcagctac ctgaccgacc tgtaccgcga 2040caacaagctg atcgcgcccg gcgcgctgcg catcggcggc accccggtcg acctttcgaa 2100ggtcgaaacg ccgtcctaca tccaggccgg ccgcgaagat catatcgcgc cgccgcaaag 2160cgtctggaag atcaccgagc atttccgcgg gccgcacaag ttcgtgctgg cgggttccgg 2220gcatatcgca ggtgtaataa accccccggc ggcgaagaaa taccaatact ggaccaatac 2280agggcctgcc gagtcgctcg actcctttat cgaaaccgcg acggaacatg cgggaagttg 2340gtggccggat tggctggatt gggtccgtgc gctgaacggt gcaaaggttg cgacgagcgg 2400
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<223>人工序列的描述與鞘氨醇單胞菌ATCC 53159基因片段退火的PCR引物1Xba<400>14attctagaga tgatgaagcc gaaggtgtgg at 32<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述與鞘氨醇單胞菌ATCC 53159基因片段退火的PCR引物4Xba<400>15attctagatg gtgcgctcgt tgagg 25<210>16<211>34<212>DNA<213>Sphingomonas sp.ATCC 531559
<400>16gaaattctgc ctctttgtcg gtcctctcct tcgc 3權(quán)利要求
1.鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)的突變菌株，其中編碼參與聚羥基丁酸合成的蛋白質(zhì)的至少一種基因受到選擇性突變或缺失，使得突變菌株生成鞘氨糖但不生成聚羥基丁酸。
2.依照權(quán)利要求1的突變菌株，其中突變菌株生成選自下組的鞘氨糖S-7、S-60、S-88、S-130、S-194、S-198、S-657、NW-11、和B16。
3.依照權(quán)利要求1的突變菌株，其中編碼參與聚羥基丁酸合成的蛋白質(zhì)的至少一種基因選自下組phaA、phaB、和phaC。
4.依照權(quán)利要求3的突變菌株，其中phaC受到選擇性突變或缺失。
5.依照權(quán)利要求4的突變菌株，其中鞘氨糖是S-60。
6.依照權(quán)利要求4的突變菌株，其中鞘氨糖是S-657。
7.通過發(fā)酵依照權(quán)利要求1的鞘氨醇單胞菌屬突變菌株的方法而制備的缺乏PHB的鞘氨糖。
8.來自多沼鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas elodea)的分離DNA序列，其中該DNA序列編碼具有SEQ ID NO7所列核苷酸序列的PHB合酶。
9.用于制備澄清的鞘氨糖溶液的方法，包括下列步驟a)將鞘氨糖水溶液加熱至澄清溫度大約30℃-大約70℃；b)用選自下組的至少一種澄清劑處理鞘氨糖水溶液螯合劑、苛性劑、氧化劑、及其混合物；并c)用酶處理鞘氨糖水溶液。
10.依照權(quán)利要求9的制備澄清的鞘氨糖溶液的方法，其中同時進行步驟a)和b)。
11.依照權(quán)利要求9的方法，其中用至少一種螯合劑處理鞘氨糖水溶液。
12.依照權(quán)利要求9的方法，其中用至少一種苛性劑處理鞘氨糖水溶液。
13.依照權(quán)利要求9的方法，其中用選自下組的至少一種氧化劑處理鞘氨糖水溶液次氯酸鈉或其它次氯酸鹽、二氧化氯、過氧化氫、過乙酸、和臭氧。
14.依照權(quán)利要求9的方法，其中用至少一種苛性劑和至少一種表面活性劑處理鞘氨糖水溶液。
15.依照權(quán)利要求9的方法，其中在pH大約5-大約9進行酶處理。
16.依照權(quán)利要求9的方法，其中至少一種螯合劑選自下組乙二胺四乙酸、磷酸、偏磷酸、碳酸、檸檬酸、酒石酸、葡萄糖酸、谷氨酸、焦磷酸、多磷酸、偏磷酸、葡糖二酸、乙二醇二(β-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)、乙二胺、2，3-二氨基丁烷、1，2-二氨基環(huán)己烷、三氨基三乙胺、或它們的鹽。
