專利名稱：用于重組蛋白質(zhì)過量表達(dá)的起始密碼子下游被修飾的構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在原核細(xì)胞中表達(dá)編碼目的重組蛋白質(zhì)的基因的構(gòu)建體，該基因置于色氨酸操縱子Ptrp的控制之下，該構(gòu)建體包含在起始密碼子直接下游的序列SEQ ID No.1的核酸序列和位于該序列下游的、接受編碼所述的目的重組蛋白質(zhì)的基因的多克隆盒，該序列SEQ IDNo.1的至少一個(gè)核苷酸突變或缺失，從而使所述的重組蛋白質(zhì)過量表達(dá)。本發(fā)明還涉及包含該構(gòu)建體的載體、用該載體轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞、以及利用本發(fā)明的構(gòu)建體產(chǎn)生目的重組蛋白質(zhì)的方法。
由于生物技術(shù)學(xué)家能夠在短期內(nèi)克隆一個(gè)基因、將其以生物活性蛋白質(zhì)形式表達(dá)、然后創(chuàng)造其變體以建立序列/功能關(guān)系，因此這使得提供用于醫(yī)療或研究目的的許多重組蛋白質(zhì)成為可能。由于可以應(yīng)用來自生物技術(shù)的純凈形式的和可接受的價(jià)格的分子，目前許多人類疾病可以得到治療或避免(K.Koths，Current Opinion in Biotechnology，6，681-687，1995)。
細(xì)菌細(xì)胞是優(yōu)選的表達(dá)重組蛋白質(zhì)的宿主是因?yàn)樗鼈儬I養(yǎng)需求有限而同時(shí)可以達(dá)到很高的生長密度，但也由于在過去它們是許多研究的對象因此產(chǎn)生了許多目的突變體和不同的質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)。通過從大量的有關(guān)在其中表達(dá)原核或真核來源的蛋白質(zhì)的文獻(xiàn)可以判斷出，在細(xì)菌中大腸桿菌(Escherichia coli(E.coli))是最常用和鑒定最完善的生物體。但是由于在多個(gè)水平(目的基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、影響該分子在細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)環(huán)境中的結(jié)局的翻譯后事件)上存在的困難使得不是所有的蛋白質(zhì)都能以相同的效率在其中得到表達(dá)(S.C.Makrides，Microbiological Reviews，60，512-538，1996)。
為了有效翻譯，信使RNA必須含有特異結(jié)合細(xì)菌的核糖體和能使翻譯起始的序列。稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的該序列位于包括起始密碼子的區(qū)域。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析細(xì)菌的mRNA起始結(jié)構(gòu)域表明存在一34核苷酸的窗口(window)，其序列與隨機(jī)分布的不同(L.Gold，AnnualReview of Biochemistry，57，199-233，1988)。如果+1位為起始密碼子的第一個(gè)核苷酸的話，該序列為mRNA的-20位至+13位，其通過幫助核糖體從所有的“RBS樣”序列中區(qū)別真正的起始結(jié)構(gòu)域而發(fā)揮RBS的作用。許多研究使有關(guān)RBS的知識(shí)完善以定義其一些特征性成分成為可能i)Shine-Dalgarno(SD)序列經(jīng)16S核糖體RNA的3′末端序列測定(J.Shine and L.Dalgarno，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，71，1342-1346，1974)，將“ Shine-Dalgarno”序列定義為與16S rRNA的3′末端序列5′-CCUCCUUA-3′互補(bǔ)的定位起始密碼子5′末端的mRNA區(qū)。通過E.coli mRNA的天然RBS區(qū)(-12；-7)的嘌呤堿基A和G的強(qiáng)表現(xiàn)度證實(shí)了Shine-Dalgarno序列介導(dǎo)的16S rRNA和RBS間的相互作用。也在158種基于其促進(jìn)報(bào)告基因表達(dá)的能力選擇的、隨機(jī)化的RBS中發(fā)現(xiàn)這種傾向性(D.Barrick等，NucleicAcid.Res.，22，1287-1295，1994)。
ii)起始密碼子盡管GUG以及再次UUG可以偶爾被發(fā)現(xiàn)為啟動(dòng)密碼子，但是優(yōu)選AUG密碼子作為起始密碼子(S.Ringquist等，MolecularMicrobiology，6，1219-1229，1992)。
iii)SD序列和起始密碼子之間的距離H.Chen等人的詳盡地研究(Nucleic Acid Reserch，22，4953-4957，1994a)已經(jīng)表明在SD序列的3′末端和起始密碼子之間存在最適間隔距離。將共有序列5′-UAAGGAGGU-3′作為參考SD序列，可以使最大水平表達(dá)的間隔是5個(gè)核苷酸。1-9個(gè)核苷酸的間隔都是有效的，可以保證至少50％最大水平的表達(dá)水平。
iv)其它主要序列已知在起始翻譯中涉及兩種配對首先是mRNA起始密碼子和tRNA-fMet之間的配對，另外是SD序列和16S rRNA 3′末端之間的配對。突變研究和非典型mRNA(特別是缺少引導(dǎo)序列的mRNA)的分析使在AUG密碼子的周圍鑒定新序列成分(其可能導(dǎo)致了起始結(jié)構(gòu)域的全部功效)成為可能。緊接著起始密碼子下游的富含腺嘌呤的基序有助于翻譯起始(G.F.E.Scherer等，Nucleic Acids Research，8，3895-3907，1980；H.Chen等，Journal of Molecular Biology，240，20-27，1994b)。類似的，在第二密碼子位置(L.Gold，1988)最常見的AAA和GCU密碼子對翻譯也有正面的影響，特別是當(dāng)該起始密碼子不是最適宜的時(shí)(GUG或UUG)(S.Ringquist等，1992)。在T7噬菌體0.3基因的mRNA上鑒定的、稱為“Downstream Box(下游盒)”(DB)的序列，因其位于起始密碼子的下游，是另一種翻譯促進(jìn)成分(M.L.Sprengart等，Nucleic Acids Research，18，1719-1723，1990)。該12個(gè)核苷酸的序列與16S rRNA的1469-1483位核苷酸互補(bǔ)，并且在幾種高度表達(dá)的E.coli和細(xì)菌噬菌體基因的翻譯起始結(jié)構(gòu)域中具有類似的形式(M.L.Sprengart等，1990)。該“Downstream Box”即使在缺少SD序列的情況下也能使翻譯起始(M.L.Sprengart等，The EMBO Journal，15，665-674，1996)。最近的研究結(jié)果表明，與最初提出的假設(shè)相反，該DB序列可能通過與16S rRNA的1469-1483區(qū)域配對不同的機(jī)制起作用(M.O′Connor等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，96，8973-8978，1999)。
