專利名稱：通過擾亂Ran/Ran－粘合蛋白介導的細胞過程而產(chǎn)生高產(chǎn)量,超多產(chǎn)轉基因植物的方法
技術領域：
本發(fā)明描述了一種通過擾亂Ran/Ran粘合蛋白介導的細胞過程而產(chǎn)生高產(chǎn)量的超多產(chǎn)的轉基因植物的方法。尤其是，本發(fā)明涉及到一種通過過量表達有義(sense)或反義(antisense，anti-)Ran或各種Ran-粘合蛋白以修飾涉及這些蛋白的生物過程而產(chǎn)生轉基因植物的方法。這些基因技術提供了發(fā)展具有經(jīng)濟價值的轉基因植物的途徑，轉基因植物出產(chǎn)的超多產(chǎn)農(nóng)作物源于它們的大小或長度的增加，正如所見的轉基因植物的器官包括葉、莖、花、根和種子那樣。
通過相互作用(粘合)的蛋白來完成Ran的GTP-或GDP-界態(tài)的調整，如RCC1(一種Ran核的鳥嘌呤核苷交換因子)，Ran-GTP酶-活性蛋白(RanGAP)，Ran-粘合蛋白1(RanBP1，一種RanGAP的輔因子)，以及Mogl(一種鳥嘌呤核苷釋放因子)(Kahana，J.A.，and Cleveland，D.W.，(1999)J.Cell Biol.146，1205-1210)。RCC1是一種鳥嘌呤核苷的交換因子(GEF)，它將Ran-界的GDP與GTP交換，Ran-GAP是一種Ran-GTP酶活性蛋白，它可以催化Ran的GTP酶的活性，RanBP1是一種輔因子，它通過穩(wěn)定Ran-GTP狀態(tài)輔助Ran-GAP的活性(Hopper，A.K.Traglia，H.M.，and Dunst，R.W.(1990)J.Cell Biol，111，309-321；Koepp，D.M.，and Silver，P.A.(1996)Cell87，1-4)。這樣RanBPs導致了在細胞分裂的初期在細胞質和核質中Ran-GTP和Ran-GDP分配不平衡。特別是，Ran-GTP大量地形成于核孔復合物的核質邊上并且Ran-GDP主要形成于復合物的細胞質邊上(Kahana，J.A.，andCleveland，D.W.(1999)J.Cell Biol.146，1205 1210)。
有絲分裂的細胞復制，增加了2倍染色體的數(shù)量，均勻地傳遞它們到子細胞。有絲分裂的過程由前期、中期，后期和末期組成。Ran/RanBP信號的轉導路徑與RanBP1，RanBPM，RCC1和RanGAP等等相一致，并且最近顯示在如使用動物細胞和酵母作為生物模型的實驗過程中扮演臨界角色。RCC1維持在核中的Ran-GTP于高水平，同時RanBP1或RanGAP在相同的核中增加Ran-GDP水平。RanBPM以Ran-GTP依賴的方式促進了染色體微管紡錘體的形成(Wilde，A.，and Zheng，Y.(1999)Science 284，1359-1362)。這些紡錘體移動染色體到相反的一極，從而促進了細胞周期的前進和分裂(Nakamura，M.，Masuda，H.，Horri，J.，Kuma，K.I.，Yokoyama，N.，Ohba，T.，Nishitani，H.，Miyata，T.，Tanaka，M.，and Nishimoto，T.(1998)J.Cell.Biol.143，1041-1052)。
在酵母中RanBP1對有絲分裂的影響在各種研究中已經(jīng)被報道了(Battistoni，A.，Guar guaglini，G.，Degrassi，F(xiàn).，Pittoggi，C.，Palena，A.，Matteo，G.D.，Pisano，C.，Cundari，E.，and Lavia，P.C.(1 997)J.Cell Sci.110，2345-2357；He，X.，Hayashi，N.，Walcott，N.G.，Azuma，Y.，Patterson，T.E.，Bischoff，F(xiàn).R.，Nishimoto，T.，and Sazer，S.(1998)Genetics 148，645-656；Kalab，P.，Pu，R.T.，and Dasso M.(1999)Curr.Biol.9，481-484)。據(jù)報道在酵母中AtRanBP1c的過量表達抑制了正常隔膜的形成(Xia et al.，1996，Paint J.10(4)761-769)；細胞核被濃縮并且肌動蛋白的排列變得不規(guī)則。
另外，Ouspenski報道了一種RanBP1的突變型(yrb1-21)造成了常規(guī)排列的缺損和有絲分裂紡錘體的形成，這樣抑制了正常的有絲分裂的進行。(Ouspenski，1.1.(1998)Exp.Cell Res.244，171-183)。
還說明了植物的Ran具有和當Ran在酵母中過量表達時酵母的相似的功能。這暗示了在植物中的Ran/RanBP途徑的生物功能可能與酵母或哺乳動物細胞的相類似。Ach和Gruissem說明了番茄的Ran蛋白在功能上與酵母Ran-類蛋白相類似(Ach，R.A.and Gruissem，W.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5863-5867).
