專利名稱：衍生自多能干細胞的肝細胞譜系細胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明一般涉及胚胎細胞和肝細胞的細胞生物學的領域。更具體的，本發(fā)明涉及人多能干細胞在特定培養(yǎng)條件下朝肝細胞譜系的細胞的定向分化。
相關申請的引用本申請要求美國臨時專利申請60/200,095，2000年4月27日提交；和美國實用新型申請09/718,308，2000年11月20日提交的優(yōu)先權。為了在美國的執(zhí)行，在此完整地引入優(yōu)選權申請以供參考。
背景技術：
肝臟疾病在全世界影響著數(shù)以百萬計的人。暴發(fā)性肝臟衰竭是肝功能迅速和災難性停止的臨床術語，通常導致在幾小時內(nèi)死亡。肝臟疾病的其它形式，例如慢性肝炎和肝硬化，涉及肝功能的隱伏和進行性的衰竭，具有生理上健康和長期預后的可怕效果。在美國，每年估計有300,000肝病例住院和30,000例死亡，而可供移植的捐獻肝臟只有4,500個。
健康的肝臟具有顯著的自我再生的能力—但是當該能力受損時，后果是可怕的?，F(xiàn)代醫(yī)學的一個重要挑戰(zhàn)是尋找一條補充再生的天然途徑，從而恢復病人的肝功能的方法。
進行了一些早期研究以鑒定小動物模型中的肝臟祖細胞。Ageili等(Histochem，J.29205，1997)，Brill等(Dig.Dis.Sci.44364，1999)和Reld等(美國專利5,576,207)提出了早肝臟祖細胞在胚胎和新生大鼠肝臟中擴增的條件。Michalopouloe等(Hepatology 2990，1999)報道了一種在生物學基質中培養(yǎng)大鼠肝細胞和非實質細胞的系統(tǒng)。Block等(J.Cell Biol.1321133，1996)發(fā)現(xiàn)了在合成培養(yǎng)基中，由生長因子組合誘導的肝細胞原代培養(yǎng)物的增殖、克隆生長和特定分化的條件。一段時間來已知大鼠肝細胞是從能分化成成熟肝細胞或膽表皮細胞的前體(有時稱為“肝母細胞”或“卵形細胞”)衍生出來的(L.E.Rogler，Am.J.Pathol.160591，1997；M.Alison，Current Opin.Cell Biol.10710，1998；Lazaro等，Cancer Res.58514，1998；Germaln等，Cancer Res.484908，1983)。
遺憾的是，未鑒定出重建治療用的人肝細胞的現(xiàn)成來源。歐洲專利申請EP 953633 A1提出了一種細胞培養(yǎng)方法和用于產(chǎn)生顯然來自人肝臟組織的增殖和分化的人肝臟細胞的培養(yǎng)基。在大多數(shù)人手中，在培養(yǎng)物中復制人肝細胞的能力是令人失望的。作為補救，提出了通過用SV40病毒的大T抗原轉染使肝細胞無限增殖(美國專利5,869,243)。
許多近來的發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生希望干細胞成為各種細胞類型和組織的來源，用于替換那些在疾病、感染或先天異常的過程中受損的細胞。各種類型的推定的干細胞隨著其分裂而分化，成熟為進行特定組織，例如心臟、肝臟或大腦的獨特功能的細胞。
特別重要的進展是從胚胎組織分離出兩類人多能干細胞。據(jù)信多能細胞能在體內(nèi)分化成大多數(shù)細胞類型(R.A.Pedersen，Scientif.Am.280(4)68，1999)。在小鼠中進行了胚胎干細胞的早期工作(Robertson綜述Math.Cell Biol.75173，1997；和Pederson，Reprod.Fertil.Dev.6543，1994)。然而證明猴和人的多能細胞脆弱得多，而且對小鼠胚胎細胞的相同培養(yǎng)條件沒有反應。僅在最近發(fā)現(xiàn)能體外獲得和培養(yǎng)的原代胚胎細胞。
Thomson等(美國專利5,843,780；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995)首先成功地從靈長類培養(yǎng)胚胎干細胞。它們?nèi)缓笱苌鰜碜匀伺吲莸娜伺咛ジ杉毎?hES)細胞系(Science 282114，1998)。Gerahart和同事從胎兒性腺組織衍生出入胚胎精細胞(hEG)(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9513726，1998和國際專利申請WO 98/43679)。hES和hEG細胞都具有長期尋求的人多能干細胞(hPS)特征；它們能在體外持續(xù)增殖而不分化，維持正常的核型，維持能分化產(chǎn)生所有成熟細胞類型的能力。
多能干細胞在培養(yǎng)物或畸胎瘤中的自發(fā)分化產(chǎn)生具有不同表型混合的細胞群，代表不同的細胞譜系的譜。在許多用途中，理想的是分化的細胞具有更均一的性質—在它們表達表型和能產(chǎn)生子代的類型方面。
因此，需要從靈長類尤其是從人的多能胚胎細胞中產(chǎn)生更均一化的細胞群的技術。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了一種有效產(chǎn)生從多能細胞分化肝母細胞譜系細胞的靈長類細胞的系統(tǒng)。獲得的這些細胞的培養(yǎng)物與未分化的細胞和傳送到其它組織類型的細胞相比，相對富含肝細胞的典型特征。
本發(fā)明的一個實施例是一種從分化的靈長類多能干細胞(pPS)獲得的細胞群，其形式是該群中顯著比例的細胞具有肝細胞譜系的細胞的特征。在說明書后文中列出了所需的特征。細胞可以顯示任何或所有下列α1-抗胰蛋白酶或白蛋白的抗體可檢測表達；不存在α-胎蛋白的抗體可檢測表達；以反向PCR擴增可檢測的水平表達無唾液酸糖蛋白受體；糖原儲藏的證據(jù)；細胞色素p450或葡萄糖-5-磷酸酶活性的證據(jù)；和肝細胞的形態(tài)特征。優(yōu)選的細胞群在該群中較大比例的細胞中具有多種這些肝細胞特征。應理解細胞可在分化期間和隨后的操縱中復制形成子代。這些子代在所有未明確排除的情況下也屬于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
通過使來自人胚泡的培養(yǎng)物獲得的胚胎干細胞(hES)得到示范性細胞。通過在含有干細胞分化劑，例如正丁酸或其它文獻中描述的分化劑的生長環(huán)境中培養(yǎng)pPS細胞產(chǎn)生分化的細胞?？芍苯訉⒎只瘎┘拥胶虿缓曫B(yǎng)細胞的未分化pPS細胞培養(yǎng)物中。另外，使pPS細胞分化成混合的細胞群(例如通過形成胚狀體或通過培養(yǎng)物過度生長)，在混合群中加入分化劑。出現(xiàn)較少均一的群，其中有相當比例的細胞具有所需的表型。在一些情況下，培養(yǎng)方法還包括肝細胞成熟因子，例如文獻中舉例的那些，它們包括二甲基亞砜(DMSO)，F(xiàn)GF、EGF和肝細胞生長因子，以及糖皮質激素樣地塞米松。
本發(fā)明的另一個實施例是一種分化的細胞，具有肝細胞譜系的細胞的特征，它是從本發(fā)明的分化的細胞群收集的或是從該群收集的細胞的子代。例子是一種分化的細胞，它是通過提供一種在基本無飼養(yǎng)細胞的生長環(huán)境中的人多能干細胞(hPS)產(chǎn)生的；在含有肝細胞分化劑的培養(yǎng)基中，在產(chǎn)生富含具有肝細胞特征的細胞的細胞群的條件下，培養(yǎng)該hPS細胞；隨后從富集的細胞群中收集分化的細胞。
本發(fā)明的另一個實施例是一種處理人多能干細胞(hPS)，以獲得能在體外培養(yǎng)物中維持的分化的細胞的方法，該方法是提供一種hPS細胞的培養(yǎng)物，在含有肝細胞分化劑的培養(yǎng)基中的基質上，允許分化的細胞富集的條件下培養(yǎng)細胞。用于該方法的有益技術和試劑在下文中公開。在本發(fā)明中還體現(xiàn)的是一種根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的分化的細胞，特別是那些具有肝細胞譜系特征的細胞。
本發(fā)明的另一個實施例是一種篩選或調節(jié)肝細胞毒性的化合物的方法，包括使本發(fā)明的分化的細胞接觸，并檢測得到的細胞中任何表型或代謝變化。本發(fā)明的另一個實施例是使一種液體解毒，例如血液的方法，包括在允許細胞去除或改變液體中的毒素的條件下，本發(fā)明的分化的細胞與液體接觸。在這方面，公開內(nèi)容中所述的分化的細胞可用作肝臟支持裝置的一部分，或治療性施用以在體內(nèi)重建肝細胞功能。
本發(fā)明的這些和其它實施例根據(jù)下面的描述將變得明白。
附1是相差光學顯微照片(4X、10X、20X)的半色調復制。右側來自人多能胚胎肝干細胞(hES)的胚狀體在肝細胞分化劑正丁酸鹽中培養(yǎng)2天。得到的細胞顯示均一的形態(tài)。左側，在僅含培養(yǎng)基的血清(PBS)中培養(yǎng)的胚狀體細胞。細胞的不均一小塊顯示許多不同細胞類型的形態(tài)。
圖2是相差光學顯微照片(上兩欄10X、其它欄20X)的半色調復制。這些是與正丁酸鹽培養(yǎng)6天的分化的細胞。細胞明顯具有成熟肝細胞的特征。在視野中的細胞具有雙核并且是多邊形的，表達通過免疫染色或反向PCR檢測到的成熟肝細胞的標記。
圖3是半色調復制，顯示一些細胞特異性標記(右側)的免疫組織化學染色的結果，與同一視野中細胞核的位置(二苯酰亞胺染色，左側)比較。圖3A(40X)顯示成年人肝細胞的結果；圖3B(20X)顯示用正丁酸鹽培養(yǎng)6天的分化的hES細胞結果。兩個培養(yǎng)物都顯示高比例的對白蛋白、α1-抗胰蛋白酶和CD18(三個肝細胞譜系特征性標記)染色陽性的細胞，和α-胎蛋白(較不成熟細胞的標記)陰性。
圖4是用高碘酸Schiff染色細胞檢測糖原存在的半色調復制(10X和40X)。與約80％胎肝細胞(中部)和成纖維細胞系基本無(底部)相比，約60％的丁酸鹽處理的細胞(頂部)顯示糖原儲藏的證據(jù)。
圖5是相差光學顯微照片(10X，40X)的半色調復制，顯示在示范性分化和成熟過程中不同時間的細胞。A列顯示在含有5mM正丁酸鈉的SR培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后的細胞。培養(yǎng)物中80％以上的細胞直徑大，含有大核和顆粒狀胞質。5天后，細胞被轉移到特制的肝細胞培養(yǎng)基(HCM)中。B和C列顯示在HCM中培養(yǎng)2天或4天后的狀態(tài)。多核化多邊形細胞是常見的。用這些條件，衍生自ES的細胞類似新鮮分離的人成年肝細胞(D列)和胎兒肝細胞(E列)。
圖6是柱狀圖，顯示細胞色素P450酶1A1和1A2(CYP1A1/2)的活性。用5μm甲基膽蒽(methylchloranthrene，MC)培養(yǎng)誘導酶，然后用乙氧試鹵靈(ethoxyresorufin)測定。在衍生自ES細胞的H1細胞系和衍生自H9品系的的兩個肝細胞譜系中檢測CYPlA1/2活性?；钚缘乃匠^在兩個新鮮分離的人成年肝細胞(HH)制備物中觀察到的水平。未分化的H1和H9細胞和BJ胚胎成纖維細胞中的活性可忽略不計。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種從靈長類來源的多能干細胞制備肝細胞譜系的分化細胞的系統(tǒng)。
已發(fā)現(xiàn)當多能干細胞在肝細胞分化劑存在下培養(yǎng)時，衍生出一群細胞，它們是具有顯著高比例的具有培養(yǎng)的肝細胞表型特征的細胞?？扇芜x的，該效果可通過再在肝細胞成熟因子存在下培養(yǎng)細胞而增強。由于多能干細胞可在培養(yǎng)物中增殖一年或更長(超過300次群體倍增)，本公開中描述的發(fā)明提供了幾乎無限的肝細胞樣細胞來源，適合各種開發(fā)和治療的目的。
圖2顯示已通過與表型肝細胞分化劑正丁酸鹽一起培養(yǎng)分化的細胞的相差光學顯微照片。細胞顯示相同的肝細胞特征，包括多邊形，顯示白蛋白，α1-抗胰蛋白酶(AAT)和無唾液酸糖蛋白受體的特征性表型標記，而缺少α-胎蛋白。細胞已在含有丁酸鹽的培養(yǎng)基中維持了1-3周。
鑒于組蛋白去乙酰酶抑制劑類的丁酸鹽和曲古抑菌素A已用于分化各式各樣的細胞類型的事實，該發(fā)現(xiàn)是驚人的。由因及果，預測丁酸鹽將驅動多能干細胞群分化成各種不同的群體，例如不用飼養(yǎng)細胞或在視黃酸存在下培養(yǎng)胚胎干細胞得到的結果是合理的。與該預測相反，獲得了顯著均一的肝細胞譜系的群體。
這代表了在人多能干細胞群體分化中的一個重要的新范例。就我們所了解，還沒有公開報道關于從任何類型的胚胎干細胞獲得這種相同的肝細胞品譜系的群體。
Gladhaug等(Cancer Res.486580，1988)，Engelmann等(In vitro Cell.Dev.Biol.2386，1987)，Staecker等(J.Physiol.135367，1988；Arch.Biochem.Biophys.261291，1988；和Biochem.Biophys.Res.commun.14778，1987)研究了丁酸鹽對原代肝細胞培養(yǎng)物中的DNA合成和標記表達的作用。Salto等(Int.J.Cancer 48291，1991)和Yoon等(Int.J.Artif.Organs 22769，1999)研究了丁酸鹽對人肝細胞系的作用。Pack等(Exp.Cell Res.204198，1993)和Germain等(Cancer Res.46368，1988)研究了丁酸鹽對大鼠卵形細胞(肝細胞前體)的作用。Niki等(Hepatology 29858，1999；和歐洲專利申請EP 9837742 A1)研究了曲古抑菌素A對原代培養(yǎng)物中大鼠肝臟星狀細胞的作用。Blouin等(Exp.Cell Res.2122，1995)研究了丁酸鹽對胚胎大鼠肝臟上皮細胞(對肝細胞和膽上皮的雙向潛能性)的作用。Coleman等(J.Cell.Physiol.161463，1994)研究了丁酸鹽對培養(yǎng)的大鼠肝臟上皮細胞前體的作用。L.E.Rogler(Am.J.Pathol.150591，1997)報道了用DMSO或丁酸鈉處理小鼠肝母細胞系誘導迅速的肝細胞分化。Watkins等(J.Dairy Res.66559，1999)報道了丁酸還能誘導人肝臟腫瘤細胞的凋亡。所有這些研究涉及成熟肝細胞、轉化的肝臟細胞或定型的肝細胞前體細胞。
已顯示丁酸鹽對各種其它細胞類型在培養(yǎng)物和體內(nèi)都具有分化和調節(jié)作用。Kosugi等(Leukemia 131316，1999)和Tamagawa(Biosci.Biotechnol.Biochem.521483，1998)報道組蛋白去乙酰酶抑制劑是急性髓樣白血病細胞中分化的強誘導劑。Davis等(Biochem J.346，第二部分455，2000)和Rivero等(Biochem.Biophys.Res.Commun.248664，1998)討論了丁酸鹽在成紅細胞分化中的作用。Perrine等(Am.J.Pediatr.Hematol.Oncol.1567，1994)和Perrine等(N.Engl.J.Med.32881，1993)提出了丁酸鹽衍生物作為在β-珠蛋白障礙中刺激胎珠蛋白產(chǎn)生的藥物。Tal等(Hematol.Oncol.14181，1996)分析了嗜曙紅粒細胞的丁酸鹽分化的作用。