v)二級結(jié)構(gòu)在SD區(qū)附近的mRNA序列可能通過形成二級結(jié)構(gòu)影響翻譯的效率。M.H.de Smit和J.van Duin(Journal of Molecular Biology，235，173-184，1994)表明mRNA分子內(nèi)配對可通過與mRNA/rRNA配對競爭對正確的翻譯不利，SD區(qū)與16S rRNA的互補(bǔ)性越弱時(shí)更加如此。同樣地也已表明凝乳酶原在E.coli中的表達(dá)依賴于連接SD序列與起始密碼子區(qū)域的組成限制二級結(jié)構(gòu)的序列促進(jìn)RBS接近核糖體，并導(dǎo)致高的表達(dá)效率(G.Wang等，Protein Expression ang Purification，6，284-290，1995)。
由于翻譯起始步驟對重組蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)量的重要性，為優(yōu)化細(xì)菌表達(dá)載體的RBS區(qū)進(jìn)行了許多研究。一種直觀的方法是首先將完整的共有SD區(qū)(UAAGGAGGU)置于目的基因的上游(G.Jay等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，78，5543-5548，1981)。D.M.Marquis等(Gene，42，175-183，1986)比較系統(tǒng)地將該序列置于多種啟動(dòng)子的下游，并與起始密碼子不同的距離(5-9個(gè)核苷酸)。以IL-2基因?yàn)槟Ｐ?，結(jié)果顯示對幾乎所有的被測試啟動(dòng)子來說，6個(gè)核苷酸的SD/AUG間隔是最適的。但是，W.Mandecki等(Gene，43，131-13，1986)在共有SD序列和lacZ基因的SD序列之間的比較研究中指出共有SD序列的體外表達(dá)水平較高，但在體內(nèi)時(shí)較lacZ的SD序列弱2-2.5倍。也已經(jīng)證實(shí)對于不同來源(植物、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌)的蛋白質(zhì)的表達(dá)來說，來自噬菌體基因的、帶有其本身SD序列的完整的RBS區(qū)優(yōu)于共有SD序列(P.O.Olins等，Gene，73，227-235，1998)。K.Curry和C.S.C.Tomich(DNA，7，173-179，1988)利用色氨酸啟動(dòng)子比較了共有序列SD序列與Ptrp天然存在的SD序列的效率。他們的結(jié)果表明對所研究的目的基因有很強(qiáng)的依賴性，并得出結(jié)論構(gòu)建對所有異源基因都起作用的最適載體是不可能的。M.K.Olsen等人(Journal of Biotechnology，9，179-190，1989)也研究了色氨酸啟動(dòng)子和共有SD序列，通過富集SD區(qū)側(cè)翼序列的A和T核苷酸對多種異源蛋白質(zhì)(生長激素、TNF)獲得了非常高的表達(dá)水平(總蛋白的20-30％)。早前H.A.De Boer等人(DNA，2，231-235，1983)描述了類似的結(jié)果，其指出了在雜和啟動(dòng)子Ptrp/PlacUV5表達(dá)α-干擾素時(shí)置于SD區(qū)下游的A和T堿基的正效應(yīng)。
所有的結(jié)果都是從僅考慮有限參數(shù)的試驗(yàn)中獲得的。由于意識(shí)到許多因素(已知的和未知的)對翻譯的起始有影響，尤其意識(shí)到未被反復(fù)的試驗(yàn)所考慮的因素間的相互作用可能具有重要的作用，隨后一些作者嘗試從大的隨機(jī)文庫中篩選體內(nèi)最佳的合成的RBS。因此R.S.Wilson等人(BioTechniques，17，944-952，1994)篩選了起始密碼子上游16處簡并的所有組成序列(在含有l(wèi)ac啟動(dòng)子/操縱子控制下的β-內(nèi)酰胺酶基因的表達(dá)盒之內(nèi))。該試驗(yàn)有可能鑒定具有3倍高的表達(dá)效率的表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶的原始序列。利用另一種編碼scFv的基因時(shí)，過量表達(dá)水平為原始RBS的大約2倍。
鑒于這些結(jié)果，可以確定最佳RBS區(qū)通常在特定情況下涉及目的基因序列和mRNA前導(dǎo)區(qū)序列(其本身依賴于所用啟動(dòng)子的類型)的區(qū)域。色氨酸啟動(dòng)子(B.P.Nichols和C.Yanofsky，Methods inEnzymology，101，155-164，1983)是用于重組蛋白質(zhì)表達(dá)的主要系統(tǒng)之一(D.G.Yansura和D.J.Henner，Methods in Enzymology(AnonymousAcademic Press，Inc.，San Diego，CA)54-60，1990；D.G.Yansura和S.H.Bass，Methods in Molecular Biology，62，55-62，1997)，但是其RBS從來未是利用基于隨機(jī)序列篩選的方法進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化的對象。
對于希望開發(fā)工業(yè)規(guī)模的方法的生物技術(shù)學(xué)家來說，具有使無論何種目的蛋白質(zhì)都能最大表達(dá)的工具是非常重要的。因此，對能夠可能最優(yōu)化重組蛋白質(zhì)表達(dá)的任何增強(qiáng)(通過宿主菌株、表達(dá)載體、培養(yǎng)和表達(dá)方法或這些因素的任意組合導(dǎo)致的增強(qiáng))都有極大的興趣。
更具體而言，本發(fā)明從翻譯的效率上證明了新型核苷酸序列(表達(dá)載體攜帶的、在核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)區(qū)、色氨酸啟動(dòng)子(Ptrp)的下游)的優(yōu)點(diǎn)。
本申請人利用在起始密碼子上游引入的簡并寡核苷酸，然后選擇過量表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)報(bào)告基因的克隆尋找新型最優(yōu)化的RBS序列。在起始密碼子的上游尋找最優(yōu)化的序列時(shí)意外的發(fā)現(xiàn)可以突變或缺失位于起始密碼子直接下游的核酸序列以過量表達(dá)重組蛋白質(zhì)。因此獲得的序列具有增強(qiáng)不同來源的多種目的基因表達(dá)的特性。
