專利名稱：環(huán)波菌素、它們的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新穎的化合物，稱為環(huán)波菌素(cyclipostin)，可通過培養(yǎng)鏈霉菌屬菌株HAG 004107(DSM 13381)獲得，及其生理學(xué)上可耐受的鹽和化學(xué)等價(jià)物。本發(fā)明進(jìn)而涉及環(huán)波菌素的制備方法、微生物HAG 004107(DSM 13381)、環(huán)波菌素及其生理學(xué)上可耐受的鹽和化學(xué)等價(jià)物作為藥物、特別是作為脂肪酶抑制劑的用途，和含有環(huán)波菌素或其生理學(xué)上可耐受的鹽或等價(jià)物的藥物制劑。
特別有利地用脂肪酶抑制劑治療的疾病是糖尿病。糖尿病是這樣一種病癥，由于慢性代謝障礙，以血糖濃度增加為特征。代謝障礙基于胰島素缺乏或胰島素作用減少。缺少胰島素作用引起機(jī)體細(xì)胞利用在血液中所吸收的葡萄糖不足。有鑒于此，并且由于蛋白質(zhì)再生葡萄糖(糖異生)，血液葡萄糖水平上升。而且，在脂肪組織中胰島素作用減少的情況下，胰島素拮抗激素、例如胰高血糖素引起脂肪分解增加，從而升高血液中的脂肪酸濃度。發(fā)生酮酸中毒，也就是酮體(乙酸、β-羥基丁酸、丙酮)的生成增加。在急性條件下，生物化學(xué)調(diào)節(jié)異常的程度危及生命，若不經(jīng)治療，引起糖尿病性昏迷，最終迅速死亡。糖尿病屬于最常見的人慢性代謝障礙，據(jù)估計(jì)高達(dá)3％以上的人口患有糖尿病或前驅(qū)糖尿病素因，從而是頗具威脅的。因此迫切需要治療或治愈糖尿病的藥物。
糖尿病是通過胰島素給藥進(jìn)行治療的，在成人發(fā)作的糖尿病中，即所謂的非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)或II型糖尿病，首先給藥的是磺酰脲類?；酋ｋ孱惖淖饔迷硎且认佴?細(xì)胞分泌胰島素激增，目的從而是補(bǔ)償激素缺乏或胰島素抵抗。不過，隨著條件的發(fā)展，也已經(jīng)采用胰島素。胰島素的作用可以總結(jié)為下列方式。這種肽類激素降低血液中的葡萄糖濃度，引起合成代謝過程增加，同時(shí)抑制分解代謝
●它增加機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，●它增加肝臟和肌肉內(nèi)的糖原生成，●它抑制脂肪分解，●它增加脂肪組織對(duì)脂肪酸的吸收，●它增加機(jī)體細(xì)胞對(duì)氨基酸的吸收和蛋白質(zhì)合成。
胰島素最強(qiáng)烈的效果之一是抑制脂肪分解。在II型糖尿病的情況下，這種脂肪分解的調(diào)節(jié)作用不再有效，血液中的游離脂肪酸水平增加。血液中的游離脂肪酸刺激肝臟內(nèi)的糖異生，減少骨骼肌對(duì)葡萄糖的利用。脂肪分解也就是脂肪酸被所謂的激素敏感性脂肪酶(HSL)所釋放，見于脂肪細(xì)胞內(nèi)，通過磷酸化級(jí)聯(lián)被胰島素所抑制，因此是受控制的。抑制劑、也就是HSL抑制劑因此將是可取的，它刺激胰島素的作用，能夠降低血液脂質(zhì)水平。這類藥物適合于治療II型糖尿病，控制脂質(zhì)代謝，但是在其他儲(chǔ)藏障礙中的應(yīng)用也將是可能的。為此，迫切需要和尋找HSL和其他脂肪酶的新抑制劑。
已經(jīng)驚人地發(fā)現(xiàn)，微生物鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381能夠生成高度活性的新穎的脂肪酶抑制劑，它們即使在非常低的濃度下也抑制激素敏感性脂肪酶。新穎的天然化合物是有機(jī)磷酸酯類，由雙環(huán)系統(tǒng)(二環(huán))和取代的碳鏈組成，特異性地抑制脂肪酶。環(huán)結(jié)構(gòu)——僅有甲基代替碳鏈——已經(jīng)被第一次描述為乙酰膽堿酯酶抑制劑CGA 134736，見R.Neumann & H.H.Peter，Experientia(實(shí)驗(yàn))，43卷，1235-1237頁，1987，后來，同一化合物被稱為cyclophostin，見T.Kurokawa等，J.Antibiotics(抗生素雜志)，46，1315-1318，1993。這種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物不具有選擇性脂肪酶抑制性質(zhì)。以前已知的物質(zhì)表現(xiàn)出不令人滿意的作用水平、高毒性和/或不可取的副作用等缺點(diǎn)。
本發(fā)明因此涉及式I化合物
其中R1是1.具有2至30個(gè)碳原子的碳鏈，它可以是直鏈、支鏈、飽和或不飽和、碳環(huán)或雜環(huán)的，其中該碳鏈可選地被下列基團(tuán)單或二取代1.1-OH，1.2＝O，1.3-O-C1-C6-烷基，其中的烷基是直鏈或支鏈的，1.4-O-C2-C6-烯基，其中的烯基是直鏈或支鏈的，1.5-C1-C6-烷基，其中的烷基是直鏈或支鏈的，1.6-芳基，1.7-C1-C6-烷基苯，1.8-聯(lián)苯，1.9-NH-C1-C6-烷基，其中的烷基是直鏈或支鏈的，1.10-NH-C2-C6-烯基，其中的烯基是直鏈或支鏈的，1.11-NH2，1.12＝S，1.13-S-C1-C6-烷基，其中的烷基是直鏈或支鏈的，或1.14-S-C2-C6-烯基，其中的烯基是直鏈或支鏈的，1.15鹵素，其中取代基1.1至1.15還可以是另外被取代的，2.-[-芳基-(CH2)n]m，其中[-芳基-(CH2)n]m是未取代的或者被1.1至1.15所述取代基單或二取代，n和m彼此獨(dú)立地是整數(shù)0、1、2或3；R2是1.C1-C6-烷基，其中的烷基是未取代的或者被1.1至1.15所述取代基單或二取代，2.C2-C6-烯基，其中的烯基是未取代的或者被1.1至1.15所述取代基單或二取代，
3.C2-C6-炔基，其中的炔基是未取代的或者被1.1至1.15所述取代基單或二取代，E是磷(P)或硫(S)原子，X1、X2和X3彼此獨(dú)立地是1.-O-，2.-NH-，3.-N＝，4.-S-，或5.-CH2-和-CHR2，以所有它們的立體化學(xué)形式和這些形式的任意比例混合物存在，和它們的生理學(xué)上可耐受的鹽和化學(xué)等價(jià)物。
R1優(yōu)選地具有6至24個(gè)碳原子的鏈長，非常優(yōu)選為10至18個(gè)碳原子。該鏈可以是飽和的，例如-烷基，其中的烷基可以是直鏈或支鏈的，或者可以是不飽和的，例如-烯基或-炔基，其中的烯基或炔基是直鏈或支鏈的。R1可以是未取代的，或者被上述基團(tuán)1.1至1.15相同或不同地單或二取代。碳原子8’至16’上的取代基是優(yōu)選的，位置10’至14’是特別優(yōu)選的。取代基1.1至1.15還可以另外被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，取代基選自醇、醛、縮醛、縮酮、醚、羧基、酯、氨基、腈、硝基、肟、肟醚和鹵素。
具有2至30個(gè)碳原子的碳環(huán)碳鏈?zhǔn)怯?至30個(gè)碳原子組成的鏈，且具有一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選為一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)環(huán)系，該環(huán)系優(yōu)選地各自由4、5、6或7個(gè)碳原子組成。該環(huán)可以是單環(huán)、二環(huán)或三環(huán)的，優(yōu)選為單環(huán)，可以位于碳鏈的開始、中間和/或末尾。碳環(huán)可以是脂族的或芳族的。實(shí)例是取代的聯(lián)苯或烷基苯。