美國專利5,763,255報道了誘導上皮細胞分化的方法，其中在干燥的天然纖維膠原細胞培養(yǎng)物基質上的未分化的細胞中加入5mM丁酸。Yamads等(Biosci.Biotech.Biochem.551261，1992)研究了丁酸鹽對三種成纖維細胞和兩種上皮細胞系的作用。Jeng等(J.Periodontal.701435，1999)研究了丁酸鹽和丙酸鹽對培養(yǎng)的齒齦成纖維細胞的作用。Devereux等(Cancer Res.596087，1999)報道了用曲古抑菌素A處理人成纖維細胞系誘導細胞表達端粒酶反轉錄酶。Yabushita等(Oncol.Res.5173，1993)研究了丁酸鹽、DMSO和二丁?；鵦AMP對卵巢腺癌細胞的作用。Graham等(J.Cellular Physiol.13663，1988)報道了丁酸鈉誘導乳腺癌細胞系的分化。Kamitani(Arch.Biochem.Biophys.36845，1999)，Slavoshian等(Gut 46507，2000)和Reynolds等(Cancer Lett.1153，1998)研究了丁酸鈉和曲古抑菌素A對人腸上皮細胞和結腸癌細胞的增殖和分化的作用。McBain等(Biochem.Pharmacol.531367，1997)報道了腺癌細胞系中的凋亡可以通過丁酸鹽和其它組蛋白去乙酰酶抑制劑誘導。
Rocchi等(Anticancer Res.181099，1998)和Mateul等(Brain Res.843112，1999)報道了丁酸鹽類似物在人成神經(jīng)細胞瘤細胞中對增殖、分化和誘導兒茶酚胺合成的作用。Gillenwater等(Head Neck 2247，2000)研究了丁酸鈉對鱗狀癌細胞系的作用。Buommino等(J.mol.Endocrinol.)研究了丁酸鹽對精囊上皮細胞的作用。Sun等(Lipids 32273，1997)研究了神經(jīng)膠質瘤細胞的丁酸鹽誘導的分化。Wang等(Exp.Cell.Res.19827，1992)研究了正丁酸鹽對正常人角質形成細胞分化的作用。Porez等(J.Surg.Res.781，1998)報道了丁酸鹽上調Kupffer細胞的PGE2生產(chǎn)和調節(jié)免疫功能.Schultz等(J.Exp.Zool.(Mol.Dev.Evol.)286276，1999)發(fā)現(xiàn)用組蛋白去乙酰酶抑制劑處理2-細胞胚胎重新調整了一些基因的表達.Chen等(Proc.Natl.Acad.Sci.945796，1997和PCT申請WO97/47307)報道了用組蛋白去乙酰酶抑制劑重新激活病毒轉導的基因。Simon等(Regul.Pept.70143，1997)研究了丁酸鹽對誘導胰島細胞分化的作用，導致胰島素生產(chǎn)的增加。
由于丁酸鹽和相關的化合物促進大量的不同細胞類型的分化，人們會預料到處理衍生自多能胚胎細胞的混合細胞群將導致該群中的每一個細胞沿著已確定的路線分化-僅得到更成熟的混合細胞群。不能預計到丁酸鹽處理將得到相同的細胞群-或這些細胞將變成何種組織類型。
本發(fā)明涉及該驚人的發(fā)現(xiàn)，即用丁酸鹽(或另一種肝細胞分化因子，下文詳述)培養(yǎng)胚胎多能細胞，產(chǎn)生具有顯著高比例的肝細胞表型特征的細胞的細胞群。
用分化因子培養(yǎng)多能細胞的常見結果是80％以上的細胞在開始的24小時內(nèi)從培養(yǎng)物中丟失。培養(yǎng)幾天后出現(xiàn)的是主要具有肝細胞譜系特征的細胞群，例如多邊形雙核表型，α1-抗胰蛋白酶和白蛋白，和代謝上重要的酶活性的表達，例如細胞色素P450酶1A1和1A2。不受本發(fā)明實施的限制，假定丁酸鹽和其它分化因子幫助誘導細胞變?yōu)楦渭毎V系，或優(yōu)選促進肝細胞譜系的細胞存活，或具有這兩種作用的組合。
下面進一步描述該培養(yǎng)系統(tǒng)如何用于從靈長類來源的多能胚胎干細胞產(chǎn)生肝細胞譜系細胞。描述了肝細胞分化劑(舉例說明但不限于正丁酸鹽)和促進肝細胞譜系細胞在培養(yǎng)物中產(chǎn)生的其它培養(yǎng)系統(tǒng)的特征。
由于多能胚胎干細胞可基本上無限生長，該系統(tǒng)提供了肝細胞樣細胞在研究、藥物開發(fā)和肝臟疾病的治療中的無限的來源。
定義可使用術語“肝細胞譜系”細胞、“肝胚樣細胞”和“肝胚胎樣細胞”，指本發(fā)明的分化的細胞，它們是用所述方法分化多能細胞獲得的。分化的細胞至少具有一種已知肝細胞前體細胞、肝母細胞和肝細胞的各種有區(qū)別的表型特征，如在本公開下文中的那樣。通過使用這些術語，對于細胞表型、細胞標記、細胞功能或增殖能力不暗示特定的限制，除非有明確的需要。
“肝細胞前體細胞”或“肝細胞干細胞”是一種細胞，它能夠在合適的環(huán)境條件下增殖并進一步分化肝母細胞。這些細胞偶爾具有能產(chǎn)生其它類型的子代，例如卵形細胞，膽管上皮細胞或其它肝細胞前體細胞的能力。
“肝細胞分化劑”和“肝細胞成熟因子”是在本公開內(nèi)容中使用的兩個具有不同意義的術語，代表可用于制備和維持本發(fā)明的分化細胞的化合物的集合。下面的章節(jié)中進一步描述和舉例說明了這些試劑。術語不意味著暗示特定的模式或作用的時間，也不涉及這些限制。“肝細胞增殖因子”是一種促進肝細胞和/或肝細胞前體細胞增殖的生物或合成的化合物(肽、寡糖等)。
原型“靈長類多能干細胞”(pPS細胞)是在受精后的任何時間衍生自前胚胎、胚胎或胎兒組織的多能細胞，并且具有在正確條件下產(chǎn)生多種不同細胞類型的子代的能力。如本公開的目的所限定的，根據(jù)標準的本領域已接受的試驗，例如在合適的宿主中形成畸胎瘤的能力，pPS細胞能產(chǎn)生作為全部三種胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的衍生物的子代。
pPS細胞的非限制性例子是人胚胎干細胞(hES)細胞，如Thomson等，Science2821145，1998；其它靈長類的胚胎干細胞，例如Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995所述的Rhesus干細胞；和人胚胎生殖細胞(hEG細胞)，Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513726，1998所述。該術語也描述了其它類型的非惡性多能細胞。特別是，包括完全多能(能產(chǎn)生全部三種胚層的衍生物的子代)的任何靈長類的細胞，不論它們是否衍生自胚胎組織、胎兒組織或其它來源。
當顯示能將其與胚胎或成年人來源的分化細胞清楚地區(qū)別開的形態(tài)時，pPS細胞培養(yǎng)物是“基本未分化的”。pPS細胞通常具有高的核/胞質比，顯著的核，和很難辨別的細胞接頭形成緊密的集落，容易被本領域技術人員識別。未分化細胞的集落可以被周圍的分化的細胞包圍。另外，在適當?shù)臈l件下培養(yǎng)時，基本未分化的集落將繼續(xù)存在，且未分化的細胞在培養(yǎng)細胞傳代后占增殖細胞的很大比例。含有任何比例的具有這些條件的未分化pPS的細胞群可用于本發(fā)明。被描述成基本未分化的細胞培養(yǎng)物通常含至少約20％、40％、60％、80％未分化的pPS，按照提高的優(yōu)選的次序。
“飼養(yǎng)細胞(feeder cell)”或“飼養(yǎng)細胞(feeders)”是術語，用于描述與第二類型的細胞共同培養(yǎng)的一種類型的細胞，以提供第二種類型的細胞可維持，且可能增殖的環(huán)境。飼養(yǎng)細胞可任選自與其支持的細胞不同的物種。例如，可用小鼠胚胎成纖維細胞(來自原代培養(yǎng)物或端?；废?或人成纖維細胞樣或間充質細胞(例如可分化并選自hES細胞的)支持的一些pPS細胞。通常(但不一定)，通過輻射或用抗有絲分裂劑，例如絲裂霉素C處理滅活飼養(yǎng)細胞，以防止其生長超過它們支持的細胞。
如果細胞在新的培養(yǎng)環(huán)境中已傳代且未加入新鮮的飼養(yǎng)細胞，pPS細胞群被稱為是“基本無”飼養(yǎng)細胞。認識到如果先前用含有飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物作為pPS來源用于傳代，將有一些飼養(yǎng)細胞在傳代中存活下來。例如，hES細胞通常在9.6cm2孔中，在接近匯合的約375,000個初次輻照過的胚胎成纖維細胞上培養(yǎng)。在下一次傳代時，或許150,000個飼養(yǎng)細胞仍然存活，分裂并與hES一起傳代，后者增殖到約1-1.5×106的數(shù)量。在1∶6分裂后，hES細胞通常繼續(xù)增殖，但成纖維細胞不生長，僅一小部分在培養(yǎng)約6天結束時存活。該培養(yǎng)物“基本無”飼養(yǎng)細胞，組合物含有少于約5％飼養(yǎng)細胞，更優(yōu)選少于1％、0.2％飼養(yǎng)細胞的組合物。
“生長環(huán)境”是一種感興趣的細胞將體外增殖的環(huán)境。環(huán)境特征包括細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、溫度、O2和CO2的分壓和如果存在支持結構(例如固體表面上的底物)。
“營養(yǎng)培養(yǎng)基”是用于培養(yǎng)細胞的含有促進增殖的營養(yǎng)物的培養(yǎng)基。營養(yǎng)培養(yǎng)基可含有任何下列合適的組合等滲鹽水、緩沖液、氨基酸、抗生素、血清或血清替換物、和外源加入的因子。
“條件培養(yǎng)基”是通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)第一群細胞，然后收集培養(yǎng)基制備的。條件培養(yǎng)基(和細胞分泌到培養(yǎng)基中的任何東西)然后可以用于支持第二群細胞的生長。
用于該公開的術語“抗體”指多克隆和單克隆抗體。術語的范圍有意不僅包含完整的免疫球蛋白分子，還包括免疫球蛋白分子的片段和衍生物(例如單鏈Fv構建物、二價抗體和融合構建物)，如本領域已知的技術制備的，并維持所需的抗體結合特異性。
“限制性發(fā)育譜系細胞”是衍生自胚胎組織的細胞，通常是通過pPS細胞的分化衍生的細胞。這些細胞能增殖和分化成幾種不同的細胞類型，但是其子代的表型范圍有限。例子包括造血細胞，它是血細胞型的多能細胞；神經(jīng)前體，它可產(chǎn)生神經(jīng)膠質細胞前體，發(fā)展成少突膠質細胞；神經(jīng)元限制細胞，它發(fā)展成各種類型的神經(jīng)元；和肝細胞前體，它對于肝細胞和有時其它類型的肝臟細胞，例如膽管上皮是多能的。
一般技術為了進一步詳細描述本發(fā)明實踐中使用的一般技術，實施人可引用細胞生物學、組織培養(yǎng)和胚胎學中的標準教科書和綜述。包括《Teratocarcinoma & EmbryonicStem CellA Practical Approach》(E.J.Robertson編，IRL Press Ltd，1987)；《Guide to Techniques in Mouse Development》(P.M.Wasserman等編，AcademicPress 1993)；《Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro》(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225900，1993)；《Properties and uses of Embryonic Sten CellsProspects for Application to Huamn Biology and Gene Therapy》(P.D.Rathjen等，1993)。與肝細胞譜系的細胞有關的一般信息可在《Live Stem Cells》中找到(S.Seil & Z.Ilic，R.G.Landes Co.，1997)，Stem Cell Biology(L.M.Reid，Curr.Opinion Cell Biol.2121，1990)，和Liver Stem Cells(J.W.Grisham，pp232-282于(Stem Cells)，Academic Press，1997)。在藥物研究中使用肝細胞樣細胞《In Vitro Methods in Pharmaceutical Research》(Academic Press，1987)中有所描述。
分子遺傳學和基因工程中的方法一般在《分子生物學實驗室手冊》(《Molecular CloningA Laboratory Mannual》)，第二版(Sambrook等，1989)；《0ligonucleotide Synthesis》(M.J.Gait編，1984)；《Animal Cell Culture》(R.I.Freshney編，1987)；《the series Methods in Enzymology》(Academic Press，Inc.，)；《Gens Transfer Vectors for Mammalian Cells》(J.M.Miller&M.P.Calos編，1987)；《Current Protocols in Molecular Biology》and《Short protocolsin Molecular Biology》，第三版(F.M.Ausubel等編，1987 & 1995)；和《RecombinantDNA Methodology II》(R.Wu編，Academic Press，1995)中有所描述。本公開中引用的試劑、克隆載體和基因操縱的試劑盒購自供貨商例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTech和Sigma Chemical Co.等。
用于產(chǎn)生，純化和修飾抗體的一般技術，和包括免疫組織化學的免疫測定的設計和執(zhí)行，讀者可參見Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir & C.C.Blackwell編)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等編，1991)；和Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff，W.H.albert和N.A.Staines編，WeinheimVCH Verlags GmbH，1993)。