另外，擬南芥菜中Ran1、Ran2和Ran3的序列和它們的粘合蛋白，AtRanBP1a和AtRanBP1b最近被確定。它們的表達模式和生化特性也被報道了(Haizel，T.，Merkle，T.，Pay，A.，F(xiàn)ejes，E.，and Nagy，F(xiàn).(1997)Plant J.11(1)，93-103)。然而，直到現(xiàn)在在植物中這些蛋白的功能從沒有被深入地研究過。
本發(fā)明的另一個目的是提供通過上述方法可以被轉化到農(nóng)作物的重組載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供通過上述方法可以被轉化到農(nóng)作物的基因。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了Ran的堿基序列，如SEQ.ID.No.1所示。
另外，本發(fā)明也提供了AtRanBP1b的堿基序列，如SEQ.ID.No.2所示。
另外，本發(fā)明也提供了AtRanBP1c的堿基序列，如SEQ.ID.No.3所示。
另外，本發(fā)明也提供了反義AtRanBP1b的堿基序列，如SEQ.ID.No.4所示，其抑制了內源的AtRanBP1b基因的表達。
另外，本發(fā)明也提供了反義AtRanBP1c的堿基序列，如SEQ.ID.No.5所示，其抑制了內源的AtRanBP1c基因的表達本發(fā)明也提供了一種具有如SEQ.ID.No.4所示的反義AtRanBP1b的堿基序列或一部分反義AtRanBP1b的堿基序列的重組載體。
本發(fā)明也提供了一種具有如SEQ.ID.No.5所示的反義AtRanBP1c的堿基序列或一部分反義AtRanBP1c的堿基序列的重組載體。
本發(fā)明也提供了一種重組載體，其所具有的基因從包括Ran，AtRanBP1a，AtRanBP1b，AtRanBP1c，RanGAP，RanBPM，RCG1和RanBP1在內的Ran和Ran-粘合蛋白所組成的組中選擇。
本發(fā)明也提供了一種在Ran-介導的細胞過程中與具有基因的有義(sense)或反義(antisense)堿基序列的重組載體轉化的轉基因植物。
本發(fā)明也提供了一種產(chǎn)生轉基因植物的方法，與在Ran-介導的細胞過程中包含基因的有義或反義堿基序列的重組載體轉化，或通過T-DNA或轉座子導入到基因中。
圖2顯示為pLBJ21/AtRanBP1b載體結構的示意圖。
圖3顯示為pLBJ21/AtRanBP1c載體結構的示意圖。
圖4顯示為pLBJ21/反義(antisense，anti-)AtRanBP1b載體結構的示意圖。
圖5顯示為pLBJ21/反義AtRanBP1c載體結構的示意圖。
圖6顯示為轉基因擬南芥菜(pLBJ21/PsRan)基因組DNA(southern)印跡分析圖。
圖7顯示為轉基因擬南芥菜(pLBJ21/反義AtRanBP1c)基因組DNA印跡分析圖。
圖8顯示為轉基因擬南芥菜(pLBJ21/PsRan)RNA(northern)印跡分析圖。
圖9顯示為轉基因擬南芥菜(pLBJ21/反義AtRanBP1c)RNA印跡分析圖。


圖10顯示為本發(fā)明的轉基因擬南芥菜(pLBJ21/PsRan)的根部長度與野生型植物的根部長度的比較圖。
圖11顯示為本發(fā)明的轉基因擬南芥菜(pLBJ21/反義AtRanBP1c)的根部長度與野生型植物的根部長度的比較圖。
圖12顯示為本發(fā)明的轉基因擬南芥菜(pLBJ21/反義AtRanBP1b)的種子大小與野生型植物的種子大小的比較圖。
圖13顯示為本發(fā)明的轉基因擬南芥菜(pLBJ21/反義AtRanBP1b)的花的大小與野生型植物的花的大小的比較圖。
圖14顯示為本發(fā)明的轉基因擬南芥菜(pLBJ21/反義AtRanBP1b)的葉的大小與野生型植物的葉的大小的比較圖。
圖15顯示為本發(fā)明的轉基因植物pLBJ21/反義AtRanBP1b的成年植物的大小與野生型植物成年植物大小的比較圖。
圖16顯示為本發(fā)明的轉基因番茄(pLBJ21/AtRanBP1b)的成年植物的大小與野生型植物的成年植物大小比較圖。
圖17顯示為本發(fā)明的轉基因番茄(pLBJ21/AtRanBP1b)的葉的大小與野生型植物的葉的大小的比較圖。
圖18顯示為本發(fā)明的轉基因番茄(pLBJ21/AtRanBP1b)的枝的大小與野生型植物的枝的大小的比較圖。
圖19顯示為本發(fā)明的轉基因番茄(pLBJ21/AtRanBP1b)未成熟的果實大小與野生型植物的未成熟的果實大小的比較圖。
植物中Ran或Ran-BP的結構至今從沒有被研究過。本發(fā)明人揭示出植物的Ran和AtRanBP1c在生長素-誘導的細胞循環(huán)過程的調節(jié)中是至關重要的。本發(fā)明人揭示了轉基因植物在Ran或AtRanBP1c水平改變，從而根部細胞的有絲分裂對生長素的敏感得以增加。該修飾的結果是轉基因植物具有長根。本發(fā)明還揭示了AtRanBP1b是一種減數(shù)分裂和有絲分裂過程中重要的調整者，并透露了AtRanBP1b在植物細胞分裂的從中期到間期控制細胞的周期過程。通過本發(fā)明已經(jīng)生產(chǎn)了在AtRanBP1b的水平改變的轉基因植物，并且這些植物已經(jīng)表現(xiàn)出支撐一種大的植物顯型和產(chǎn)生顯著的高產(chǎn)量的產(chǎn)品。該大植物顯型在其后的文件中被定義。
本發(fā)明確定了通過過量表達或抑制屬于Ran-介導的細胞過程中的一組蛋白的有義或反義序列，產(chǎn)生超多產(chǎn)轉基因植物、高產(chǎn)量農(nóng)作物的方法。
