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      通過哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)制備人血小板生成素多肽的方法

      文檔序號:587983閱讀:537來源:國知局
      專利名稱:通過哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)制備人血小板生成素多肽的方法
      背景技術(shù)
      在每個正常的成年人中,血細(xì)胞是在骨髓處從干細(xì)胞中通過一個稱為“血細(xì)胞生成”的過程產(chǎn)生的。在幾個增殖和分化步驟后,這些先祖多潛能細(xì)胞能夠自體復(fù)制而不分化自身(核內(nèi)倍增/自我復(fù)制)或者能夠以4種主要分化方式產(chǎn)生一系列先祖細(xì)胞a)細(xì)胞胞類(紅血細(xì)胞或紅細(xì)胞);b)骨髓樣(多形核白細(xì)胞和單核細(xì)胞);c)淋巴樣(淋巴細(xì)胞)和d)megakaryiotic(巨核細(xì)胞/血小板的產(chǎn)生源)。骨髓產(chǎn)生的量和細(xì)胞類型是受通過靶細(xì)胞上結(jié)合膜的受體起作用的復(fù)雜的細(xì)胞因子或生長因子的系統(tǒng)細(xì)微調(diào)節(jié)的過程。這些細(xì)胞因子包括異源組的生長因子,其包括白介素(其中有TNF-α、IL-3、IL-6、IL-8e IL-11)和稱為“菌落刺激因子”(粒細(xì)胞集落刺激因子和粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子[分別是G-CSF y GM-CSF]的糖蛋白激素;作為紅細(xì)胞祖先的刺激因子的紅細(xì)胞生成素和作為血小板先祖的刺激物的血小板生成素。
      隨著對血細(xì)胞生成和它的調(diào)節(jié)的了解的增加,人們利用了各種造血的細(xì)胞因子在醫(yī)藥治療中。以這樣的方式,已經(jīng)包括在醫(yī)學(xué)治療中的有-紅細(xì)胞生成素(EPO),用于在慢性腎衰竭中治療二次貧血。
      -集落刺激因子(G-CSF y GM-CSF),能夠使接受化學(xué)治療的癌癥患者或那些接受骨髓移植的患者的免疫系統(tǒng)加速恢復(fù)。
      -IL-2和干擾素-α,兩者已經(jīng)廣泛用于化學(xué)治療劑的結(jié)合治療中。干擾素已經(jīng)使用在慢性肝炎的治療中,以及IL-2在AIDS治療中與抗逆病毒劑結(jié)合使用,都有一定的療效。
      循環(huán)的血液血小板是在骨髓中產(chǎn)生的,并且在血液的凝結(jié)中起關(guān)鍵的作用。血小板與組織損傷位點(diǎn)黏連并且募集其他物質(zhì)與之聚集,形成“初級止血栓子”。另外,它可以作為凝集因子受激產(chǎn)生纖維凝塊的表面。在沒有血小板時,這兩種功能都沒有,繼而發(fā)生出血(1)。血小板的產(chǎn)生意味著骨髓干細(xì)胞增殖和分化成巨核細(xì)胞,其將產(chǎn)生在外周血液中正常循環(huán)的成熟的血小板(凝血細(xì)胞)。
      產(chǎn)生血小板的生理過程需要來自巨核細(xì)胞譜系的作為生長和發(fā)育因子稱為“血小板生成的”因子的存在。在臨床醫(yī)學(xué)中,血小板數(shù)目的降低(血小板減小)是涉及下面兩個相關(guān)情況的一個很嚴(yán)重的并發(fā)癥a)影響血小板的正常產(chǎn)生的疾病(初級血小板缺少癥)和b)是癌癥患者或接受骨髓移植的患者中治療起源的并發(fā)癥的后果(次級血小板缺少癥)。這些患者中出血風(fēng)險的增加實(shí)際需要施用來自有相關(guān)的生物學(xué)危險(變態(tài)反性、感染、免疫超敏感性)的正常供體的血小板濃縮物。從Kelemaen和cols(2)于1958年對血小板減少的動物中的血小板生成素活性的早期描述開始,我們不得不一直等到1994年才鑒定了該因子,通過了若干次的純化和克隆,作為能夠結(jié)合細(xì)胞受體MPI(應(yīng)答鼠骨髓增殖白血病病毒的癌基因)的糖蛋白(3),其鑒定為血小板生成素(或者稱為c-MPI配體;巨大生成素(Megapoietin)或巨核細(xì)胞生長和發(fā)育因子(MGDF)),能夠特異地刺激巨核細(xì)胞的生成或血小板的生成(4-8)。具有血小板生成活性的其他因子已有敘述(9),包括IL-6和IL-11,雖然它們是非特異的并且具有多效作用。分別施用高劑量的IL-11和IL-6已經(jīng)導(dǎo)致了循環(huán)中血小板少量增加(10)。人血小板生成素的基因(hTPO)以單個拷貝定位于染色體3(3q26-27)。它編碼353個氨基酸的蛋白質(zhì)(10590個堿基對的可讀框),包括21個氨基酸(aa)的信號肽(63個堿基對)。成熟的蛋白質(zhì)具有332個aa(996bp)并且估計(jì)分子量為38kDa(非糖苷化)。它具有6個便于產(chǎn)生70-80kDa的完全糖苷化蛋白質(zhì)的N-糖苷化位點(diǎn)和一個在第153位和第154位的精氨酸之間的切割位點(diǎn),其中蛋白質(zhì)分成兩個區(qū)a)與已知的蛋白質(zhì)沒有同源性的高度糖苷化的C末端區(qū),和b)與EPO有23%同一性的153個氨基酸的類似EPO區(qū)或N末端區(qū)。允許保守氨基酸取代,序列的保守性達(dá)到50%。重要的是強(qiáng)調(diào),由于穩(wěn)定性降低和在循環(huán)中快速凈化,非糖苷化形式在體外而不是體內(nèi)具有完全的活性。除了天然分子(70-80kDa),已經(jīng)敘述了幾個循環(huán)中的TPO形式,作為它的部分蛋白質(zhì)水解的結(jié)果,由30、25和18kDa形式組成,所有形式都截?cái)嘣贑末端區(qū)(9,11和12)。