培養(yǎng)基和飼養(yǎng)細胞分離和繁殖pPS細胞的培養(yǎng)基具有幾種不同配方，只要獲得的細胞具有所需的特征，可以進一步繁殖。合適的來源如下Dulbecco的改良Eagles培養(yǎng)基(DMEM)，Gibco #11965-092；剔除Dulbecco的改良Eagles培養(yǎng)基(KO DMEM)，Gibco#10829-018；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco11140-050；β-巰基乙醇，Sigma#M7522；人重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，Gibco #13256-029。示范性含血清的ES培養(yǎng)基是用60％ DMEM(通常是KO DMEM)、20％未熱滅活的限定性胎牛血清(FBS)、1％非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mMβ-巰基乙醇制備的。無血清的ES培養(yǎng)基是用60％KO DMEM、20％血清替代物、0.1mM非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mM β-巰基乙醇制備的。不是所有的血清替代物都可以用；一種有效的血清替代物是Gibco #10828-028。對于增殖多能干細胞中無血清培養(yǎng)基的信息出版在國際專利出版物WO97/47734(Pedersen，U.California)和WO 98/30679(Price等，LifeTechnologies)。過濾培養(yǎng)基，儲藏在4℃不超過2周。在使用前，加入最終濃度為4ng/ml的人bFGF(Bodnar等，Geron Corporation，國際出版物WO99/20741)。
pPS細胞通常在一層以各種方式，例如產(chǎn)生促進pPS存活或增殖，或抑制分化的可溶性因子支持pPS細胞的飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)。飼養(yǎng)細胞通常是成纖維細胞類型的細胞，通常衍生自胚胎或胎兒組織。飼養(yǎng)成纖維細胞的常用來源是小鼠胚胎。飼養(yǎng)細胞鋪板至接近匯合，輻射防止增殖，用于支持pPS細胞培養(yǎng)。
在飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)pPS細胞的一個例子中，從遠系繁殖的CF1小鼠(獲自SASCO)或其它合適品系獲得小鼠胚胎成纖維細胞(mEF)。用70％乙醇擦拭妊娠13天的小鼠腹部，將蛻膜移到磷酸緩沖鹽水(PBS)中。收集胚胎；除去胎盤、膜和軟組織；用PBS洗滌尸體兩次。然后將其轉移到新鮮的含2ml胰蛋白酶/EDTA的10厘米培養(yǎng)皿中，精細切碎。37℃培育5分鐘后，用含有10％FBS的5ml DMEM滅活胰蛋白酶，將混合物轉移到15ml錐形管中，并分離。使碎片沉淀2分鐘，上清液占終體積10ml，鋪在10厘米組織培養(yǎng)板或T75燒瓶中。燒瓶靜置培養(yǎng)24小時，然后替換培養(yǎng)基。當燒瓶匯合(約2-3天)，細胞1∶2分到新燒瓶中。
飼養(yǎng)細胞在含有90％DMEM(Gibco#11965-092)、10％FBS(Hyclone#30071-03)和2mM谷氨酰胺的mEF培養(yǎng)基中繁殖。mEF在T150燒瓶(Corning#430825)中繁殖，用胰蛋白酶每隔1天將細胞一分為二，保持細胞亞匯合，當需要時任選冷凍。為了制備飼養(yǎng)細胞層，用一定劑量輻照細胞來抑制增殖，但允許合成重要的支持hES細胞的因子(約4000拉德γ-輻射)。通過用37℃培育過夜的1ml0.5％明膠/孔鋪6孔培養(yǎng)板(例如Falcon#304)，每孔鋪375,000個輻射過的mEF。鋪板后5小時-1周使用飼養(yǎng)細胞層。用新鮮hES培養(yǎng)基在接種pPS細胞前替換培養(yǎng)基。
靈長類多能干細胞(pPS)的制備可從靈長類物種成員的成纖維細胞分離胚胎干細胞(Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995)。可使用Thomson等(美國專利5,843,780；Science2821145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38133ff.1998)描述的技術從人成纖維細胞制備人胚胎干細胞(hES)。
為了獲得人成纖維細胞，可用體內(nèi)預植入胚胎或體外受精(IVF)的胚胎，或單細胞的人胚胎可以擴張到胚泡階段(Bongso等，Hum Reprod 4706，1989)。簡單地說，人胚胎在G1.2和G2.2培養(yǎng)基中培養(yǎng)到胚泡階段(Gardner等，F(xiàn)ertil.Steril.6984，1998)。發(fā)育的胚泡可選擇用于ES細胞的分離。通過簡單接觸鏈霉蛋白酶(Sigma)從胚泡除去透明帶。用免疫手術分離內(nèi)細胞團，其中胚泡接觸1∶50稀釋的家兔抗人脾細胞抗血清30分鐘，然后用DMEM洗滌3次，每次5分鐘，接觸1∶5稀釋的豚鼠補體(Gibco)3分鐘(見Solter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA725099，1975)。再用DMEM洗滌2次后，從完整的內(nèi)細胞團通過溫和吸取除去裂解的滋養(yǎng)外胚層細胞，將ICM鋪在mEF飼養(yǎng)細胞層上。
9-15天后，內(nèi)細胞團衍生的長出物通過接觸無鈣和鎂的磷酸緩沖鹽水(PBS)和1mM EDTA，通過接觸分散酶或胰蛋白酶；或通過用微量滴管機械解離成團；然后重新鋪在新鮮培養(yǎng)基中的mEF上。解離的細胞重新鋪在新鮮ES培養(yǎng)基中的mEF飼養(yǎng)細胞層上，并觀察集落形成。顯示未分化形態(tài)的集落分別是通過微量滴管、機械分解離成團，和重新鋪板選擇的。ES-樣形態(tài)的特征是密集的集落具有高的核/胞質比和顯著的核仁。
人胚胎生殖細胞(hEG)可以從存在于最后一次月經(jīng)后的8-11周的人胎兒材料的原生殖細胞制備。合適的制備方法如Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9513726，1998和國際專利申請WO 98/43679中所述。
簡單地說，用等滲緩沖液漂洗生殖嵴，然后置于0.1mL 0.05％胰蛋白酶/0.53mMEDTA鈉溶液(BRL)中，切成＜1mm3的塊。然后用100微升移液管尖吸取組織，進一步分解細胞。37℃保溫約5分鐘，然后加入約3.5mL EG生長培養(yǎng)基。EG生長培養(yǎng)基是DMEM、4500mg/L D-葡萄糖、2200mg/L mM碳酸氫鈉；15％ES合格的胎牛血清(BRL)；2mM谷氨酰胺(BRL)；1mM丙酮酸鈉(BRL)；1000-2000U/ml人重組白血病抑制因子(LIF，Genzyme)；1-2ng/ml人重組堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，Genzyme)；和10μM弗司扣林(在10％DMSO中)。
預先用在無LIF、bFGF或弗司扣林的改良EG生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天亞匯合的飼養(yǎng)細胞層制備96孔組織培養(yǎng)板，然后用5000拉德γ-輻射滅活。合適的飼養(yǎng)細胞是STO細胞(ATCC登錄號CRL 1503)。在各孔中加入約0.2ml原生殖細胞(PGC)懸液。在EG生長培養(yǎng)基中7-10天后進行第一次傳代，將各孔轉移到24孔培養(yǎng)皿的一個孔中，該孔先前用輻射過的STO小鼠成纖維細胞制備。
未分化的pPS細胞具有特征性形態(tài)特點，具有高的核/質比，顯著的核仁，和很難辨別的細胞接頭形成緊密的集落。需要獲得具有“正常核型”的細胞，意味著細胞是整倍體，其中所有人染色體是存在的，沒有明顯的改變。該特征在任何隨后衍生和增殖的分化細胞中也是理想的。
可用免疫組織化學或流式細胞術計數(shù)，使用SSEA1、SSEA-3和SSEA-4國立兒童健康和人類發(fā)育研究所發(fā)育研究雜交瘤庫(Development Studies HybridomaBank，National Institute of Child Health and Human Development，BethesdaMD)和TRA-1-60和TRA-1-81(Andrews等，in E.J.Robertson編，Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cells.IRL Press，207-246，1987)的抗體鑒定特征性胚胎抗原。SSEA-1標記通常在hES細胞中很少或不存在，但存在于hEG細胞中。細胞體外分化通常導致SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的喪失，及SSEA-1的表達提高。pPS細胞的特征還有堿性磷酸酶活性的存在，它可以通過用Vector Red作為底物(Vector Laboratories，Burlingame CA)顯色固定的細胞未檢測，并用羅丹明濾膜系統(tǒng)檢測產(chǎn)物的紅色熒光。
可通過在8-12周齡的雄性SCID小鼠的后腿肌肉中注射約0.5-10×108個細胞，確定胚胎干細胞的多能性。得到的腫瘤可在8-16周發(fā)展時固定在4％聚甲醛中，石蠟包埋后組織學檢測。顯示所有三個胚層的組織，例如軟骨、平滑肌或橫紋肌(中胚層)；具有毛囊的復層鱗狀上皮、具有心室、中間物或套層的神經(jīng)管(外胚層)；和纖毛柱狀上皮和通過吸收性腸細胞排列的絨毛或分泌粘液的杯狀細胞(內(nèi)胚層)的畸胎瘤產(chǎn)生。
pPS細胞的增殖胚胎干細胞可在營養(yǎng)培養(yǎng)基的飼養(yǎng)細胞層上培養(yǎng)。常規(guī)每1-2周通過簡單胰蛋白酶消化，接觸Dulbecco’s PBS(不含鈣或鎂，含有2mM EDTA)，接觸分散酶或IV型膠原酶(1mg/ml；Gibco)或用微量移液管選擇單集落分開ES細胞。約50-100個細胞的簇大小是最佳的。另外，在與蛋白酶培育后，刮下培養(yǎng)物，分解離成小簇，并以1∶3-1∶30的分散比重新接種到新鮮飼養(yǎng)細胞上。
胚胎干細胞在飼養(yǎng)細胞上培養(yǎng)，每天更換生長培養(yǎng)基，直到出現(xiàn)形態(tài)與EG細胞一致的細胞，通常是7-30天，1-4次傳代。細胞在幾個月的培養(yǎng)中維持其多能性。
國際專利申請WO 99/20741描述了在不存在飼養(yǎng)細胞的條件下，在含有營養(yǎng)培養(yǎng)基的胞外基質上培養(yǎng)多能干細胞的方法和材料。合適的是來自許多來源的裂解的成纖維細胞或分離的基質成分制備的成纖維細胞基質。營養(yǎng)培養(yǎng)基可含有丙酮酸鈉、核苷酸和一種或多種內(nèi)源加入的生長因子，例如bFGF，還可以通過與成纖維細胞一起培養(yǎng)調理。
在不存在飼養(yǎng)細胞的情況下，適合pPS增殖的基質包括胞外基質成分，例如Matrigel(Becton Dickenson)或層粘連蛋白。Matrigel是在室溫膠凝形成重建的基底膜的Engelbreth-Holm-Swarm腫瘤細胞的細胞外基質的可溶性制劑。為了避免存在于膜中的生長因子(例如TGF-1、TGF和PDGF)的影響，可使用減少生長因子的Matrigel?？赏ㄟ^制備所有成分的人工混合物，省去依次測定效果的成分來鑒定基質的關鍵成分。胞外基質成分的其它混合物也是合適的。例子包括膠原、纖連蛋白、蛋白聚糖、ontactin、硫酸乙酰肝素等的各種組合。
然后將多能細胞以合適的分布涂布在底物上，在促進細胞生存、繁殖和維持所需特征的培養(yǎng)基上有在。所有這些特征是由于仔細留意接種分布獲得的。分布的一個特征是鋪板密度。發(fā)現(xiàn)至少約15,000個細胞cm-2的鋪板密度促進生存和限制分化。通常使用約90,000-170,000cm-2之間的鋪板密度。
另一種特征是細胞的分散。小鼠干細胞的繁殖涉及細胞分散在單細胞懸液中(Robinson，Meth.Mol.Biol.75173，1997，177頁)。相反，在不存在飼養(yǎng)細胞的情況下pPS細胞的傳代獲得了制備小簇的pPS細胞的益處。通常，在細胞變得完全分散前停止酶消化(即用膠原酶IV約5分鐘)。然后用移液管溫和地刮平板，用移液管研碎細胞，直到它們作為粘著細胞的簇懸浮，大小約10-2000個細胞。然后直接將簇鋪到底物上，而不進一步分散。
還發(fā)現(xiàn)在無新鮮的飼養(yǎng)細胞的情況下，pPS細胞可以受益于在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基通常含有提高細胞存活的常見成分，包括等滲緩沖液，必需礦物質和血清或某種血清替代品。還有利的是經(jīng)過調理的培養(yǎng)基，供給一些飼養(yǎng)細胞提供的元素?？赏ㄟ^在無血清培養(yǎng)基，例如在加了20％血清替代品和4ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的血清替代培養(yǎng)基(如KO DMEM)中以5×105細胞/9.6cm2孔的密度培養(yǎng)輻照過的原代小鼠胚胎成纖維細胞(或其它合適的細胞制備物)制備條件培養(yǎng)基。在37℃1天后收集培養(yǎng)物上清液，通常補充有益于pPS細胞生長的其它生長因子。對于hES，通常使用bFGF等生長因子。對于hEG，培養(yǎng)基可補充bFGF等生長因子，gp130的誘導物，例如LIF或(制瘤素-M)和可能提高cAMP水平的因子，例如各種類型的pPS細胞可受益于培養(yǎng)基中的其它因子。
用這些技術中的幾種技術增殖的細胞通常在許多個月的多次傳代中維持基本不分化。認識到在某些傳代期間，集落邊緣周圍的一些細胞可能分化(特別是當作為單細胞重新鋪板時，或當使其形成大簇時)。然而，培養(yǎng)物通常在培養(yǎng)期內(nèi)重建具有特征性形態(tài)的較大比例的未分化細胞?？扇芜x的，增殖的細胞將具有不超過約20-40小時的倍增時間。
分化pPS細胞的材料和方法可在肝細胞分化劑存在下培養(yǎng)pPS細胞制備本發(fā)明的分化細胞。可任選的，還可在肝細胞成熟因子存在下(與分化劑培養(yǎng)的同時或依次)培養(yǎng)細胞。得到的細胞具有肝細胞譜系的表型特征，如下節(jié)所述。