另外，有關(guān)當(dāng)前限制質(zhì)量的主要問題是獲得盡可能純的重組蛋白質(zhì)，即在該重組蛋白質(zhì)的上游或下游嫁接最少量的由所使用的構(gòu)建體產(chǎn)生的氨基酸。當(dāng)位于起始密碼子和第一個(gè)克隆位點(diǎn)之間的核酸序列存在缺失以至于過量表達(dá)重組蛋白質(zhì)時(shí)，本發(fā)明也解決了該問題。
因此本發(fā)明的主題是用于在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)置于色氨酸操縱子啟動(dòng)子Ptrp控制下的編碼重組蛋白質(zhì)的基因的構(gòu)建體，其包含起始密碼子直接下游的序列SEQ ID No.1的核酸序列、位于該序列下游的用來接受編碼所述目的重組蛋白質(zhì)的基因的多克隆盒，其特征在于該序列SEQ ID No.1中至少一個(gè)核苷酸被突變或缺失使得所述的重組蛋白質(zhì)過量表達(dá)。
因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)了沒有修飾的該序列SEQ ID No.1的使用，因此根據(jù)本發(fā)明獲得過量表達(dá)更加出人意料。為此需特別提到專利US5,714,589、US5,468,845、US5,418,135、US4,891,310、US4,789,702、WO88/09344、US4,738,921和EP0 212 532，其教導(dǎo)在起始密碼子下游的序列SEQ ID No.1表達(dá)目的蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
表述“目的重組蛋白質(zhì)”是指通過基因重組獲得的并能用于人類或動(dòng)物健康領(lǐng)域、美容業(yè)領(lǐng)域、動(dòng)物營養(yǎng)領(lǐng)域、工農(nóng)業(yè)領(lǐng)域或化學(xué)工業(yè)領(lǐng)域的所有的蛋白質(zhì)、多肽或肽。在這些目的蛋白質(zhì)中需特別提到、但不限于此的是-細(xì)胞因子并特別是白細(xì)胞介素、干擾素、組織壞死因子和生長因子并特別是造血生長因子(G-CSF、GM-CSF)、人類生長激素或胰島素、神經(jīng)肽；-在凝固中涉及的因子或輔因子并特別是因子VIII、yonWillebrand因子、抗凝血酶III、蛋白C、凝血酶和水蛭素；-酶并特別是胰蛋白酶、核酶和β-半乳糖苷酶；-酶抑制因子如α1-抗胰蛋白酶和病毒蛋白酶抑制因子；-能夠抑制癌癥起始或發(fā)展的蛋白質(zhì)，如腫瘤抑制基因(例如P53基因)的表達(dá)產(chǎn)物；-能夠刺激免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)或抗原，如革蘭氏陰性(Gram-negative)細(xì)菌的膜蛋白或其活性片段，特別是克雷白氏桿菌屬(Klebsiella)OmpA蛋白質(zhì)或人呼吸道合胞病毒蛋白G；-可能或不可能人源化的單克隆抗體或抗體片段如scFv-能夠抑制病毒感染或其發(fā)展的蛋白質(zhì)，例如所討論的病毒的抗原性表位或病毒蛋白修飾的變體，其能夠與天然病毒蛋白質(zhì)競爭；-常用于化妝品組合物中的蛋白質(zhì)，如物質(zhì)P或超氧化物歧化酶；-食物蛋白質(zhì)并特別是alicament；-能夠指導(dǎo)合成化學(xué)或生物學(xué)化合物的蛋白質(zhì)，或能夠降解某些毒性化合物的蛋白質(zhì)；或
-對產(chǎn)生其的微生物具有毒性的任何蛋白質(zhì)，特別是例如如果該微生物是E.coli時(shí)的HIV-1病毒蛋白酶、ECP蛋白(“嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白”)、或脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白2B和3A。
表述“序列SEQ ID No.1的核酸序列，該序列中至少一個(gè)核苷酸突變或缺失使所述的重組蛋白質(zhì)過量表達(dá)”是指包含序列SEQ ID No.1的至少一個(gè)核苷酸缺失或突變的任何序列，與使用未修飾的序列SEQID No.1獲得的所述的重組蛋白質(zhì)相比，其使重組蛋白質(zhì)過量表達(dá)。
術(shù)語“缺失”是指在序列SEQ ID No.1的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位點(diǎn)去除一個(gè)或多個(gè)核苷酸。獲得的序列較原始序列短。
術(shù)語“突變”是指用另一種核酸替換一種核酸(A用C、G或T；C用A、G或T；G用A、C或T；T用A、C或G)。獲得的序列與原始序列具有相同的長度。
可以利用下列方法之一具體地確定過量表達(dá)(即獲得比起始密碼子下游沒有修飾時(shí)獲得的表達(dá)更大的表達(dá)的情況)i)通過SDS-PAGE遷移細(xì)菌總蛋白，用考馬斯蘭染色或用Western印跡顯示重組蛋白質(zhì)；ii)通過利用特異性抗體的方法(Elisa)分析該重組蛋白質(zhì)；iii)如果該重組蛋白質(zhì)具有催化活性，進(jìn)行酶促分析。
優(yōu)選使用方法ii)，詳見實(shí)施例III。
表述“多克隆盒”是指含有一種或多種限制性位點(diǎn)的核苷酸序列，該位點(diǎn)可用于在起始密碼子的下游克隆目的基因。
優(yōu)選的，所述的序列SEQ ID No.1中至少一個(gè)核苷酸被缺失使得所述的重組蛋白質(zhì)過量表達(dá)。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的構(gòu)建體，其中所述的至少突變或缺失的(優(yōu)選缺失的)核苷酸位于序列SEQ ID No.1的SEQ ID No.2的片段上。
本發(fā)明的另一主題涉及構(gòu)建體，其中所述的至少突變或缺失的(優(yōu)選突變的)核苷酸位于序列SEQ ID No.1的密碼子GTA和/或密碼子GCA和/或密碼子CTG上。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的序列SEQ ID No.1(至少一個(gè)核苷酸突變或缺失)至少在位點(diǎn)1、2和3具有核苷酸A。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，位于序列SEQ ID No.1的核酸序列與接受編碼所述目的重組蛋白質(zhì)的基因的多克隆盒之間的至少一個(gè)核苷酸、優(yōu)選的所有的核苷酸被缺失。
在本發(fā)明另一更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的序列SEQ ID No.1其至少一個(gè)核苷酸突變或缺失，并且所有的核苷酸位于序列SEQ ID No.1的核酸序列與多克隆盒之間被完全缺失，結(jié)果使起始密碼子直接在多克隆盒的上游。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的構(gòu)建體含有起始密碼子直接上游的核酸序列，該序列選自序列SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。
