專利名稱：右旋泛酸堿土金屬鹽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從發(fā)酵肉湯制備右旋泛酸的堿土金屬鹽的方法。
泛酸可由化學(xué)合成制備或通過生物技術(shù)由適宜的微生物在適宜的營養(yǎng)液中發(fā)酵制備。外消旋泛內(nèi)酯是化學(xué)合成中的重要化合物，其由甲醛、異丁醛和氰化物經(jīng)多步方法制備。在進(jìn)一步的方法步驟中，將外消旋混合物分離，右旋泛內(nèi)酯與β-丙氨酸縮合得到右旋泛酸。
用微生物發(fā)酵制備的優(yōu)點(diǎn)是直接形成正確的立體異構(gòu)形式，即不含左旋泛酸的右旋形式的泛酸。
如EP-A-0493060、EP-A-0590857及WO 97/10340所報(bào)導(dǎo)，多種類型的細(xì)菌，例如大腸桿菌(Escherichia coli)、產(chǎn)脲節(jié)桿菌(Arthrobacter ureafaciens)、產(chǎn)紅棒狀桿菌(Corynebacteriumerythrogenes)、產(chǎn)氨短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)和酵母例如卡斯特爾氏德巴利氏酵母(Debaromyces castellii)，在適宜的發(fā)酵條件下產(chǎn)生右旋泛酸。在所引文獻(xiàn)中所述的，特別適宜的微生物是大腸桿菌IFO3547的衍生物，例如FV5069/pFV31菌株或FV5069/pFV202菌株。
在如EP-A-0493060、EP-A-0590857及WO 97/10340所述的右旋泛酸的發(fā)酵制備中，在適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能夠產(chǎn)生右旋泛酸的微生物，然后根據(jù)復(fù)雜且高成本的過程分離所形成的右旋泛酸，純化，得到其鈣鹽。
適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基含有碳源如葡萄糖或淀粉水解產(chǎn)物，前體如β-丙氨酸、外消旋泛酸或外消旋泛內(nèi)酯，氮源如硫酸銨，磷源如磷酸鉀，以及其它鹽類、微量元素、氨基酸和維生素，以及任選的復(fù)合培養(yǎng)基添加劑如酵母提取物或玉米漿。然后在適宜的pH值、適宜的通氣及攪拌下，將該微生物在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這樣該微生物形成右旋泛酸。
例如，EP-A-0590857描述了用于在裝有2.3升或2.5升培養(yǎng)基的5升反應(yīng)器中制備泛酸的補(bǔ)料分批法。在該試驗(yàn)例中，估計(jì)地加入固體碳酸鈣來調(diào)節(jié)pH值。然而在具有好幾立方米的容積的大型反應(yīng)器中預(yù)先添加或后續(xù)添加固體碳酸鈣極為不利，因?yàn)閿嚢铇?、?nèi)表面及封口上的碳酸鈣沉積增加裝料量，培養(yǎng)液的流動(dòng)性和無菌條件受到不利的影響。
根據(jù)WO 96/33283和EP-A-0590857概括的現(xiàn)有技術(shù)，從含有泛酸的發(fā)酵肉湯開始，經(jīng)復(fù)雜且高成本的分離和純化方法得到右旋泛酸的鈣鹽。通過過濾或離心對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行首次分離，通過活性碳或柱層析進(jìn)一步純化處理濾液。在預(yù)處理濾液或洗脫液中加入氫氧化鈣后，然后通過結(jié)晶純化該批產(chǎn)物。
WO 96/33283中描述的純化方法如下進(jìn)行。在第一柱中通過活性碳使濾液脫色。用濃鹽酸將pH調(diào)節(jié)至3.0，然后將液體連續(xù)通過兩根添有活性碳的柱進(jìn)行純化。用甲醇進(jìn)行右旋泛酸的洗脫。在充分混合下以氫氧化鈣粉末進(jìn)行后續(xù)中和。通過在5℃下后續(xù)結(jié)晶得到右旋泛酸鈣。