具有2至30個(gè)碳原子的雜環(huán)碳鏈?zhǔn)怯?至30個(gè)碳原子組成的鏈，且具有一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選為一至三個(gè)環(huán)系，其中至少一個(gè)碳原子被雜原子代替，例如O、S或N。這些環(huán)可以是單環(huán)、二環(huán)或三環(huán)的，優(yōu)選為單環(huán)，可以位于碳鏈的開始、中間和/或末尾。它們可以優(yōu)選地是4-、5-、6-或7-元脂族或芳族環(huán)。實(shí)例是取代或未取代的烷基哌啶。
芳基是具有6至14個(gè)、優(yōu)選為6至10個(gè)碳原子的芳族環(huán)或環(huán)系，例如可選被取代的烷基苯酚或烷基萘酚。
鹵素是氯、溴、氟或擬鹵化物，例如氰化物(腈)。
-C1-C6-烷基是具有1、2、3、4、5或6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基，例如甲基、乙基、異丙基、叔丁基和己基。
-C2-C6-烯基是具有2、3、4、5或6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烯基，例如烯丙基、巴豆基和戊烯基。
-C2-C6-炔基是具有2、3、4、5或6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈炔基，例如丙炔基、丁炔基和戊炔基。
R1優(yōu)選地是1.-(CH2)15CH3，2.-(CH2)13CH(CH3)2，3.-(CH2)11CH(OH)(CH2)3CH3，4.-(CH2)11CH(OH)CH2CH(CH3)2，5.-(CH2)12CH(OH)(CH2)2CH3，6.-(CH2)13CH(OH)CH2CH3，7.-(CH2)14CH(OH)CH3，8.-(CH2)15CH2(OH)，9.-(CH2)16CH3，或10.0-(CH2)13C＝OCH2CH311.0-(CH2)12C＝OCH2CH2CH312.0-(CH2)11C＝OCH2CH2CH2CH313.0-(CH2)13CH314.0-(CH2)11CH(CH3)215.0-(CH2)14CH3或16.0-(CH2)12CH(CH3)2R2優(yōu)選地是C1-C6-烷基，特別是甲基、乙基或丙基。
優(yōu)選的本發(fā)明化合物如下所示式II的環(huán)波菌素A
式IIA的環(huán)波菌素A2 式III的環(huán)波菌素B 式IV的環(huán)波菌素C 式V的環(huán)波菌素D 式VI的環(huán)波菌素E 式VII的環(huán)波菌素F 式VIII的環(huán)波菌素G
式IX的環(huán)波菌素H 式X的環(huán)波菌素N 式XI的環(huán)波菌素P 式XIA的環(huán)波菌素P2 式XII的環(huán)波菌素Q 式XIII的環(huán)波菌素R 式XIIIA的環(huán)波菌素R2 所有它們的立體化學(xué)形式和這些形式的任意比例混合物、和它們的生理學(xué)上可耐受的鹽和化學(xué)等價(jià)物。
上述結(jié)構(gòu)式中關(guān)于NMR光譜的碳原子編號(hào)方式如下 環(huán)系獨(dú)自含有兩個(gè)不對(duì)稱取代的原子，即碳原子3和磷原子。這兩個(gè)原子都可以存在R或S構(gòu)型。已經(jīng)驚人地發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381能夠各自生成大量式I化合物的立體異構(gòu)體，也就是說該菌株合成其中C3和P原子彼此獨(dú)立地可以假定為R或S構(gòu)型的化合物。空間形式為碳(3)R構(gòu)型且磷S構(gòu)型的異構(gòu)體大量存在于鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381中，即式IA
不過，另外也生成具有其他構(gòu)型的環(huán)波菌素，例如(R，R)、(S，S)或(S，R)，它們驚人地也具有相當(dāng)?shù)闹久敢种谱饔谩?br> 式I化合物或其生理學(xué)上可耐受的鹽或化學(xué)等價(jià)物可以這樣制備，在適合的條件下，在培養(yǎng)基中發(fā)酵微生物鏈霉菌屬菌株HAG004107，DSM 13381或其變體或突變體之一，直至一種或多種式I化合物蓄積在培養(yǎng)基中，然后從培養(yǎng)基中分離它們，再可選地轉(zhuǎn)化為化學(xué)等價(jià)物和生理學(xué)上可耐受的鹽。
根據(jù)本發(fā)明的環(huán)波菌素可以由放線菌目菌株(Actinomycetalesspecies)制備，優(yōu)選為鏈霉菌屬菌株(Streptomyces species)HAG 004107，DSM 13381。鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381具有象牙色菌絲體(RAL 1014)，以鏈霉菌特有的分生孢子為特征。
分離菌已經(jīng)按照布達(dá)佩斯條約于2000年3月16日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1B，D 38124中，編號(hào)為鏈霉菌屬菌株HAG004107，DSM 13381。
代替鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381的是，也有可能采用它的突變體和變體來合成一種或多種根據(jù)本發(fā)明的環(huán)波菌素化合物。這類突變體可以以本身已知的方式通過物理手段制備，例如輻射，例如紫外或X-射線，或者化學(xué)誘變劑，例如甲磺酸乙酯(EMS)、2-羥基-4-甲氧基二苯酮(MOB)或N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)。
本發(fā)明因而涉及式I化合物或其生理學(xué)上可耐受的鹽的制備方法，其特征在于它包含在適合的條件下，在培養(yǎng)基中發(fā)酵微生物鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381或其變體或突變體之一，直至一種或多種式I化合物蓄積在培養(yǎng)基中，然后從培養(yǎng)基中分離它們，再可選地轉(zhuǎn)化為化學(xué)等價(jià)物和生理學(xué)上可耐受的鹽。
優(yōu)選地，在含有碳與氮源和常用無機(jī)鹽的營養(yǎng)溶液(也稱培養(yǎng)基)中發(fā)酵鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381、它的突變體和/或變體，直至新穎的環(huán)波菌素蓄積在培養(yǎng)基中，然后從培養(yǎng)基中分離這些環(huán)波菌素，再可選地分離為單獨(dú)的活性組分。
發(fā)酵優(yōu)選地在需氧條件下進(jìn)行；它在18與35℃之間的溫度下和6與8之間的pH下進(jìn)行得特別充分。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模(毫升至升范圍)和工業(yè)規(guī)模(立方米規(guī)模)上發(fā)酵。如果沒有相反規(guī)定，所有百分率都指的是重量。在液體情況下的混合比例指的是體積，除非給出其他細(xì)節(jié)。
適合于需氧發(fā)酵的優(yōu)選碳源是可同化的碳水化合物和糖醇，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖或D-甘露糖醇，和含有碳水化合物的天然產(chǎn)物，例如燕麥片、大豆粉和麥芽提取物?？赡艿暮獱I養(yǎng)物是氨基酸、肽和蛋白質(zhì)，和它們的降解產(chǎn)物，例如蛋白胨或胰胨，進(jìn)一步的小麥提取物、酵母提取物、研磨過的種子(例如玉米、小麥、豆、大豆或棉花植物)、酒精生產(chǎn)的蒸餾殘余物、小麥粗粉或酵母提取物，以及銨鹽和硝酸鹽。營養(yǎng)溶液可以含有的無機(jī)鹽例如堿金屬或堿土金屬、鐵、鋅、鈷和錳的氯化物、碳酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽。