      目前,具有可獲得的血小板生成活性和FDA(食品和藥品管理局)批準(zhǔn)的唯一因子是人重組IL-11。
      本發(fā)明的一般敘述從一般的觀察點(diǎn)來看,本發(fā)明涉及在一個方面,本發(fā)明提供了在哺乳動物宿主細(xì)胞中可復(fù)制的表達(dá)載體。這些載體包括下面的可操作連接的元件1)轉(zhuǎn)錄啟動子;2)編碼天然hTPO的分泌性前導(dǎo)物或信號肽的第一DNA區(qū)段;3)編碼完整的hTPO多肽的第二DNA區(qū)段;4)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子;5)聚腺苷酸化信號和6)轉(zhuǎn)錄終止子。
      在本發(fā)明的第二方面,提供了含有如上公開的DNA構(gòu)建體的已培養(yǎng)的真核細(xì)胞系。優(yōu)選的細(xì)胞系是哺乳動物細(xì)胞。
      在第三方面,提供了對hTPO產(chǎn)生方法的敘述,其具有用前面所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞質(zhì)起源的鼠細(xì)胞系。所以,這一細(xì)胞系獲得了合成和分泌與它的天然等當(dāng)物相同的生物活性人重組hTPO(rhTPO)的能力。本發(fā)明的詳細(xì)說明在描述本發(fā)明之前,和為了簡化對它的理解,對本發(fā)明中利用的一些術(shù)語和方法進(jìn)行概括和解釋是有幫助的血小板生成素(TPO)其是在正常個體中主要由肝和腎細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白。它能夠特異地與刺激血小板生產(chǎn)的來自相同物種的MPI受體結(jié)合。MPI受體主要存在于多潛能干細(xì)胞、巨核細(xì)胞和血小板上。詞頭“h”參考了人TPO(hTPO)。術(shù)語hTPO包括了展示完整分子的定量的生物學(xué)活性(受體結(jié)合和體內(nèi)血小板生產(chǎn)的刺激)的全長血小板生成素分子。
      重組蛋白質(zhì)當(dāng)為了產(chǎn)生不是由細(xì)胞正常產(chǎn)生的蛋白質(zhì),通過重組DNA技術(shù)遺傳修飾來自某起源的細(xì)胞時,獲得了重組蛋白質(zhì)的名稱。通常,詞頭“r”表示它是重組生物分子。
      cDNA(互補(bǔ)的脫氧核糖核酸)其代表稱為逆轉(zhuǎn)錄的過程中所得到的核糖核酸(RNA)的互補(bǔ)拷貝,其中DNA聚合酶利用RNA作為模板(逆轉(zhuǎn)錄酶)。cDNA可以是單鏈或雙鏈的。
      表達(dá)載體其是線性或環(huán)狀的DNA分子,包括編碼與提供轉(zhuǎn)錄的其他區(qū)段可操作地連接的目的多肽的區(qū)段。這樣的其他區(qū)段包括啟動子和終止子序列。表達(dá)載體亦可以包括一個或多個復(fù)制起點(diǎn)、一個或幾個可選擇的標(biāo)記、增強(qiáng)子、聚腺苷酸化信號等。表達(dá)載體通常起源于質(zhì)粒或病毒DNA,或者可以含有這兩個元件。術(shù)語“可操作地連接”表示這些區(qū)段排列成使它們的作用與它們的使用目的一致,例如,轉(zhuǎn)錄起始在啟動子,并通過編碼區(qū)到終止子前行。在宿主生物中表達(dá)載體的復(fù)制可以是自身的或者通過整合進(jìn)宿主基因組中。
      前導(dǎo)或信號序列編碼分泌性肽的DNA序列。信號序列亦稱為前導(dǎo)或前序列。分泌性肽是指導(dǎo)成熟多肽或蛋白質(zhì)從細(xì)胞中分泌的氨基酸序列。分泌性肽的特征是具有疏水氨基酸的核,并且通常(并非唯一)是在新合成的蛋白質(zhì)的氨基末端發(fā)現(xiàn)的。十分常見情況下,分泌性肽是在分泌過程中經(jīng)過一次或多次切割后從成熟蛋白質(zhì)中切割出來的。這樣的分泌性肽含有當(dāng)它們通過分泌通道時,允許從成熟蛋白質(zhì)切割分泌肽的加工位點(diǎn)。
      啟動子為了啟動基因轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生對應(yīng)的信使RNA而被RNA聚合酶識別的DNA序列。
      轉(zhuǎn)染通過導(dǎo)入DNA構(gòu)建體遺傳地修飾真核細(xì)胞的方法,所述構(gòu)建體能夠產(chǎn)生不是細(xì)胞正常產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。它們被描述為“轉(zhuǎn)染細(xì)胞”。
      本發(fā)明提供了用于獲得具有已證明的生物活性的人重組TPO的材料和方法,總的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)具有如下步驟1.從已經(jīng)進(jìn)行了hepatobilliar手術(shù)的志愿者供體得到的正常人的肝中分離總RNA。
      2.通過逆轉(zhuǎn)錄過程從RNA得到總cDNA,和利用特異引物從cDNA擴(kuò)增hTPO的完整的序列(表II)。
      3.進(jìn)行了含有hTPO的特異cDNA的表達(dá)載體的構(gòu)建,它的形式是能夠?qū)胝婧思?xì)胞的,以便誘導(dǎo)人血小板生成素的表達(dá)和產(chǎn)生。
      4.在可以體外培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞系中,通過常規(guī)電穿孔技術(shù)導(dǎo)入載體。
      5.在細(xì)胞生長的人工培養(yǎng)基中加入新霉素抗生素。選擇已經(jīng)成功摻入表達(dá)載體的細(xì)胞,因?yàn)檫@些細(xì)胞攜帶編碼對抗生素新霉素有抗性的基因。
      6.通過限制稀釋的方法,選擇含有表達(dá)載體的個體細(xì)胞。產(chǎn)生明顯量的重組人血小板生成素的細(xì)胞稱為“克隆”。