17.依照權(quán)利要求9的方法，其中至少一種螯合劑選自下組乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸二鉀、乙二胺四乙酸四鈉、乙二胺四乙酸四鉀、檸檬酸三鈉、檸檬酸三鉀、六偏磷酸鈉、六偏磷酸鉀、多磷酸鈉、多磷酸鉀、焦磷酸鈉、焦磷酸鉀、磷酸單鈉、磷酸單鉀、磷酸二鈉、磷酸二鉀、磷酸三鈉、磷酸三鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀、陽離子交換樹脂、乙二胺二氫氯酸、乙二胺二醋酸、乙二胺鋰鹽、乙二胺二氫碘酸、及其混合物。
18.依照權(quán)利要求9的方法，其中苛性劑選自下組氫氧化鉀、氫氧化鈉、和磷酸三鈉。
19.通過依照權(quán)利要求9的由澄清鞘氨糖溶液分離鞘氨糖的方法而制備的澄清的鞘氨糖。
20.依照權(quán)利要求19的澄清的鞘氨糖，其中鞘氨糖是由鞘氨醇單胞菌的突變型缺乏PHB菌株生成的，其中編碼參與聚羥基丁酸合成的蛋白質(zhì)的至少一種基因受到選擇性突變或缺失。
21.依照權(quán)利要求20的澄清的鞘氨糖，其中phaC基因受到選擇性突變或缺失。
22.依照權(quán)利要求21的澄清的鞘氨糖，其中鞘氨糖是高?；鵖-60。
23.依照權(quán)利要求9的方法，其中在步驟b)中用表面活性劑進一步處理鞘氨糖水溶液。
24.依照權(quán)利要求23的方法，其中用一種螯合劑和至少一種表面活性劑處理鞘氨糖水溶液。
25.依照權(quán)利要求23的方法，其中至少一種表面活性劑選自下組SDS、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、卵磷脂、單甘油酯、酒石酸單甘油酯、磷酸化單甘油酯、乳?；瘑胃视王?、乙?；瘑胃视王ァ㈢牾；瘑胃视王?、乙氧基化單甘油酯、脫水山梨糖醇酯、聚山梨酸酯、聚甘油酯、蔗糖酯、硬脂酰乳酸鈉、和丙二醇酯。
26.用于制備澄清的鞘氨糖溶液的方法，包括下列步驟a)將鞘氨糖水溶液加熱至澄清溫度大約30℃-大約70℃；b)用螯合劑進行處理；c)用溶菌酶進行處理；d)用苛性劑或氧化劑進行處理；并e)用蛋白酶進行處理。
27.依照權(quán)利要求26的方法，其中在pH大約3-大約7.5進行溶菌酶處理。
28.依照權(quán)利要求26的方法，其中在pH大約6.5-大約9進行蛋白酶處理。
29.通過依照權(quán)利要求26的由澄清鞘氨糖溶液分離鞘氨糖的方法而制備的澄清的鞘氨糖。
30.依照權(quán)利要求29的澄清的鞘氨糖，其中鞘氨糖是由鞘氨醇單胞菌的突變型缺乏PHB菌株生成的，其中編碼參與聚羥基丁酸合成的蛋白質(zhì)的至少一種基因受到選擇性突變或缺失。
31.依照權(quán)利要求30的澄清的鞘氨糖，其中phaC基因受到選擇性突變或缺失。
32.依照權(quán)利要求31的澄清的鞘氨糖，其中鞘氨糖是高?；鵖-60。
33.依照權(quán)利要求20或權(quán)利要求30的澄清的鞘氨糖，其中鞘氨糖水溶液具有至少60％的透光率。
34.包含依照權(quán)利要求33的澄清鞘氨糖的食品產(chǎn)品。
35.依照權(quán)利要求34的食品產(chǎn)品，其中鞘氨醇單胞菌的缺乏PHB菌株的phaC基因受到選擇性突變或缺失。
36.依照權(quán)利要求35的食品產(chǎn)品，其中鞘氨糖是高?；鵖-60。
37.包含依照權(quán)利要求33的澄清鞘氨糖的工業(yè)產(chǎn)品。
38.包含依照權(quán)利要求7的缺乏PHB鞘氨糖的工業(yè)產(chǎn)品。
39.依照權(quán)利要求38的工業(yè)產(chǎn)品，其中鞘氨醇單胞菌的缺乏PHB菌株的phaC基因受到選擇性突變或缺失。
40.依照權(quán)利要求39的工業(yè)產(chǎn)品，其中鞘氨糖是S-657。
41.來自鞘氨醇單胞菌ATCC 53159的分離DNA序列，其中該DNA序列編碼具有SEQ ID NO13所列核苷酸序列的PHB合酶和側(cè)翼區(qū)。
全文摘要
本發(fā)明涉及鞘氨醇單胞菌屬突變菌株，其中編碼參與聚羥基丁酸(“PHB”)合成的蛋白質(zhì)的至少一種基因中具有突變，使得突變菌株生成缺乏PHB的鞘氨糖。本發(fā)明還致力于用于制備澄清的鞘氨糖溶液的方法，包括將鞘氨糖水溶液(特別是缺乏PHB的鞘氨糖溶液)加熱至澄清溫度大約30℃－大約70℃，并用澄清劑和酶處理溶液。另外，本發(fā)明還致力于包含缺乏PHB的和/或澄清的鞘氨糖的食品或工業(yè)產(chǎn)品。本發(fā)明的一個具體實施方案致力于澄清的、缺乏PHB的高?；m糖及其生產(chǎn)方法。
文檔編號C12P19/00GK1553957SQ01807557
公開日2004年12月8日 申請日期2001年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月2日
發(fā)明者S·鮑威爾, E·布克, N·哈丁, Y·N·帕特爾, J·C·施耐德, D·玫斯尼爾, N·莫里森, R·比贊森, S 鮑威爾, 奚, 帕特爾, 施耐德, 鍔, 鼓岫 申請人:Cp凱爾科美國公司