根據(jù)本發(fā)明的式II至XVA環(huán)波菌素的生成在含有大約0.1至5％、優(yōu)選為0.3至3％燕麥片和痕量元素的培養(yǎng)基中進(jìn)行得特別好。百分率的細(xì)節(jié)各自基于全部培養(yǎng)基的重量。
優(yōu)選的式VIII至XVA環(huán)波菌素的生成可以特別容易地在含有大約0.1至5％、優(yōu)選為0.3至2％甘油和0.2至5％、優(yōu)選為0.5至3％大豆粗粉和0.05至1.0g/l、優(yōu)選為0.1至1.0g/l氯化鈉的營養(yǎng)溶液中進(jìn)行。
在培養(yǎng)基中，鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381生成環(huán)波菌素的混合物。根據(jù)培養(yǎng)基的組成，一種或多種根據(jù)本發(fā)明的環(huán)波菌素的量可以各不相同。而且，有可能借助培養(yǎng)基的組成控制單獨(dú)環(huán)波菌素的合成，以便完全沒有制備其他一種或多種環(huán)波菌素或者所制備的量低于微生物的檢測限。
培養(yǎng)物優(yōu)選地含有可檢測的環(huán)波菌素。環(huán)波菌素A或P或P2是優(yōu)選生成的。
除了環(huán)波菌素A至T2(式II至XVA化合物)以外，在鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381的培養(yǎng)基中還生成其他相關(guān)的化合物，它們因經(jīng)過修飾的基團(tuán)R1和R2而不同于式II至XVA所示化合物。已經(jīng)檢測到更少量的R1被截短或進(jìn)一步分支的環(huán)波菌素。這些次要組分的氧化(羥基化)產(chǎn)物在鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381的培養(yǎng)物中也是可檢測到的。
微生物的培養(yǎng)是需氧進(jìn)行的，例如在搖瓶或發(fā)酵器內(nèi)深層培養(yǎng)，同時(shí)搖動(dòng)或攪拌，如果適當(dāng)?shù)脑捯肟諝饣蜓?。可以在大約18至35℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選為大約25至32℃，特別是26至30℃。pH范圍應(yīng)當(dāng)在6與8之間，優(yōu)選在6.5與7.8之間。微生物在這些條件下一般培養(yǎng)24至300小時(shí)，優(yōu)選為30至90小時(shí)。
有利的是，培養(yǎng)分多個(gè)階段進(jìn)行，也就是說首先在液體培養(yǎng)基中制備一份或多份預(yù)培養(yǎng)物，然后接種在真正的制備培養(yǎng)基、即主培養(yǎng)基中，例如體積比為1∶10。預(yù)培養(yǎng)物例如是這樣得到的，向營養(yǎng)溶液接種菌絲體，使其生長大約36至120小時(shí)，優(yōu)選為48至96小時(shí)。菌絲體例如可以這樣得到，在固體或液體營養(yǎng)培養(yǎng)基上，例如麥芽/酵母/瓊脂或燕麥片/瓊脂，使菌株生長大約3至40天，優(yōu)選為4至10天。
發(fā)酵的過程可以借助培養(yǎng)物pH或菌絲體體積加以監(jiān)測，并采用色譜方法，例如薄層色譜或高效液相色譜，或者測試生物活性。根據(jù)本發(fā)明的環(huán)波菌素存在于菌絲體中，在培養(yǎng)物濾液中也存在一小部分。下述分離過程用以純化根據(jù)本發(fā)明的環(huán)波菌素，優(yōu)選為環(huán)波菌素A和P。
根據(jù)本發(fā)明的環(huán)波菌素從培養(yǎng)基中分離和/或純化是按照已知方法進(jìn)行的，并考慮天然物質(zhì)的化學(xué)、物理和生物性質(zhì)。關(guān)于測定培養(yǎng)基中或單獨(dú)分離階段中的環(huán)波菌素濃度，可以使用薄層色譜，例如硅膠，使用二氯甲烷/乙酸乙酯或氯仿/甲醇混合物(例如定量比為98∶1)作為洗脫劑，或HPLC。在薄層色譜分離情況下的檢測例如可以這樣進(jìn)行，借助顯色劑，例如鉬磷酸或I2蒸氣，將預(yù)期生成的物質(zhì)量與校準(zhǔn)溶液比較。
關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的環(huán)波菌素的分離，首先按照常用方法從培養(yǎng)基中分離出菌絲體，然后使用可選與水混溶的有機(jī)溶劑從細(xì)胞物中萃取環(huán)波菌素。有機(jī)溶劑相含有根據(jù)本發(fā)明的環(huán)波菌素；可選地在真空中濃縮它們，進(jìn)一步如下所述純化。
可選地將培養(yǎng)物濾液與菌絲體提取物濃縮物合并，用適合的水不混溶性有機(jī)溶劑萃取，例如正丁醇或乙酸乙酯。隨后分離出有機(jī)相，可選地在真空中濃縮，溶于最初體積為1/30的水/甲醇。
一種或多種根據(jù)本發(fā)明的環(huán)波菌素的進(jìn)一步純化是通過在適合材料上的色譜法進(jìn)行的，例如優(yōu)選在分子篩、正相載體(例如硅膠、氧化鋁)、離子交換或吸附樹脂或反相(反轉(zhuǎn)相，RP)上。環(huán)波菌素是借助這些色譜方法分離的。環(huán)波菌素的色譜法是利用有機(jī)溶劑或水溶液與有機(jī)溶液混合物進(jìn)行的。
水溶液或有機(jī)溶液的混合物被理解為表示所有水可混溶性有機(jī)溶劑，優(yōu)選為甲醇、丙醇和乙腈，溶劑濃度為10至100％，優(yōu)選為60至90％，或者所有經(jīng)過緩沖的水溶液，它們與有機(jī)溶劑是可混溶的。所用緩沖劑與上述相同。
環(huán)波菌素基于不同極性的分離是借助反相色譜進(jìn)行的，例如MCI(來自日本三菱的吸附樹脂)或Amberlite XAD(TOSOHAAS)，其他疏水性材料，例如RP-8或RP-18相。而且，分離可以借助正相色譜進(jìn)行，例如硅膠、氧化鋁等。
環(huán)波菌素的色譜法是利用經(jīng)過緩沖或酸化的水溶液或水溶液與醇或其他水可混溶性有機(jī)溶劑的混合物進(jìn)行的。所用有機(jī)溶劑優(yōu)選地是丙醇和乙腈。
經(jīng)過緩沖或酸化的水溶液被理解為例如表示水、磷酸鹽緩沖液、乙酸銨、檸檬酸緩沖液，濃度為1mM至0.5M，和甲酸、乙酸、三氟乙酸或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有商業(yè)上可得到的酸，濃度優(yōu)選為0.01至3％，特別是0.1％。
色譜法是利用梯度進(jìn)行的，開始于100％含水緩沖劑，終止于100％溶劑；優(yōu)選地采用50至100％2-丙醇或乙腈的線性梯度。
作為替代選擇，還可以進(jìn)行凝膠色譜或疏水相色譜。
凝膠色譜是在聚丙烯酰胺或混合的聚合物凝膠上進(jìn)行的，例如Biogel-P 2(Biorad)、Fractogel TSK HW 40(Merck，Germany或Toso Haas，USA)或Sephadex(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。
上述色譜的順序是可逆的。
進(jìn)而非常有效的環(huán)波菌素純化步驟是結(jié)晶。環(huán)波菌素會(huì)從有機(jī)溶劑溶液和水與有機(jī)溶劑的混合物中結(jié)晶出來。結(jié)晶是以本身已知的方式進(jìn)行的，例如濃縮或冷卻飽和環(huán)波菌素溶液。
根據(jù)本發(fā)明的環(huán)波菌素在固體或液體狀態(tài)下和在pH在4與8之間、特別是5與7之間的溶液中是穩(wěn)定的，從而能夠結(jié)合在常用的藥物制劑中。