屬于Ran-介導的細胞過程的蛋白和本發(fā)明的靶子是Ran(Haizel et al.，1997，Plant J11(1)193-103)和Ran粘合蛋白。所希望的是Ran粘合蛋白從由AtRanBPla(Haizel et al.，1997，Plant J11(1)93-103)，AtRanBP1b(Haizelet al.，1997，Plant J11(1)93-103)，AtRanBP1c(AT5 in Xia et al.，1996，Plant J.10(4)761-769)，RanGAP(Merril et al.，1999 Science，2831742-1745)，RanBPM(Nakamura et al.，1998，J.Cell.Biol.，143(4)1041-1052)，RCCl(Fruno et al.，1991，Genomic，11(2)459-461)，和RanBP1(Ouspenski et al.，1995，J.Biol.Chem..，270(5)1975-1978)組成的蛋白組中優(yōu)選。AtRanBP1a，AtRanBP1b和AtRanBP1c是發(fā)現(xiàn)于擬南芥菜中的Ran-粘合蛋白，RanGAP，RanBPM，RCC1和RanBP1是發(fā)現(xiàn)于動物或酵母等中的Ran-粘合蛋白。Ran蛋白的氨基酸序列在生物體中被完好保存；在植物中90％或更多是相互一致的，70％或更多與酵母(Merkle et al.，1994，Plant J.6(4)555-565)的氨基酸序列相互一致。植物中AtRanBP1的DNA序列80％或更多是相互一致的，對于其他生物體則60％或更多是相同的(Haizel et al.，1997，Plant J.11(1)93-103)。在另一方面，CST20的氨基酸序列，酵母的RanBP1，大約有50％與老鼠的RanBP1的是相同的(Ouspenski et al.，1995，JBC 270(5)1975-1978)。老鼠的RanBPM的氨基酸序列和人的幾乎是相同的，并且大約有30％和酵母的是相同的(Nakamura et al.，1998，J.Cell.Biol.，143(4)1041-149)。Drosophilae的RanGAP的氨基酸序列有34％到36％和酵母中的以及老鼠的RanGAP的氨基酸序列是相同的(Merril et al.，1999，Science，12283-287)。這樣，Ran可以說是一種70％或更多氨基酸序列相同的同族蛋白，AtRanBP1b或AtRanBP1c可以說是一種氨基酸序列的相同率為50％或更多的同族蛋白。因此，其他RanBPs如RanGAP，RCC1，和RanBPM是氨基酸序列相同率為35％或更多的一組蛋白。
許多Ran-粘合蛋白具有一段氨基酸序列稱作Ran-粘合域(RanBD)，Ran蛋白粘合到其上(Beddow et al.，1995，PNAS，923328-3332)。該Ran-粘合域通過粘合到Ran蛋白幫助GTP的水解(Novoa et al.，1999，Mol.Biol.Cell.，102175-2190)。
因此，在Ran-介導細胞過程的有關的一組蛋白由含有Ran-粘合域的一組蛋白組成。
另外，本發(fā)明提供了通過過量表達、抑制或剔除這些基因采用修飾的Ran或Ran-粘合蛋白(RanBP)水平而產(chǎn)生轉基因植物的方法。這些轉基因植物可以通過過量表達Ran或RanBP，通過利用互補反義RNA的表達抑制內源基因，或使用各種植物啟動子，利用相關雙鏈RNA(RNA干涉)的表達抑制內源基因而產(chǎn)生。這些植物也可以通過使用UV-處理、EMS-處理、或轉座子來剔除基因而產(chǎn)生。其反義方法是一種通過在生物體中表達互補鏈(反義)到靶基團使靶基因的mRNA和反義mRNA之間產(chǎn)生結合而抑制靶基因的mRNA的翻譯的方法，從而導致靶基因的mRNA不能被翻譯成蛋白。
番茄和擬南芥菜通常在植物的分子生物學領域內用作模型植物。在本發(fā)明中，轉基因番茄或擬南芥菜是通過轉化重組載體過量表達或抑制Ran或Ran-粘合蛋白而產(chǎn)生的。這些重組載體包括任何可以表達Ran或Ran-粘合蛋白的有義或反義序列、或在同時可以表達蛋白基因的有義和反義序列的基因表達的啟動子。
為產(chǎn)生如上所述的轉基因植物，如SEQ.ID.NO.1所示并且是一種豌豆的Ran蛋白的PsRan，從黃化豌豆幼芽庫中克隆并且被插入到載體pLBJ21中以構造重組載體pLBJ21/PsRan.。這個載體被保藏在韓國典型生物保藏中心，保藏號為KCTC0837BP。載體pBJ21是一種pKYLX71衍生質粒，該衍生質粒上在pKYLX71的表達盒的多克隆區(qū)域的HindIII識別位點變?yōu)镋coRI識別位點(Schardl，C.L.，Byrd，A.D.，Benzion，G.，Altschuler M.A.，Hilderbrand，D.F.，and Hunt，A.G.(1987)Gene 61，1-11，1987；Lloyd，A.M.N Walbot，V.，and Davis，R.W.(1992)Science 258，1773-1775)。在本發(fā)明中其為二元載體，并在本發(fā)明中被用作轉化載體。
另外，AtRanBP1b(如SEQ.ID.NO.2所示)和AtRanBP1c(如SEQ.ID.NO.3所示)被插入到載體pLBJ21中，并被保藏在韓國典型生物保藏中心，保藏號分別為pLBJ21/AtRanBP1b KCTC 0838BP和pLBJ21/AtRanBP1c KCTC0839BP。
三種重組載體pLBJ21/PsRan，pLBJ21/AtRanBP1b和pLBJ21/AtRanBP1c被轉化到擬南芥菜中。選擇轉基因株系以特征化轉基因顯型。轉基因pLBJ21/PsRan(KCTC 0837BP)擬南芥菜表現(xiàn)為長根和大的植株顯型。與pLBJ21/AtRanBP1b(KCTC 0838BP)轉化的轉基因擬南芥菜表現(xiàn)為大的植株顯型。與pLBJ21/AtRanBP1c(KCTC 0839BP)轉化的轉基因擬南芥菜表現(xiàn)為長根，種子重量增加和大的植株顯型。