本發(fā)明包含本發(fā)明的構(gòu)建體，其特征在于原核宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌，優(yōu)選屬于E.coli種屬。
本發(fā)明的另一主題關(guān)于含有上述構(gòu)建體的載體，以及用該載體轉(zhuǎn)染的原核宿主細(xì)胞(優(yōu)選屬于E.coli種)。
本發(fā)明的主題還是利用上述構(gòu)建體在宿主細(xì)胞中制備目的重組蛋白質(zhì)的方法。
本發(fā)明的主題還是制備本發(fā)明的目的重組蛋白質(zhì)的方法，其中優(yōu)選通過上述載體將所述的構(gòu)建體引入到原核宿主細(xì)胞中。
制備本發(fā)明的目的重組蛋白質(zhì)的優(yōu)選方法的特征在于其包含下列步驟a)將目的基因克隆進(jìn)本發(fā)明的載體中；b)用包含編碼所述目的重組蛋白質(zhì)的基因的載體轉(zhuǎn)染原核細(xì)胞；c)在能使重組蛋白質(zhì)表達(dá)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞；d)從培養(yǎng)基或所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中回收重組蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還包含本發(fā)明的構(gòu)建體、載體或原核宿主細(xì)胞制備重組蛋白質(zhì)的用途。
最后，本發(fā)明涉及重組蛋白質(zhì)制備醫(yī)藥產(chǎn)品(給予需要此類治療的患者)的用途，其特征在于所述的重組蛋白質(zhì)是利用制備本發(fā)明的目的重組蛋白質(zhì)的方法制備的。
下列實(shí)施例和圖是用來說明本發(fā)明，決不是限制其范圍。
圖和表的說明

圖1質(zhì)粒載體pTEXmp18圖譜，以及包含Ptrp啟動(dòng)子/操縱基因、PtrpL前導(dǎo)區(qū)、mp18多克隆位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子的1-450區(qū)的序列SEQID No.39。
圖2載體pTEXmp18上的RBS(核糖體結(jié)合位點(diǎn))區(qū)的限制性圖譜(SEQ ID No.40)。
圖3用載體pTEXCAT和pTEXCAT4轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中CAT表達(dá)的SDS-PAGE凝膠分析。
圖4用載體pTEX-βGAL和pTEX4-βGAL的β-半乳糖苷酶表達(dá)的比較研究(發(fā)酵罐中的動(dòng)力學(xué))。
實(shí)施例I本實(shí)施例闡述本發(fā)明的一個(gè)方面，具體而言闡明攜帶Ptrp色氨酸啟動(dòng)子并且起始密碼子上游隨機(jī)突變了的質(zhì)粒載體文庫的構(gòu)建方式。原始載體如圖1所示。其為衍生自pBR322(F.Bolivar等，Gene，2，95-113，1977)的質(zhì)粒，其中克隆有Ptrp啟動(dòng)子/操縱基因(1-298)，接著是編碼E.coli TrpL前導(dǎo)序列的頭7個(gè)氨基酸的序列(C.Yanofsky等，Nucleic Acids Research，9，6647-6668，1981)、多克隆位點(diǎn)和E.coli trpt轉(zhuǎn)錄終止子(C.Yanofsky等，1981)。pTEXmp18中的Ptrp的3′部分與天然序列不同，其在ATG起始密碼子上游有XbaI克隆位點(diǎn)(見圖2)，并且在SD和起始密碼子之間具有較長的間隔。
為了選擇RBS部分修飾的載體，將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)報(bào)告基因克隆到pTEXmp18的EcoRI和PstI位點(diǎn)。為此，利用寡核苷酸CATfor和CATrev經(jīng)PCR擴(kuò)增cat基因的編碼序列，該序列為CATfor5′-CCGGAATTCATGGAGAAAAAAATCACTGG-3′(SEQ ID No.11)EcoRICATrev5′-AAACTGCAGTTACGCCCCGCCCTG-3′(SEQ ID No.12)PstI利用噬菌粒pBC-SK(Stratagene，La Jolla，CA，USA)為模板進(jìn)行該P(yáng)CR反應(yīng)。根據(jù)GeneClean方法(Bio101，La Jolla，CA)將擴(kuò)增產(chǎn)物上樣到瓊脂糖凝膠并純化。轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli后，通過在含有30μg/ml的氯霉素的LB培養(yǎng)基(J.Sambrook等，Molecular cloning.Alaboratory manual，2ndedition.Plainview，NYCold Spring HarborLaboratory Press，1989)的平皿上出現(xiàn)的克隆來驗(yàn)證pTEXmp18的插入克隆。利用“Dye Terminator”試劑盒和DNA測序儀373A(PerkinElmer Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)通過自動(dòng)測序來確定插入片段的序列。獲得的載體稱為pTEXCAT。
通過把合成的寡核苷酸連接到載體pTEXCAT的SpeI和EcoRI位點(diǎn)插入起始密碼子的上游具有簡并序列的RBS。通過酶消化將SpeI和EcoRI位點(diǎn)(分別位于位點(diǎn)-49和+28)(見圖2)之間的區(qū)域缺失，并用兩條互相雜交的部分簡并的合成寡核苷酸形成的異源雙螺旋取而代之。使用兩對寡核苷酸，分別為寡核苷酸RanSD1/RanSD2和RanSD3/RanSD4，其序列為5’CTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAANNNNNNNNNNNNNNNNATGAAAGCAATTTTCGTACTGAATGCGG-3’(SEQ ID No.13)RanRD25’AATTCCGCATTCAGTACGAAAATTGCTTTCATNNNNNNNNNNNNNNNNTTTACGTGAACTTGCGTACTAGTTAA-3’(SEQ ID No.14)RanSD35’CTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAATRRRRRRRNNNNNNATGAAAGCAATTTTCGTACTGAATGCGG-3’(SEQ ID No.15)RanSD45’AATTCCGCATTCAGTACGAAAATTGCTTTCATNNNNNNYYYYYYYATTTACGTGAACTTGCGTACTAGTTAA-3’(SEQ ID No.16).