本發(fā)明進(jìn)一步包含式I化合物的明顯的化學(xué)等價(jià)物，它們具有輕微的化學(xué)差異，也就是說具有相同的活性或者能夠在溫和條件下轉(zhuǎn)化為根據(jù)本發(fā)明的化合物。所述等價(jià)物例如包括根據(jù)本發(fā)明的化合物的酯與醚和氧化、還原與氫化產(chǎn)物。
酯與醚衍生物、氧化、氫化與還原產(chǎn)物可以按照文獻(xiàn)所述方法制備，例如Advanced Organic Synthesis(高等有機(jī)合成)，第4版，J.March，John Wiley & Sons.，1992。
本發(fā)明包括式I至XVA化合物的所有立體異構(gòu)型。式I至XVA化合物所含有的不對(duì)稱中心都可以彼此獨(dú)立地具有S構(gòu)型或R構(gòu)型。本發(fā)明包括所有可能的對(duì)映異構(gòu)體和非對(duì)映異構(gòu)體，以及任意比例的兩種或多種立體異構(gòu)型的混合物，例如對(duì)映異構(gòu)體和/或非對(duì)映異構(gòu)體的混合物。本發(fā)明因而涉及對(duì)映異構(gòu)純形式的對(duì)映異構(gòu)體、旋轉(zhuǎn)和右旋的對(duì)映體、R和S構(gòu)型、外消旋物的形式和任意比例的兩種對(duì)映異構(gòu)體的混合物形式。在順式/反式異構(gòu)現(xiàn)象的存在下，本發(fā)明涉及順式構(gòu)型和反式構(gòu)型以及任意比例的這些形式的混合物。
鑒于寶貴的藥理性質(zhì)，根據(jù)本發(fā)明的化合物適合在人和/或獸醫(yī)中用作藥物。它們抑制脂肪酶，具有有利于代謝障礙治療的性質(zhì)，代謝障礙導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂。根據(jù)本發(fā)明的式I化合物對(duì)激素敏感性脂肪酶HSL具有驚人的抑制作用，HSL是脂肪細(xì)胞中的一種變構(gòu)酶，受胰島素的抑制，負(fù)責(zé)脂肪細(xì)胞中脂肪的分解，從而負(fù)責(zé)脂肪成分向血流的轉(zhuǎn)移。這種酶的抑制從而相當(dāng)于根據(jù)本發(fā)明的化合物的胰島素樣作用，最終引起血液中的游離脂肪酸和血糖減少。它們因此能夠用于代謝機(jī)能障礙，例如非胰島素依賴型糖尿病、糖尿病綜合征和對(duì)胰腺的直接損傷。
本發(fā)明因此涉及藥物制劑，該制劑含有一種或多種根據(jù)本發(fā)明的環(huán)波菌素和/或其化學(xué)等價(jià)物。與適合的賦形劑或載體材料混合使用是優(yōu)選的。可以用于人的載體材料都是藥理學(xué)上可耐受的載體材料和/或賦形劑。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明的藥物的制備方法，其特征在于包含利用藥學(xué)上適合的與生理學(xué)上可耐受的載體和——如果適當(dāng)?shù)脑挕渌m合的活性化合物、添加劑或賦形劑將至少一種根據(jù)本發(fā)明的化合物制成適合的給藥劑型。
根據(jù)本發(fā)明的藥物一般是口服、局部或腸胃外給藥的，但是直腸給藥在原則上也是可能的。適合的固體或液體藥物劑型例如顆粒劑、粉劑、片劑、包衣片、(微)膠囊劑、栓劑、糖漿劑、乳劑、懸液、氣霧劑、滴劑或安瓿形式的可注射溶液，和延長活性化合物釋放的制劑，在這樣的制劑中，習(xí)慣上使用載體和添加劑和/或賦形劑，例如崩解劑、包衣劑、溶脹劑、滑動(dòng)劑或潤滑劑、矯味劑、甜味劑或穩(wěn)定劑。經(jīng)常使用的載體或賦形劑例如可以提到碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露糖醇與其他糖類、滑石、乳蛋白、明膠、淀粉、維生素、纖維素及其衍生物、動(dòng)物或植物油、聚乙二醇和溶劑，例如無菌水、醇、甘油和多元醇。
如果適當(dāng)?shù)脑?，可以將劑量單元微囊包封，用于口服給藥，目的是延遲或延長釋放經(jīng)過更長的時(shí)間，例如將顆粒形式的活性化合物包衣或包埋在適合的聚合物、蠟等中。
優(yōu)選地，藥物制劑是以劑量單元形式制備和給藥的，每個(gè)單元含有作為活性成分的特定劑量的一種或多種根據(jù)本發(fā)明的環(huán)波菌素化合物和/或其化學(xué)衍生物。在固體劑量單元的情況下，例如片劑、膠囊劑和栓劑，這種劑量可以高達(dá)大約200mg，但是優(yōu)選大約0.1至100mg，在安瓿形式的注射溶液的情況下，至多大約200mg，但是優(yōu)選大約0.1至100mg，均為每日劑量。
所要給藥的每日劑量取決于哺乳動(dòng)物的體重、年齡、性別和狀況。不過在某些環(huán)境下，更高或更低的每日劑量也可以是適當(dāng)?shù)摹Ｃ咳談┝康慕o藥可以這樣進(jìn)行，以單獨(dú)劑量單元或多數(shù)更小劑量單元的形式單次給藥，或者按特定間隔分劑量反復(fù)給藥。
本發(fā)明還涉及藥物制劑，它含有一種或多種根據(jù)本發(fā)明的環(huán)波菌素和/或其化學(xué)等價(jià)物。與適合的賦形劑或載體材料混合使用是優(yōu)選的。在人的情況下，所用載體材料可以都是藥理學(xué)上可耐受的載體材料和/或賦形劑。
測試了根據(jù)本發(fā)明的式I化合物對(duì)下列酶試驗(yàn)系統(tǒng)的作用酶的制備部分純化的HSL的制備按照已公開的方法(例如S.Nilsson等，Anal.Biochem.(生物化學(xué)紀(jì)事)158，1986，399-407；G.Fredrikson等，J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)256，1981，6311-6320；H.Tornquist等，J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)251，1976，813-819)，通過膠原酶處理，從未經(jīng)治療的雄性大鼠(Wistar，220-250g)附睪脂肪組織得到離體大鼠脂肪細(xì)胞。通過浮集法，將來自10只大鼠的脂肪細(xì)胞各自用50ml勻化緩沖液(25ml Tris/HCl，pH7.4，0.25M蔗糖，1mMEDTA，1mM DTT，10μg/ml亮肽素，10μg/ml抗蛋白酶，20μg/ml胃酶抑制劑)洗滌三次，最后溶于10ml勻化緩沖液。在含特氟隆玻璃勻化器(Braun-Melsungen)內(nèi)勻化脂肪細(xì)胞，條件是10沖程、1500rpm和15℃。將勻化產(chǎn)物離心(Sorvall SM24試管，5000rpm，10min，4℃)。除去上面的脂肪層與粒狀沉淀之間的下層，反復(fù)離心。再次離心由此所得下層(Sorvall SM24試管，20000rpm，45min，4℃)。除去下層，用1g肝素-瓊脂糖處理(Pharmacia-Biotech，CL-6B，用25mM Tris/HCl，pH7.4，150mM NaCl洗滌5x)。在4℃下培育60min后(每隔15min搖動(dòng))，成批離心(Sorvall SM24試管，3000rpm，10min，4℃)。向上清液加入乙酸至pH5.2，在4℃下培育30min。離心收集沉淀(Sorvall SS34，12000rpm，10min，4℃)，懸浮在2.5ml 20mM Tris/HCl，pH7.0，1mM EDTA，65mM NaCl，13％蔗糖，1mM DTT，10μg/ml亮肽素/胃酶抑制劑/抗蛋白酶)中。在4℃下將懸液對(duì)25mM Tris/HCl，pH7.4，50％甘油，1mM DTT，10μg/ml亮肽素、胃酶抑制劑、抗蛋白酶透析過夜，然后上羥基磷灰石(hydroxyappetite)柱(0.1g每1ml懸液，用10mM磷酸鉀，pH7.0，30％甘油，1mM DTT平衡)。將柱子用四體積平衡緩沖液洗滌，流速為20至30ml/h。用一體積含有0.5M磷酸鉀的平衡緩沖液洗脫HSL，然后透析(見上)，通過在4℃下超濾(Amicon Diaflo PM 10 Filter)濃縮5至10倍。經(jīng)過部分純化的HSL可以在-70℃下貯存4至6周。