      7.利用培養(yǎng)上清液,通過它們可選擇性誘導(dǎo)的能力,在體外和體內(nèi)分析中測試它的生物學(xué)活性a)在體外培養(yǎng)物中,造血前體向巨核細(xì)胞分化;b)TPO依賴的細(xì)胞系增殖;c)在血小板減少的動物中,血液循環(huán)中的血小板增加(體內(nèi)刺激血小板生產(chǎn))。
      鑒定為NM000460的核苷酸序列和鑒定為對應(yīng)于成熟的hTPO的SEQ N°1的氨基酸序列表示在表I(5)中。序列NM 000460和SEQ N°1表示hTPO的單個等位基因,其中可能存在不同的等位基因變體。從已克隆的細(xì)胞、人組織或DNA制備物中可以得到那些變體。該序列用于獲得對擴(kuò)增特異的TPO物質(zhì)和其后的克隆和純化所需要的引物。在本發(fā)明中,我們進(jìn)行了從正常的肝組織中克隆和獲得對應(yīng)于包括它的信號肽的完整hTPO的cDNA。在本發(fā)明中未利用相同的序列的部分或修飾的片段。
      在本發(fā)明中構(gòu)建的表達(dá)載體(在哺乳動物細(xì)胞中可復(fù)制),如前所述,按順序包括a)轉(zhuǎn)錄啟動子,派生自人B淋巴細(xì)胞的基因組文庫得到的人免疫球蛋白的κ鏈的可變基因;b)編碼hTPO的特異信號肽的DNA的第一區(qū)段;c)編碼全長的成熟hTPO多肽的DNA的第二區(qū)段;d)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子,派生自人κ基因的內(nèi)含子區(qū)域(來自人B淋巴細(xì)胞的基因組文庫);e)聚腺苷酸化信號;f)轉(zhuǎn)錄終止子;g)對作為細(xì)菌系統(tǒng)中選擇性標(biāo)記的氨芐青霉素有抗性的基因的完整序列;h)對作為真核細(xì)胞系統(tǒng)中選擇性標(biāo)記的新霉素有抗性的基因的完整序列;I)允許在細(xì)菌中擴(kuò)展的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。編碼成熟hTPO多肽的DNA區(qū)段的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)導(dǎo)的直接產(chǎn)物可以依賴于轉(zhuǎn)導(dǎo)后的加工,即通過稱為“N-連接糖基化或O-連接糖基化”的化學(xué)鍵加入不同的化學(xué)基團(tuán),其中包括碳水化合物的聯(lián)合。這一轉(zhuǎn)導(dǎo)后修飾的準(zhǔn)確性質(zhì)將最大地,但不是唯一地由用于生產(chǎn)重組hTPO的宿主細(xì)胞的類型來決定。
      在本發(fā)明中利用的適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括可經(jīng)改造以表達(dá)異源DNA、可以在培養(yǎng)基中生長并且具有有效的分泌途徑的任何類型真核細(xì)胞。符合這些要求的優(yōu)選的細(xì)胞有本領(lǐng)域已知、并且可以從公共保藏中心如美國典型培養(yǎng)物保藏中心,Rockville,馬里蘭州(ATCC)得到、由鼠骨髓瘤派生的那些。為了給出一個參考,細(xì)胞系是X-63(P63X63Ag.563(ATCC N°CRL-1580)和SP2(ATCC N°CRL-1581和CRL-8287)。為了指導(dǎo)hTPO多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑,將編碼分泌性前導(dǎo)物的DNA序列和編碼hTPO多肽的DNA序列組合使用。在本發(fā)明中,利用的信號肽對應(yīng)于天然hTPO(在表I中SEQ 1以黑字體出現(xiàn)的氨基酸序列)。通常需要強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄啟動子,如便于參考包括在此的免疫球蛋白、派生自SV40、腺病毒或巨細(xì)胞病毒的病毒啟動子。
      藥物選擇是允許選擇那些已經(jīng)成功摻入表達(dá)載體的哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞的廣泛使用的方法。這些細(xì)胞通常稱為“轉(zhuǎn)染體”。在存在選擇劑時培養(yǎng)的并且能夠?qū)⒛康幕騻鬟f給它們的子代的細(xì)胞稱為”穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體”。優(yōu)選的可選擇標(biāo)記是編碼對抗生素新霉素有抗性的基因。篩選在新霉素型藥物如G-418等存在下進(jìn)行。選擇系統(tǒng)也可以用于增加目的基因的表達(dá)水平,一個稱為“擴(kuò)增”的過程。擴(kuò)增是在存在低水平選擇劑下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染體,然后增加選擇劑的量從而選擇產(chǎn)生高水平的導(dǎo)入基因產(chǎn)物的細(xì)胞來進(jìn)行的??梢允褂玫钠渌幬锟剐曰蚩梢允浅泵顾?、多藥物抗性基因、二氫葉酸還原酶和嘌呤霉素乙?;D(zhuǎn)移酶。
      有許多方法可以在哺乳動物的細(xì)胞中摻入外源DNA,其中我們強(qiáng)調(diào)的有a)磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染;b)電穿孔(14);c)DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Ausubel等編,Current Protocols in Molecular Biology(當(dāng)前分子生物學(xué)方案),John Wiley and Sons,Inc.,NY,1987)和d)陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。用于本發(fā)明的優(yōu)選的方法是電穿孔。轉(zhuǎn)染細(xì)胞是在常規(guī)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的,培養(yǎng)基中含有細(xì)胞生長的必需營養(yǎng)物,以及必需的抗生素,以便選擇已經(jīng)摻入了外源DNA的細(xì)胞。