在EP-A-0590857中描述的純化方法如下進(jìn)行。首先用陽離子交換和陰離子交換柱對(duì)濾液進(jìn)行純化。用鹽酸進(jìn)行洗脫。然后用氫氧化鈣中和洗脫液，之后加入活性碳并過濾混合物。將所得濾液以低分子量醇(甲醇、乙醇、異丙醇)提取，通過結(jié)晶得到右旋泛酸鈣。
以上述方法制備的右旋泛酸鈣用作動(dòng)物營養(yǎng)的飼料添加劑。
發(fā)明目的本發(fā)明提供了用于制備右旋泛酸的堿土金屬鹽，尤其是鈣鹽與鎂鹽的改進(jìn)方法，所得產(chǎn)品適于用作動(dòng)物營養(yǎng)的飼料添加劑。發(fā)明內(nèi)容維生素右旋泛酸是商業(yè)上的重要產(chǎn)品，其用于動(dòng)物營養(yǎng)、藥品、人營養(yǎng)和化妝品。因此提供制備泛酸或其鹽的新方法受到關(guān)注。
本發(fā)明提供從發(fā)酵肉湯制備右旋泛酸或含有右旋泛酸的混合物的堿土金屬鹽的方法，其特征在于a)在堿土金屬化合物的存在下進(jìn)行發(fā)酵；b)發(fā)酵完成后，將生物質(zhì)任選地全部或部分除去；c)濃縮這樣處理的發(fā)酵肉湯；以及d)以純品形式或以含有發(fā)酵肉湯成分的混合物的形式從發(fā)酵肉湯得到右旋泛酸的堿土金屬鹽。
本發(fā)明還提供一種方法，其特征在于將期望量的右旋泛酸的一種或多種不同的堿土金屬鹽加入發(fā)酵肉湯的成分和含有右旋泛酸的一種或多種堿土金屬鹽的混合物中。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用于制備右旋泛酸堿土金屬鹽的方法，其特征在于a)將生物質(zhì)和含有右旋泛酸的堿土金屬鹽的發(fā)酵肉湯分離；b)濃縮無細(xì)胞的發(fā)酵肉湯；c)將親水有機(jī)溶劑，特別是乙醇、甲醇或丙酮加入這樣得到的濃縮物中；然后d)分離泛酸的堿土金屬鹽，任選地用親水有機(jī)溶劑洗滌，然后，若需要；
e)在親水有機(jī)溶劑的水溶液中重結(jié)晶，任選地加入活性碳，以高純度獲得產(chǎn)物。
所有能夠產(chǎn)生右旋泛酸的微生物和在適宜的發(fā)酵條件下產(chǎn)生右旋泛酸的微生物都適用于本發(fā)明的方法。所述微生物可以從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素或從甘油和乙醇生產(chǎn)泛酸。
所述微生物可以是真菌或酵母，例如卡斯特爾氏德巴利氏酵母或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或革蘭氏陽性細(xì)菌，例如棒狀桿菌屬，或者也可以是革蘭氏陰性細(xì)菌，例如腸桿菌科。在腸桿菌科中，以大腸桿菌為代表的埃希桿菌屬尤應(yīng)提及。在大腸桿菌中，應(yīng)該提及所謂的K-12菌株，例如MG1655或W3110菌株(Neidhard等Escherichia coli and Salmonella.Cellular and MolecularBiology(ASM Press，Washington D.C.))或大腸桿菌野生型菌株IFO3547(Institute for Fermentation，Osaka，Japan)及其突變株。在從IFO3547獲得的菌株中，應(yīng)該依次提及FV5069/pFV31(EP-A-0590857、US-A-5518906)和FV5069/pFV202(WO 97/10340、US-A-5932457)。在棒狀桿菌屬中尤應(yīng)提及谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)。
可以在分批法中或者在補(bǔ)料分批法或重復(fù)補(bǔ)料分批法中連續(xù)或不連續(xù)地培養(yǎng)上述微生物，以生產(chǎn)右旋泛酸的堿土金屬鹽。對(duì)已知培養(yǎng)方法的總結(jié)見Chmiel編寫的手冊(cè)(Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik[Introduction to Biotechnology](Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas編寫的手冊(cè)(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))。