測定法關(guān)于底物的制備，將25-50μCi[3H]三油?；视?甲苯溶液)、6.8μMol未標(biāo)記的三油?；视秃?.6mg磷脂(磷脂酰膽堿/磷脂酰肌醇3∶1 w/v)混合，借助N2干燥，然后通過超聲處理(Branson250，microtips，1-2檔，2×1min，間隔1min)溶于2ml 0.1M KPi(pH7.0)。加入1ml KPi和新的超聲處理(冰上4×30sec，間隔30sec)后，加入1ml 20％BSA(牛血清白蛋白)(KPi)(三油?；视偷淖罱K濃度為1.7mM)。關(guān)于反應(yīng)，將100μl底物溶液吸移到100μl HSL溶液(如上制備的HSL，稀釋在20mM KPi，pH7.0，1mMEDTA，1mM DTT，0.02％BSA，20μg/ml胃酶抑制劑，10μg/ml亮肽素中)中，在37℃下培育30min。加入3.25ml甲醇/氯仿/庚烷(10∶9∶7)和1.05ml 0.1M K2CO3、0.1M硼酸(pH10.5)后，將該批次充分混合，最后離心(800×g，20min)。相分離后，除去一當(dāng)量上層相(1ml)，通過液體閃爍測量法測定放射性。
評(píng)價(jià)習(xí)慣上分獨(dú)立的四批測試物質(zhì)。通過與未抑制的對(duì)照反應(yīng)比較，測定供試物質(zhì)對(duì)HSL酶活性的抑制作用。IC50值的計(jì)算是借助抑制曲線進(jìn)行的，采用至少10種濃度的供試物質(zhì)。關(guān)于數(shù)據(jù)的分析，使用Elsevier-BIOSOFT的GRAPHIT軟件包。
本試驗(yàn)中，化合物顯示下列作用環(huán)波菌素A、P、P2和R抑制大鼠脂肪細(xì)胞的脂肪分解，IC50＝~0.2μM，它們還抑制人激素敏感性脂肪酶(HSL)，以三油?；视蜑榈孜颕C50＝~0.07至0.5μM。以NBD(4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑)為底物，在4nM至10nM的濃度下抑制來自大鼠的HSL。
環(huán)波菌素在亞微摩爾濃度下抑制激素敏感性脂肪酶(HSL)和大鼠提取物的單酰基甘油脂肪酶。
下列實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。百分率指的是重量?；旌媳仍谝后w的情況下指的是體積，除非已經(jīng)給出其他的細(xì)節(jié)。
實(shí)施例實(shí)施例1鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381甘油培養(yǎng)物的制備在無菌的300ml埃倫邁厄燒瓶內(nèi)向100ml營養(yǎng)溶液(麥芽提取物2.0％，酵母提取物0.2％，葡萄糖1.0％，(NH4)2HPO40.05％，pH6.0)接種鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381，在28℃和180rpm下在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器上培育7天。然后將1.5ml該培養(yǎng)物用1.5ml 99％甘油稀釋，貯存在-20℃下。
實(shí)施例2鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381在埃倫邁厄燒瓶內(nèi)的預(yù)培養(yǎng)物的制備在無菌的300ml埃倫邁厄燒瓶內(nèi)含有100ml下列營養(yǎng)溶液15g/l葡萄糖、15g/l大豆粉、5g/l玉米漿、2g/l CaCO3和5g/lNaCl，接種生長在斜面試管上的培養(yǎng)物(相同的營養(yǎng)溶液，但是含有2％瓊脂)或1ml甘油培養(yǎng)物(見實(shí)施例1)，在180rpm和28℃下在搖動(dòng)器上培育。相同營養(yǎng)溶液的48至96小時(shí)深層培養(yǎng)(接種量約為10％)可滿足10和200l發(fā)酵器的接種需求。
實(shí)施例3鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381在埃倫邁厄燒瓶內(nèi)的培養(yǎng)物的制備在無菌的300ml埃倫邁厄燒瓶內(nèi)含有100ml下列營養(yǎng)溶液20g/l狗用燕麥片和2.5ml痕量元素溶液，接種10％接種量的預(yù)培養(yǎng)物(實(shí)施例2)，在180rpm和28℃下在搖動(dòng)器上培育。培養(yǎng)物可以在兩天后用于得到環(huán)波菌素或者接種發(fā)酵器。痕量元素溶液具有下列組成3g/l CaCl2×2H2O，1g/l檸檬酸Fe(III)，0.2g/l MnSO4×H2O，0.1g/l ZnCl2，0.025g/l CuSO4×5H2O，0.02g/l四硼酸Na，0.004g/l CoCl2×6H2O，0.01g/l鉬酸Na。
實(shí)施例4式II至IX環(huán)波菌素的制備將200l發(fā)酵器在下列條件下用90升營養(yǎng)溶液操作營養(yǎng)培養(yǎng)基20g/l燕麥片/水，2.5ml/l痕量元素，pH7.8(滅菌前)。
將營養(yǎng)溶液加熱滅菌30分鐘，冷卻后，接種5％體積的按照實(shí)施例3所得接種材料。
痕量元素溶液3g/l CaCl2×2H2O，1g/l檸檬酸Fe(III)，0.2g/l MnSO4×H2O，0.1g/l ZnCl2，0.025g/l CuSO4×5H2O，0.02g/l四硼酸Na，0.004g/l CoCl2×6H2O，0.01g/l鉬酸Na。
進(jìn)行時(shí)間72小時(shí)培育溫度28℃攪拌速度90rpm換氣6m3空氣每小時(shí)無需加入止泡劑即可進(jìn)行發(fā)酵。產(chǎn)量在約40至76小時(shí)后達(dá)到最大。
實(shí)施例5
環(huán)波菌素X至XV A的制備在下列條件下操作200l發(fā)酵器，填充100l營養(yǎng)培養(yǎng)基5g/l葡萄糖，20g/l甘油，20g/l大豆粉，5g/l酵母提取物，3g/l NaCl，2.5ml/l痕量元素溶液，pH7.0(滅菌前)。
進(jìn)行時(shí)間72小時(shí)培育溫度27℃攪拌速度65rpm換氣6m3空氣每小時(shí)無需加入抑制泡沫生成的試劑即可進(jìn)行發(fā)酵。產(chǎn)量在約48小時(shí)后達(dá)到最大。
實(shí)施例6環(huán)波菌素混合物從鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381培養(yǎng)溶液中的分離鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381發(fā)酵完成后，向發(fā)酵器加入約2％過濾助劑(例如Celite)過濾按照實(shí)施例4所得100升培養(yǎng)肉湯，用40升甲醇萃取細(xì)胞物(10升)。過濾除去含有活性化合物的甲醇溶液中菌絲體，在真空中濃縮。將濃縮物加載上已準(zhǔn)備好的7升MCI GEL，CHP20P柱。使用水至丙-2-醇的梯度進(jìn)行洗脫。收集柱子流出物(每小時(shí)20升)，每10升一級(jí)分，將含有環(huán)波菌素19至21的級(jí)分各自在真空中濃縮。借助HPLC檢查各級(jí)分(見實(shí)施例7)。第19級(jí)分包含環(huán)波菌素A至E和它們的異構(gòu)體，第20級(jí)分包含環(huán)波菌素F及其異構(gòu)體，第21級(jí)分包含抑制劑環(huán)波菌素N、P、P2、Q、R、S、T和它們的異構(gòu)體。