      根據(jù)本發(fā)明制備的hTPO多肽可以治療性地用于需要增加血小板生產(chǎn)的地方,如各種疾病包括再生障礙性貧血、骨髓發(fā)育不良綜合癥、化療或先天性血小板減少所誘導(dǎo)的血小板減少癥的治療中。
      血小板減少癥的特征是血液循環(huán)中血小板的減少,并且明顯是皮膚和粘膜出血增加。血小板數(shù)量的降低可能是由于例如血小板生產(chǎn)的缺陷、血小板的異常分布、大量輸血導(dǎo)致的稀釋性損失或血小板的不正常破壞而造成的。另外,某些惡性腫瘤可以損傷血小板的生產(chǎn)和血小板的分布。用于殺死惡性細(xì)胞的放射性治療也殺死血小板的先祖細(xì)胞。血小板減少癥也可出現(xiàn)由藥物、新生兒同種免疫性或血小板輸血性同種免疫性誘導(dǎo)的各種血小板自身免疫紊亂。hTPO多肽可以減少或消除對輸血的需要,從而降低血小板同種免疫性的發(fā)生率。血小板的不正常破壞可以是下面因素導(dǎo)致的1)在血管移植中或受外傷的組織中的血小板消耗的增加;或2)與例如藥物誘導(dǎo)的血小板減少、自發(fā)性的血小板減少癥紫瘢(ITP)、自身免疫疾病、血液學(xué)紊亂如白血病和淋巴瘤或涉及骨髓的轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)的免疫機(jī)制。hTPO的其他適應(yīng)癥包括再生性障礙貧血和由例如化學(xué)治療或AZT對HIV感染的治療所導(dǎo)致的藥物誘導(dǎo)的骨髓抑制。
      rhTPO也可以于其他細(xì)胞因子如SCF、IL-3、IL-6、IL-11或GM-CSF相關(guān)。rhTPO的治療劑量范圍是每天0.1到100μg/kg(優(yōu)選0.5-50μg/kg/天)。準(zhǔn)確的劑量必須通過每個特殊病例中的臨床評估來確定。rhTPO是在化學(xué)治療或骨髓移植后給藥28天,或直到血小板數(shù)大于20,000/μl,優(yōu)選50,000/μl。
      rhTPO多肽也是體外研究造血細(xì)胞分化和發(fā)育的的有價值的工具,如用于闡述細(xì)胞分化的機(jī)制,或用于決定成熟細(xì)胞的譜系,并且也可以發(fā)現(xiàn)作為細(xì)胞培養(yǎng)中的增殖劑的實(shí)用性。
      rhTPO多肽也可以離體使用,如用于自身的骨髓培養(yǎng)。簡要地說,在化學(xué)治療前,將骨髓從患者體中移出,并用rhTPO多肽處理,任選與一個或多個其他細(xì)胞因子組合使用。然后,將經(jīng)處理的骨髓在化學(xué)治療之后返回到患者,以加速骨髓的恢復(fù)。另外,rhTPO多肽也可以用于離體擴(kuò)展骨髓或外周血先祖(PBPC)細(xì)胞。在化學(xué)治療之前,可以用干細(xì)胞因子(SCF)或G-CSF刺激骨髓,以將早期的先祖細(xì)胞釋放到外周循環(huán)中??梢詮耐庵苎惺占饪s這些先祖細(xì)胞,然后用一個或多個rhTPO多肽,任選結(jié)合一個或多個其他的細(xì)胞因子在培養(yǎng)物中處理,這些其他的細(xì)胞因子包括但不限于SCF、G-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-6或IL-11,從而分化和增殖成高密度的巨核細(xì)胞培養(yǎng)物,然后可以將培養(yǎng)物在高劑量化學(xué)治療之后返回到患者體中。
      rhTPO的另一個潛在的用途是它在幾個診斷方法中的用途,進(jìn)行這些診斷是為了確定抗TPO抗體的存在,這些抗體已經(jīng)證實(shí)在自身免疫血小板減少癥中。
      本發(fā)明進(jìn)一步通過下面的非限制性實(shí)施例說明。
      - 循環(huán)1-1095℃30秒、58℃30秒和72℃120秒。
      - 循環(huán)10-2095℃30秒、58℃30秒和72℃240秒。
      - 循環(huán)20-3095℃30秒、58℃30秒和72℃360秒。
      - 最后的延伸階段72℃10分鐘。
      用內(nèi)引物TPOFOWy TPOREV(參見表II B)在相同條件下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增,但以2μl的第一輪擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物來代替第一輪中5μl的cDNA。反應(yīng)條件是20次擴(kuò)增循環(huán),并先在95℃溫育2分鐘,描述如下- 循環(huán)1-10 95℃30秒、62℃30秒和72℃120秒。
      - 循環(huán)10-1595℃30秒、62℃30秒和72℃240秒。
      - 循環(huán)15-2095℃30秒、62℃30秒和72℃30秒。