另外，為了產(chǎn)生抑制屬于Ran-介導的細胞過程中的基因的轉基因植物，反義堿基序列到AtRanBP1b和AtRanBP1c被分別設計。使用標準序列表的軟件程序，反義AtRanBP1b堿基序列在SEQ.ID.NO.4中描述和反義AtRanBP1c堿基序列在SEQ.ID.NO.5中描述。Ran-介導的細胞過程被抑制的轉基因植物，能夠采用具有SEQ.ID.NO.4或SEQ.ID.NO.5的完整反義序列或部分堿基序列的重組載體而產(chǎn)生。應用的核苷序列在長度上為50對堿基對(bp)或更多。在轉基因植物中同時表達基因的有義和反義堿基序列、抑制屬于Ran-介導的細胞過程中的內源基因這一情況下，序列優(yōu)選在長度上為26bp或更多(Parrish et al.，2000 Molecular Cell 61077-1087；Chuang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 974985-4990)。
在本發(fā)明中，將反義AtRanBP1b或AtranBP1c插入到pLBJ21載體以構建兩種重組載體。構建的重組載體pLBJ21/反義AtRanBP1b的保藏號為KCTC 0850BP，重組載體pLBJ21/反義AtRanBP1c的保藏號為KCTC0851BP。
兩種重組載體pLBJ21/反義AtRanBP1b和pBLJ21/反義AtRanBP1c被轉化到擬南芥菜中，并觀察轉化體的顯型。其結果為，由重組載體pLBJ21/反義AtRanBP1b(KCTC 0850BP)轉化的轉基因擬南芥菜表現(xiàn)為大的植物顯型；實際上，所有植物體的尺寸都增加。例如，葉的面積，莖的厚度，種子的體積和重量，植株的高度，花的尺寸，毛狀體的長度，和每個種子的重量都有明顯的增加。重組載體PLBJ21/反義AtRanBP1c(KCTC 0851BP)轉化的轉基因擬南芥菜表現(xiàn)為長主根顯型，并具有如上所述同樣的大植株。
對在pLBJ21/反義AtRanBP1c轉化的擬南芥菜植株中的生長素進行敏感測試。生長素是一種植物激素促進了花粉的萌生，花粉管的延伸，側根和花蓓蕾的形成，萌芽或來自愈合組織的根的產(chǎn)生，以及分裂細胞的分裂和生長。在本發(fā)明中，檢測影響細胞分裂和生長的對生長素敏感是否在轉化的植株中發(fā)生了變化。通常，當側根的生長受到抑制時，在根中的低濃度(10-6-10-7M)生長素可以促進根細胞分裂和并發(fā)根的生長，然而高濃度的(10-6-10-5M)的生長素的作用則相反。
本發(fā)明的pBLJ21/反義AtRanBP1c轉化的轉基因擬南芥菜表現(xiàn)為對生長素的超敏感；甚至低濃度的生長素如從外部提供的pM也抑制根的生長，促進側根開始分化。與野生型植株形成對照，對相同濃度的生長素沒有反應。野生型的植株中，10-7M的生長素促進了側根的分化。由于本發(fā)明的轉基因植物增加了生長素敏感性，因此，通常不能促進野生型根生長的非常低濃度的內源生長素，實際上促進了通過本發(fā)明遺傳修飾的植物根的生長。
另外，本發(fā)明產(chǎn)生了pBLJ21/反義AtRanBP1b(KCTC0850BP)，pBLJ21/反義AtRanBP1c(KCTC 0851BP)，pBLJ21/PSRan(KCTC 0837BP)，pBLJ21/AtRanBP1b(KCTC0838BP)，或pLBJ21/AtRanBP1c(KCTC0839BP)轉化的番茄。
Ran-介導的細胞過程被修飾的轉基因植物表現(xiàn)出長根、大尺寸的種子和大個體的顯型。因此，通過如上所述生產(chǎn)在本發(fā)明的Ran-介導的細胞過程中被修飾的轉基因植物的方法能發(fā)展獲得優(yōu)種。
將對照下列相關實施例更詳細地說明本發(fā)明。然而，下列實施例解釋本發(fā)明但并不限于此。
實施例1.表達PsRan蛋白的轉基因植物。
(1)PsRan基因的克隆使用由擬南介菜Cdna BANK(ARBC，Ohio)提供的ATTS1902克隆中的EcoRI/Xhol基因片段作為探針，篩選豌豆幼芽cDNA表達文庫得到PsRan基因。
(2)含有PsRan基因的重組載體的構建將PsRan cDNA克隆到pBluescript SK+(Strategene，CA)載體的EcoRI和XhoI位點。用限制酶EcoRI和XhoI消化所述基因，然后克隆到已用相同限制酶消化好的pLBJ21載體中以此構建CaMV35S啟動子引導表達PsRan的pLBJ21/PsRan，如圖1所示。通過電穿孔(Koncz，C.，和Schell，J.(1986)MoI.Gen.Genet.204，383-396)將融合載體導入含有pMP90質粒的根癌農(nóng)桿菌GV3101從而將重組載體轉化到植物中。
(3)轉化了pLBJ21/PsRan的擬南芥菜的制備利用農(nóng)桿菌介導的轉化方法(Valvekens等，D.，Montagu，M.V.，和Lijsebettens，m.v.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5536-5540)將pLBJ21/PsRan導入擬南芥菜根部外植體。在發(fā)芽培養(yǎng)基(Valvekens等，D.，Montagu，M.V.，和Lijsebettens，M.V.(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，5536-5540)上培養(yǎng)初級轉化子的T1種子，并用50ug/L卡那霉素選擇轉化子。從所選的T1植物上收獲T2種子，并在同樣的培養(yǎng)基上培育來確認純合的T2種子。確認的T2種子用于觀察轉基因植物的性狀。