實(shí)施例7環(huán)波菌素的HPLC分析環(huán)波菌素的高效液相色譜(HPLC)分析是在HP 1100單元中進(jìn)行的，柱子為YMC Pack Pro C18柱(AS-303，250×4.6mm，S-5μm，120A°)。流速為1ml/分鐘，柱溫為40℃。使用0.05％三氟乙酸至乙腈的梯度。11分鐘后洗脫劑變?yōu)?00％乙腈，然后將柱子用這種溶劑進(jìn)一步恒定(等度)洗脫。測量210nm下的紫外吸收，進(jìn)行檢測。利用這種操作，環(huán)波菌素具有下列保留時(shí)間環(huán)波菌素A 12.7分鐘環(huán)波菌素A212.6分鐘環(huán)波菌素F 13.2分鐘環(huán)波菌素N 15.9分鐘環(huán)波菌素P 17.7分鐘環(huán)波菌素P217.3分鐘環(huán)波菌素Q 18.3分鐘環(huán)波菌素R 16.7分鐘環(huán)波菌素R216.4分鐘環(huán)波菌素S 18.5分鐘環(huán)波菌素T 19.1分鐘環(huán)波菌素T218.7分鐘實(shí)施例8純環(huán)波菌素A和A2的制備將按照實(shí)施例6所得第19級(jí)分在真空中濃縮，將1g濃縮物溶于水/甲醇(1∶1)，加載Nucleoprep 100-5 C18AB柱(21×250mm)上。利用含50％乙腈的0.01％三氟乙酸至100％乙腈的梯度進(jìn)行洗脫。流速為50ml/分鐘。測量210nm下的吸光度，測試脂肪酶抑制性質(zhì)，檢查柱子流出級(jí)分。每60ml為一級(jí)分。在第34和35級(jí)分中發(fā)現(xiàn)環(huán)波菌素A，在第41至44級(jí)分中發(fā)現(xiàn)環(huán)波菌素A2。將這些級(jí)分分別合并，在真空中濃縮，連續(xù)在SP 250/10 Nucleosil 100-5 C18HD柱上分離。所選擇的梯度是含50％至66％乙腈/0.01％三氟乙酸，用一滴氫氧化銨溶液調(diào)節(jié)溶液的pH至4.0。將含有純化合物的級(jí)分分別合并，冷凍干燥。得到5.4mg純的環(huán)波菌素A，為蠟狀物質(zhì)，和3mg環(huán)波菌素A2，為油狀物。
實(shí)施例9
環(huán)波菌素A的特征鑒別外觀中性、無色、蠟狀物質(zhì)，可溶于含氧有機(jī)溶劑，但是僅微溶于水和石油醚。
UV最大在甲醇中為228nm。
IR譜帶1752和1671cm-1。
利用硝基苯甲醇/LiCl基質(zhì)進(jìn)行高分辨率FAB質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)分子量為467.2757amu，與環(huán)波菌素A-Li的經(jīng)驗(yàn)式C23H41O7PLi相對(duì)應(yīng)。由此，從環(huán)波菌素A的經(jīng)驗(yàn)式C23H41O7P得到分子量為460。以正電離模式進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜(ESI，正)，發(fā)現(xiàn)峰值在461amu，與(M+H)+相對(duì)應(yīng)；而且，特征峰在221amu，與C7H10O6P相對(duì)應(yīng)。在ESI負(fù)模式中，發(fā)現(xiàn)459amu(M-H)-、337amu(C16H34O5P)和219amu(C7H8O6P)。關(guān)于醇基位置的測定，用N-甲基-N-三甲代甲硅烷基三氟乙酰胺進(jìn)行衍生化，利用電子電離質(zhì)譜檢查樣品。三甲代甲硅烷基衍生物得到 質(zhì)量數(shù)為554amu。甲硅烷基化羥基的位置由強(qiáng)化離子所示，在497amu(α-裂解)和159amu(α-裂解)。
NMR信號(hào)見表1。
表1在300K下，環(huán)波菌素A在甲醇-d4中的1H與13C化學(xué)位移
a)除了n和n±1以外b)13C/31P偶合常數(shù)如括號(hào)內(nèi)所示。
實(shí)施例10環(huán)波菌素B的特征鑒別如實(shí)施例8關(guān)于環(huán)波菌素A所述分離環(huán)波菌素B，多次重復(fù)色譜步驟，如實(shí)施例9進(jìn)行特征鑒別。
外觀中性、無色、蠟狀物質(zhì)，可溶于含氧有機(jī)溶劑，但是僅微溶于水和石油醚。
UV最大在甲醇中為228nm。
以正電離模式進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜(ESI，正)，發(fā)現(xiàn)峰值在461amu，與(M+H)+相對(duì)應(yīng)；而且，特征峰在221amu，與C7H10O6P相對(duì)應(yīng)。在ESI負(fù)模式中，發(fā)現(xiàn)459amu(M-H)-、337amu(C16H34O5P)和219amu(C7H8O6P)。關(guān)于醇基位置的測定，用N-甲基-N-三甲代甲硅烷基三氟乙酰胺進(jìn)行衍生化，利用電子電離質(zhì)譜檢查樣品。三甲代甲硅烷基衍生物得到 質(zhì)量數(shù)為554amu。甲硅烷基化羥基的位置由強(qiáng)化離子所示，在511amu(α-裂解)和145amu(α-裂解)。
環(huán)波菌素B的經(jīng)驗(yàn)式C23H41O7P，分子量460。
實(shí)施例11環(huán)波菌素C的特征鑒別如實(shí)施例8關(guān)于環(huán)波菌素A所述分離環(huán)波菌素C，多次重復(fù)色譜步驟，如實(shí)施例9進(jìn)行特征鑒別。
外觀中性、無色、蠟狀物質(zhì)，可溶于含氧有機(jī)溶劑，但是僅微溶于水和石油醚。
UV最大在甲醇中為228nm。
以正電離模式進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜(ESI，正)，發(fā)現(xiàn)峰值在461amu，與(M+H)+相對(duì)應(yīng)；而且，特征峰在221amu，與C7H10O6P相對(duì)應(yīng)。在ESI負(fù)模式中，發(fā)現(xiàn)459amu(M-H)-、337amu(C16H34O5P)和219amu(C7H8O6P)。關(guān)于醇基位置的測定，用N-甲基-N-三甲代甲硅烷基三氟乙酰胺進(jìn)行衍生化，利用電子電離質(zhì)譜檢查樣品。三甲代甲硅烷基衍生物得到 質(zhì)量數(shù)為554amu。甲硅烷基化羥基的位置由強(qiáng)化離子所示，在525amu(α-裂解)和131amu(α-裂解)。
環(huán)波菌素C的經(jīng)驗(yàn)式C23H41O7P，分子量460。
實(shí)施例12環(huán)波菌素F的特征鑒別如實(shí)施例8所述分離按照實(shí)施例6所得第20級(jí)分，多次重復(fù)色譜步驟分離環(huán)波菌素F，如實(shí)施例9進(jìn)行特征鑒別。
保留時(shí)間13.2分鐘。
外觀中性、無色、蠟狀物質(zhì)，可溶于含氧有機(jī)溶劑，但是僅微溶于水和石油醚。
UV最大在甲醇中為228nm。
以正電離模式進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜(ESI，正)，發(fā)現(xiàn)峰值在459amu，與(M+H)+相對(duì)應(yīng)；而且，特征峰在221amu，與C7H10O6P相對(duì)應(yīng)。在ESI負(fù)模式中，發(fā)現(xiàn)457.6amu(M-H)-、336amu(C16H32O5P)和219amu(C7H8O6P)。
環(huán)波菌素F的經(jīng)驗(yàn)式C23H39O7P，分子量458。
實(shí)施例13環(huán)波菌素P的特征鑒別如實(shí)施例8所述分離按照實(shí)施例5和6所得第21級(jí)分，多次重復(fù)色譜步驟分離環(huán)波菌素P(210mg)，如實(shí)施例9進(jìn)行特征鑒別。