      - 最后的延伸階段72℃10分鐘。實(shí)施例4為了克隆,純化和制備hTPO擴(kuò)增的cDNA。通過電泳,在低融點(diǎn)的瓊脂糖凝膠(1%)中分離和鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。含有1107個堿基對的條帶的凝膠部分被切出,分離和純化出DNA(Nucleiclean Sigma)。其中利用了纖維-玻璃微球體的容量的技術(shù)以便在飽和的碘化鈉介質(zhì)中強(qiáng)結(jié)合該DNA,同時此介質(zhì)能夠溶解瓊脂糖(16)。DNA采用酚/氯仿抽提、乙醇洗滌、乙醇沉淀并最后懸浮于10μl的水中。為了在3′OH的末端摻入腺嘌呤核苷酸用于A-T載體中克隆,用Taq DNA聚合酶、緩沖液和dATP,在72℃溫育純化的片段10分鐘。利用酚/氯仿萃取、乙醇沉淀,再次抽提和純化此片段,然后重懸浮于20μl的水中。準(zhǔn)備連接cDNA片段,并克隆進(jìn)A-T克隆載體系統(tǒng)中。實(shí)施例5將擴(kuò)增的cDNA片段克隆到A-T克隆載體系統(tǒng)中。把實(shí)驗(yàn)4中的純化片段與pCR2.1質(zhì)粒(Original TA Cloning Kit;invitrogen)連接。利用T4 DNA連接酶(Boehringer Mannheim)、pCR2載體和純化的cDNAhTPO,在下面的鹽性介質(zhì)中進(jìn)行連接-2μl的實(shí)施例4中純化的TPO片段-1μl的連接緩沖液10X-2μl的pCR2.1載體(25ng/μl)-1μl的T4 DNA連接酶(4個單位)-4μl的水在14℃酶連接溫育16小時。
      用已連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌菌株(One ShotTMTOP 10F′;Invitrogen)。這些載體允許a)由于存在氨芐青霉素的抗性基因,獲得包括質(zhì)粒的細(xì)菌菌落;b)鑒定具有含編碼hTPO的cDNA插入體的質(zhì)粒的細(xì)菌菌落。這是根據(jù)在載體中存在lacZa□基因來進(jìn)行的,是IPTG異丙基硫代-β-半乳糖苷誘導(dǎo)的,允許追蹤,根據(jù)X-Gal水解鑒定白色/藍(lán)色細(xì)菌菌落;c)從陽性細(xì)菌菌落中通過在LB(Luria-Bertani)中的微型培養(yǎng)分離大量的質(zhì)粒(微型制備),以便進(jìn)行限制分析和利用M13引物對插入體進(jìn)行測序以便證明該序列。
      在限制分析后,得到了10個陽性菌落,相關(guān)性地稱為pCR2 TPO-1到pCR2 TPO-10。
      將分離的菌落分成3組
      -菌落pCR2-1、-2、-4和-9,匹配hTPO的對應(yīng)序列,其中12個堿基(4aa)缺失,與前面所述的稱為TPO2(17)的同工型相同。
      -菌落pCR2-5、-6、-7、-8和-10,匹配天然hTPO的完整序列,其中沒有氨基酸取代。
      -菌落pCR2-9,匹配hTPO的對應(yīng)序列,具有與前面所述的TPO3的同工型相同的116個bp的缺失(17)。
      對插入體進(jìn)行測序,以便準(zhǔn)確地鑒定,方法如Sanger和cols所述(18)。對兩條鏈完全地進(jìn)行測序。
      選擇對應(yīng)于菌落pCR TPO-5的質(zhì)粒制備物以繼續(xù)下面的實(shí)驗(yàn)步驟。實(shí)施例6用編碼成熟的hTPO(pK-eTPO)的序列設(shè)計(jì)載體。根據(jù)下面的特征構(gòu)建真核生物表達(dá)載體1.新霉素-抗性基因(Neor),以在含有新霉素(G-418)的培養(yǎng)基中陽性選擇轉(zhuǎn)染細(xì)胞2.免疫球蛋白基因的啟動子序列3.含有限制位點(diǎn)ClaI和NotI的克隆區(qū)域4.人免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子5.大腸桿菌的原核復(fù)制起點(diǎn)(ColE1 ori)6.氨芐青霉素抗性基因(Ampr)7.派生自SV40的真核生物復(fù)制起點(diǎn)(SV 40ori)所有這些部分是按邏輯排列的,以保證對應(yīng)rhTPO基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)導(dǎo)。構(gòu)建的表達(dá)載體鑒定為pK,并在

      圖1中有圖解。實(shí)施例7利用編碼成熟hTPO的序列構(gòu)建真核生物表達(dá)載體(pK-eTPO)。具有編碼hTPO的DNA片段并且其序列完全證實(shí)的pK表達(dá)載體的構(gòu)建體稱為pK-eTPO。圖1中描述了包括所有功能區(qū)段的pK-eTPO結(jié)構(gòu)的圖解。在下面的各個實(shí)驗(yàn)時期進(jìn)行了構(gòu)建;時期1首先,設(shè)計(jì)含有ClaI和NotI限制位點(diǎn)的表達(dá)引物(參見表II C),并且稱為Cla-eTPOFOW和Not-eTPOREV。它們允許(1)擴(kuò)增編碼hTPO的序列,該序列包含在從pCR2 TPO-5得到的克隆載體中。
      (2)在酶連接反應(yīng)后,為了在pK載體中導(dǎo)入編碼包括信號肽的hTPO的完整序列,導(dǎo)入兩個限制位點(diǎn)(ClaI和NotI)。
      在pCR2 TPO-5中含有的,并且經(jīng)修飾含有ClaI和NotI限制位點(diǎn)的擴(kuò)增hTPO片段被稱為eTPO-5。擴(kuò)增反應(yīng)在下列總體積為50μl(TaqDNA聚合酶試劑盒;Gibco BRL-Life Technologies)中進(jìn)行-2.5μl(dNTP 10mM)-2.5μl(10mM Cla-eTPOFOW)-2.5μl(10mM Not-eTPOREV)-5μl(緩沖液10X)-0.5μl(Taq聚合酶)-5μl(pCR2 TPO-5的1/100,000的稀釋液)-1.5μl MgCl2(50mM)-30.5μl(水)溫育條件95℃下一個4分鐘的循環(huán);25個循環(huán)的95℃30秒、65℃30秒、72℃30秒;和最后的一個延伸循環(huán)是72℃10分鐘。時期2利用電泳技術(shù)在低融點(diǎn)的瓊脂糖凝膠(1%)中分離和鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。