所用培養(yǎng)基必須適宜地滿足相應(yīng)微生物的需求。用于各種微生物的培養(yǎng)基參見美國細(xì)菌學(xué)協(xié)會(huì)(American Society for Bacteriology)的“Manual of Methods for General Bacteriology”(Washington D.C.，USA，1981)。糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和纖維素，油和脂肪，例如豆油、葵花油、花生油和椰子油，脂肪酸，例如棕櫚酸、硬脂酸和亞油酸，醇，例如甘油和乙醇，還有有機(jī)酸，如乙酸，可以用作碳源。這些物質(zhì)可以單獨(dú)或以混合物使用。作為氮源，例如可以使用有機(jī)含氮化合物，如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麥芽汁、玉米漿、大豆粉和尿素，或無機(jī)化合物，如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。這些氮源可以單獨(dú)或以混合物使用。作為磷源，可以使用磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應(yīng)的含鈉鹽。培養(yǎng)基還必須含有金屬鹽，如硫酸鎂或硫酸鐵，它們對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)是必需的。最后，必需的生長(zhǎng)因子如氨基酸和維生素可以和上述物質(zhì)一起使用?？梢栽谂囵B(yǎng)基中進(jìn)一步加入前體如β-丙氨酸或任選地它們的鹽。上述物質(zhì)可以一次性添加到培養(yǎng)物中，也可以在培養(yǎng)過程中適宜地定量添加。
可以適宜的方式使用堿性化合物如氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH，在本發(fā)明方法的范圍內(nèi)不包括其它措施。消泡劑如脂肪酸聚乙二醇酯可以用于控制泡沫形成?？梢蕴砑舆m宜的選擇性作用的物質(zhì)，例如抗生素，以保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。為了保持有氧條件，可以向培養(yǎng)物中通入氧或含氧氣體混合物，例如空氣。培養(yǎng)物的溫度通常為20℃-50℃，優(yōu)選為25℃-45℃。繼續(xù)培養(yǎng)直至形成最大量的右旋泛酸。該目的通常在10-160小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)。
已發(fā)現(xiàn)，通過在發(fā)酵過程中向發(fā)酵液中連續(xù)加入含堿土金屬的無機(jī)化合物或有機(jī)酸的堿土金屬鹽的溶液或懸浮液，可以簡(jiǎn)單的方式生產(chǎn)右旋泛酸的堿土金屬鹽，特別是其鈣鹽和鎂鹽，所添加的含堿土金屬的無機(jī)化合物例如氫氧化鈣、氫氧化鎂，尤其是氫氧化鈣，或氧化鎂，所添加的有機(jī)酸的堿土金屬鹽例如乙酸鈣、富馬酸鈣或天冬氨酸鈣。分批定量加入含堿土金屬的化合物也是可能的。以這種方式，將形成右旋泛酸堿土金屬鹽所需的陽離子直接引入發(fā)酵肉湯中。
本發(fā)明的發(fā)酵方法通常特征在于，首先以將氨用作pH調(diào)節(jié)劑和氮源的已知方式培養(yǎng)能夠產(chǎn)生右旋泛酸的微生物，在隨后的生產(chǎn)階段，優(yōu)選通過使用含堿土金屬化合物，例如氫氧化鈣、氫氧化鎂、氧化鎂、乙酸鈣、富馬酸鈣或天冬氨酸鈣的溶液或懸浮液調(diào)節(jié)pH。如果使用有機(jī)酸的鈣鹽，則有機(jī)基通常被微生物用作碳源。
所使用的含堿土金屬化合物，尤其是氫氧化鈣和氫氧化鎂的溶液或懸浮液的濃度是5-50％(重量)，優(yōu)選是5-30％(重量)，最優(yōu)選是10-25％(重量)。根據(jù)本發(fā)明，還可能使用在這些濃度范圍內(nèi)的各種含堿土金屬化合物的混合物。