實施例2.表達AtRanBP1b蛋白的轉基因植物
(1)AtRanBP1b基因的克隆以PsRan為誘餌用酵母二元雜交篩選方法在擬南芥菜cDNA文庫中克隆Ran結合蛋白。具體來說，以含有啟始ATG密碼子的SEQ ID No.3和含有終止密碼子的SEQ ID No.4作為引物經(jīng)PCR方法擴增全長PsRan。用EcoRl和BamHl消化所擴增的PsRan，然后亞克隆到經(jīng)相同限制酶預降解的pGBT9載體(Clonetech，CA)中。將重組的pGBT9/PsRan載體與亞克隆到pACT中的擬南芥cDNA文庫共轉化到啤酒酵母Y190中，然后根據(jù)公開在Clonetech上的酵母二元雜交篩選中描述的方法克隆Ran結合蛋白質AtRanBP1b。
(2)含有AtRanBP1b基因的重組載體、pLBJ21/AtRanBP1b的構建通過實施例1中描述的同一方法構建pLBJ21/AtRanBP1b重組載體，不同的是用AtRanBP1b代替PsRan，如圖2所示。具體來說，用含有ATG的SEQ.ID.No.8和SEQ.ID.No.9引物經(jīng)PCR擴增全長AtRanBP1b，然后用Xhol/Xbal消化所擴增的基因。將消化好的AtRanBP1b片段亞克隆到經(jīng)相同酶消化的pLBJ21中來構建如圖2所示的重組載體pLBJ21/AtRanBP1b。將重組載體如上所述經(jīng)電穿孔導入農(nóng)桿菌。
(1)轉化了pLBJ21/AtRanBP1b的擬南芥的制備通過與實施例1所描述的同樣方法制備轉化了pLBJ21/AtRanBP1b的擬南芥植物。
實施例3.表達AtRanBP1c基因的轉基因植物(1)AtRanBP1c基因的克隆通過實施例2(1)中描述的酵母二元雜交篩選方法克隆AtRanBP1c。
(2)含有AtRanBP1c基因的重組載體、pLBJ21/AtRanBP1c的構建通過實施例2(2)描述的同樣方法構建pLBJ21/AtRanBP1c重組載體，不同的是用AtRanBP1c代替AtRanBP1b，如圖3所示。利用引物SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11經(jīng)PCR擴增全長AtRanBP1c。
(3)轉化了pLBJ21/AtRanBP1c的擬南芥植物的制備通過與實施例1所描述的同樣方法制備轉化了pLBJ21/AtRanBP1c的擬南芥植物。
實施例4.表達反義AtRanBP1b的轉基因植物(1)反義AtRanBP1b堿基序列的制備利用在AtRanBP1b的3′末端cDNA帶有一個Xhol酶識別位點的引物1SEQ.ID.No.12和5′末端cDNA帶有Xbal識別位點的引物2 SEQ.ID.No.13，由擬南芥菜總RNA經(jīng)RT-PCR擴增全長AtRanBP1b。
(2)含有反義AtRanBP1b堿基序列的重組載體pLBJ21/反義AtRanBP1b的構建。
用Xhol/Xbal消化RT-PCR所擴增的AtRanBP1b來制備含有反義AtRanBP1b堿基序列的DNA片段，其方向從Xhol到Xbal。然后，將所述DNA片段克隆到用Xhol/Xbal消化的pLBJ21區(qū)域來構建CaMV35S啟動子引導的過量表達反義AtRanBP1b的pLBJ21/反義AtRanBP1b，如圖4所示。經(jīng)電穿孔(Koncz，C.，和Schell，J.(1986)Mol.Gen.Genet.204，383-396)將pLBJ21/反義AtRanBP1b導入含有pMP90質粒的根癌農(nóng)桿菌GV3101。
(3)轉化了pLBJ21/反義AtRanBP1b的轉基因植物的制備通過與實施例1所描述的同樣方法制備轉化了pLBJ21/反義AtRanBP1b的轉基因植物。
實施例5.表達反義AtRanBP1c的轉基因植物(1)反義AtRanBP1c堿基序列的制備通過實施例4(1)描述的相同方法經(jīng)RT-PCR擴增全長AtRanBP1c。RT-PCR中使用引物SEQ.ID.No.14和SEQ.ID.No.15。
(2)含有反義AtRanBP1c堿基序列的重組載體的構建用實施例4所述的相同方法構建pLBJ21/反義AtRanBP1c重組載體，不同的是用AtRanBP1c代替AtRanBP1b，如圖5所示。
(3)轉化了pLBJ21/反義AtRanBP1c的擬南芥菜的制備通過實施例1所述的相同的方法制備轉化了pLBJ21/反義AtRanBP1c的擬南芥菜植物。
實施例6到10通過實施例1到5所述的相同的方法將pLBJ21/PsRan，pLBJ21/AtRanBP1b，pLBJ21/AtRanBP1c，pLBJ21/反義AtRanBP1b，和pLBJ21/反義AtRanBP1c重組載體轉化番茄，不同的是用番茄的子葉代替擬南芥菜根外植體。
實驗1轉基因植物的鑒定(i)基因組Southern分析為了鑒定轉化到以上實施例所述的轉基因植物的基因是否穩(wěn)定地導入了植物的染色體，用轉基因植物的基因組DNA進行Southern分析。
從3周齡的植物中分離基因組DNA，并用EcoRI降解。通過電泳在0.8％的瓊脂糖凝膠上分離降解的DNA，并轉移到zeta-probe膜(Biorad)上。該膜于65℃在0.25M磷酸鈉(pH7.2)和7％SDS中預培養(yǎng)30分鐘。在培養(yǎng)溶液中加入[a-32P]dATP-CaMV 35S啟動子(消化Xbal/HindIII的pBI221載體的片段)探針，并將膜繼續(xù)在65℃培養(yǎng)20小時。培養(yǎng)后，將膜用含有20mM磷酸鈉，pH7.2，和5％SDS的溶液洗滌，最后用含有1％SDS的相同溶液在65℃洗滌1小時。然后將膜曝光來檢測插入的轉基因。結果，攜帶CaMV35S啟動子和轉基因的轉化植物得以確認。
圖6和7顯示了兩個不同轉基因種系的Southern印跡分析。