在本發(fā)明的一些實施例中，通過首先形成胚狀體引發(fā)pPS的分化。O’Shea，Anat.Rec.(New Anat.257323，1999)報道了培養(yǎng)胚狀體中的一般原理。pPS細胞以允許聚集物形成的方式培養(yǎng)，其中可獲得許多選擇例如通過供體pPS細胞培養(yǎng)物的過度生長，或通過在具有低粘附性質的基質，例如甲基纖維素的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)pPS細胞。胚狀體易被本領域技術人員識別，并易收集并轉移到新的培養(yǎng)環(huán)境中。胚狀體通常具有內(nèi)胚層外部和中胚層和外胚層內(nèi)部。
如下節(jié)實施例中所說明的，胚狀體還可以在懸浮培養(yǎng)中制備。簡單膠原酶消化，解離成簇，鋪在非粘附的細胞培養(yǎng)板上收集pPS細胞。每隔數(shù)天喂養(yǎng)聚集物，然后在合適的時間段，通常是4-8天后收集。然后將聚集物鋪在適合肝細胞譜系的細胞的底物上。例子是較早更充分描述的Matrigel(Becton Dickenson)、層粘連蛋白、各種類型的膠原和明膠?？墒褂闷渌斯せ|成分和組合。還可通過首先培養(yǎng)產(chǎn)生基質的細胞系(例如成纖維細胞，內(nèi)皮細胞或間充質干細胞)，然后裂解和洗去細胞碎片，使得基質維持與容器表面連接來生產(chǎn)基質。通常不需要從胚狀體上分散細胞；胚狀體可直接鋪在基質上。然后在含有肝細胞分化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。
在本發(fā)明的其它實施例中，pPS細胞與分化劑混合，不形成相當數(shù)量的胚狀體-即在標準pPS細胞培養(yǎng)物中，在達到匯合時間或達到匯合時間之前，但不是開始過度生長之前加入試劑。這在本文中稱為直接分化法。通常有利的是(但不是所需的)pPS細胞在無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物中?？墒占痯PS細胞并鋪在新的底物上，加入含有分化劑的培養(yǎng)基。另外，如果pPS細胞已經(jīng)被維持在適合培養(yǎng)分化的細胞的基質上，那么分化劑可直接加到pPS培養(yǎng)物中，不用重新鋪板。每天觀察培養(yǎng)物，以確定是否達到匯合。已發(fā)現(xiàn)正當細胞達到匯合時加入分化劑，肝細胞譜系細胞的產(chǎn)率可以高3倍，而不是在約60-80％匯合時。
通過提供體內(nèi)肝細胞的環(huán)境典型的底物來進一步促進分化肝母細胞譜系。例如，某些胞外基質成分提供了合適的表面，例如Matrigel(Becton Dickenson)、層粘連蛋白或從裂解細胞獲得的基質。另一種對于這些細胞分化合適的底物是明膠。在含有適合維持細胞的緩沖液、離子強度和營養(yǎng)物的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞(見WO99/20741)。對特定細胞優(yōu)化培養(yǎng)基是在熟練技術人員的范圍內(nèi)，并且在本公開中有例證。
細胞在含有合適的底物和肝細胞分化劑的環(huán)境中維持足夠的時間，使允許從其它細胞富集分化的細胞-如憑經(jīng)驗確定的那樣。例如，用分化劑(如正丁酸鹽)培養(yǎng)的第一天使得約90％培養(yǎng)的胚狀體衍生細胞從基質釋放入培養(yǎng)基中。在24小時后更換培養(yǎng)基時，除去這些細胞，在含有正丁酸鹽的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)存活的細胞。
在充分培養(yǎng)一段時間后，剩余的細胞大量富集了具有肝細胞和/或肝細胞祖細胞特征的細胞。對于肝細胞分化劑正丁酸鹽來說，培養(yǎng)期通常約4-8天，通常約6天。讀者注意到在本發(fā)明的一些分化劑存在下延長培養(yǎng)，對最大限度的獲得肝細胞譜系細胞可能是次優(yōu)的。其它分化劑，例如正丁酸鹽在長期培養(yǎng)中會耐受。在這些情況下，將試劑保持在培養(yǎng)基中有利于維持分化的細胞的表型。不意味著被理論所限，本發(fā)明假設肝細胞分化劑，例如正丁酸鹽具有兩種作用第一，促進pPS細胞沿肝細胞譜系分化，第二，隨著繼續(xù)培養(yǎng)優(yōu)先選擇該譜系的細胞存活。
合適的分化劑正丁酸鹽是典型的肝細胞分化劑，在下面的實施例中說明。本領域技術人員將不難認識到，易鑒定具有相似作用的許多正丁酸鹽的同系物，并在本發(fā)明的實踐中用作替代品。
一類同系物包括其它烴類，它們與正丁酸鹽具有相似的結構和理化性質。這些同系物中的一些是酸性烴類，由3-10個碳原子組成，是分枝、直鏈或環(huán)狀形式，或是共軛堿，選自羧酸鹽、磺酸鹽、磷酸鹽和其它質子供體。合適的例子包括但不限于正丁酸、異丁酸、2-丁烯酸、3-丁烯酸、丙酸、丙烯酸、戊酸、戊烯酸、其它飽和或不飽和的短鏈脂肪酸、氨基丁酸、苯基丁酸、苯基丙酸、苯基乙酸、苯氧基乙酸、肉桂酸和二甲丁酸鹽。還感興趣的是與這些化合物等比容的烴類磺酸酯或磷酸酯，特別是丙烷磺酸和丙烷磷酸，它們與正丁酸鹽等比容。
在這些化合物的命名中，應理解包括所有立體異構體，除非特別說明。具有酸基團的化合物可以酸形式提供，或作為共軛堿，具有任何可接受的對相反荷離子。由于使用正丁酸鈉將提高所用的環(huán)境的離子強度，如需要可通過加入鹽改變離子強度來增強其它試劑的作用。
另一類同系物是丁酸鹽和丁酸鹽同系物的衍生物，包括與其它分子，例如氨基酸、單糖和其它可接受的共軛配對的共軛物。已開發(fā)了許多這樣的衍生物，作為在體內(nèi)或原位通過合適的轉化酶(例如蛋白酶或糖苷酶)存在轉化成活性形式的丁酸鹽前藥。為了說明起見，該類的成員包括精氨酸丁酸鹽、賴氨酸丁酸鹽、其它丁酸鹽酰胺、葡萄糖戊丁酸鹽、三丁精、二丙酮葡萄糖丁酸鹽、其它丁酸鹽糖類、氨基丁酸、異丁酰胺、特戊氧甲基丁酸鹽、1-(2-羥乙基)4-)1-氧丁基)-哌嗪丁酸鹽、其它丁酸鹽的哌嗪衍生物和吡乙酰胺(2-氧-1-吡咯烷乙酰胺，NotropylTM)，γ-氨基丁酸眼的環(huán)衍生物。
另一類同系物是組蛋白去乙酰酶的抑制劑。非限制性例子包括曲古抑菌素A、5-氮胞苷、trapoxin A、oxamflatin、FR901228、順氯氨鉑和MS-27-275。讀者還可參見U.S.5,922,837中的抗原生動物的環(huán)狀四肽；U.S.5,925,659中的抗菌劑；WO 99/23885中的共阻遏物抑制劑；和WO 99/11659中的環(huán)狀肽衍生物。用組蛋白去乙酰酶抑制劑鑒定化合物的方法可通過去阻遏激素受體化合物(WO98/48825)鑒定。
正丁酸鹽的肝細胞分化作用可能至少部分是取決于抑制組蛋白去乙酰酶的能力。組蛋白去乙酰酶活性的檢測可用作預先篩選，來選擇其它分化劑的候選物。有許多這樣的檢測方法。例如，U.S.5,922,637(第3欄以下)描述了用含氚的N-去甲氧基阿匹西定(apicidin)和寄生蟲或雞肝S100溶液作為去乙酰酶活性的來源的試驗。將候選化合物加到反應混合物中，用濾膜法測定氚釋放。Nare等(Anal.Biochem.267390，1999)開發(fā)了一種閃爍鄰近試驗，使用來自組蛋白H4的肽，用氚乙酰化賴氨酸ε-氨基，它與SPA珠結合，后者的閃爍與鄰近的氚量成正比。組蛋白去乙酰酶活性(從HeLa細胞核的抽提物獲得)釋放標記的乙?；?，并減少閃爍，而去乙酰酶抑制劑的存在維持閃爍。Hoffman等(Nucl.Acids Res.272057，1999)描述了組蛋白去乙酰酶活性的非同位素測定。開發(fā)了熒光底物，它們是Ω-乙?；馁嚢彼岬陌被愣顾匮苌铩＿@使得底物的定量在納摩爾濃度范圍內(nèi)，能夠進行組蛋白去乙酰酶抑制劑的高通量篩選。
對合適的分化劑的最可靠測試是其將pPS細胞培養(yǎng)物轉化成富含肝細胞譜系的細胞培養(yǎng)物的能力，如本公開所述。在pPS細胞或胚狀體的培養(yǎng)物中，以類似于已知對正丁酸鹽有效的方式，加入可任選的根據(jù)上述條件的一個或多個預篩選的候選化合物。任何可至少促進pPS細胞沿肝細胞譜系途徑分化，或優(yōu)選允許成肝細胞型細胞生長，或優(yōu)選除去其它譜系的細胞的化合物將有利于衍生本發(fā)明的一些分化的細胞群。
根據(jù)這些指導，作為肝細胞分化劑的特定化合物或化合物的組合包括在化合物存在下培養(yǎng)一群基本未分化的pPS細胞，或一群混合的分化的pPS細胞(例如那些從胚狀體或pPS培養(yǎng)物過度生長獲得的)，然后確定對細胞形態(tài)、標記表達、酶活性、增殖能力或其它與肝細胞譜系的細胞有關的感興趣的特征的作用。為了最佳結果，評估了幾種濃度的測試化合物。合適的基礎濃度可以是等滲容摩或與有效丁酸鹽濃度等滲的或具有另一種組蛋白去乙酰酶相等的抑制能力。然后可測試的試驗化合物超過約1/10ih到10倍基礎濃度的范圍，或更大，從確定它是否具有所需的肝細胞分化能力。
如果能從pPS細胞培養(yǎng)物或胚狀體細胞產(chǎn)生一群細胞，其中至少40％細胞具有肝母細胞或肝細胞的至少三個特征，將該化合物視為有效的分化劑。產(chǎn)生具有大量的肝細胞特征的更均一的群的試劑在一些情況下是有利的。認識到產(chǎn)生較復雜或不太均一或不太成熟的肝細胞群的試劑也可能是有利的，如果細胞維持另一種理想的特征(例如難于操作，或增殖能力)。如下文所述，這些細胞群可以通過分揀或吸附技術進一步富集所需的細胞類型。
成熟因子的選用如需要可使用一種起肝細胞成熟因子作用的分離化合物或化合物的混合物，補充用肝細胞分化劑富集分化的細胞。這些試劑可增強分化劑促進的表型改變，或可以推動分化途徑進一步朝更成熟細胞發(fā)展，或可以幫助篩選肝細胞譜系的細胞(例如，通過優(yōu)先支持其生存)，或可以促進更迅速增殖具有所需表型的細胞。
一類肝細胞成熟因子是可溶性生長因子(肽激素、細胞因子、配體-受體復合物等)，它們能促進肝細胞譜系的細胞的生長。這些因子包括但不限于表皮生長因子(EGF)、胰島素、TGF-α、TGF-β、成纖維細胞生長因子(FGF)、肝素、肝細胞生長因子(HGF)、在地塞米松存在下的制瘤素M、IL-1、IL-6、IGF-I、IGF-II、HBGF-1和胰高血糖素。
另一類肝細胞成熟因子是皮質類固醇，特別是糖皮質素。這些化合物是類固醇或類固醇模擬物，并影響中間代謝，特別是促進肝臟糖原儲藏，和抑制炎癥。包括天然存在的激素，例如可地松，和合成的糖皮質醇，例如地塞米松(美國專利號3,007,923)及其衍生物，強的松、甲基強的松、氫化可地松和去炎松(美國專利號2,789,118)及其衍生物。
另一類肝細胞成熟因子是有機溶劑，例如DMSO。具有類似性質的取代物包括但不限于二甲基乙酰胺(DMA)、六亞甲基二乙酰胺和其它多亞甲基二乙酰胺。該類中的溶劑在增強細胞膜通透性的性質上是部分相關的。還感興趣的是煙酰胺等溶質。測試候選化合物是否起到本發(fā)明的肝細胞成熟因子的作用是憑經(jīng)驗進行的用上述肝細胞分化劑，聯(lián)合模式肝細胞分化劑，例如生長因子或DMSO(陽性對照)將pPS培養(yǎng)物分化肝母細胞譜系的細胞。平行對pPS進行類似方案，使用相同的分化劑和候選成熟因子。然后比較得到的細胞的表型，測定候選試劑是否具有陽性對照的類似效果。
在本發(fā)明的具體實施例中，同時或依次使用肝細胞分化劑和肝細胞成熟因子。在一個例子中，將新鮮鋪板的胚狀體或無飼養(yǎng)細胞的pPS培養(yǎng)物鋪在含有正丁酸鹽和DMSO的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4、6或8天，或直到培養(yǎng)基出現(xiàn)特征性特征，每隔一段時間(即每24小時)用含有正丁酸鹽和DMSO的新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。在另一個例子中，EB或pPS培養(yǎng)物首先和正丁酸鹽和DMSO培養(yǎng)4、6或8天，然后用含有生長因子的混合物的對肝細胞有利的培養(yǎng)基(可能與正丁酸鹽聯(lián)合)交換培養(yǎng)基，長期培養(yǎng)或測定。
根據(jù)這些指導，起到肝細胞成熟因子作用的特定化合物或化合物的組合的能力包括在化合物存在下培養(yǎng)先前用肝細胞分化劑處理過的一群細胞，或將化合物包括在用肝細胞分化因子處理的細胞培養(yǎng)物中。然后測定化合物對細胞形態(tài)、標記表達、酶活性、增殖能力或其它感興趣的特征的作用，比較不含候選化合物的平行培養(yǎng)物。對于最佳結果，評估了化合物的幾個濃度。有機溶劑的合適基礎濃度可以是與有效DMSO濃度等滲摩爾或等滲。生長因子、細胞因子和其它激素的合適基礎濃度可以是與其它系統(tǒng)中具有類似生長誘導或激素活性的濃度。然后可測試的試驗化合物超過約1/10ih到10倍基礎濃度的范圍，或更大，從確定它是否對肝細胞指導的pPS細胞的成熟具有所需的作用。
一旦獲得所需表型的細胞，可以收集細胞用于任何所需的用途。在本發(fā)明的某些分化細胞群中，細胞足夠表型均一，它們可以簡單的通過將細胞從基質釋放收集(例如使用膠原酶或物理操作)，和任選的洗滌細胞除去碎片。如需要，收集的細胞可進一步通過陽性篩選所需特征，或陰性篩選不需要的特征來處理。例如，可陽性或陰性篩選表達表面標記或受體的細胞，通過細胞群與抗體或偶聯(lián)配體一起孵育，然后分離出結合的細胞-例如使用標記的分揀技術，或吸附到固體表面上。還可以通過將細胞群與針對不需要標記的細胞裂解性抗體在補體存在下一起，孵育來進行陰性篩選。
如需要，收集的細胞可轉移到其它培養(yǎng)環(huán)境中，例如對于其它類型的肝細胞制備物的增殖所述的那些。見例如美國專利號5,030,105和5,576,207；EP專利申請EP 953,633；Angeill等，Histochem J.29205，1997；Gomez-Lechon等，p.130，下文，《藥物研究的體內(nèi)方法》，Academic Press，1997)。
分化的細胞的特征根據(jù)許多表型條件可以表征細胞。條件包括但不限于檢測或定量表達的細胞標記，和酶活性，以及形態(tài)特征和胞內(nèi)信號的表征。
本發(fā)明描述的一些分化的pPS細胞具有肝細胞的特征性形態(tài)特征。這些特征易被本領域技術人員在評估這些情況中識別，包括任何或下列全部多邊形細胞形狀，雙核表型，存在粗面內(nèi)質網(wǎng)用于合成分泌的蛋白質，存在高爾基-內(nèi)質網(wǎng)溶酶體復合物用于胞內(nèi)蛋白質分揀，存在過氧化物酶體和糖原顆粒，相對豐富的線粒體，和形成緊密胞內(nèi)連接的能力，導致形成膽小管空間。存在于單細胞中的許多這些特征與作為肝細胞譜系的成員的細胞一致。可通過對分化的pPS細胞，成年或胎兒肝細胞和一種或多種陰性對照細胞，例如成纖維細胞，或RPE(視網(wǎng)膜色素上皮)細胞的顯微照片編碼進行無偏的測定細胞是否具有肝細胞的特征性形態(tài)特征-然后以不知情方式評估顯微照片，并解開編碼來確定分化的pPS細胞是否可被準確鑒別。