定量加入堿土金屬化合物的方式使堿土金屬化合物和形成的右旋泛酸的摩爾比為1∶0.5至1∶20，優(yōu)選是1∶1.3至1∶10，更優(yōu)選是1∶1.3至1∶2.5，最優(yōu)選的化學(xué)計(jì)量范圍是1∶1.8至1∶2.2。如果需要，為了保持堿土金屬化合物和形成的右旋泛酸的比例的預(yù)期范圍，在發(fā)酵過程中可以通過定量加入氨水，或者如果含羧基的副產(chǎn)物過量形成，則加入氨氣調(diào)節(jié)pH。
可以在發(fā)酵1-70小時(shí)，優(yōu)選10-40小時(shí)，最優(yōu)選20-25小時(shí)后定量加入堿土金屬化合物。在開始定量加入堿土金屬化合物時(shí)，右旋泛酸的濃度通常為0.5-70g/l，優(yōu)選是5-35g/l，特別優(yōu)選是20-25g/l。在定量加入堿土金屬化合物時(shí)，生物質(zhì)的濃度通常為1-30g干重/l，優(yōu)選是10-23g干重/l，特別優(yōu)選是17-21g干重/l。
本發(fā)明還提供用于以快速且低成本的方式生產(chǎn)含有右旋泛酸的堿土金屬鹽，尤其是鈣鹽或鎂鹽的粉末或飼料添加劑的方法。為此目的，將根據(jù)本發(fā)明方法制備的含有特別是右旋泛酸的鈣鹽或鎂鹽的發(fā)酵肉湯用已知方法濃縮，所述方法如使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器或降膜蒸發(fā)器。然后將以這種方式濃縮的發(fā)酵肉湯通過噴霧干燥或冷凍干燥技術(shù)，例如參見M.L.Shuler和F.Kargi的“BioprocessEngineering，Basic Concepts”，(Prentice Hall Inc.，Englewood Cliffs，New Jersey，USA，1992))，或者通過其它適宜的方法轉(zhuǎn)化成優(yōu)選是易流動(dòng)性粉末或飼料添加劑。為了達(dá)到預(yù)期的濃度水平，可以在適宜的方法階段任選地加入含有右旋泛酸鈣或鎂的物質(zhì)或制劑。所得產(chǎn)品中右旋泛酸鈣或鎂的濃度，以右旋泛酸表示，為20-80％(重量)，優(yōu)選為30-75％(重量)。該產(chǎn)品適于用作動(dòng)物營養(yǎng)的飼料添加劑。
本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)了另一種生產(chǎn)含有右旋泛酸鈣或鎂的粉末或飼料添加劑的方法。為此目的，首先通過已知的分離方法，例如離心、過濾、潷析或者是后者的組合，將如上所述制備的含有特別是右旋泛酸鈣或鎂的發(fā)酵肉湯和生物質(zhì)全部或部分地分離。然后將無細(xì)胞的發(fā)酵肉湯通過已知方法，例如使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器或降膜蒸發(fā)器進(jìn)行濃縮。然后將以這種方式濃縮的懸浮液通過包括噴霧干燥或冷凍干燥的方法或通過其它適宜的方法處理成優(yōu)選是易流動(dòng)性粉末。為了達(dá)到預(yù)期的濃度值，在適宜的方法階段任選地加入含有右旋泛酸鈣或鎂的物質(zhì)或制劑。所得產(chǎn)品中右旋泛酸鈣或鎂的濃度，以右旋泛酸表示，為20-80％(重量)，優(yōu)選為30-75％(重量)。該產(chǎn)品適于用作動(dòng)物營養(yǎng)的飼料添加劑。
本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)了用于以快速且低成本的方式生產(chǎn)含右旋泛酸鈣或鎂的晶體的方法。為此目的，首先將如上所述制備的含有右旋泛酸鈣或鎂的發(fā)酵肉湯如上所述和生物質(zhì)分離。然后將無細(xì)胞的發(fā)酵肉湯用已知方法，例如使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、薄膜蒸發(fā)器或降膜蒸發(fā)器濃縮。然后將親水有機(jī)溶劑，例如乙醇、甲醇或丙酮加入以此方式濃縮的懸浮液中。通過將懸浮液冷卻至0-8℃，優(yōu)選為0-5℃，使剩余固體物質(zhì)沉淀出。然后通過用右旋泛酸鈣或鎂晶體或含有右旋泛酸鈣或鎂晶體的物質(zhì)接種使期望的鹽結(jié)晶。結(jié)晶在0-8℃，優(yōu)選在0-5℃下進(jìn)行，持續(xù)1小時(shí)至12天，優(yōu)選1小時(shí)至10天，特別優(yōu)選為1小時(shí)至8天。然后優(yōu)選將這樣得到的結(jié)晶產(chǎn)物用甲醇洗滌并干燥。如果想獲得更高純度的產(chǎn)物，則在甲醇的含水溶液中處理結(jié)晶產(chǎn)物并結(jié)晶，任選地在加入活性碳的條件下進(jìn)行。甲醇的含水溶液中甲醇含量為70-99％(體積)，優(yōu)選為80-99％(體積)，特別優(yōu)選為90-99％(體積)。