圖6顯示轉化了pLBJ21/PsRan的擬南芥菜的DNA凝膠印跡分析(Southern印跡分析)照片，圖7顯示轉化了pLBJ21/反義AtRanBP1c的擬南芥菜的DNA凝膠印跡分析照片。如圖6和7所示，我們制備了許多pLBJ21/PsRan和pLBJ21/反義AtRanBP1c轉基因植物，其轉基因插入了不同的染色體(例如，在有義PsRan-1，-4，-6，-7，-8植物基因組中，CaMV35S片段被不同長度的不同條帶鑒定)。
(i)RNA的Northern印跡分析如上所示已經(jīng)證實基因被導入了這些轉基因植物，為了鑒定導入的基因能否表達，進一步對它們進行Northern印跡分析。
為此，用Trizol試劑(Gibco BRL)溶液提取轉基因植物的RNA，并在含有6％甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上電泳分離。然后用有義或反義核酸探針PsRan，AtRanBP1b或AtRanBP1c做Northern印跡分析。所述探針是用轉錄試劑盒MAXlscript T3/T7(Ambion，TX)制備的。Northern雜交后，將RNA對加強屏曝光并顯影以便測量相應RNA的表達。
圖8顯示轉化了pLBJ21/PsRan的植物的Northern印跡分析照片，圖9顯示轉化了pLBJ21/反義AtRanBP1c的植物的Northern印跡分析照片。如圖8和9所示，轉基因在轉基因擬南芥菜植物中被過表達。此外，如圖9所示，證實了表達反義AtRanBP1c表達時，在相應轉基因植物中內源AtRanBP1c的表達被抑制。
實驗2 5個不同轉基因擬南芥菜種系的表現(xiàn)型(i)根長度的表現(xiàn)型按照實施例1到5測量擬南芥菜根的長度，結果示于表1和2。

表1

表2如圖8，表1和表2所示，過表達PsRan的轉基因擬南芥菜(pLBJ21/PsRan-4)和轉基因擬南芥菜(pLBJ21/PsRan-7)的根長度比野生型植物的或不過量表達PsRan基因的轉基因擬南芥菜(pLBJ21/PsRan-1)的大。另外，pLBJ21/反義AtRanBP1c轉化的擬南芥菜的根也比野生型植株的長。
圖10顯示的為pLBJ21/PsRan-7轉化的擬南芥菜的根的照片，和其他對照植株。pLBJ21/PsRan-7轉基因的根的長度比野生型或pLBJ21轉化的擬南芥菜的大。
圖11顯示的為pLBJ21/反義AtRanBP1c轉化的擬南芥菜的根的長度的照片。清楚的看到pLBJ21/反義AtRanBP1c轉化的擬南芥菜的根的長度比野生型的大。
解剖分析上述實施例中5種不同的轉基因擬南芥菜株系，用Navishins溶液固定根組織(Mauseth，J.D.，Montenegro，G.，and Walckowiak，A.M.(1984)Can.J.Bor.62，847-857)。固定后，植物組織通過標準的乙醇步驟被干燥。乙醇導入到石蠟前用二甲苯交換，并且然后將組織切成7μm并染色以用標準亮的顯微鏡觀察。每24小時用解剖學使用的40X放大率的顯微鏡和尺計算每個根。從轉基因植物或野生型植物的生長平均數(shù)計算尖端生長率的平均數(shù)。用SAS程序來進行統(tǒng)計分析，用千分尺在6.3X放大率的物鏡下操作進行測量。野生型的擬南芥菜用來比較分析。
下列表3中顯示了轉基因植株和pLBJ21/反義AtRanBP1c之一和野生型之間存在的用顯微鏡可以觀察到的解剖上的不同。

表3如上述表3所述的pLBJ21/反義AtRanBP1c轉化的轉基因植物的根的長度的平均數(shù)大約是野生型的1.6倍。這種長根的顯型歸于表皮，皮層和內皮的長度的平均數(shù)的增加，如表4所示。

表4

表5另外，如表5所示，轉基因植物的根尖端細胞的生長率大約是野生型的1.5倍。
(ii)計算轉基因植物的IAA敏感性為了檢查轉基因植物對IAA(吲哚乙酸)的反應，用普通的漂白溶液將轉基因擬南芥菜(pLBJ21/反義AtRanBP1c)的種子表面滅菌15分鐘。然后將它們用已滅菌的水清洗，然后在空氣中干燥。準備好萌芽培養(yǎng)基(GM-蔗糖)的盤子，并將種子放于其中，在4℃培養(yǎng)72小時，這樣萌芽將同時出現(xiàn)。各種濃度的IAA被加入到盤中，并將培養(yǎng)基轉移到培養(yǎng)室在相同的條件下生長。種子萌芽并生長10天(Modified from Knee and Hangarter，1996)10天后，測量并觀察根的長度和形狀。實施例中的轉基因植物的這些與野生型的比較，并把結果列于下面的表6中。

表6在野生型植物的根中，通過應用10-10M-10-6M的生長素通常可以促進生長，超過上述范圍的濃度則抑制其生長。如表6中所示，轉基因植物對生長素的敏感性已經(jīng)大大地增加了。因此，根部的生長甚至通過應用10-10M-10-12M的生長素而被嚴重抑制。在實施例5的轉基因植物的細胞分裂中發(fā)生的體細胞分裂的失敗導致了抑制根的生長。從其中，明顯的看出非常低濃度的內源生長素(低于10-10M-10-12M)促進了實施例5中轉基因植物的主根的生長。
(iii)比較轉基因植物種子的大小按照實施例1到5的5種不同的轉基因株系產(chǎn)生的T3種子的獲得和重量。結果顯示于表7中。

表7如表7所示，本發(fā)明的轉基因植物產(chǎn)生的種子比野生型的種子重量增加了1.2到2倍或更多。特別是，pLBJ21/反義AtRanBP1b轉化的擬南芥菜產(chǎn)生的種子的重量是野生型的2倍，另外，本發(fā)明的轉基因植物表現(xiàn)為葉面積，莖厚度和每個植物的種子數(shù)量的增加。
圖12是反義AtRanBP1b/pLBJ21植物產(chǎn)生的比野生型大的種子的照片。
(vi)比較轉基因植物的葉面積、胚軸長度和干重pLBJ21/反義AtRanBp1b轉化的一種擬南芥菜在MS培養(yǎng)物中發(fā)芽，擬南芥菜在4葉期的特征在發(fā)芽2周后觀察。這些實驗的結果列于表8中。