通過MWG Biotech(Ebersberg，Germany)合成四條寡核苷酸，合成條件是保證對于每種簡并性堿基的分配摩爾數(shù)相等。RanSD1/RanSD2對在ATG密碼子前的16個(gè)核苷酸引入完全的簡并性(N＝4種核苷酸A、C、T、G的混合)。組和數(shù)(416，即大約4.3×109)使能夠從Shine-Dalgarno(SD)序列和位于SD區(qū)與起始密碼子之間的序列以及SD-ATG間隔上篩選最適的RBS。在下文中該文庫被稱為(N16)。RanSD3/RanSD4對在ATG前的6個(gè)核苷酸上引入完全的簡并性以及在上游7個(gè)核苷酸上引入部分簡并性。在正鏈上專用嘌呤(R＝A或G)以及在互補(bǔ)鏈上專用嘧啶(Y＝C或T)促進(jìn)了至ATG密碼子的最適距離(6個(gè)核苷酸)的Shine-Dalgarno類型序列的豐度。該文庫稱為(R7N6)。
根據(jù)J.Sambrook等人描述的條件(1989)進(jìn)行載體pTEXCAT的線性化并凝膠純化、配對的寡核苷酸雜交、異源雙螺旋連接到線性化的載體pTEXCAT并轉(zhuǎn)化進(jìn)組成文庫的E.coli中。通常向終體積15μl的含有T4連接酶的連接反應(yīng)中加入100fmol的載體和1000fmol的插入片段。在16℃下反應(yīng)過夜。然后在制造商(Invitrogen，Carlsbad，CA)建議的條件下用3μl的連接混合物電穿孔轉(zhuǎn)化電子感受態(tài)TOP10細(xì)菌(50μl)。將轉(zhuǎn)化混合物鋪在含有200μg/ml的氨芐青霉素的LB瓊脂平皿上，37℃溫育16小時(shí)后使之產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的克隆。
實(shí)施例II基于克隆過表達(dá)CAT酶將提高氯霉素抗性的假設(shè)篩選該文庫。這通過結(jié)果如下列表1所示的實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證。
表1存在或不存在IAA的TOP10×pTEXCAT細(xì)菌的氯霉素抗性
數(shù)字(上面一行)表明在37℃溫育18小時(shí)后計(jì)數(shù)的克隆數(shù)，每一種培養(yǎng)基接種大約100個(gè)細(xì)胞。
下面一行的指數(shù)是克隆生長的定量標(biāo)準(zhǔn)(-＝?jīng)]有生長至+++＝最大生長)。
這些結(jié)果表明用載體pTEXCAT轉(zhuǎn)化的并鋪在含有不同濃度的氯霉素的平皿中的TOP10E.coli細(xì)菌(Invitrogen，Carlsbad，CA)在300-600μg/ml的氯霉素、存在3-β吲哚乙酸(IAA)(色氨酸類似物，其通過Ptrp抑制作用作為誘導(dǎo)物)(R.Q.Marmorstein和P.B.Sifler，The Journal of Biological Chemistry，264，9149-9154，1989)下生長更好。這暗示由于最適的RBS區(qū)過量產(chǎn)生CAT的克隆可能在低于MIC(最低抑制濃度)的氯霉素濃度時(shí)比野生型群體生長得更快，或者能在對于野生型群體為致死的氯霉素濃度下生長。
實(shí)施例III該實(shí)施例闡述了從根據(jù)實(shí)施例的描述構(gòu)建的文庫中選擇克隆。將獲得的在LB+氨芐青霉素的瓊脂平皿上的克隆層形式的文庫溶解在無菌水中，重新形成具有1以內(nèi)的580nm光密度(OD)的混懸液。根據(jù)實(shí)施例2的結(jié)果，將該混懸液以100μl/培養(yǎng)皿的比例鋪在含有致死計(jì)量的氯霉素(600、700、800和900μg/ml)的LB瓊脂平皿上。將平皿在37℃下溫育，研究出現(xiàn)的抗性克隆，同時(shí)確證用野生型pTEXCAT載體轉(zhuǎn)化的TOP10細(xì)菌的混懸液接種的平皿上沒有任何生長。分離抗性克隆并在選擇性培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)幾次以確定它們的抗性表型。然后對該步驟選擇到的克隆進(jìn)行一系列分析(i)提取質(zhì)粒(Qiagen kit，Hilden，Germany)并對包括RBS的區(qū)測序，(ii)在IAA的誘導(dǎo)下在Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)并用ELISA試驗(yàn)測定CAT的表達(dá)水平，(iii)將從上述培養(yǎng)物中提取的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并用考馬斯蘭染色，以顯示總的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。在ABI 373A測序儀(Perkin Elmer AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)上利用Dye terminator試劑盒測序該克隆。Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)物通過接種25ml的TSBY(30g/l的胰胨豆胨培養(yǎng)液(DIFCO)+5g/l的酵母提取物(Difco))培養(yǎng)基+8mg/l的四環(huán)素和平皿上的克隆或保存在-80℃的細(xì)菌混懸液制備。每一預(yù)培養(yǎng)物在37℃、200rpm振蕩的平臺(tái)溫育過夜。轉(zhuǎn)移一部分至50ml的相同培養(yǎng)基中以使起始光密度等于1。向培養(yǎng)基中加入25mg/l的IAA，其然后在相同條件下振蕩5小時(shí)來誘導(dǎo)CAT蛋白。將一部分懸液(3×1ml，稀釋到OD＝0.8)離心，并將細(xì)胞保存在-20℃用來ELISA分析CAT(CATELISA kit，Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)。以10000g、4℃離心15分鐘回收剩余的生物物質(zhì)。以5ml/g濕生物物質(zhì)的比例將該生物物質(zhì)溶解在TEL緩沖液(25Mm Tris，1mM EDTA，500μg/ml的溶菌酶，pH8)中。通過超聲處理(配有顯微探針的VibraCell超聲波儀，Sonics&Materials，Danbury，CT)將細(xì)胞裂解。將1ml獲得的混懸液以12000rpm離心5分鐘。將沉淀用200μl的TEL溶解，獲得不溶性的部分(I)。上清記為“S”。用變性電泳(SDS-PAGE)和考馬斯蘭染色分析部分I和S中的總蛋白。
下列表2表明在篩選兩個(gè)文庫(N16)和(R7N6)后獲得的各種RBS序列。與GenBank和EMBL核苷酸數(shù)據(jù)庫比對后，我們可以得出結(jié)論在各種分離的克隆中的緊接著AUG密碼子上游的16-核苷酸((N16)策略)或13-核苷酸((R7N6)策略)序列至今沒有一種被描述過。表2利用(N16)策略或(R7N6)策略之一分離的新型RBS序列
(*)每條核苷酸序列(信使RNA)在起始密碼子下游包含突變區(qū)。表中的第一行為載體pTEXCAT的參考序列。該表中表示了該載體起始密碼子上游和下游的核酸序列轉(zhuǎn)錄后的RNA形式。在這些序列的3′末端，只表示了多克隆位點(diǎn)的頭兩個(gè)密碼子，稱為GAAUUC。