在以這種方式得到的結(jié)晶產(chǎn)物中，右旋泛酸鈣或鎂的濃度為60-99％(重量)，更優(yōu)選為70-99％(重量)，特別優(yōu)選為80-99％(重量)。該產(chǎn)物適于在動(dòng)物營養(yǎng)中用作飼料添加劑。
右旋泛酸的濃度可以通過已知方法測(cè)定(Velisek；Chromatographic Science 60，515-560(1992))。純右旋泛酸鈣(＞99％(重量))中右旋泛酸的含量為91.16％(重量)。純右旋泛酸鎂(＞99％(重量))中右旋泛酸的含量為94.73％(重量)。
為此目的，用產(chǎn)生右旋泛酸的大腸桿菌5069/pFV31菌株進(jìn)行試驗(yàn)，所述菌株按布達(dá)佩斯條約以保藏號(hào)FERM-BP 4395保藏在Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Science andTechnology，其地址為1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki(Japan)(US-A-5518906)。
還進(jìn)行了發(fā)酵試驗(yàn)，其中將富馬酸或天冬氨酸的鈣鹽加入發(fā)酵肉湯中，從而直接形成右旋泛酸鈣。
為了制備工作細(xì)胞庫，將10ml部分的加有50μg/ml的氨芐西林的LBG培養(yǎng)基加入100ml的錐形瓶中，然后和100μl上述主細(xì)胞庫一起培養(yǎng)。所述培養(yǎng)在Kuhner AG(Birsfelden，Switzerland)的ESR培養(yǎng)箱中在37℃和180rpm的條件下進(jìn)行16小時(shí)。
培養(yǎng)后，用Dr.Lange(Berlin，Germany)的LP2W光度計(jì)在660nm的測(cè)量波長(zhǎng)下測(cè)定培養(yǎng)物懸浮液的光密度(OD)。光密度為3.5。然后在無菌條件下將細(xì)胞培養(yǎng)物加入Greiner(Frickenhausen，Germany)的無菌的30ml聚乙烯試管中，用Beckmann(Hanover，Germany)的J-6B型離心機(jī)在2500rpm下離心15分鐘。將分離的生物質(zhì)重新懸浮在10ml加有20％甘油的LBG培養(yǎng)基中。然后在無菌條件下，以500μl部分將細(xì)胞懸浮液加入Nalgene(New York，U.S.A)的1ml無菌試管中，并在-70℃冷凍。將以此方式制備的冷凍細(xì)胞懸浮液用作工作細(xì)胞庫。2.含右旋泛酸鈣的發(fā)酵肉湯的制備為了制備含右旋泛酸鈣的發(fā)酵肉湯，首先將工作細(xì)胞庫在搖瓶培養(yǎng)箱中繁殖，然后用于接種預(yù)發(fā)酵罐。接著來自預(yù)發(fā)酵罐的培養(yǎng)物用于接種生產(chǎn)發(fā)酵罐。
將SKA培養(yǎng)基用于搖瓶培養(yǎng)物(表1)。SKA培養(yǎng)基如下制備稱量硫酸銨7.0g、磷酸二氫鉀0.5g、磷酸氫二鉀1.0g、七水硫酸鎂0.5g、一水硫酸錳0.01g、七水硫酸鋅0.01g、硫酸鐵0.005g和預(yù)先用25％氨水調(diào)節(jié)pH至6.8的玉米漿20g、加入1升燒杯中、然后補(bǔ)充蒸餾水至825g。將該含有玉米漿的鹽溶液在高壓滅菌器中在121℃下滅菌20分鐘。將由24g葡萄糖和0.002g鹽酸硫胺素組成并用蒸餾水補(bǔ)充至125g的溶液通過過濾滅菌。稱取10g碳酸鈣放入100ml燒瓶中，在高壓滅菌器中在123℃下滅菌20分鐘。通過將前述兩種成分與含有玉米漿的鹽溶液混合得到SKA培養(yǎng)基。