表8另外，我們計算種子的產(chǎn)生量，花的大小，和節(jié)間長度。植物在按50∶50的比例混合腐殖質和蛭石的土壤中在生長室中生長7到9周，生長條件為23℃，60％的濕度，以及12小時的黑暗和12小時的光。包含5％氮，10％磷酸溶液和5％鉀溶液的肥料液一周兩次加入到植物中。計算植物的特征并將結果列于表9中。

表9如圖13，14和15所示，pLBJ21/反義AtRanBP1b轉化的擬南芥菜的花的大小、葉的大小和植株的大小比野生型大。
實驗3.轉基因番茄的顯型在按照實施例6到10的轉基因番茄中，pLBJ21/AtRanBP1b轉化的轉基因番茄的特征列于表10中。

表10如表10所示，pLBJ21/AtRanBP1b轉化的轉基因番茄的生物量的特性，如植株高度，葉的厚度、重量和大小，每單位重量的葉綠素的容量和莖的直徑都明顯的增加了。另外，未成熟的果實的直徑增加是因為葉的光合能力的增加。如圖16，17，18和19所示，轉基因番茄的成熟體的大小，成熟葉的大小，莖的厚度和未成熟的果實的大小比對比的野生型植株大。
成體或種子大小或根的長度增加的轉基因植物可以通過過量表達Ran和RanBPs或抑制它們的表達而獲得。由本發(fā)明的5種重組載體轉化的農(nóng)作物可以增加它們的產(chǎn)量，這樣可以應用于高產(chǎn)量、超多產(chǎn)的品種的發(fā)展。
序列表<110>KIM，soo hwan<120>Protocols for generation of high yield，super-productivetransgenic plants disturbed in Ran/RanBP-mediated cellular process<130>dp012427<150>KR 10-2000-50067<151>2000-08-28<150>KR 10-2001-51820<151>2001-08-27<160>15<170>Kopatentin 1.71<210>1<211>874<212>DNA<213>從豌豆中分離的PaRan<400>1cgcaacctag cttttcctcc ataatcgatt attccattca tttcaatggc cttgcctaat60cagcaaacag ttgattatcc tagtttcaag cttgtgatcg tcggtgacgg tggcacagga 120aaaacaactt tcgtaaagag gcatcttact ggagaatttg agaagaaata tgaaccaact 180attggtgttg aagtgcatcc attggatttc ttcacaaagt gtggtaagat tcgtttctac 240tgctgggata ctgctggtca agagaagttt ggtggtctca gagatggata ctatattcat 300ggacagtgtg ctattataat gtttgatgtt actgcacggc tgacatacaa gaatgtccct 360acttggcacc gtgatctttg ccgggtctgt gaaaacatcc caattgttct ttgtggaaac 420aaggttgatg tgaagaacag gcaagtgaag gcaaagcagg ttaccttcca caggaagaaa 480aatttgcagt actatgaaat atcagctaag agcaactaca actttgagaa gcctttcctg 540tatcttgcca ggaaacttgc aggtgatcct aatttgcact ttgtagaatc tcctgcactg 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780gctacctgag ctccggtgtc ttcatcttcg ttgacttcgg tttcatcttc acggttctca 840cgctctggct cagtgctcgc catctctgta ttgaaacttg aaagtgtgtg tgtgtgctct 900gcaacttccg gacgcgtggg tcg 923<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>PsRan的有義引物<400>6attcgaattc atggccttgc ctaatc 26<210>7<211>27<212>DNA<213>Artificial Seguence<220><223>PsRan的反義引物<400>7cgcgggatcc tctgaaggtc cttccta 27<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>AtRanBP1b的有義引物<400>8tttctcgaga tggcgagcat tagcaacgag c31<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><23>AtRanBP1b的反義引物<400>9aaatctagaa cacgcgaatc atccatgcat ac 32<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>AtRanBP1c的有義引物<400>10aatctcgaga tggcgagcac tgagccagag30<210>11<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>AtRanBP1c的反義引物<400>11aaatctagac agtaaagaga cgacacaata g 