因此，非常另人驚奇的發(fā)現(xiàn)，表2中所述的克隆在緊接著AUG密碼子下游的RBS區(qū)有突變。克隆pTEXCAT4、pTEXCAT1′、pTEXCAT3′攜帶的點(diǎn)突變影響編碼的蛋白質(zhì)的N末端部分的氨基酸(分別為Leu7Pro、Ala3Pro和Val6Ala)。其它克隆攜帶更大的重排pTEXCAT2′、pTEXCAT5′和pTEXCAT9′帶有的缺失分別引起Ala2Leu7、Ile4Leu7和Ile4Asn8區(qū)的缺失。如果隨機(jī)分析(N16)文庫在氨芐青霉素上選擇(即沒有氯霉素的選擇壓力)的10個(gè)克隆，表明在TrpL肽編碼區(qū)沒有改變(數(shù)據(jù)未列出)，因此可以推斷根據(jù)表達(dá)CAT的能力選擇的克隆中觀察到的TrpL中的突變在表達(dá)中發(fā)揮重要作用。因此，我們證明了下列創(chuàng)新的特性重組蛋白質(zhì)的表達(dá)確實(shí)受起始密碼子下游的突變的影響。
圖3顯示了用pTEXCAT或pTEXCAT4轉(zhuǎn)化的細(xì)菌總蛋白的SDS-PAGE分析。其表明了載體pTEXCAT4的過量表達(dá)的特性，因?yàn)槲挥贑AT位置的主要蛋白質(zhì)(28kDa)在IAA的誘導(dǎo)提取物中非常明顯，而在相同誘導(dǎo)條件下獲得的載體pTEXCAT的提取物中僅有低密度的條帶。
為了排除過量表達(dá)是由SpeI-EcoRI部分之外的載體的修飾引起的可能性，通過SpeI-EcoRI消化和雙螺旋(由下列兩條磷酸化的寡核苷酸形成的)連接由pTEXCAT體外重新構(gòu)建了載體pTEXCAT4SDopt4-f5’CTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAACGGAGAAACCCCCCAATGAAAGCAATTTTCGTACCGAATGCGG-3’(SEQ ID No.17)SDopt4-r5’AATTCCGCATTCGGTACGAAAATTGCTTTCATTGGGGGGTTTCTCCGTTTTACGTGAACTTGCGTACTAGTTAA-3’(SEQ ID No.18).
然后將獲得的載體(稱為pTEXCAT-SD4)轉(zhuǎn)化E.coli TOP10，并與pTEXCAT4就CAT酶表達(dá)能力進(jìn)行比較。獲得的結(jié)果表明pTEXCAT4和pTEXCAT-SD4的表達(dá)水平相當(dāng)并明顯高于pTEXCAT。這證實(shí)了該假設(shè)本專利申請中要求的克隆中觀察到的表達(dá)的增強(qiáng)確實(shí)是特異地由位于SpeI和EcoRI位點(diǎn)間的序列引起的。
為了證明位于起始密碼子的直接下游的突變或缺失序列的特異性，用脯氨酸CGG取代野生型載體pTEXCAT的第七位的亮氨酸CTG，得到載體pTEXCAT-L7P。用亮氨酸CTG取代載體pTEXCAT4的第七位的脯氨酸CGG，得到載體pTEXCAT-P7L。該試驗(yàn)結(jié)果列于下列表3表3載體pTEXCAT、pTEXCAT4、pTEXCAT-L7P和pTEXCAT-P7L的表達(dá)水平的比較
結(jié)果(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)是由兩次獨(dú)立的試驗(yàn)獲得。將載體pTEXCAT水平任意地定為1。
這些結(jié)果證明起始密碼子下游突變獨(dú)立地引起過量表達(dá)，因?yàn)閷⒃撏蛔冎匦乱胍吧洼d體使其獲得相同的過量表達(dá)。
實(shí)施例IV該實(shí)施例表明所述的新型序列的過量表達(dá)作用不限于用來選擇它們的報(bào)告基因，一旦其它基因有效地與他們連接到相同地載體上，其可以轉(zhuǎn)而影響這些基因。為此，用編碼E.coliβ-半乳糖苷酶的lacZ基因序列取代載體pTEXCAT和pTEXCAT4的CAT基因。通過使用載體pβGAL-basic(Clontech，Palo Alto，CA)PCR擴(kuò)增lacZ序列、然后將該序列在單一BsmI和HindIII位點(diǎn)插入trpL的下游進(jìn)行克隆，分別獲得載體pTEX-βGAL和pTEX4-βGAL。
將兩種載體轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli菌株ICONE 200(法國專利申請F(tuán)R 2777292，公布于1999年10月15日)以在發(fā)酵罐中培養(yǎng)(具有β-半乳糖苷酶表達(dá)動(dòng)力學(xué))。通常，在200ml完全培養(yǎng)基(30g/l的胰胨豆胨培養(yǎng)液(DIFCO)，5g/l的酵母提取物(DIFCO))中37℃過夜培養(yǎng)重組的細(xì)菌ICONE 200×pTEX-βGAL和ICONE 200×pTEX4-βGAL。將細(xì)胞混懸液無菌地轉(zhuǎn)到含有1.8升下列培養(yǎng)基的發(fā)酵罐(Chemap modelCF3000，體積3.5l)中(2升最終培養(yǎng)物中的濃度)90g/l甘油，5g/l(NH4)2SO4，6g/l KH2PO4，4g/l K2HPO4，9g/l檸檬酸三鈉.2H2O，2g/lMgSO4.7H2O，1g/l酵母提取物，微量元素，0.06％消泡劑，8mg/l四環(huán)素，200mg/l色氨酸。通過加入氨水將pH定為7.0。通過振蕩速率和通過測量溶氧的通氣速率的伺服控制將溶氧水平維持在30％的飽和度。當(dāng)培養(yǎng)物的光密度達(dá)到30-40時(shí)，加入25mg/l的IAA(Sigma，St Louis，MO)進(jìn)行誘導(dǎo)。進(jìn)行培養(yǎng)物的光密度(580nm的OD)和細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶活性的動(dòng)力學(xué)分析。混合30μl樣品(部分“S”，參見實(shí)施例3)、204μl緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.5-1mM MgCl2)和66μl ONPG(4mg/ml的50mMTris-HCl， pH7.5)，通過比色分析測定β-半乳糖苷酶的活性水平。反應(yīng)混合物37℃溫育。加入500μl 1M Na2CO3終止反應(yīng)。420nm的OD(與溫育時(shí)間相關(guān))與樣品中的β-半乳糖苷酶的活性成正比。由于E.coli ICONE 200的lac操縱子完全缺失，測量的β-半乳糖苷酶的活性只由質(zhì)粒lacZ基因的表達(dá)所致。
該對比研究的結(jié)果表明，兩次獨(dú)立的試驗(yàn)中，載體pTEX4-βGAL的β-半乳糖苷酶的活性水平比pTEX-βGAL高大約50倍(圖4)。由此我們可以推斷出在載體pTEXCAT4的RBS區(qū)分離的新型序列不但能使CAT蛋白表達(dá)，也能使例如β-半乳糖等其它蛋白質(zhì)表達(dá)?；谠搶?shí)施例，我們可以得出結(jié)論利用本發(fā)明的載體之一，通過將其編碼序列引入到本發(fā)明的突變的或缺失的序列的下游，可以方便地表達(dá)其它目的生物工程蛋白質(zhì)。
實(shí)施例V比較載體pTEXwt(不在本發(fā)明之內(nèi))和載體pTEX9′、pTEX10′、pTEX11′和pTEX12′的表達(dá)水平。
載體pTEX10′、pTEX11′和pTEX12′衍生自載體pTEX9，但包含另外的突變，如下列表4所示
表4比較載體pTEXwt、pTEX9′、pTEX10′、pTEX11′和pTEX12′的表達(dá)水平
(*)每條核苷酸序列(信使RNA)在起始密碼子下游包含突變區(qū)。表中的第一行為載體pTEXCAT的參考序列。該表中表示了該載體起始密碼子上游和下游的核酸序列轉(zhuǎn)錄后的RNA形式。在這些序列的3′末端，只表示了多克隆位點(diǎn)的頭兩個(gè)密碼子，稱為GAAUUC。