本發(fā)明的細胞還可以根據(jù)它們是否表達肝細胞譜系特征性表型標記來表征。用于辨別肝臟祖細胞、肝細胞和膽表皮的細胞標記如表1所示(根據(jù)Seil & Zoran，Liver Stem Cells，R.G.Lardes Co.，TX，1997，p35；和Grisham等，“Stem Cells”，Academic Press，1997，p242改編)。
表1肝細胞標記
報道了肝細胞分化需要轉錄因子HNF-4α(Li等，Genes Dev，14464，2000)。不依賴于HNF-4α表達的標記包括α1-抗胰蛋白酶、α-胎蛋白、apoE、糖激酶、胰島素生長因子1和2、IGF-1受體、胰島素受體和苗條蛋白。依賴于HNF-4α表達的標記包括白蛋白、apoA1、apoAII、apoB、apoCIII、醛縮酶B、苯基丙氨酸羥化酶、L-型脂肪酸結合蛋白、轉鐵蛋白、視黃醇結合蛋白和紅細胞生成素(EPO)。感興趣的其它標記包括那些在下文實施例1、2和6中列出的。
可通過與其它細胞比較，來評估確定這些標記的表達水平。成熟肝細胞標記的陽性對照包括感興趣的物種的成年肝細胞，和建立的肝細胞細胞系，例如衍生自美國專利5,290,684報道的肝母細胞瘤的HepG2系。讀者注意到HepG2等永久細胞系可以代謝性改變，不能表達原代肝細胞的某些特征，例如細胞色素p450。原代肝細胞的培養(yǎng)物還可顯示在持續(xù)培養(yǎng)后一些標記表達的下降。陰性對照包括獨立譜系的細胞，例如成年成纖維細胞系，或視網(wǎng)膜色素表皮(RPE)細胞。未分化的pPS細胞對于上面列出的一些標記是陽性的，但對于成熟肝細胞的標記是陰性的，例如下面的實施例中所說明的。
本公開中列出的組織特異性蛋白質和寡糖決定簇可用任何合適的免疫學技術檢測-例如流式免疫細胞化學用于細胞表面標記，免疫組織化學(例如對于固定的細胞或組織切片)用于胞內(nèi)或細胞表面標記，細胞抽提物的Western印跡分析和酶聯(lián)免疫分析用于細胞抽提物或分泌到培養(yǎng)基中的產(chǎn)物。據(jù)說細胞對抗原的表達是“抗體可檢測的”，如果抗體的顯著可檢測量與抗原在標準的免疫細胞化學或流式細胞術測定中結合，在固定細胞之后可任選的，和可任選的使用標記的二抗或其它偶聯(lián)物(例如生物素-鏈霉親和素偶聯(lián)物)來放大標記。
還可以在mRNA水平通過Northern印跡分析、斑點印跡雜交分析，或反轉錄酶引發(fā)的聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，在標準擴增方法中使用序列特異性引物檢測組織特異性標記的表達。進一步的細節(jié)見美國專利號5,843,780?？蓮墓_數(shù)據(jù)庫，例如GenBank(URL www.ncbi.nlm.nih.gov80/entrez)獲得在該公開中列出的特定標記的序列數(shù)據(jù)。根據(jù)本公開中的測定之一mRNA水平的表達據(jù)說是“可檢測的”，只要在典型的受控實驗中，根據(jù)標準方法測定對細胞樣品的性能導致可清楚分辨的雜交或擴增產(chǎn)物。如果水平至少是對照細胞，例如未分化的pPS細胞、成纖維細胞或其它無關的細胞類型的2倍，優(yōu)選大于10倍或50倍以上，在蛋白質或mRNA水平檢測到的組織特異性標記的表達視為陽性。
還可以根據(jù)是否顯示肝細胞譜系的細胞特征性的酶活性來表征細胞。例如，Bublitz(Mol Cell Biochem.108141，1991)；Yasmineh等(Clin.Biochem.25109，1992)；和Ockerman(Clin.Chem.Acta 17201，1968)描述了葡萄糖-6-磷酸酶活性的測定。Shiojiri描述了肝細胞中堿性磷酸酶(ALP)和5-核苷酶(5’-Nase)的測定(J.Embryol.Exp.Morph.62139，1981)。為研究和衛(wèi)生部門服務的許多實驗室提供了肝臟酶的測定，作為一種商業(yè)服務。
細胞色素p450是單加氧酶系統(tǒng)的一種關鍵的催化成分。它組成一類負責生物異源物質的氧化代謝(施用的藥物)和許多內(nèi)源化合物的血紅素蛋白。不同的細胞色素代表特征性和重疊的底物特異性。大部分生物轉化能力是基于稱為1A2、2A6、286、3A4、2C9-11、2D6和2E1的細胞色素(Gomes-Lechon等，pp.129-153，《藥物研究的體外方法二》，Academic Press，1997)。
在測定細胞色素p450酶活性的領域內(nèi)許多測定是已知的。例如，細胞可以與非熒光底物接觸，該底物可被p450活性轉化成熒光產(chǎn)物，然后通過熒光激活的細胞計數(shù)(美國專利5,869,243)分析。具體是，洗滌細胞，然后與10μm/L 5，6-甲氧基羰基熒光素(Molecular Probes，Eugene OR)的溶液一起在37℃避光孵育15分鐘。然后洗滌細胞，用胰蛋白酶從培養(yǎng)平板上分離，并在約520-560nm熒光發(fā)射分析。據(jù)說如果測試細胞中的活性水平比對照細胞，例如成纖維細胞高2倍，優(yōu)選10或10倍以上，細胞具有所測定的酶活性。
還可以在蛋白質水平上，例如在Western印跡中使用特異性抗體，或在mRNA水平，在Northen印跡或RT-PCR中使用特異性探針和引物測定細胞色素p450的表達。見Borlakoglu等，Int.J.Biochem.251659，1993。還可測定p450系統(tǒng)的特定活性7-乙氧基香豆素O-去-乙基酶活性，烯丙試鹵靈(aloxyresorufin)O-去-烷基酶活性，香豆素7-羥基酶活性，對硝基苯酚羥基酶活性，睪酮羥化，UDP-葡糖醛酸基轉移酶活性，谷胱甘肽S-轉移酶活性等(由Gomes-Lechon等綜述，pp.411-431在“藥物研究的體外方法”，Academic Press，1997)。然后可與原代肝細胞比較活性水平，如表2所示。
表224小時原代培養(yǎng)的人肝細胞的藥物代謝活性
*24小時培養(yǎng)的人肝細胞確定的平均±標準偏差酶活性。
細胞色素P450含量表達成pMol/mg細胞蛋白。
NADPH-C、UDPG-t和GSH-t活性表達成納摩爾/毫克/分鐘。
§CYP酶活性表達成pMol/mg/min。
測定還用于與小分子藥物的偶聯(lián)、代謝或解毒有關的酶。例如，可通過與膽紅素、膽酸和小分子藥物偶聯(lián)，以通過尿道或膽道排泄的能力來表征細胞。細胞與合適的底物接觸，培養(yǎng)合適的時間，然后分析介質(通過GCMS或其它合適的技術)來確定是否形成偶聯(lián)產(chǎn)物。藥物代謝性酶活性包括去乙基化，去烷基化，羥基化，去甲基化，氧化，葡糖醛酸偶聯(lián)，磺基偶聯(lián)、谷胱甘肽偶聯(lián)和N-乙酰轉移酶活性(A.Gulliouzo，pp411-431，《藥物研究的體外方法》，Academic Press，1997)。測定包括非那西汀去乙基化、普魯卡因胺N-乙?；?、對乙酰氨基酚磺基偶聯(lián)和對乙酰氨基酚葡糖醛酸化(Chesne等，345-350頁，Liver Cells and Drugs，A.Guiliouzo編，John Libbery Eurotext，London，1988)。
還可以評估肝細胞譜系的細胞儲藏糖原的能力。合適的測定使用高碘酸Schiff(PAS)染色，它不與單糖和二糖反應，但對長鏈聚合物，例如糖原和葡聚糖染色。PAS反應提供了復雜的糖類和可溶性和膜結合糖類化合物的定量估計。Kirkeby等(Biochem.Biophys.Meth.24225，1992)描述了糖類化合物和去污劑的定量PAS測定。Van der Laarse等(Biotech.Histochem.67503，1992)描述了使用PAS反應對糖原進行微光度測定。如果細胞與對照細胞，例如成纖維細胞比較，PAS陽性的水平至少是2倍，優(yōu)選10倍以上，確定糖原儲藏的證據(jù)。還可以通過根據(jù)標準方法的核型分析來表征細胞。
本發(fā)明的分化的pPS細胞可具有許多上述特征，包括抗體可檢測的α1-抗胰蛋白酶(AAT)或白蛋白；不存在抗體可檢測的α-胎蛋白的表達；RT-PCR可檢測的無唾液酸糖蛋白受體(ASGR-1或ASGR-2同工型)的表達；糖原儲藏的證據(jù)；細胞色素9450或葡萄糖-6-磷酸酶活性的證據(jù)；和肝細胞的形態(tài)學特征。特定細胞中存在這些特征越多，它越可被表征為肝細胞譜系的細胞。具有至少2、3、5、7或9個這些特征的細胞越來越優(yōu)選。根據(jù)一特定的細胞群，例如可存在于培養(yǎng)容器或給藥的制備物，細胞在表達這些特征中的均一性通常是有利的。在這種情況下，其中至少約40％、60％、80％、90％、95％或98％的細胞具有所需特征的群體越來越優(yōu)選。
本發(fā)明分化細胞的其它所需特征是在體內(nèi)作為藥物篩選試驗中的靶細胞的能力，和重建肝功能的能力，和作為體外裝置的部分。這些特征在下文中進一步詳述。
分化的細胞的端?；硐氲氖?，肝細胞譜系的細胞能在一些藥物篩選和治療應用中復制。本發(fā)明的細胞可任選的在變成有限的發(fā)育譜系細胞或最終變成分化的細胞之前或之后端?；蕴岣咂鋸椭颇芰?。端?；膒PS細胞可采取先前描述的分化途徑；或可直接端?；只募毎?。
端粒化之前或之后，可用本領域已知的試劑和方法確定hTERT基因產(chǎn)物的端粒酶活性和表達。例如，用TRAP活性測定(Kim等，Science 2662011，1997，Weinrich等，Nature Genetics 17498，1987)評估了pPS細胞。用RT-PCR評估m(xù)RNA水平的hTERT表達。
通過用合適的載體轉染或轉導、同源重組或其它合適的技術基因改變細胞而端?；?，使其表達端粒酶催化成分(TERT)。特別合適的是人端粒酶的催化成分(hTERT)，在國際專利申請WO 98/14592中提供。對于一些應用，還可使用物種同系物，例如小鼠TERT(WO 99/27113)。Bodhar等，Science 279349，1998和Jiang等，Nat.Genet.21111，1989描述了人細胞中端粒酶的轉染和表達。在另一個實施例中，hTERT克隆(WO 98/14592)用作hTERT編碼序列的來源，在MPSV啟動子的控制下剪接入PBBS212載體的EcoR1位點，或在LTR啟動子控制下剪接入市售的pBABE反轉錄病毒載體的EcoRI位點。用含有8-16小時以上的上清液的載體基因改變分化或未分化的pPS細胞，然后交換到生長培養(yǎng)基中1-2天。用0.5-2.5μg/ml嘌呤霉素篩選基因改變的細胞，并重新培養(yǎng)，然后通過RT-PCR評估hTERT，端粒酶活性(TRAP測定)，hTERT的免疫細胞化學染色或復制能力。在支持增殖的條件下進一步培養(yǎng)可富集連續(xù)復制克隆，具有所需表型的細胞可任選的通過限制稀釋進行克隆。
在本發(fā)明的一些實施例中，pPS細胞分化成具有肝細胞譜系特征的細胞，然后分化的細胞被基因改變以表達TERT。在本發(fā)明的其它實施例中，pPS細胞被基因改變以表達TERT，然后分化成具有肝細胞譜系特征的細胞。通過TRAP測定可確定成功的修改增加了TERT表達，或確定是否改進了細胞的復制能力。
還設想了使細胞無限增殖的其它方法，例如用編碼SV40大T抗原的DNA轉化細胞(美國專利5,869,243，國際專利申請WO 97/32972)。當細胞要用于治療時，用癌基因或腫瘤病毒產(chǎn)物轉染不太合適。端?；募毎诒景l(fā)明的應用中特別感興趣，因為具有可增殖并維持其核型的細胞是有利的，例如在藥物篩選和治療方案中，其中對個體給予分化的細胞以增加肝功能。
分化的細胞的用途本發(fā)明提供了一種方法，通過它可產(chǎn)生大量肝細胞譜系的細胞。這些細胞群可用于許多重要的研究、開發(fā)和商業(yè)目的。
表達文庫和特異性抗體的制備本發(fā)明的分化的細胞可用于制備cDNA文庫，該cDNA文庫相對不被在來自其它譜系細胞中優(yōu)先表達的DNA污染。例如，1000rpm離心5分鐘收集細胞，然后用標準技術從沉淀中制備mRNA(Sambrook等，見上)。在反轉錄到cDNA中后，用來自任何或全部下列細胞類型的cDNA減去制備物未分化的pPS、胚胎成纖維細胞、內(nèi)臟內(nèi)胚層、竇狀內(nèi)皮細胞、膽管上皮或其它不需要的特異性的細胞，從而產(chǎn)生所選cDNA文庫，反映代表成熟肝細胞、肝細胞前體或兩者的表達模式。
本發(fā)明的分化的細胞還可以用于制備對肝細胞標記、祖細胞標記、對肝細胞前體特異性的標記和其它可在細胞上表達的抗原特異性的抗體。本發(fā)明的細胞提供了一種產(chǎn)生這些抗體的改良方法，因為它們與pPS培養(yǎng)物和來自肝臟組織的肝細胞培養(yǎng)物比較，相對富含特定的細胞類型?？赏ㄟ^將本發(fā)明的細胞以免疫原性形式注射入脊椎動物，來制備多克隆抗體。標準文獻如Harrow & Lane(1986)，美國專利號4,491,632、4,472,500和4,444,887和Methods In Enzymology73B3(1981)描述了單克隆抗體的產(chǎn)生。獲得特異性抗體分子(最佳是單鏈可變區(qū)形式)的其它方法涉及使免疫活性細胞或病毒顆粒與靶抗原接觸，并在陽性篩選的克隆中生長。見Marks等，New Eng.J.Med.335730，1996，國際專利申請WO94/13804、WO 92/01047、WO 90/02809和McGuiness等，NatureBiotechnol.141449，1996。通過用本發(fā)明的pPS陽性篩選和用攜帶更廣泛分布的抗原的細胞(例如分化的胚胎細胞)或成年人衍生的干細胞陰性篩選，可獲得所需的特異性?？贵w相反可用于鑒定或拯救來自混合細胞群的所需表型的肝細胞前體細胞，如用于使用組織樣品在免疫診斷期間共染色，和從成熟肝細胞或其它譜系的細胞中分離這些細胞。
基因組學分化的pPS細胞感興趣之處在于鑒定肝細胞前體細胞特征性轉錄物和新合成的蛋白質的表達模式，和有助于指導分化途徑或促進細胞之間的相互作用。獲得分化的細胞的表達模式并與對照細胞系，例如未分化的pPS細胞，其它類型的定型的前體細胞(例如朝其它譜系分化的pPS細胞，造血干細胞，其它中胚層衍生的組織的前體細胞，內(nèi)皮或膽管上皮的前體細胞，從成年組織獲得的肝細胞干細胞，或用其它試劑或技術朝肝細胞譜系分化的pPS細胞)比較。
在蛋白質水平比較表達的合適方法包括上述的免疫分析或免疫組織化學技術。在轉錄水平比較表達的合適的方法包括mRNA分化顯示方法(Liang，Peng等，Cancer Res.526955，1992)和基質陣列表達系統(tǒng)(Schena等，Science 270467，1995；Eisen等，Methods in Enzymol.303179，1999；Brown等，Nat.Genet.21增刊133，1999)。