31<210>12<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>反義AtRanBP1b的RT-PCR的引物<400>12cacctcgagt cttccagata atgaaaccc 29<210>13<211>28<21>DNA<213>人工序列<220><223>反義AtRanBP1b的RT-PCR的引物<400>13ttttctagaa tggcgagcat tagcaacg 28<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>反義AtRanBP1c的RT-PCR的引物<400>14ctgctcgagt gctttctcct cacttata 28<210>15<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>反義AtRanBP1c的RT-PCR的引物<400>15gcgtctagac cgtgaagatg aaaccgaag 29
PCT/R0/134表微生物或其它生物材料的保藏證明(PCT條約13bis) 微生物或其它生物材料的保藏證明(PCT條約13bis) 微生物或其它生物材料的保藏證明(PCT條約13bis) 微生物或其它生物材料的保藏證明(PCT條約13bis) 微生物或其它生物材料的保藏證明(PCT條約13bis)
權利要求
1.一種從豌豆中分離的PaRan序列SEQ.ID.NO.1。
2.一種從擬南芥菜中分離的AtRanBP1b序列SEQ.ID.NO.2。
3.一種從擬南芥菜中分離的AtRanBP1c序列SEQ.ID.NO.3。
4.一種AtRanBP1b的反義(antisense，anti-)序列SEQ.ID.NO.4，其抑制AtRanBP1b基因的表達。
5.一種AtRanBP1c的反義序列SEQ.ID.NO.5，其抑制AtRanBP1c基因的表達。
6.一種包括AtRanBP1b反義序列SEQ.ID.NO.4或部分AtRanBP1b反義序列的重組載體。
7.按照權利要求6的重組載體，其中重組載體是pLBJ21/反義(antisense)AtRanBP1b(KCTC0850BP)。
8.一種包括部分AtRanBP1c反義序列或AtRanBP1c反義序列SEQ.ID.NO.5的重組載體。
9.按照權利要求8的重組載體，其中重組載體是pLBJ21/反義AtRanBP1c(KCTC0851BP)。
10.一種包括從Ran，AtRanBP1a，AtRanBP1b，AtRanBP1c，RanGAP，RanBPM，RCC1和RanBP1中選擇的基因的重組載體。
11.按照權利要求10的重組載體，其中重組載體從pLBJ21/PsRan(KCTC0837BP)，pLBJ21/AtRanBP1b(KCTC 0838BP)和pLBJ21/AtRanBP1c(KCTC0839BP)中選擇。
12.一種包括參與Ran-介導的細胞過程的有義(sense)或反義基因序列的轉基因載體轉化的重組植物。
13.按照權利要求12的轉基因植物，其中基因選自Ran，AtRanBP1a，AtRanBP1b，AtRanBP1c，RanGAP，RanBPM，RCC1和RanBP1。
14.按照權利要求12的轉基因植物，其中重組載體是權利要求6所述的重組載體、權利要求8所述的重組載體或權利要求10所述的重組載體。
15.按照權利要求12的轉基因植物，其中轉基因植物選自由pLBJ21/反義AtRanBP1b(KCTC0850BP)，pLBJ21/反義AtRanBP1c(KCTC0851BP)，pLBJ21/PsRan(KCTC 0837BP)，pLBJ21/AtRanBP1b(KCTC 0838BP)和pLBJ21/AtRanBP1c(KCTC 0839BP)轉化的植物組成的組。
16.一種產(chǎn)生轉基因植物的方法，包括將包含參與Ran-介導的細胞過程的基因的重組載體轉化到植物中，或從中剔除這些基因的步驟。
17.按照權利要求16的方法，其中重組載體包括或者可以同時表達基因的有義或反義序列或者可以同時表達RNA的有義或反義序列的啟動子。
18.按照權利要求16的方法，其中基因選自Ran，AtRanBP1a，AtRanBP1b，AtRanBP1c，RanGAP，RanBPM，RCC1和RanBP1。
19.按照權利要求18的方法，其中Ran是一種70％或更多與氨基酸相同的蛋白。
20.按照權利要求18的方法，其中AtRanBP1b或AtRanBP1c是一種50％或更多與氨基酸相同的蛋白。
21.按照權利要求18的方法，其中AtRanBP1a，RanGAP，RanBPM，RCC1或RanBP1是一種35％或更多與氨基酸相同的蛋白。
22.按照權利要求16的方法，其中基因由Ran-粘合域組成。
23.按照權利要求16的方法，其中反義序列是全部或部分反義序列。
24.按照權利要求16的方法，其中剔除方法是一種從由轉座子，UV-處理，和EMS-處理組成的組中選擇的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及由擾亂Ran/Ran－粘合蛋白介導的細胞過程而產(chǎn)生高產(chǎn)量，超多產(chǎn)轉基因植物的方法。特別是，本發(fā)明涉及一種通過過量表達有義或反義Ran或不同Ran－粘合蛋白以修飾涉及這些蛋白的生物過程而產(chǎn)生轉基因植物的方法。這些基因技術提供了發(fā)展具有經(jīng)濟價值超高產(chǎn)的農(nóng)作物的途徑，其生物量和產(chǎn)量比現(xiàn)在可以獲得的野生型的提高1.5－2.5倍。這些大小或長度的增加可以在許多轉基因植物的器官包括葉，莖，花，根和種子中看到。
文檔編號C12N15/82GK1462176SQ01814962
公開日2003年12月17日 申請日期2001年8月28日 優(yōu)先權日2000年8月28日
發(fā)明者金守煥 申請人:Bionox株式會社