確定表達(dá)的方法為上述實(shí)施例中使用的方法。
這些結(jié)果證明起始密碼子下游的缺失有可能獲得比用野生型載體觀察到的表達(dá)高達(dá)250倍以上的過量表達(dá)。
序列表序列表<110>PIERRE FABRE MEDICAMENT<120>用于重組蛋白質(zhì)過量表達(dá)的起始密碼子下游被修飾的構(gòu)建體<130><150>PCT/FR 01/01 952<151>2001-06-21<150>FR 00/08 002<151>2000-06-22<160>40<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>1aaagcaattt tcgtactg 18<210>2<211>9<212>DNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>2tttcgtact 9<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>3aagggtatct agaatt16<210>4<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>4gggccggttt cttatt16<210>5<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>5acggagaaac ccccca16<210>6<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>6tgggagggtc aatt 14<210>7<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>7taaaggaacc atat 14<210>8<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RB5)的序列<400>8taggaaagat aacg 14<210>9<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>9tgaggagaag acag 14<210>10<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>10tgaggagagt aatc 14<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>源自CAT報(bào)告基因(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)的引物<400>11CCggaattca tggagaaaaa aatcactgg 29<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>源自CAT報(bào)告基因(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)的引物<400>12aaactgcagt tacgccccgc cctg 24<210>13<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>簡并的寡核苷酸RanSD1<400>13ctagttaact agtacgcaag ttcacgtaaa nnnnnnnnnn nnnnnnatga aagcaatttt 60cgtactgaat gcgg74<210>14<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>簡并的寡核苷酸RanSD2<400>14aattccgcat tcagtacgaa aattgctttc atnnnnnnnn nnnnnnnntt tacgtgaact 60tgcgtactag ttaa74<210>15<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>簡并的寡核苷酸RanSD3<400>15ctagttaact agtacgcaag ttcacgtaaa trrrrrrrnn nnnnatgaaa gcaattttcg 60tactgaatgc gg 72<210>16<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>簡并的寡核苷酸RanSD4<400>16aattccgcat tcagtacgaa aattgctttc atnnnnnnyy yyyyyattta cgtgaacttg 60cgtactagtt aa 72<210>17<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>磷酸化寡核苷酸SDopt4-f<400>17ctagttaact agtacgcaag ttcacgtaaa acggagaaac cccccaatga aagcaatttt 60cgtaccgaat gcgg74<210>18<211>74<212>DNA<213>人工序列<223>磷酸化寡核苷酸SDopt4-r<400>18aattccgcat tcggtacgaa aattgctttc attggggggt ttctccgttt tacgtgaact 60tgcgtactag ttaa74<210>19<211>49<212>RNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>19aaggguaucu agaauuauga aagcaauuuu cguacugaau gcggaauuc 49<210>20<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>源自大腸桿菌TrpL前導(dǎo)序列N-末端序列的肽<400>20Met Lys Ala Ile Phe Val Leu Asn Ala Glu Phe1 5 10<210>21<211>49<212>RNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>21gggccgguuu cuuauuauga aagcaauuuu cguaccgaau gcggaauuc 49<210>22<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>源自大腸桿菌TrpL前導(dǎo)序列N-末端序列的肽<400>22Met Lys Ala Ile Phe Val Pro Asn Ala Glu Phe1 5 10<210>23<211>47<212>RNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>23ugggaggguc aauuaugaaa ccaauuuucg uacugaaugc 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32<210>32<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>源自大腸桿菌TrpL前導(dǎo)序列N-末端序列的肽<400>32Met Lys Ala Ala Glu Phe1 5<210>33<211>29<212>RNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>33ugaggagagu