切出含有1090個bp的帶的凝膠部分,并分離和純化該DNA(Nucleiclean,Sigma)。這是通過利用纖維-玻璃微球體的容量的技術(shù)進(jìn)行的,以便在飽和的碘化鈉介質(zhì)中強(qiáng)烈地結(jié)合該DNA,同時所述碘化鈉介質(zhì)能夠溶解瓊脂糖(16)。然后,用乙酚/氯仿萃取DNA,洗滌,乙醇沉淀,最后再懸浮于15μl的水中。時期3為了進(jìn)行酶限制分析和核苷酸測序以便證實(shí)該片段與天然hTPO具有完全的同一性,根據(jù)下面的反應(yīng)方案將純化的eTPO片段連接進(jìn)pCR2-1載體中-1μl的eTPO片段-1μl的連接緩沖液10X-2μl的pCR2.1載體(25ng/μl)-1μl T4 DNA連接酶(4個單位)-5μl水在4℃,溫育反應(yīng)16小時。利用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌菌株(One ShotTMTOP 10F′;invitrogen),允許根據(jù)銷售商的技術(shù)說明書進(jìn)行擴(kuò)展。鑒定和分離了含有準(zhǔn)確攜帶eTPO插入體的質(zhì)粒的6個細(xì)菌菌落。它們稱為pCR2-eTPO 1到6。把它們中的每一個用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基進(jìn)行微型培養(yǎng),以便分離質(zhì)粒物質(zhì)(微型制備)。時期4對插入體eTPO-1到6進(jìn)行鑒定和測序。利用BamHI限制圖譜達(dá)此目的,然后在全自動測序儀(ALF-EXPRESS;Pharmacia)中采用Sanger和cols(18)所述的方法進(jìn)行測序以證實(shí)兩條DNA鏈中完整的核苷酸序列。表1表示了鑒定為“ETPO”的核苷酸序列,其對應(yīng)于質(zhì)粒pCR2-eTPO2質(zhì)粒,相比較的序列是NM000460(Sauvage等,1994)。如所描述,得到的序列與用作參考的序列相同。選擇pCR2-eTPO2質(zhì)粒進(jìn)行隨后的步驟。時期5在連接到eTPO片段之前,用ClaI和NotI酶消化真核生物pK表達(dá)載體。為了進(jìn)行消化,在37℃溫育如下的酶反應(yīng)4小時-10.0μl載體pK質(zhì)粒制備物-2.0μl Cla I酶制劑(Sigma)
      -1.5μl NotI酶制劑(Sigma)-5.0μl緩沖液10X-31.5μl水利用低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠(1%)的電泳技術(shù)分離和鑒定酶消化后的線性載體。切出其中包含載體的區(qū)域,并通過透析膜電洗脫分離和純化DNA。用酚/氯仿萃取DNA,洗滌,和乙醇沉淀,最后再懸浮在15μl水中。時期6為了得到eTPO-2片段,利用ClaI和NotI酶消化pCR2-eTPO2。對于消化,利用了下面的酶反應(yīng),在37℃溫育4小時-5.0μl pCR2-eTPO2質(zhì)粒制備物-2.0μl ClaI酶制劑(Sigma)-1.5μl NotI酶制劑(Sigma)-5.0μl緩沖液10X-36.5μl水利用低融點(diǎn)瓊脂糖(1%)的電泳技術(shù)從eTPO2片段上分離酶消化后的線性載體。切出其中含有eTPO2片段的凝膠區(qū),通過利用纖維-玻璃微球體的容量的技術(shù)分離和純化DNA,以便在同時能溶解瓊脂糖的飽和碘化鈉介質(zhì)中強(qiáng)烈地結(jié)合DNA(16)。用酚/氯仿萃取DNA,洗滌,乙醇沉淀,最后再懸浮于15μl的水中。時期7利用T4 DNA連接酶(Pharmacia),按照供應(yīng)商的技術(shù)說明書,將pK載體與eTPO-2純化片段連接。用酚/氯仿萃取方法純化稱為pK-eTPO的這一連接反應(yīng)產(chǎn)物,用乙醇沉淀,最后再懸浮于15μl的水中。時期8通過電穿孔,用構(gòu)建的pK-eTPO轉(zhuǎn)染大腸桿菌(菌株XL1)。在1mm杯中,將40μl的電感受態(tài)XL-1菌株與2μl的第7時期得到的純化連接物放置在一起。用電阻129Ω、電容50uF的1380v的脈沖激發(fā)5毫秒。脈沖后加入800μl的LB培養(yǎng)基。在37℃下200rpm的軌道溫育器中溫育45分鐘后,接種在LB瓊脂氨芐青霉素的平板中。
      分離兩個陽性菌落,并在LB-氨芐青霉素中擴(kuò)展,過夜微培養(yǎng)。用常規(guī)方法(“微型制備”)萃取質(zhì)粒以便通過擴(kuò)增和限制酶分析來證明插入體。以這種方法,獲得pK-eTPO的純化的質(zhì)粒片段。實(shí)施例8用PuvI線性化pKeTPO載體和選擇待轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞系。一旦得到pK-eTPO,盡管從哺乳動物派生的任何細(xì)胞最后都可以利用這一表達(dá)質(zhì)粒,但是選擇從已知為X-63的鼠骨髓瘤(P3X63Ag8.653,ATCC N° CRL 1580)派生的哺乳動物細(xì)胞系。在不同的細(xì)胞系中,選擇這一個是因?yàn)樗哂腥缦碌膬?yōu)點(diǎn)a)因?yàn)樗ㄅc免疫球蛋白的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子連接的免疫球蛋白基因的啟動子,因此在本發(fā)明中,它具有完全適應(yīng)設(shè)計(jì)的表達(dá)載體的蛋白質(zhì)(免疫球蛋白)的高效合成和分泌系統(tǒng)。另外,在體外培養(yǎng)基如用胎牛血清(FBS)10%補(bǔ)充的RPMI-1640中能夠不確定地生長。根據(jù)下面的反應(yīng),用PvuI(Boehringer Mannheim)將pKeTPO載體線性化-20μl質(zhì)粒pKe TPO部分-5μl緩沖液H(10X)-2μl PvuI-23μl水在37℃將反應(yīng)物溫育4小時,用酚/氯仿萃取純化該物質(zhì),用乙醇沉淀,最后回收在10μl的水中。