Fritz等Science 288316，2000；“微陣列生物芯片技術”，M.Schena編，Eaton Publishing Company；“微陣列分析”，Gwynne&Page，Science(1999/8/6增刊)；Poliack等，Nat Genet 2341，1999；Gerhold等，Trends Biochem.Sci.24168，1999；“基因芯片(DNA微陣列)”，L Shi，www.Gene-Chips.com綜述了微陣列在分析基因表達中的用途。從下列公司可買到進行微陣列分析的系統(tǒng)和試劑，例如Affymetrix，Inc.，Santa Clara Ca；Gene Logic Inc.，ColumbiaMD；Hyseq Inc.，Sunnyvale CA；Molecular Dynamics Inc.，Sunnyvale CA；Nanogen，San Diego CA；和Synteni Inc.，F(xiàn)remont CA(由Incyte Genomics，PaloAlto CA獲得)。
固相陣列是通過在所需位置合成探針，或預先合成探針片段，然后將其附著于固相載體，將探針附著在特定位點制備的。可使用各種固相載體，包括玻璃、塑料、陶瓷、金屬、凝膠、膜、紙和各種成分的珠。美國專利號5,445,934公開了一種芯片上合成的方法，其中用含有光可切割的保護基團的化學物質衍生載玻片。通過掩模輻射去除各位點的保護，然后與含有光保護性基團的DNA單聚物反應。將預先合成的探針附著于固相載體的方法包括吸附、紫外光連接和共價結合。在一個例子中，修飾固相載體攜帶一個活性基團，例如羥基、羧基、胺、醛、肼、環(huán)氧化物、溴乙?；?、馬來酰亞胺或巰基，通過該基團可接合探針(美國專利號5,474,895和5,514,785)。
探測試驗通常是通過陣列與可能含有感興趣的核苷酸序列的液體在合適的雜交條件下接觸，然后確定形成的任何雜交體進行的。例如，樣品中的mRNA或DNA在與合適標記接合的核苷酸，例如熒光標記的Cy3或Cy5存在下擴增。調節(jié)條件，從而發(fā)生具有精確互補配對，或在合適情況下具有不同程度同源性的雜交。然后洗滌陣列，通過測定與固相結合的標記量，確定結合的核酸?？杀容^陣列之間不同樣品的相對表達水平，可任選使用在大多數(shù)感興趣的細胞中表達的基因，例如核糖體或持家基因，或作為樣品中總多核苷酸的比例標準化。另外，可通過從具有不同標記的來源制備擴增的多核苷酸，同時在同一陣列上測試兩個或多個不同來源的樣品。
用Genetic Microsystems陣列發(fā)生器和Axon GenePixTM掃描儀進行一種示范性方法。通過首先以96或384孔形式擴增編碼要分析的標記序列的cDNA片段制備微陣列。然后直接將cDNA點樣于載玻片上，密度高達＞5000/片。為了比較感興趣的兩種細胞的mRNA制備物，將一種制備物轉化成Cy3-標記的cDNA，而另一種轉化成Cy5-標記的cDNA。同時將兩種cDNA制備物與微陣列載玻片雜交，然后洗滌消除非特異性結合。陣列上任何給定的點將以兩種原始mRNA制備物中的轉錄物的豐度成正比，與各cDNA產(chǎn)物結合。然后在各標記合適的波長掃描載玻片，得到的熒光是定量的，格式化結果得到陣列上各標記的mRNA相對豐度的指標。
鑒定表達產(chǎn)物，用于表征和影響本發(fā)明分化的細胞，涉及分析第一細胞類型，例如沿肝細胞譜系分化的pPS細胞的RNA、蛋白質或其它基因產(chǎn)物的表達水平；然后分析相同產(chǎn)物在對照細胞類型中的表達水平；比較兩種細胞類型之間的相對表達水平(通常由樣品中的總蛋白質或RNA標準化，或與期望在兩種細胞類型中以相似水平表達的另一種基因產(chǎn)物，例如持家基因)；然后基于比較的表達水平鑒定感興趣的產(chǎn)物。
與對照比較，在本發(fā)明的分化的pPS細胞中如果相對表達水平至少是約2倍、10倍或100倍提高(或抑制)，它們通常是感興趣的產(chǎn)物。該分析可任選的是計算機輔助的，通過在獨立的軸上標記各細胞類型中的表達水平，其中相對于各軸的標記的位置是根據(jù)各細胞中的表達水平，然后基于標記位置選擇感興趣的產(chǎn)物。另外，第一種細胞與對照細胞之間的表達差異可以在色譜上表示(例如黃色代表相等的表達水平，紅色代表增加的表達，藍色代表抑制的表達)。然后可基于代表一種感興趣的標記的表達的顏色，或基于代表多種標記的顏色的圖案選擇感興趣的產(chǎn)物。
用于藥物篩選的分化的pPS細胞可用本發(fā)明的分化的pPS細胞篩選影響肝細胞譜系的分化細胞的特征的因子(例如溶劑、小分子藥物、肽、多核苷酸等)或環(huán)境條件(例如培養(yǎng)條件或操作)。
在一些應用中，用pPS細胞(分化或未分化的)篩選促進細胞沿肝細胞譜系成熟的因子，或促進在長期培養(yǎng)中增殖和維持這些細胞。例如，通過將候選肝細胞成熟因子或生長因子加到不同孔的pPS細胞中，然后根據(jù)進一步培養(yǎng)的所需條件和細胞的用途測定任何表型改變測試這些因子。
本發(fā)明的特定篩選應用涉及在藥物研究中測試藥物化合物。讀者一般可參見標準教科書《藥物研究的體外方法》，Academic Press，1997和美國專利5,030,015。在該發(fā)明中，分化肝母細胞譜系的pPS細胞對標準藥物篩選和毒性測試起了測試細胞的作用，如先前在肝細胞細胞系或原代肝細胞在短期培養(yǎng)中進行的。候選藥物化合物活性的評估通常涉及將本發(fā)明的分化的細胞與候選化合物混合，確定可歸因于化合物的細胞形態(tài)、標記表型或代謝活性的任何改變(與未處理的細胞或用惰性化合物處理的細胞比較)，然后將化合物的作用與觀察到的變化聯(lián)系起來。由于設計的化合物對肝臟細胞具有藥理學作用，或由于設計的對其它部位有作用的化合物對肝臟有不良副作用，因此可進行篩選。可聯(lián)合測試兩種或多種藥物(通過同時或依次與細胞混合)，來檢測可能的藥物-藥物相互作用效果。
在一些應用中，篩選的化合物起初可能有肝臟毒性(Castell等，pp.375-410，于《藥物研究的體外方法》，Academic Press，1997)?？稍谝婚_始用對細胞存活能力，存活、形態(tài)和酶滲漏入培養(yǎng)基的影響來確定細胞毒性。進行更詳細的分析來來確定化合物是否影響細胞功能(例如糖異生、尿素生成和血漿蛋白質合成)，而不導致中毒。乳酸脫氫酶(LDH)是良好標記，因為肝同工酶(V型)在培養(yǎng)條件中是穩(wěn)定的，使得培養(yǎng)上清液中在12-24小時孵育后有可復制的量度。酶(例如線粒體谷氨酸草酰乙酸酯轉氨酶和谷氨酸丙酮酸轉氨酶)的滲漏也可使用。Gomez-Lechon等(Ahal.Biochem.233296，1996)描述了測量糖原的微陣列，它能夠用于測量藥物化合物對肝細胞糖異生的作用。
目前用于評估肝臟毒性的其它方法包括確定白蛋白、膽固醇和脂蛋白的合成和分泌；偶聯(lián)的膽酸和膽紅素的轉運；尿素生成；細胞色素p450水平和活性；谷胱甘肽水平；α-谷胱甘肽s-轉移酶的釋放；ATP、ADP和AMP代謝的；胞內(nèi)K+和Ca2+濃度；核基質蛋白或寡核小體的釋放；和凋亡的誘導(由細胞變圓，染色質凝聚和核片段化指示)?？捎肹3H]-胸腺嘧啶或BrdU摻入測定DNA合成。藥物對DNA合成或結構的作用可通過測定DNA合成或修復確定。[3H]-胸腺嘧啶或BrdU摻入，尤其在細胞周期中的未預定的時間，或在細胞復制可需的水平以上，與藥物作用有關。不良作用還包括姐妹染色體交換的異常比例，由分裂中期涂片確定。讀者可參見A.Vickers(pp.375-410，于《藥物研究的體外方法》，Academic Press，1997)進一步詳述。
肝功能的恢復本發(fā)明還提供了用分化的pPS細胞使由于急性、慢性或先天性肝臟功能損傷，而需要這種治療的病人恢復一定程度的肝功能。
為了確定分化的pPS細胞治療應用的合適程度，首先可在合適的動物模型中測試細胞。在一個水平，評估細胞在體內(nèi)存活和維持其表型的能力。將分化的pPS細胞在適合進一步觀察的位點，例如在腎囊下，胰臟內(nèi)或肝臟葉中給予免疫缺陷動物(例如SCID小鼠，或通過化學方法或輻射使的動物免疫缺陷)。在幾天到幾周或更長時間后收集組織，評估是否還存在pPS細胞。這可以通過提供給予具有可檢測標記(例如綠色熒光蛋白，或β-半乳糖苷酶)的細胞進行，或通過測定對給予的細胞特異性的組成型標記。當在嚙齒類模型中測試分化的pPS細胞時，可用免疫組織化學或ELISA，使用人特異性抗體，或通過RT-PCR使用引物和導致對人多核苷酸序列特異性擴增的雜交條件，評估給予的細胞的存在和表型。表3提供了在mRNA或蛋白質水平評估基因表達的合適標記。Grompe等(Sem.Liver Dis.197，1999)；Peeters等(Hepatology 25884，1997)和Ohashi等(Nature Med.6327，2000)提供了用于確定動物模型中肝細胞樣細胞命運的一般描述。
在另一個水平，評估分化的pPS細胞在缺乏完全的肝功能的動物中恢復肝功能的能力。Braun等(Nature Med.6320，2000)描繪了由尿激酶表達的肝臟疾病的模型。Mignon等(Nature Med.41185，1998)描繪了HSK tk基因的轉基因小鼠中毒素誘導的肝臟疾病的模型。Rhim等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA924942，1995)和Lieber等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 926210，1995)描繪了針對細胞表面標記Fas的抗體誘導的肝臟疾病。Overtruf等(Human GeneTher.9295，1998)在小鼠中通過靶向破裂Fab基因開發(fā)了一種遺傳性酪氨酸血癥I型模型。通過供給2-(2-硝基-4-氟甲基芐醇基)-1，3-環(huán)己二酮(NTBC)拯救了該動物的缺陷，但取出NTBC時產(chǎn)生肝臟疾病。急性肝臟疾病可用90％肝切除術作為模型(Kobayashi等，Science 2871258，2000)。急性肝臟疾病的模型也可以是用肝臟毒素，例如半乳糖胺，CCl4，或硫代乙酰胺處理動物。慢性肝臟疾病，例如硬化可用亞致死劑量的肝臟毒素長期處理動物，足夠誘導成纖維化作為模型(Rudolph等，Science 2871253，2000)。評估分化的細胞重建肝功能的能力涉及將細胞施給這些動物，然后確定1-8周或更長的存活，同時監(jiān)測動物病況的發(fā)展?？稍u估在肝臟組織中表達的標記、細胞色素p450活性和血液指標，例如堿性磷酸酶活性、膽紅素偶聯(lián)和凝血酶原時間，以及宿主的存活來確定對肝功能的作用。根據(jù)存活、疾病發(fā)展或肝功能的維持中的任何改善與療效有關的任何這些條件，可進行進一步優(yōu)化。
本發(fā)明包括包囊的分化的細胞，或生物人工肝臟裝置的部分。各種形式的包囊在(Cell Encapsulation Technology and Therapeutics)，Kuhtreiber等編，Birknauser，Boston MA，1999中描述。本發(fā)明的分化的細胞可以用體外或體內(nèi)使用的任何方法包囊。
臨床使用的生物人工器官設計成作為長期治療的一部分，或連結暴發(fā)性肝臟衰竭和肝臟重建或肝臟移植之間的時間，以支持肝功能受損的個體。Macdonald等，pp.252-286，于““Cell Encapsulation Technology and Therapeutics”中綜述了生物人工肝臟裝置，及在美國專利號5,290,684、5,624,840、5,853,717和5,935,849。懸吊型生物人工肝臟包括懸浮在平板透析液中，或在合適基質中微囊化，或與被胞外基質包裹的微載體珠結合的細胞。另外，肝細胞可置于填料床、多片平床或微通道屏障，或包圍空心纖維毛細管的固相載體上。裝置具有病人的血液通過的進口和出口，有時有一套單獨的可對細胞提供營養(yǎng)物的口。
這些肝臟支持裝置的目前計劃涉及來自異種來源的肝細胞，例如豬肝細胞懸液，因為缺乏可得的原代人肝細胞。異種組織來源產(chǎn)生有關免疫原性和可能的物種交叉病毒傳播的有條理的關注。
本發(fā)明提供了一個產(chǎn)生人細胞的制備性培養(yǎng)物的系統(tǒng)。根據(jù)上述方法制備分化的多能干細胞，然后將其裝在裝置中的合適基質，例如Matrigel或膠原上?？赏ㄟ^比較傳入通道和傳出通道中血液的成分，根據(jù)從傳入的液體中取出的代謝物和傳出的液體中新合成的蛋白質評估裝置的效力。
可用該類裝置對液體，例如血液解毒，其中液體與本發(fā)明的分化的細胞在允許細胞除去或改變液體中毒素的條件下接觸。解毒涉及除去或改變肝臟通常具有的至少一種配體、代謝物或其它化合物(天然和合成的)。這些化合物包括但不限于膽紅素、膽酸、尿素、血紅素、脂蛋白、糖類、轉鐵蛋白、血色素結合蛋白、無唾液酸糖蛋白、胰島素和胰高血糖素等激素，和各種小分子藥物。裝置還可以用于富集流出液中的合成的蛋白質，例如白蛋白、急性期反應物和未負荷的載體蛋白?？蓛?yōu)化該裝置，從而進行這些不同的功能，由此恢復盡可能多的肝功能。在治療護理中，裝置處理從肝臟衰竭病人流出的血液，然后血液回到病人。
在動物模型中(如上所述)顯示所需的功能特征的本發(fā)明的分化的pPS細胞還適合直接對肝功能受損的病人給藥。為了止血，細胞可在充分接觸循環(huán)的任何位點，通常在腹腔內(nèi)施用細胞。對于一些代謝和解毒功能，有利的是細胞接觸膽道。因此，細胞在肝臟(例如在治療慢性肝臟疾病中)或脾臟(例如在治療暴發(fā)性肝衰竭中)附近施用。在一種方法中，細胞通過肝動脈或通過門靜脈，通過固定導管輸液，施用到肝循環(huán)內(nèi)?？刹倏v門靜脈中的導管，使得細胞主要流入脾臟或肝臟，或兩者的組合。在另一種方法中，通過在接近靶器官的腔內(nèi)安置丸藥，通常是將留住在丸藥的賦形劑或基質中施用細胞。在另一種方法中，細胞直接注射到肝臟或脾臟的葉中。
可用本發(fā)明的分化的細胞治療任何需要恢復或補充肝功能的病人。適合這些治療的人病況包括任何原因的暴發(fā)性肝衰竭、病毒性肝炎、藥物誘導的肝臟損傷、硬化、先天性肝臟功能不全(例如Wilson氏病、Gilbert氏綜合征或α1-抗胰蛋白酶缺陷)、肝膽癌、自身免疫性肝臟疾病(例如自身免疫性慢性肝炎或原發(fā)性膽硬化)和任何其它導致肝功能損傷的病況。對于人治療，劑量通常在約109-1012個細胞之間，通常在約5×109和5×1010個細胞之間，根據(jù)病人體重、疾病的性質和嚴重程度，和施用的細胞的復制能力進行調節(jié)。最終由主治醫(yī)生負責確定治療模式和合適的劑量。
提供下列實施例是為了非限制性說明本發(fā)明的具體實施例。
實施例實驗方法本節(jié)提供了下列實施例使用的技術和試劑的一些細節(jié)。