aaucaugaaa gcagaauuc 29<210>34<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>源自大腸桿菌TrpL前導(dǎo)序列N-末端序列的肽<400>34Met Lys Ala Glu Phe1 5<210>35<211>26<212>RNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>35ugaggagagu aaucaugaaa gaauuc26<210>36<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>源自大腸桿菌TrpL前導(dǎo)序列N-末端序列的肽<400>36Met Lys Glu Phe1<210>37<211>23<212>RNA<213>人工序列<220><223>源自細(xì)菌序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的序列<400>37ugaggagagu aaucauggaa uuc 23<210>38<211>3<212>PRT<213>人工序列<220><223>源自大腸桿菌TrpL前導(dǎo)序列N-末端序列的肽<400>38Met Glu Phe1<210>39<211>445<212>DNA<213>人工序列<220><223>源自質(zhì)粒載體pTEXmp18的序列<400>39gaattaattc atgctgtggt gtcatggtcg gtgatcgcca gggtgccgac gcgcatctcg 60actgcacggt gcaccaatgc ttctggcgtc aggcagccat cggaagctgt ggtatggctg 120tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg cgcactcccg ttctggataa 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權(quán)利要求
1.在原核細(xì)胞中表達(dá)編碼目的重組蛋白質(zhì)的基因的構(gòu)建體，該基因置于色氨酸操縱子Ptrp的控制之下，該構(gòu)建體包含在起始密碼子的直接下游的序列SEQ ID No.1的核酸序列和位于該序列下游的、用于接受編碼所述的目的重組蛋白質(zhì)的基因的多克隆盒，其特征在于至少一個(gè)序列SEQ ID No.1的核苷酸被突變或缺失，從而能使所述的重組蛋白質(zhì)過量表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的構(gòu)建體，其特征在于至少一個(gè)序列SEQ ID No.1的核苷酸被缺失。
3.權(quán)利要求1的構(gòu)建體，其特征在于所述的至少被突變或缺失的核苷酸位于序列SEQ ID No.1的序列SEQ ID No.2的片段上。
4.權(quán)利要求1的構(gòu)建體，其特征在于所述的至少被突變或缺失的、優(yōu)選被突變的核苷酸位于序列SEQ ID No.1的密碼子GTA上。
5.權(quán)利要求1的構(gòu)建體，其特征在于所述的至少被突變或缺失的、優(yōu)選被突變的核苷酸位于序列SEQ ID No.1的密碼子GCA上。
6.權(quán)利要求1的構(gòu)建體，其特征在于所述的至少被突變或缺失的、優(yōu)選被突變的核苷酸位于序列SEQ ID No.1的密碼子CTG上
7.權(quán)利要求1的構(gòu)建體，其特征在于所述的至少一個(gè)核酸被突變或缺失的序列SEQ ID No.1至少在位點(diǎn)1、2和3具有核苷酸A。
8.權(quán)利要求1的構(gòu)建體，其特征在于所述的序列SEQ ID No.1被完全缺失。
9.權(quán)利要求1到8之一的構(gòu)建體，其特征在于位于序列SEQ IDNo.1的核酸序列和接受編碼所述的目的重組蛋白質(zhì)的基因的多克隆盒之間的至少一個(gè)核苷酸、優(yōu)選所有的核苷酸被缺失。
10.權(quán)利要求1到9任一項(xiàng)中的構(gòu)建體，其特征在于在起始密碼子直接上游的核酸序列選自序列SEQ ID No.3至SEQ ID No.10。
11.權(quán)利要求1到10任一項(xiàng)中的構(gòu)建體，其特征在于原核宿主細(xì)胞為革蘭氏陰性菌。
12.權(quán)利要求1到11任一項(xiàng)中的構(gòu)建體，其特征在于原核宿主細(xì)胞為E.coli。
13.包含權(quán)利要求1到12任一項(xiàng)中的構(gòu)建體的載體。
14.用權(quán)利要求13的載體轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的原核宿主細(xì)胞，其特征在于其為E.coli。
16.用權(quán)利要求1-12的任一項(xiàng)中的構(gòu)建體在宿主細(xì)胞中制備目的重組蛋白質(zhì)的方法。
17.權(quán)利要求16中的制備目的重組蛋白質(zhì)的方法，其中所述的構(gòu)建體被引入原核宿主細(xì)胞。
18.權(quán)利要求16或17中的制備目的重組蛋白質(zhì)的方法，其中所述的構(gòu)建體通過權(quán)利要求13的載體被引入原核宿主細(xì)胞。
19.權(quán)利要求16-18之一中的制備目的重組蛋白質(zhì)的方法，其特征在于其包含下列步驟a)將目的基因克隆到權(quán)利要求13的載體；b)用含有所述目的蛋白質(zhì)編碼基因的載體轉(zhuǎn)化原核宿主細(xì)胞；c)在能夠使重組蛋白質(zhì)表達(dá)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；及d)從培養(yǎng)基或所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中回收重組蛋白質(zhì)。
20.權(quán)利要求1-12之一的構(gòu)建體、權(quán)利要求13的載體或權(quán)利要求14或15的細(xì)胞在制備重組蛋白質(zhì)上的用途。
21.重組蛋白質(zhì)在制備用來給予需要此類治療的患者的醫(yī)藥產(chǎn)品上的用途，其特征在于所述的重組蛋白質(zhì)是用權(quán)利要求16-19之一的方法制備的。
全文摘要
本發(fā)明涉及在原核細(xì)胞中表達(dá)編碼目的重組蛋白質(zhì)的基因的構(gòu)建體，該基因置于色氨酸操縱子(Ptrp)的控制之下，該構(gòu)建體包含在起始密碼子的直接下游的核酸序列SEQ ID No.1和位于該序列下游的、設(shè)計(jì)為接受編碼所述的目的重組蛋白質(zhì)的基因的多克隆盒，至少該核酸序列SEQ ID No.1的核酸被突變或缺失，從而能使所述的重組蛋白質(zhì)過量表達(dá)。本發(fā)明還涉及包含該構(gòu)建體的載體、用該載體轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞、以及利用本發(fā)明的構(gòu)建體產(chǎn)生目的重組蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1443242SQ01812988
公開日2003年9月17日 申請日期2001年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月22日
發(fā)明者L·切瓦萊特 申請人:皮埃爾法博赫藥品公司