實(shí)施例9用pKeTPO載體轉(zhuǎn)染X-63細(xì)胞。在含有10%FBS的RPMI-1640(Gibco BRL-Life Technologies)中體外擴(kuò)展實(shí)施例8中所述的哺乳動物細(xì)胞(X-63),然后在無FBS的RPMI-1640中洗滌。將它們以下面的濃度再懸浮在800μl不含F(xiàn)BS的RPMI 1640中有150萬個細(xì)胞。然后,將800μl的細(xì)胞放置于2mm的電穿孔杯中,加入10μg的pKeTPO質(zhì)粒。在下面的條件下,電穿孔(BTX電穿孔系統(tǒng)600;GenetronicsBiomedical LTD)進(jìn)行13毫秒-C1200uF;R48Ω;V210V;E1.050kV/cm在37℃和5%CO2下,在含有20%FBS的RPMI中使電穿孔細(xì)胞培養(yǎng)24小時。實(shí)施例10篩選和選擇生產(chǎn)rhTPO的克隆細(xì)胞。如實(shí)施例9所述,在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,它們分布在有新霉素的3個不同的培養(yǎng)物組(培養(yǎng)物I、II和III)?;九囵B(yǎng)基是RPMI 1640,其中含有10%的FBS和鏈霉素-青霉素(分別為50mcg/ml和100UI/ml)、2mM L-谷氨酰胺、1μM丙酮酸鈉以及10mM Hepes(生長培養(yǎng)基)。在培養(yǎng)了15天后,培養(yǎng)基中有微弱的變化,利用抗-hTPO抗體(RDI;Research Diagnostics,Inc.)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡來分析上清液中分泌的rhTPO。作為陰性對照,利用了用pKκ載體轉(zhuǎn)染的X-63細(xì)胞的上清液。這些程序與包括免疫球蛋白的κ人鏈的TPO而不是rhTPO插入體的那些程序相同。
      培養(yǎng)物II的上清液產(chǎn)生rhTPO的微弱陽性,通過限制稀釋(細(xì)胞稀釋在含有20%FBS和1mg/ml新霉素的RPMI1640的96孔平板中放置0.3個細(xì)胞/孔)進(jìn)行克隆。在15天后,分離58個新霉素抗性克隆。加工上清液,通過蛋白質(zhì)印跡來評估rhTPO的存在。分析發(fā)現(xiàn)存在產(chǎn)生和分泌rhTPO的16個克隆。分離稱為2A4的克隆,由于在培養(yǎng)上清液中檢測到顯著量的rhTPO,所以通過限制稀釋再次克隆,以保證它的克隆性(clonaility)。
      如圖2所示,在通過蛋白質(zhì)印跡分析后,選擇來自2A4的亞克隆16,稱為亞克隆24A-16。在不間斷地培養(yǎng)8星期后,測試?yán)脕喛寺?4A-16的rhTPO的生產(chǎn)穩(wěn)定性(參見圖2)。來自稱為24A-16的X-63細(xì)胞和以穩(wěn)定方式生產(chǎn)可溶性rhTPO的克隆稱為克隆X-63 eTPO。實(shí)施例11分析這一表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的rhTPO的存在和生物活性。利用X-63eTPO培養(yǎng)物的上清液,以0.6×106細(xì)胞/培養(yǎng)的濃度,有RPMI 1640、10%FBS存在時,體外進(jìn)行測試生物活性的實(shí)驗(yàn)通過ELISA測定TPO的濃度。利用人TPO的試劑盒(Quantikine,R&amp;D系統(tǒng))進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下,經(jīng)確認(rèn)大約的濃度是0.5mcg/ml。
      利用Baf-MPI細(xì)胞系進(jìn)行體外生物實(shí)驗(yàn)。Baf-mpI細(xì)胞系(1994年9月28日根據(jù)布達(dá)佩斯條約以ATCC N° CRL-11723保藏)對應(yīng)于用MpI受體(TPO受體)轉(zhuǎn)染的鼠系Baf-BO3。親本系Baf-BO3依賴于IL-3,轉(zhuǎn)染的系Baf-mpI依賴于IL-3或TPO。實(shí)驗(yàn)是基于在48小時的過程中,有不同濃度的細(xì)胞因子或正在測試的上清液存在下溫育細(xì)胞。在這一時期后,用[3H]-胸腺嘧啶溫育12小時,其后通過濾器回收細(xì)胞,然后放置于瓶中,其中通過液體閃爍計(jì)數(shù)測試放射性。在96孔板中進(jìn)行兩個實(shí)驗(yàn),在不同濃度時測試上清液10%、3%、1%、0.3%、0.1%、0.03%、0.01%和0.003%,對Baf-mpI細(xì)胞(30,000細(xì)胞/孔)做三份。以10ng/ml、3ng/ml、1ng/ml、0.3ng/ml、0.1ng/ml、0.03ng/ml、0.01ng/ml和0.003ng/ml的濃度用標(biāo)準(zhǔn)TPO制作劑量-依賴的曲線。為了保證該細(xì)胞系對分析的細(xì)胞因子應(yīng)答,用IL-3進(jìn)行內(nèi)控的測試。在沒有生長因子時做陰性對照的測試。用親本系Baf-BO3同樣操作,以便在測試上清液中消除IL-3的影響。實(shí)驗(yàn)顯示了相同的結(jié)果,在X-63eTPO上清液培養(yǎng)物中顯示0.4mcg/ml的rhTPO標(biāo)準(zhǔn)活性。