人胚胎肝細胞的維持在無血清培養(yǎng)基中的原代小鼠胚胎成纖維細胞上維持hES細胞。hES細胞作為小簇以約40,000細胞/cm2接種在輻射過的小鼠胚胎成纖維細胞上。這些培養(yǎng)物維持在含有80％KO DMEM(Gibco)和20％血清替代品(Gibco)，補充有1％非必需氨基酸，1mM谷氨酰胺、0.1mMβ-巰基乙醇和4ng/ml人bFGF(Gibco)的培養(yǎng)基中。通過連續(xù)傳代ES集落來擴增細胞。這是通過在37℃用1mg/ml膠原酶處理ES集落的單層培養(yǎng)物實現(xiàn)的。然后溫和刮下培養(yǎng)物除去細胞。小簇溫和分離，并作為小簇重新鋪在新鮮的飼養(yǎng)細胞上。
胚狀體(EB)的產(chǎn)生通過在膠原酶中孵育15-20分鐘，然后從平板上刮下細胞收集hES細胞在飼養(yǎng)細胞上或下的匯合的單層培養(yǎng)物。然后將細胞解離成簇，并置于培養(yǎng)基中的非黏附的細胞培養(yǎng)物平板(Costar)中，該培養(yǎng)基含有80％ KO DMEM(Gibco)和20％未熱滅活的FBS(Hyclone)，補充有1％非必需氨基酸，1mM谷氨酰胺、0.1mMβ-巰基乙醇。在每孔(6孔板)的2ml培養(yǎng)基中，以1∶2比例接種細胞。每隔一天每孔加入2ml培養(yǎng)基喂養(yǎng)EB。當培養(yǎng)基體積超過4ml/孔時，收集EB并重懸浮在新鮮培養(yǎng)基中。4-8天懸浮后，將EB鋪在底物上使其進一步分化。
Matrigel包裹的培養(yǎng)基底物根據(jù)廠商指導用Matrigel包涂孔。簡單地說，4℃融化常規(guī)Matrigel或生長因子扣除的Matrigel(Collaborative Biosciences)至少3小時。在冷KODMEM中1∶10或1∶20稀釋hES細胞培養(yǎng)物或1∶30稀釋肝細胞培養(yǎng)物。用預先冷卻的平板和移液管頭，在各孔(9.6cm2)中加入0.75-1ml Matrigel溶液。平板在室溫下孵育1小時或4℃過夜，然后在加入細胞前用冷KO DMEM洗滌一次。
免疫細胞化學在室溫，將培養(yǎng)槽載玻片上生長的細胞在3.5％低聚甲醛中固定5分鐘，然后在甲醇中-20℃下固定20分鐘。將固定的細胞用PBS漂洗兩次，用10％山羊血清的PBS溶液封閉1小時。然后在用10％山羊血清和PBS稀釋的一抗中孵育2小時。以1∶500稀釋針對白蛋白、α-胎蛋白(AFP)(Sigma)和α1-抗胰蛋白酶(OEBBiosciences Inc.)的抗體，1∶200稀釋細胞角蛋白8、18和19，結蛋白(Neomarkers)、波形蛋白(Dako)和SMA(Sigma)。然后用PBS洗滌細胞3次，在二抗中孵育，它是5％山羊血清的PBS溶液中1∶100稀釋的FITC-偶聯(lián)的抗小鼠IgG，和1∶1000稀釋的Hoechst HH33258(Sigma)，孵育1小時。然后將染色的細胞在PBS中洗滌3次，并裝在VectashieldTM(Vector Labs)中。用裝有落射熒光和光點CCD照相機的Nikon LabophotTM以10X、40X拍照。
糖原染色從美國Master Tech Scientific Inc.獲得高碘酸Schiff染色(PAS)。在培養(yǎng)槽載玻片上生長的細胞，用丙酮∶甲醇1∶1在-20℃下固定20分鐘。用自來水，然后用蒸餾水漂洗固定的細胞。然后在0.5％高碘酸溶液中室溫溫育細胞4分鐘，用蒸餾水漂洗。然后與Schiff溶液在室溫溫育10分鐘，用自來水漂洗數(shù)次。然后細胞在Fast Green染料中溫育2分鐘，用100％乙醇漂洗兩次，裝在DPX固定裝置中。用裝有落射熒光和光點CCD照相機的Nikon LabophotTM以10X、40X拍照。
BrdU染色細胞在培養(yǎng)槽載玻片上在指定的生長培養(yǎng)基中生長，并用10μmBrdU標記24小時。然后用3∶1的甲醇乙酸固定細胞30分鐘，并在暗處風干過夜。用PBS漂洗固定的細胞一次，用0.07N NaOH變性2分鐘，然后在pH8.5和pH7.4的PBS中快速漂洗幾次。然后用1.5％山羊血清(Vector Labs)封閉15分鐘，用在1.5％山羊血清和0.05％TweenTM20中1∶500稀釋的BrdU抗體(Sigma)溫育2小時。樣品在PBS中洗滌三次，然后與二抗溫育30分鐘，該二抗是生物素酰化的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Vector Labs)，在1.5％馬血清中以10微克/毫升稀釋。樣品再次在PBS中洗滌三次，然后與以30微克/毫升稀釋于10mM HEPES緩沖液和0.15MNaCl pH8.5的染色偶聯(lián)物，Texas Red標記的鏈霉親和素(Vector Labs)避光溫育20分鐘。將Hoechat HO33258染料(二苯酰亞胺，Sigma目錄號B2883)以2.5μm的最終濃度混入鏈霉親和素溶液，以染色所有的核。染色的細胞在PBS中再洗滌3次，裝在VectashieldTM(Vector Labs)上。用裝有反射熒光和光點CCD照相機的Nikon LabophotTM以10X、40X拍照。
反轉錄酶PCR擴增如下進行轉錄水平上表達的RT-PCR分析用RNAeasy試劑盒TM(Qiagen)如廠商指示從細胞提取RNA。然后用DNase消化最終產(chǎn)物以除去污染的基因組DNA。RNA在含有10mM Tris pH7.5，10mM MgCl2和5mM DDT的緩沖液中，在RNAguard(Pharmacia Upjohn)和DNAse I(Pharmacia Upjohn)中37℃溫育30-45分鐘。為了從樣品中除去蛋白質，進行苯酚-氯仿抽提并用3M乙酸鈉和100％冷乙醇沉淀RNA。用70％乙醇洗滌RNA，風干沉淀物，并重懸浮在DEPC-處理的水中。為了反轉錄酶(RT)反應，將500ng總RNA與最終濃度為1X的第一鏈緩沖液(First StrandBuffer)(Gibco)、20mm DDT和25微克/毫升隨機六聚物(Pharmacia Upjohn)混合。RNA在70℃變性10分鐘，然后室溫退火10分鐘。以最終濃度為1mm加入dNTP和0.5微升Superscript II RT(Gibco)，42℃溫育50分鐘，然后80℃熱滅活10分鐘。然后將樣品儲藏在-20℃，直到它們進行PCR分析。用對感興趣的標記特異性的引物在下列反應混合物中進行標準聚合酶鏈式反應(PCR)cDNA 1.0微升，10×PCR緩沖液(Gibco)2.5微升，10×MgCl22.5微升，2.5mM dNTP 3.0微升，5μM3’-引物1.0微升，5μm 5’-引物，1.0微升，Taq 0.4微升，DEPC-水13.6微升。所選的標記和反應條件如表3所示。
表3RT-PCR表達分析的反應條件
實施例1用正丁酸鹽分化人胚胎干細胞如之前面的部分中的描述制備胚狀體(EB)。懸浮培養(yǎng)5天后，收集并鋪在減少生長因子的Matrigel包涂的平板上，和培養(yǎng)槽載玻片(Nunc)內(nèi)。平行使用了下列三種條件·含有20％胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基；·含有20％FBS和5mM丁酸鈉(Sigma)的培養(yǎng)基；·含有20％FBS、0.5％DMSO(ATCC)、4μm地塞米松(Sigma)、150ng/ml胰島素、10ng/mlEGF、600nM胰高血糖素(Sigma)。
在各種情況下，每天更換培養(yǎng)基，在鋪板后第4天固定細胞用于免疫細胞化學。
鋪板后1天，單獨鋪在20％FBS中的EB看似健康，它們幾乎全部粘附在板上，并似乎正在增殖。幾天后，只有在FBS中的細胞存活得很好，并分化形成種類非常不同的群體。相反，含有丁酸鈉的培養(yǎng)物鋪板1天后具有大比例的明顯死亡的細胞，僅有幾片含有明顯均一的細胞群存活。這些細胞的形態(tài)與原代肝細胞相似，即細胞大而且在幾天后變成多核。將這些培養(yǎng)物與原代人肝細胞培養(yǎng)物(從匹茲堡大學Stephen Strom博士處獲得)和HepG2細胞(永久人肝細胞系衍生自肝母細胞瘤，與美國專利5,290,684中報道的類似)比較。在含有0.5％DMSO和生長因子(3號)的情況下，細胞看似健康，培養(yǎng)物含有顯著不同的細胞群。


圖1顯示了重新鋪板并培養(yǎng)再2天的胚狀體細胞的形態(tài)(4X、10X、20X)。右側顯示通過在肝細胞分化劑正丁酸鹽中培養(yǎng)2天分化的細胞。在胚狀體鋪板的位點上形成圓形集落；中間的白色斑點是小區(qū)域的死亡細胞。視野中的其它細胞顯示明顯均一的形態(tài)。左側顯示單獨在含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞。胚狀體分散在廣泛的區(qū)域內(nèi)，并形成不同斑點的細胞，顯示許多不同細胞類型的形態(tài)。
鋪板后4天，用針對不同肝臟特異性標記的抗體固定在培養(yǎng)槽載玻片上生長的細胞，用于免疫細胞化學。結果如表4所示。用丁酸鈉處理的培養(yǎng)物不表達AFP，但約30％的細胞表達抗體可檢測水平的白蛋白。
表4培養(yǎng)的細胞的免疫細胞化學
*-對于顯示陽性染色的細胞百分數(shù)提供的結果(n.d.)＝在該實驗中未確定實施例2分化的細胞表達的標記懸浮培養(yǎng)4或5天后收集hES細胞衍生的胚狀體，鋪在用Matrigel包涂的6孔板(用于RNA抽提)和培養(yǎng)槽載玻片(用于免疫細胞化學)中的含有20％FBS和5mM正丁酸鈉的培養(yǎng)基中。每天或每隔一天更換培養(yǎng)基。在第1天有許多細胞死亡，然后在后面的幾天內(nèi)死亡的細胞較少。
圖2顯示了用正丁酸鹽培養(yǎng)6天后分化的細胞的形態(tài)。同一培養(yǎng)物顯示6個不同的視野(10x在頂部，20x在其它列中)。細胞是顯著均一的，顯示成熟肝細胞的大多邊形表面和雙核中心特征。
鋪在分化劑中后的第6天，用RT-PCR和免疫細胞化學根據(jù)上述方法分析細胞的標記表達。用高碘酸Schiff染料測定這些細胞中的糖原含量。通過在鋪板后第5天將細胞與10μm BrdU溫育，然后用抗BrdU抗體在24小時后染色，來測定細胞周期的S期中的細胞數(shù)。
圖3顯示了某些細胞特異性標記的免疫組織化學染色的結果。圖3A(40X)顯示了從匹茲堡大學獲得的原代成年人肝細胞的結果-抗體染色在右側，對于相同視野用Hoechst HH33258二苯酰亞胺染色的細胞核在左側。圖3B(20X)顯示了用正丁酸鹽培養(yǎng)6天的hES細胞的結果。兩組細胞對白蛋白、α1-抗胰蛋白酶和CD18顯示高比例的細胞染色，肝細胞譜系細胞的三個特征性標記，和對α-胎蛋白陰性是早祖細胞的標記。
圖4顯示了用正丁酸鹽培養(yǎng)6天的細胞的糖原染色圖(10X和40X)。用高碘酸Schiff染色細胞中的糖原(粉紅、深色)，用Fast Green染色勾畫細胞胞質(背景綠色，淺色)。約60％丁酸鹽處理的細胞顯示糖原儲藏的證據(jù)(頂部列)，與胎兒肝細胞的80％(中部列，陽性對照)和人成纖維細胞(稱為BJ成纖維細胞)中幾乎沒有(底部列，陰性對照)比較。
表5提供了表型分析的總結。在55％的細胞中發(fā)現(xiàn)白蛋白表達。完全不存在AFP。在至少60％細胞中儲藏糖原。16％的細胞被BrdU標記，表明大部分的細胞在分析時增殖。
表5；分化的細胞表型
還在用正丁酸鹽培養(yǎng)6天后進行了RT-PCR分析，觀察在肝細胞中正常表達的各種基因的表達模式。這些數(shù)據(jù)與相同基因在成年肝細胞、胎兒肝細胞、HepG2細胞(肝癌系)和非肝細胞RPE(視網(wǎng)膜色素上皮)細胞系中的表達模式比較。結果如表6所示。
表6基因表達的RTPCR分析
將正丁酸鈉的效果與其它可能的肝細胞分化劑在相似方案中比較。懸浮培養(yǎng)胚狀體4天，然后重新鋪在包涂膠原酶I的板上。然后在各化合物存在下培養(yǎng)細胞6天。結果如表7所示。
表7肝細胞分化劑
+導致肝細胞分化并選擇性除去其它細胞類型
-無誘導作用±輕微誘導作用；可能允許其它細胞類型的生長或存活在5mM濃度，氯化鈉沒有作用，而丁酸和丁酸鈉相等有效-表明分化不是簡單由于離子濃度的變化。讀者應理解丁酸和丁酸鈉在培養(yǎng)基的緩沖能力范圍內(nèi)是相同物質的共軛形式。因此，術語在本公開中可互換除非需要另外說明。
為了比較，以6mM測試各種丁酸鹽的結構類似物。類似物丙酸、異纈草酸和異丁酸有效導致肝細胞分化，但被認為在這些條件下不是優(yōu)選的，因為富集具有肝細胞表型的細胞不夠強。
曲古抑菌素A是組蛋白去乙酰酶的另一抑制劑，發(fā)現(xiàn)在2.5-100μM的范圍內(nèi)對細胞有毒，在10-50nm范圍內(nèi)是無效的。在75-100nM，曲古抑菌素A似乎誘導肝細胞分化并選擇對抗其它細胞類型的存活。用5mm正丁酸鈉和100nM曲古抑菌素A產(chǎn)生的肝細胞譜系細胞的表型如表8所示。
表8分化的細胞的表型
實施例3用肝細胞成熟因子提高正丁酸鹽的分化作用在用正丁酸鹽分化的細胞中測試了各種可能的肝細胞成熟因子的作用。在5mM正丁酸鈉中培養(yǎng)hES 4天，然后換到不同的培養(yǎng)基中。測試了下列替代物1.Clonetics的“HCM”培養(yǎng)基2.10％胎牛血清(FBS)，補充有胰島素、表皮生長因子(EGF)、地塞米松和胰高血糖素；3.10％小牛血清(CS)，補充有胰島素、EGF、地塞米松和胰高血糖素；4.20％FBS，補充有胰島素、EGF、地塞米松和胰高血糖素在這些條件下維持細胞4天。細胞在所有條件下存活，但在10％FBS和生長因子(組2和4)中看來最好。用胰蛋白酶消化這些細胞，重新鋪在用新鮮Matrigel包涂的平板中。用相似方案或組合測試其它生長因子，來確定它們對肝細胞成熟和細胞表型的作用。
實施例4hES衍生的肝細胞的端粒化用丁酸鈉分化hES幾天后，用編碼人端粒酶反轉錄酶(hTERT)的人同系物的反轉錄病毒轉導細胞。載體含有來自質粒pGRN145的hTERT編碼序列，在市售的pBABE嘌呤霉素構建物的EcoR1位點內(nèi)。hTERT編碼序列置于反轉錄病毒啟動的控制下。用PA317包裝細胞系制備對照和hTERT pBABE反轉錄病毒上清液，并與4μg/ml多聚季銨混合。
制備分化的hES細胞培養(yǎng)物，用含有反轉錄病毒上清液的培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基8-16小時。再次用正常生長培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基，使細胞恢復1-2天。然后用0.5-2.5微克/毫升嘌呤霉素選擇細胞。用形態(tài)學方法評估細胞的生長速率，用免疫細胞化學和RT-PCR評估表達模式。用TRAP測定評估端粒酶活性。
實施例5人胚胎干細胞在無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物中的分化未分化的hES集落在無飼養(yǎng)細胞的條件下如下連續(xù)傳代。培養(yǎng)物在1mg/ml膠原酶中37℃溫育5分鐘。通過將細胞從表面刮下，并解離成小簇，收集細胞。將細胞以1∶3或1∶6，約55000細胞/ml(17000細胞/平方厘米)分開。重新鋪板后，可再次鑒定未分化的細胞的集落。集落之間的單個細胞分化了。在幾天后，見到未分化的細胞增殖，集落變大和緊密。集落之間分化的細胞變得更緊密。細胞在每天用條件培養(yǎng)基喂養(yǎng)，4-7天后變匯合。當細胞達到匯合時，再次將它們分開。