將210mg環(huán)波菌素P溶于3ml丙-2-醇和13ml乙腈，加入8ml水，進(jìn)行結(jié)晶。濾出并用冷乙腈洗滌后，得到最終重量為135mg的環(huán)波菌素。m.p.58-59℃。
保留時(shí)間17.7分鐘。
外觀中性、無色、蠟狀物質(zhì)，可溶于含氧有機(jī)溶劑，但是僅微溶于水和石油醚。
UV最大在甲醇中為228nm。
IR譜帶2917，2852，1753，1671，1471，1214，996和832cm-1。
利用硝基苯甲醇基質(zhì)進(jìn)行高分辨率FAB質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)分子量為445.2717amu，與環(huán)波菌素P C23H42O6P的(M+H)+相對(duì)應(yīng)。由此，從環(huán)波菌素P的經(jīng)驗(yàn)式C23H41O6P得到子量為444。以正電離模式進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜(ESI，正)，發(fā)現(xiàn)峰值在445amu，與(M+H)+相對(duì)應(yīng)；而且，特征峰在221amu，與C7H10O6P相對(duì)應(yīng)。在ESI負(fù)模式中，發(fā)現(xiàn)443amu(M-H)-、321amu(C16H34O4P)和219amu(C7H8O6P)。
NMR數(shù)據(jù)如表2所示。
表2在300K下，環(huán)波菌素P在MeOD中的化學(xué)位移
a)13C/31P偶合常數(shù)如括號(hào)內(nèi)所示。
實(shí)施例14環(huán)波菌素P2的特征鑒別如實(shí)施例8所述分離按照實(shí)施例5和6所得第21級(jí)分，多次重復(fù)色譜步驟分離環(huán)波菌素P2(130mg)，如實(shí)施例9進(jìn)行特征鑒別。
保留時(shí)間17.1分鐘。
外觀中性、無色、油性物質(zhì)，可溶于含氧有機(jī)溶劑，但是僅微溶于水和石油醚。
UV最大在甲醇中為228nm。
利用硝基苯甲醇基質(zhì)進(jìn)行高分辨率FAB質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)分子量為445.2721amu，與環(huán)波菌素P C23H42O6P的(M+H)+相對(duì)應(yīng)。由此，從環(huán)波菌素P2的經(jīng)驗(yàn)式C23H41O6P得到分子量為444。以正電離模式進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜(ESI，正)，發(fā)現(xiàn)峰值在445amu，與(M+H)+相對(duì)應(yīng)；而且，特征峰在221amu，與C7H10O6P相對(duì)應(yīng)。在ESI負(fù)模式中，發(fā)現(xiàn)443amu(M-H)-、321amu(C16H34O4P)和219amu(C7H8O6P)。
環(huán)波菌素P2的NMR數(shù)據(jù)如表3所示。
表3在300K下，環(huán)波菌素P2在CD3OD中的化學(xué)位移
a)13C/31P偶合常數(shù)如括號(hào)內(nèi)所示。
實(shí)施例15環(huán)波菌素N的獲得和特征鑒別如實(shí)施例8所述分離按照實(shí)施例5和6所得第21級(jí)分，多次重復(fù)色譜步驟分離環(huán)波菌素N(2mg)，如實(shí)施例9進(jìn)行特征鑒別。
保留時(shí)間15.9分鐘。
外觀中性、無色、油性物質(zhì)，可溶于含氧有機(jī)溶劑，但是僅微溶于水和石油醚。
UV最大在甲醇中為228nm。
利用高分辨率質(zhì)譜FAB條件，觀察到準(zhǔn)分子離子(M+H)在417.2405amu，與經(jīng)驗(yàn)式C21H38O6P相對(duì)應(yīng)(理論值417.2406)。ESI+模式的特征片斷221amu。
表4在300K下，環(huán)波菌素N在MeOD中的化學(xué)位移
a)13C/31P偶合常數(shù)如括號(hào)內(nèi)所示。
實(shí)施例16環(huán)波菌素R的獲得和特征鑒別如實(shí)施例8所述分離按照實(shí)施例5和6所得第21級(jí)分，多次重復(fù)色譜步驟分離環(huán)波菌素R(8mg)，如實(shí)施例9進(jìn)行特征鑒別。
保留時(shí)間16.7分鐘。
外觀中性、無色、結(jié)晶物質(zhì)，可溶于含氧有機(jī)溶劑，但是僅微溶于水和石油醚。
UV最大在甲醇中為228nm。
利用高分辨率質(zhì)譜FAB條件，觀察到準(zhǔn)分子離子(M+H)在431.2561amu，與經(jīng)驗(yàn)式C22H40O6P相對(duì)應(yīng)(理論值431.2562)。ESI+模式的特征片斷221amu。
表5在300K下，環(huán)波菌素R在MeOD中的化學(xué)位移
a)13C/31P偶合常數(shù)如括號(hào)內(nèi)所示。
實(shí)施例17環(huán)波菌素R2的獲得和特征鑒別如實(shí)施例8所述分離按照實(shí)施例5和6所得第21級(jí)分，多次重復(fù)色譜步驟分離環(huán)波菌素R2(8mg)，如實(shí)施例9進(jìn)行特征鑒別。
保留時(shí)間16.4分鐘。
外觀中性、無色、油性物質(zhì)，可溶于含氧有機(jī)溶劑，但是僅微溶于水和石油醚。
UV最大在甲醇中為228nm。
利用高分辨率質(zhì)譜FAB條件，觀察到準(zhǔn)分子離子(M+H)在431.2564amu，與經(jīng)驗(yàn)式C22H40O6P相對(duì)應(yīng)(理論值431.2562)。ESI+模式的特征片斷221amu。
表6在300K下，環(huán)波菌素R2在MeOD中的化學(xué)位移
a)13C/31P偶合常數(shù)如括號(hào)內(nèi)所示。
實(shí)施例18環(huán)波菌素S的獲得和特征鑒別如實(shí)施例8所述分離按照實(shí)施例5和6所得第21級(jí)分，多次重復(fù)色譜步驟分離環(huán)波菌素S(0.7mg)，如實(shí)施例9進(jìn)行特征鑒別。
保留時(shí)間18.5分鐘。
外觀中性、無色、固體物質(zhì)，可溶于含氧有機(jī)溶劑，但是僅微溶于水和石油醚。
UV最大在甲醇中為228nm。
利用高分辨率質(zhì)譜FAB條件，觀察到準(zhǔn)分子離子(M+H)在459.2883amu，與經(jīng)驗(yàn)式C24H44O6P相對(duì)應(yīng)(理論值459.2575)。ESI+模式的特征片斷235amu。
表7在300K下，環(huán)波菌素S在MeOD中的化學(xué)位移
a)13C/31P偶合常數(shù)如括號(hào)內(nèi)所示。
實(shí)施例19環(huán)波菌素T的獲得和特征鑒別如實(shí)施例8所述分離按照實(shí)施例5和6所得第21級(jí)分，多次重復(fù)色譜步驟分離環(huán)波菌素T(5mg)，如實(shí)施例9進(jìn)行特征鑒別。
保留時(shí)間19.1分鐘。
外觀中性、無色、固體物質(zhì)，可溶于含氧有機(jī)溶劑，但是僅微溶于水和石油醚。
UV最大在甲醇中為228nm。
利用高分辨率質(zhì)譜FAB條件，觀察到準(zhǔn)分子離子(M+H)在473.3030amu，與經(jīng)驗(yàn)式C25H46O6P相對(duì)應(yīng)(理論值473.3032)。ESI+模式的特征片斷249amu。
表8在300K下，環(huán)波菌素T在MeOD中的化學(xué)位移
a)13C/31P偶合常數(shù)如括號(hào)內(nèi)所示。