      體外增殖和分化來自CD34+骨髓細(xì)胞的先祖巨核細(xì)胞。通過采用Ficoll-Hypaque的梯度密度離心獲得骨髓細(xì)胞CD34+,然后進(jìn)行免疫磁性選擇(Miltenyi,MiniMACS)。在允許向巨核細(xì)胞譜系分化的條件下將這些細(xì)胞培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中。這些條件是用運(yùn)鐵蛋白(transferrine)、胰島素、牛血清白蛋白、脂質(zhì)體補(bǔ)充的無FBS的Iscove培養(yǎng)基和有TPO的存在。在24孔的平板中(100,000個細(xì)胞/孔),用不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)rhTPO或X-63eTPO克隆的上清液培養(yǎng)CD34+骨髓細(xì)胞。在10天后,測試細(xì)胞的增殖(細(xì)胞數(shù)),和用結(jié)合FITC的抗-CD41單克隆抗體標(biāo)記它們產(chǎn)生巨核細(xì)胞的百分?jǐn)?shù),并用流式細(xì)胞儀分析。測試4個不同濃度的rhTPO(20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml)。觀察到70%的細(xì)胞屬于巨核細(xì)胞譜系(CD41陽性細(xì)胞)。在3個不同濃度10%、5%y 2.5%測試來自X-63 eTPO的上清液。分別觀察細(xì)胞數(shù)有3、2和1.5倍的增加。關(guān)于巨核細(xì)胞的生長,我們得到了75%的CD41+細(xì)胞,在三種情況下,巨核細(xì)胞的絕對數(shù)目是根據(jù)涉及細(xì)胞增殖的上清液的濃度而發(fā)生變化。通過流式細(xì)胞儀分析的代表性的結(jié)果表示在圖3,其中可以理解的是,2.5%的上清液培養(yǎng)物能夠誘導(dǎo)與5ng/ml標(biāo)準(zhǔn)hTPO誘導(dǎo)相等同的表達(dá)水平。表I.hTPO NM 000460的參照核苷酸和氨基酸序列[de Sauvage等,Nature 369,533-538(1994)]
      (.)相同的核苷酸序列(-)相同的氨基酸序列(#)終止密碼子ETPO代表本發(fā)明中得到的hTPO的序列分泌肽以黑字體描寫內(nèi)引物以下劃線字體表示表II.用于擴(kuò)增人TPO的引物的序列A.第一輪嵌套式PCR中所用的引物-TPOEXT-FOW.(外正向引物)CAG GAA GGA TTC AGG GGA GAG G-TPOEXT-REV.(外反向引物)GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA CB.第二輪嵌套式PCR中所用的引物-TPOFOW.(內(nèi)正向引物)AGC CAC GCC AGC CAG ACA CCC C-TPOREV.(內(nèi)反向引物)GCA GTG TCT GAG AAC CTT ACC CC.用于將限制位點(diǎn)ClaI y Not I插入到編碼hTPO的DNA片段中的引物-Cla-eTPOFOW.CAT ATC GAT TTC TCA CAA TGG AGC TGA CTG AAT TGC TCC-Not-eTPOREV.AGA GCG GCC GCT TAC CCT TCC TGA GAC AGA TTC TGG G
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      權(quán)利要求
      1.一種在哺乳動物細(xì)胞中可復(fù)制的表達(dá)載體,其含有以保證準(zhǔn)確和有效的轉(zhuǎn)錄方式組成的下列元件a)對應(yīng)于人免疫球蛋白的可變基因的轉(zhuǎn)錄啟動子b)編碼包括它的信號肽(分泌性前導(dǎo)物)的完整的hTPO多肽的DNA區(qū)段c)人κ基因的免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子DNA區(qū)段d)轉(zhuǎn)錄終止子e)聚腺苷酸化信號f)編碼對抗生素新霉素類型藥物有抗性的基因g)編碼對抗生素氨芐青霉素有抗性的基因h)大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)(ColE1 ori)
      2.一種從稱為X-63的鼠骨髓瘤派生的培養(yǎng)細(xì)胞系(ATCCPeX63Ag8.6533,CRL 1580),它被權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染,并能夠向培養(yǎng)基中生產(chǎn)和分泌具有生物活性的成熟rhTPO多肽。
      3.一種對應(yīng)于由權(quán)利要求2所述的細(xì)胞系所產(chǎn)生的hTPO的重組多肽,并且已經(jīng)證明在體外和體內(nèi)有生物活性。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了在體外培養(yǎng)物中哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生生物活性人TPO的方法。通過與包括免疫球蛋白增強(qiáng)子結(jié)合的免疫球蛋白啟動子的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入人血小板生成素的基因來遺傳修飾鼠骨髓瘤細(xì)胞。獲得的hTPO在刺激體外和體內(nèi)巨核細(xì)胞譜系的造血細(xì)胞增殖和發(fā)育的方法中是有用的。
      文檔編號C12N5/10GK1451040SQ01815039
      公開日2003年10月22日 申請日期2001年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月30日
      發(fā)明者阿方索·卡約塔古齊科維斯基, 卡洛斯·阿爾韋托·羅韋洛波爾托, 奧托·弗蘭斯·普里切阿爾維蘇 申請人:卡洛斯·伊格納西奧·埃德蒙多·包賈尼迪格海羅, 阿方索·卡約塔古齊科維斯基, 卡洛斯·阿爾韋托·羅韋洛波爾托, 奧托·弗蘭斯·普里切阿爾維蘇
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