對于該實施例，分化前將H9 hES細胞(p30+5)維持在無飼養(yǎng)細胞條件下30天(5次傳代)。將未分化的細胞維持在層粘連蛋白上，用MEF條件培養(yǎng)基飼養(yǎng)，如本公開之中所述。為了誘導分化，用含有5mM丁酸鈉的SR培養(yǎng)基(未補充bFGF)替換條件培養(yǎng)基。
在這些條件中1天后，可見到具有肝細胞樣形態(tài)的小塊細胞。另外，大量細胞死亡并似乎粘附在培養(yǎng)皿底部。在接受不含丁酸鹽的SR培養(yǎng)基的對照培養(yǎng)物中，觀察到大量的多種多樣的分化(具有不同形態(tài)的細胞)。處理6天后，接受丁酸鈉的培養(yǎng)物含有許多塊的肝細胞樣細胞，但也鑒定出一些具有其它形態(tài)的細胞。許多死亡細胞仍粘著在培養(yǎng)皿上。不接受丁酸鹽的培養(yǎng)物似乎非常分化，具有多種多樣的表型。
在隨后的實驗中，維持在無飼養(yǎng)細胞條件中的hES細胞與丁酸鈉在傳代時接觸。在匯合時用膠原酶收集稱為H9并在Matrigel上維持48小時(8次傳代)的hES細胞系，并重新接種在Matrigel上。將細胞在含有5mM丁酸鈉的SR培養(yǎng)基中傳代，并在培養(yǎng)的不同時間評估肝細胞樣形態(tài)和基因表達，與不用丁酸鹽培養(yǎng)的細胞比較。
實施例6丁酸鹽聯(lián)合DMSO的作用在該實驗中，在肝細胞成熟因子DMSO的存在下確定肝細胞分化劑丁酸鹽的作用。
在4天后收集懸浮培養(yǎng)的人ES細胞衍生的胚狀體，鋪在下列四種條件中。
·5mM丁酸鈉存在下明膠包涂的平板·5mM丁酸鈉和1％DMSO存在下明膠包涂的平板·5mM丁酸鈉存在下Matrigel包涂的平板·5mM丁酸鈉和1％DMSO存在下Matrigel包涂的平板每隔一天更換培養(yǎng)基，在第7天用免疫細胞化學和RT-PCR分析細胞。在這些條件下的細胞看來形態(tài)相似，包括具有均一形態(tài)的細胞集落。在存在丁酸鹽和DMSO的組中有較少的細胞集落，與單獨在丁酸鹽中培養(yǎng)比較。鋪在明膠上的兩組具有甚至更少的細胞。
免疫染色顯示在所有條件中具有相似的標記表型。培養(yǎng)物中測試的各標記染色的細胞百分數(shù)如表9所示。
表9分化的細胞的表型
實施例7hES不形成胚狀體直接分化肝母細胞樣細胞未分化的hES細胞維持在無飼養(yǎng)細胞條件下(在Matrigel上，MEF-CM中)。策略是通過在亞匯合的培養(yǎng)物中加入肝細胞成熟因子DMSO或視黃酸(RA)，引發(fā)全面分化過程。然后通過加入丁酸鈉誘導細胞形肝母細胞樣細胞。
分開后，hES細胞維持在未分化的培養(yǎng)條件中2-3天。此時，細胞約50-60％匯合，用含有1％DMSO的無條件養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。每天用SR喂養(yǎng)培養(yǎng)物4天，然后交換到含有2.5％丁酸鈉的無條件SR培養(yǎng)基中。每天用該培養(yǎng)基喂養(yǎng)培養(yǎng)物6天；此時用免疫細胞化學評估培養(yǎng)物的一半。另一半培養(yǎng)物用胰蛋白酶酶收集，重新鋪在膠原上，進一步促進富集肝細胞譜系的細胞。然后在翌日進行免疫細胞化學。
如表10所示，經(jīng)過最終重新鋪板的細胞具有比未重新鋪板的細胞高5倍的白蛋白表達，類似的α1-抗胰蛋白酶表達和低2倍的細胞角蛋白表達。據(jù)信第二次細胞鋪板富集了肝細胞樣細胞。
表10分化的細胞的表型
實施例8用于hES細胞分化肝細胞的不同基質的比較在無飼養(yǎng)細胞條件中，從hES細胞產(chǎn)生EB。在懸浮4天后，將EB鋪在補充有5mM丁酸鈉或5mM丁酸鈉和1％DMSO的20％FBS培養(yǎng)基中。EB鋪在下列基質上1.膠原I(0.03mg/ml，37℃包裹過夜)2.減少生長因子的Matrigel(1∶10，室溫包涂1小時)3.明膠(1％，37℃包裹2小時)在丁酸鈉中5天后，用形態(tài)學方法評估細胞并用免疫細胞化學檢測肝細胞標記。在所有條件中，觀察到肝細胞樣細胞的均一塊。然而，與其它條件的相比細胞簇的數(shù)量在用明膠包涂的培養(yǎng)物中，大大減少。如表11所示，在所有條件中具有白蛋白、細胞角蛋白和α1-抗胰蛋白酶免疫反應性的細胞百分數(shù)相似。在所有條件中糖原儲藏也是相似的。這些數(shù)據(jù)表明所有測試的基質促進肝細胞分化，但Matrigel和膠原I包涂支持存活的效果比明膠更好。
表11分化的細胞的表型
實施例9直接分化條件的進一步優(yōu)化hES細胞經(jīng)過先前詳述的直接分化方法，調節(jié)到表12所示的培養(yǎng)條件。肝細胞培養(yǎng)基購自Clonetics；Strom培養(yǎng)基是如Runge等，Biochem.Biophys.Res.Commun.265376，1999中所述制備的。獲得的細胞群用免疫細胞化學和酶活性評估。
表12直接分化方案
在隨后的(4天)成熟步驟中測試的其它添加劑包括因子，例如FGF-4和地塞米松存在下的制瘤素M。
圖5顯示了HCM對hES衍生的細胞的成熟作用。左欄10X放大；右欄40X放大。在丁酸鹽存在中截止4天，培養(yǎng)物中80％以上的細胞直徑大，含有大核和顆粒狀胞質(A列)。在SR培養(yǎng)基中5天后，將細胞轉換到HCM中。2天后，許多細胞變成多核，具有大的多邊形形狀(B列)。在HCM中截止4天，常見多核化多邊形細胞，并具有較深的胞液(C列)，根據(jù)這些條件它們與新鮮分離的人成年肝細胞(D列)或胎兒肝細胞(E列)相似。
實施例10代謝酶活性測試了直接分化方案產(chǎn)生的hES衍生的肝細胞譜系細胞的細胞色素P450活性。
在分化方案完成后，細胞與或不與5μM甲基膽蒽(cholranthrene)，一種細胞色素P450酶1A1和1A2的(CYP1A1/2)誘導劑一起培養(yǎng)。測量酶活性，作為乙氧基試鹵靈(EROD)的去乙基化的速率。在培養(yǎng)基中以5μM加入底物，并在2小時后在熒光顯微平板閱讀儀上，355nm激發(fā)和581nm發(fā)射處測定培養(yǎng)物上清液的熒光。用對純試鹵靈測定的標準曲線確定形成的試鹵靈量，并表達成每毫克蛋白質每分鐘形成的微微摩爾試鹵靈。
圖6顯示了結果。在測試到的三個肝細胞譜系細胞系中檢測了CYP1A1/2活性-兩個衍生自H1 ES細胞系，一個衍生自H9 ES細胞系。用甲基膽蒽(MC)可誘導活性水平，并超過在兩個新鮮分離的人成年肝細胞(HH)制備物中的觀察到的水平。未分化的H1和H9細胞中的活性水平(和在BJ人胚胎成纖維細胞系中)是可忽略的。
應理解本領域技術人員可有效地修改本公開中所述的組合物和方法，而不違背以下權利要求中所體現(xiàn)的本發(fā)明的精神。
權利要求
1.一種通過分化靈長類多能干細胞獲得的，可在體外培養(yǎng)物中分化的細胞群，其特征在于，在該群中至少約60％的細胞具有下列特征的至少三種·α1-抗胰蛋白酶的抗體可檢測表達；·白蛋白的抗體可檢測表達；·不存在α-胎蛋白的抗體可檢測表達；·無唾液酸糖蛋白受體的RT-PCR可檢測表達；·糖原儲藏的證據(jù)；·細胞色素p450活性的證據(jù)；·葡萄糖-6-磷酸酶活性的證據(jù)；和·肝細胞的形態(tài)特征。
2.如權利要求1所述的分化的細胞群，其特征在于，至少約60％的細胞具有所述特征中的至少5個。
3.如權利要求1所述的分化的細胞群，其特征在于，至少約80％的細胞具有所述特征中的至少7個。
4.如前任一權利要求所述的分化的細胞群，其特征在于，細胞色素p450酶1A1/1A2活性的水平是至少和原代人成年肝細胞中的一樣高。
5.如前任一權利要求所述的分化的細胞群，其特征在于，從靈長類多能干細胞分化出的細胞是人胚胎干細胞。
6.如前任一權利要求所述的分化的細胞群，其特征在于，所述細胞群被基因改變，以提高的水平表達端粒酶。
7.如前任一權利要求所述的分化的細胞群，其特征在于，所述細胞群是通過在含有肝細胞分化劑的生長環(huán)境中培養(yǎng)靈長類多能干細胞獲得的。
8.如權利要求7所述的分化的細胞群，其特征在于， 所述肝細胞分化劑是正丁酸鹽。
9.如前任一權利要求所述的分化的細胞群，其特征在于，在含有胞外基質的生長環(huán)境中培養(yǎng)靈長類多能干細胞。
10.如前任一權利要求所述的分化的細胞群，其特征在于，在含有一種或多種肝細胞成熟因子的生長環(huán)境中培養(yǎng)靈長類多能干細胞。
11.如權利要求10所述的分化的細胞群，其特征在于，肝細胞分化因子中的至少一種是a)選自二甲基亞砜、二甲基乙酰胺；六亞甲基二乙酰胺和其它聚亞甲基二乙酰胺的有機溶劑；或b)選自糖皮質激素、表皮生長因子、胰島素、TGF-α、TGF-β、成纖維細胞生長因子、肝素和肝細胞生長因子、IL-1、IL-6、IGF-I、IGF-II和HBGF-1的細胞或激素。
12.在基本無飼養(yǎng)細胞、胞外基質、肝細胞分化劑和肝細胞成熟因子的組合物中的前述任一權利要求所述的分化的細胞群。
13.具有權利要求1列出的至少三種特征的分化細胞群，它是從權利要求1所述的分化的細胞群收集的，或是這樣的細胞的子代。
14.一種分化的細胞群，其特征在于，該細胞群是通過提供在基本無飼養(yǎng)細胞的生長環(huán)境中的人多能干細胞；在含有肝細胞分化劑的培養(yǎng)基中，在產(chǎn)生富含肝細胞特征性特征的細胞群的條件下培養(yǎng)所述人多能干細胞；和隨后從富集的細胞群中收集具有這些特征的細胞產(chǎn)生的。
15.一種處理人多能干細胞獲得可在體外培養(yǎng)分化的細胞的方法，其特征在于，該方法包括a)提供人多能干細胞的培養(yǎng)物；b)在含有肝細胞分化劑的培養(yǎng)基中的基板上，在導致分化的細胞富集的條件下培養(yǎng)細胞。
16.如權利要求15所述的方法，其特征在于，人多能干細胞的培養(yǎng)物是在形成胚狀體的條件下培養(yǎng)細胞；將胚狀體鋪在胞外基質上，在胚狀體鋪板的同時或隨后加入肝細胞分化劑；和然后用肝細胞分化劑在允許分化的細胞富集的條件下培養(yǎng)鋪板的細胞產(chǎn)生的。
17.如權利要求15-16所述的方法，其特征在于，在含有胞外基質但基本無飼養(yǎng)細胞的人多能干細胞培養(yǎng)物中加入肝細胞分化劑；然后用肝細胞分化劑在允許分化的細胞富集的條件下培養(yǎng)人多能干細胞。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述胞外基質包括層粘連蛋白、膠原、或來自Engelbreth-Holm-Swarm細胞的基質。
19.如權利要求15-18所述的方法，其特征在于，所述肝細胞分化劑是正丁酸鹽。
20.如權利要求15所述的方法，其特征在于，該方法還包括在用肝細胞分化劑培養(yǎng)的同時或隨后，用一種或多種肝細胞成熟因子培養(yǎng)細胞。
21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，至少一種肝細胞成熟因子是a)一種有機溶劑，選自二甲基亞砜、二甲基乙酰胺、六亞甲基二乙酰胺和其它聚亞甲基二乙酰胺；或b)一種細胞因子或激素，選自糖皮質激素、表皮生長因子、胰島素、TGF-α、TGF-β、成纖維細胞生長因子、肝素和肝細胞生長因子、IL-1、IL-8、IGF-I、IGF-II和HBGF-1。
22.一種產(chǎn)生一群在培養(yǎng)物中增殖，具有細胞色素p450活性的細胞的方法，其特征在于，該方法包括在分化成具有細胞色素p450活性的細胞前或后，提高靈長類多能干細胞中的端粒酶活性。
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，通過基因改變細胞，使其表達端粒酶反轉錄酶，提高細胞中的端粒酶活性。
24.一種根據(jù)權利要求15-23所述的方法產(chǎn)生的分化的細胞，或所述細胞的子代。
25.如權利要求24所述的分化的細胞，其特征在于，該細胞具有下列特征的至少三種·α1-抗胰蛋白酶的抗體可檢測表達；·白蛋白的抗體可檢測表達；·不存在α-胎蛋白的抗體可檢測表達；·無唾液酸糖蛋白受體的RT-PCR可檢測表達；·糖原儲藏的證據(jù)；·細胞色素p450活性的證據(jù)；·葡萄糖-6-磷酸活性的證據(jù)；和·肝細胞的形態(tài)特征。
26.一種篩選肝細胞毒性的化合物的方法，其特征在于，該方法包括將權利要求1-14或24-25所述的分化的細胞與化合物混合，并確定化合物是否對細胞有毒性。
27.一種篩選化合物調節(jié)肝細胞功能的方法，其特征在于，該方法包括將權利要求1-14或24-25所述的分化的細胞與化合物混合，確定由于與化合物接觸導致的細胞表型或代謝的變化，并將所述變化與調節(jié)肝細胞功能的能力聯(lián)系起來。
28.如權利要求26-27所述的篩選方法，其特征在于，基因改變所述的分化細胞，使其表達端粒酶反轉錄酶。
29.一種去除液體毒性的方法，其特征在于，該方法包括使權利要求1-14或24-25所述的分化的細胞與液體在允許細胞除去或改變液體中毒素的條件下接觸。
30.一種肝臟支持裝置，其特征在于，安排權利要求1-14或24-25所述的分化的細胞除去從病人流出的血液的毒性，然后該血液在用裝置解毒后流回病人。
31.一種在個體中重建或補充肝細胞功能的方法，其特征在于，該方法包括在個體腹腔中施用多個權利要求1-14或24-25所述的細胞。
32.一種在個體中重建或補充肝細胞功能的方法，其特征在于，該方法包括將個體與權利要求31所述的肝臟支持裝置以其血液循環(huán)流過的方式連接，并用該裝置解毒。
全文摘要
已發(fā)現(xiàn)在肝細胞分化劑存在下培養(yǎng)多能干細胞時，衍生出一群細胞，其中有顯著高比例的具有干細胞表型特征的細胞。在一個例子中，使人胚胎干細胞形成胚狀體，然后與分化劑正丁酸鹽混合，可任選地補充成熟因子。在另一個例子中，在無飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)物中的人胚胎干細胞中加入正丁酸鹽。在兩種方法中都獲得了顯著均一的細胞群，它主要是由具有肝細胞形態(tài)特征的細胞組成的，表達肝細胞特征性表面標記，還具有對肝功能重要的酶和生物合成作用。由于肝細胞易在培養(yǎng)物中增殖，因此該系統(tǒng)為各種用途，例如藥物篩選和臨床治療中補充肝功能提供了肝細胞譜系細胞的豐富來源。
文檔編號C12N5/10GK1439049SQ01811938
公開日2003年8月27日 申請日期2001年4月26日 優(yōu)先權日2000年4月27日
發(fā)明者拉克舒美·藍哈拉, 莫莉莎·K·卡本特 申請人:杰龍公司