實(shí)施例20環(huán)波菌素T2的獲得和特征鑒別如實(shí)施例8所述分離按照實(shí)施例5和6所得第21級(jí)分，多次重復(fù)色譜步驟分離環(huán)波菌素T2(4mg)，如實(shí)施例9進(jìn)行特征鑒別。
保留時(shí)間18.7分鐘。
外觀中性、無色、固體物質(zhì)，可溶于含氧有機(jī)溶劑，但是僅微溶于水和石油醚。
UV最大在甲醇中為228nm。
利用高分辨率質(zhì)譜FAB條件，觀察到準(zhǔn)分子離子(M+H)在473.3035amu，與經(jīng)驗(yàn)式C25H46O6P相對(duì)應(yīng)(理論值473.3032)。ESI+模式的特征片斷249amu。
表9在300K下，環(huán)波菌素T2在MeOD中的化學(xué)位移
a)13C/31P偶合常數(shù)如括號(hào)內(nèi)所示。
實(shí)施例21激素敏感性脂肪酶(HSL)的抑制作用來自大鼠的激素敏感性脂肪酶受到下列濃度的抑制(IC50)，使用三油?；视妥鳛榈孜锃h(huán)波菌素A 20nM環(huán)波菌素N 450nM環(huán)波菌素P 30nM
環(huán)波菌素P2 40nM環(huán)波菌素R10nM環(huán)波菌素R2 220nM環(huán)波菌素S20nM環(huán)波菌素T200nM環(huán)波菌素T2 60nM
權(quán)利要求
1.式I化合物 其中R1是1.具有2至30個(gè)碳原子的碳鏈，它可以是直鏈、支鏈、飽和或不飽和、碳環(huán)或雜環(huán)的，其中該碳鏈可選地被下列基團(tuán)單或二取代1.1-OH，1.2＝O，1.3-O-C1-C6-烷基，其中的烷基是直鏈或支鏈的，1.4-O-C2-C6-烯基，其中的烯基是直鏈或支鏈的，1.5-C1-C6-烷基，其中的烷基是直鏈或支鏈的，1.6-芳基，1.7-C1-C6-烷基苯，1.8-聯(lián)苯，1.9-NH-C1-C6-烷基，其中的烷基是直鏈或支鏈的，1.10-NH-C2-C6-烯基，其中的烯基是直鏈或支鏈的，1.11-NH2，1.12＝S，1.13-S-C1-C6-烷基，其中的烷基是直鏈或支鏈的，或1.14-S-C2-C6-烯基，其中的烯基是直鏈或支鏈的，1.15鹵素，其中取代基1.1至1.15還可以另外被取代，2.-[-芳基-(CH2)n]m，其中[-芳基-(CH2)n]m是未取代的或者被1.1至1.15所述取代基單或二取代，n和m彼此獨(dú)立地是整數(shù)0、1、2或3；R2是1.C1-C6-烷基，其中的烷基是未取代的或者被1.1至1.15所述取代基單或二取代，2.C2-C6-烯基，其中的烯基是未取代的或者被1.1至1.15所述取代基單或二取代，3.C2-C6-炔基，其中的炔基是未取代的或者被1.1至1.15所述取代基單或二取代，E是磷(P)或硫(S)原子，X1、X2和X3彼此獨(dú)立地是1.-O-，2.-NH-，3.-N＝，4.-S-，或5.-CH2-和-CHR2，以所有它們的立體化學(xué)形式和這些形式的任意比例混合物存在，和它們的生理學(xué)上可耐受的鹽和化學(xué)等價(jià)物。
2.如權(quán)利要求1所要求保護(hù)的式I化合物或其生理學(xué)上可耐受的鹽，其特征在于R1是具有10至18個(gè)碳原子的碳鏈，它可以是直鏈、支鏈、飽和或不飽和的、碳環(huán)或雜環(huán)的，其中該碳鏈?zhǔn)俏慈〈幕蛘呷?.1至1.15所述被單或二取代。
3.如權(quán)利要求1或2所要求保護(hù)的式I化合物或其生理學(xué)上可耐受的鹽，其特征在于R1是1.0-(CH2)15CH3，2.0-(CH2)13CH(CH3)2，3.0-(CH2)11CH(OH)(CH2)3CH3，4.0-(CH2)11CH(OH)CH2CH(CH3)2，5.0-(CH2)12CH(OH)(CH2)2CH3，6.0-(CH2)13CH(OH)CH2CH3，7.0-(CH2)14CH(OH)CH3，8.0-(CH2)15CH2(OH)，9.0-(CH2)16CH3，10.0-(CH2)13C＝OCH2CH311.0-(CH2)12C＝OCH2CH2CH312.0-(CH2)11C＝OCH2CH2CH2CH313.0-(CH2)13CH314.0-(CH2)11CH(CH3)215.0-(CH2)14CH3或16.0-(CH2)12CH(CH3)2.
4.如權(quán)利要求1、2或3所要求保護(hù)的式I化合物或其生理學(xué)上可耐受的鹽，其特征在于R2是C1-C6-烷基。
5.如權(quán)利要求4所要求保護(hù)的式I化合物或其生理學(xué)上可耐受的鹽，其特征在于R2是-CH3、-CH2CH3或-CH2CH2CH3。
6.如權(quán)利要求1至5一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求保護(hù)的式I化合物或其生理學(xué)上可耐受的鹽，可以這樣制備，在適合的條件下，在培養(yǎng)基中發(fā)酵微生物鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381或其變體或突變體之一，直至一種或多種式I化合物蓄積在培養(yǎng)基中，然后從培養(yǎng)基中分離它們，再可選地轉(zhuǎn)化為化學(xué)等價(jià)物和生理學(xué)上可耐受的鹽。
7.如權(quán)利要求1至6一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求保護(hù)的式I化合物或其生理學(xué)上可耐受的鹽的制備方法，其特征在于它包含在適合的條件下，在培養(yǎng)基中發(fā)酵微生物鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381或其變體或突變體之一，直至一種或多種式I化合物蓄積在培養(yǎng)基中，然后從培養(yǎng)基中分離它們，再可選地轉(zhuǎn)化為化學(xué)等價(jià)物和生理學(xué)上可耐受的鹽。
8.如權(quán)利要求7所要求保護(hù)的方法，其特征在于發(fā)酵是在需氧條件下進(jìn)行的，溫度在18與35℃之間，pH在6與8之間。
9.用作藥物的如權(quán)利要求1至6一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求保護(hù)的式I化合物或其生理學(xué)上可耐受的鹽。
10.用作藥物的如權(quán)利要求1至6一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求保護(hù)的式I化合物或其生理學(xué)上可耐受的鹽，用于抑制脂肪酶。
11.用作抗糖尿病藥的如權(quán)利要求1至6一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求保護(hù)的式I化合物或其生理學(xué)上可耐受的鹽。
12.藥物制劑，它含有至少一種如權(quán)利要求1至6一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求保護(hù)的式I化合物或其生理學(xué)上可耐受的鹽。
13.如權(quán)利要求12所要求保護(hù)的藥物制劑的制備方法，其特征在于它包含利用適合的賦形劑和/或載體將至少一種如權(quán)利要求1至6一項(xiàng)或多項(xiàng)所要求保護(hù)的式I化合物或其生理學(xué)上可耐受的鹽制成適合的給藥劑型。
14.鏈霉菌屬菌株HAG 004107，DSM 13381。
全文摘要
本發(fā)明涉及通式(I)化合物，其中R
文檔編號(hào)C12R1/465GK1427845SQ01808881
公開日2003年7月2日 申請(qǐng)日期2001年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月4日
發(fā)明者L·維特希, K·埃利希, M·庫茲, J·溫克 申請(qǐng)人:阿文蒂斯藥物德國有限公司