將該SKA培養(yǎng)基以12.5ml部分加入100ml錐形瓶中，然后用0.5ml細(xì)胞懸浮液接種。將已經(jīng)用無菌生理鹽水以1∶100的比例稀釋的工作細(xì)胞培養(yǎng)物的冷凍樣品用作細(xì)胞懸浮液。培養(yǎng)在Infors AG(Bottmingen，Switzerland)的RC-1-TK培養(yǎng)箱中在32℃和150rpm的條件下進(jìn)行20小時(shí)。隨后在660nm的測(cè)量波長(zhǎng)處測(cè)定的光密度為12.5。
為了接種20kg預(yù)培養(yǎng)基A1-102，其是在Bioengineering(Wald，Switzerland，LP-42型)的42升容量的攪拌的反應(yīng)器發(fā)酵罐得到的，將0.5ml SKA培養(yǎng)基以1∶100稀釋，將50ml所得的懸浮液加入發(fā)酵罐中。預(yù)培養(yǎng)基A1-102含有表2所列的成分。在37℃的溫度，0.5vvm的體積通氣，20％大氣飽和的氧分壓和pH6.5下，將培養(yǎng)物培養(yǎng)15.5小時(shí)，直至OD660達(dá)到11.3。
為了接種5830g主培養(yǎng)基M1-425，其是在B.Braun(BBI，Germany，Melsungen，Biostat E/ED型)的14升容量的攪拌的反應(yīng)器發(fā)酵罐中獲得的，將423ml第二預(yù)培養(yǎng)物加入培養(yǎng)基A1-102中。主培養(yǎng)基M1-425含有表3所列的成分。首先在37℃的溫度，0.75vvm的體積通氣，400rpm的最小轉(zhuǎn)速，20％大氣飽和的氧分壓和pH6.5下，將培養(yǎng)物培養(yǎng)6.5小時(shí)，直至OD660達(dá)到18.6。然后在37℃的溫度、2％大氣飽和的氧分壓和pH6.0下，將培養(yǎng)物進(jìn)一步培養(yǎng)41小時(shí)，直至OD660達(dá)到66.8。在發(fā)酵13小時(shí)后，在34.5小時(shí)內(nèi)添加β-丙氨酸，其濃度為152.7g/570ml水。在發(fā)酵21.5小時(shí)后，在26小時(shí)內(nèi)添加10％氫氧化鈣溶液，從而穩(wěn)定pH。在41小時(shí)內(nèi)，定量添加3.43kg葡萄糖濃度為650.8g/l，鹽酸硫胺素濃度為35.7mg/l的M2-257培養(yǎng)基。
然后用Dr.Bruno Lange GmbH(Berlin，Germany)的LP1W型數(shù)字光度計(jì)在660nm的測(cè)量波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(OD)，所形成的右旋泛酸的濃度通過HPLC(Hypersil APS 25μm，250×5mm，RI檢測(cè))測(cè)定。
在47.5小時(shí)后，測(cè)定發(fā)酵樣品中右旋泛酸鈣的濃度為49.8g/l，濃度以右旋泛酸測(cè)定。
表1SKA培養(yǎng)基的成分
表2A1-102培養(yǎng)基的成分
表3M1-425培養(yǎng)基的成分
實(shí)施例2包括定量加入乙酸鈣溶液的右旋泛酸的鈣鹽的制備將大腸桿菌FV5069/pFV31菌株如實(shí)施例1所述在SKA搖瓶培養(yǎng)基(表1)中培養(yǎng)。然后將懸浮液以1∶100稀釋，將該稀釋液中的17.5ml懸浮液用于接種14升容量的攪拌的反應(yīng)器發(fā)酵罐(BBI，Germany，Melsungen，Biostat E Model)中的7kg A1-102培養(yǎng)基(表2)。
在37℃的溫度，0.5vvm的體積通氣，20％大氣飽和的氧分壓和pH6.5下將培養(yǎng)物培養(yǎng)15.5小時(shí)，直至OD660達(dá)到11.6。
在生產(chǎn)發(fā)酵罐(14升攪拌的反應(yīng)器發(fā)酵罐，BBI，Germany，Melsungen，Biostat ED型)中接種后，建立與實(shí)施例1所述相同的培養(yǎng)條件。將25％(重量)的乙酸鈣用于調(diào)節(jié)pH。24小時(shí)后完成用乙酸鈣替換氨水。發(fā)酵的總操作時(shí)間為52小時(shí)。在40小時(shí)內(nèi)定量加入3.4kg M2培養(yǎng)基。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，測(cè)定的右旋泛酸鈣的濃度為43.7g/l，濃度以右旋泛酸測(cè)定。
以此方式制備的產(chǎn)品的含量為42％(重量)，以右旋泛酸測(cè)定。
如上所述制備的產(chǎn)品的含量為64％(重量)，以右旋泛酸測(cè)定。
真空分離有機(jī)相后，得到含量為84％(重量)右旋泛酸鈣的晶體產(chǎn)品。
在進(jìn)一步的重結(jié)晶步驟中，成功地將含量提高到96％(重量)。
然后用(Dr.Bruno Lange GmbH(Berlin，Germany)的LP1W型數(shù)字光度計(jì)在660nm的測(cè)量波長(zhǎng)處測(cè)定光密度(OD)，所形成的右旋泛酸的濃度用HPLC(Hypersil APS 25μm，250×5mm，RI檢測(cè)器)測(cè)定。
54.5小時(shí)后，發(fā)酵樣品中右旋泛酸鎂的濃度為48.2g/l，濃度以右旋泛酸測(cè)定。
權(quán)利要求
1.從發(fā)酵肉湯制備右旋泛酸或含有右旋泛酸的混合物的堿土金屬鹽的方法，其特征在于a)在堿土金屬化合物的存在下進(jìn)行發(fā)酵；b)發(fā)酵完成后，將生物質(zhì)任選地全部或部分除去；c)濃縮這樣制備的發(fā)酵肉湯；以及d)以純品形式或以含有發(fā)酵肉湯成分的混合物的形式從發(fā)酵肉湯得到右旋泛酸的堿土金屬鹽。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于堿土金屬化合物的添加在右旋泛酸濃度為0.5-70g/l，優(yōu)選為5-35g/l時(shí)開始。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于加入發(fā)酵肉湯中的堿土金屬化合物和右旋泛酸的摩爾比為1∶0.5至1∶20，特別是1∶1.3至1∶10。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于在發(fā)酵過程中，將含堿土金屬的化合物分批或連續(xù)，單獨(dú)或以混合物，至少以與右旋泛酸形成相同的化學(xué)計(jì)量比加入發(fā)酵肉湯中。
5.如權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于加入一種或多種有機(jī)酸的鈣鹽，特別是富馬酸或天冬氨酸的鈣鹽。
6.如權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于將氫氧化鈣、氧化鈣、氧化鎂或氫氧化鎂用作堿土金屬化合物。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于a)將生物質(zhì)和含有右旋泛酸的堿土金屬鹽的發(fā)酵肉湯分離；b)濃縮無細(xì)胞的發(fā)酵肉湯；c)將親水有機(jī)溶劑加入這樣得到的濃縮物中；然后d)右旋泛酸的堿土金屬鹽結(jié)晶，若需要?jiǎng)t進(jìn)一步純化。
8.如前述權(quán)利要求之一項(xiàng)或多項(xiàng)所述的方法，其特征在于將右旋泛酸的一種或多種不同的堿土金屬鹽加入發(fā)酵肉湯的成分和含有右旋泛酸的一種或多種堿土金屬鹽的混合物中。
全文摘要
本發(fā)明涉及右旋泛酸的堿土金屬鹽的制備，其中在堿土金屬化合物的存在下進(jìn)行發(fā)酵。
文檔編號(hào)C12P13/00GK1427894SQ01808946
公開日2003年7月2日 申請(qǐng)日期2001年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月3日
發(fā)明者沃爾特·普費(fèi)弗爾, 烏爾里?！へ惪藸? 伊洛娜·瓦爾格, 邁克爾·賓德爾, 克勞斯－埃里西·烏夫曼, 喬治·蒂爾巴赫, 阿希姆·馬克思, 托馬斯·赫爾曼 申請(qǐng)人:德古薩股份公司