專利名稱：分級大豆蛋白及其生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從含有大豆蛋白的溶液中生產富含7S球蛋白的部分和富含11S球蛋白的部分的方法。
每個7S球蛋白和11S球蛋白都含有幾個亞基，前者含有被稱為α、α′、β的三個亞基，后者含有幾種類型的由一對酸性多肽(A)和一條堿性多肽(B)組成的亞基。關于這兩種蛋白的比例，當?shù)湫偷厥褂霉饷芏确治龇ù_定SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳譜帶的面積比來說明兩種球蛋白的比例時，7S球蛋白∶11S球蛋白的比例約為1∶2。關于7S球蛋白和11S球蛋白的性質，這兩種的分子量和靜態(tài)條件非常接近。特別是因為兩種球蛋白的不同是由于其亞基組成不同，因此它們的性質在一定程度上是不同的，并且又是相互重疊的。因此，完成無任何相互混雜的有效分離是非常困難的。
有幾種已知的分離方法，例如，利用等電點不同的分離方法，這種方法是在pH接近11S球蛋白的等電點時進行提取，這樣就專門提取了7S球蛋白(JP-A-55-124457)；利用與鈣的反應活性不同進行的分離方法，其中加入少量的鈣鹽后進行提取，這樣就可以提取到富含7S球蛋白的部分(JP-A-48-56843)；利用在某一pH值或離子強度下的溶解度不同的分離方法，包括在pH為1.2到4.0的氯化鈉或氯化鉀中除去不溶的蛋白質生產7S球蛋白的方法(JP-A-49-31843)和將等電點沉降物的pH調節(jié)到5.0至5.6，并且將氯化鈉調到0.01到0.2M來分離富含7S球蛋白的部分和富含11S球蛋白的部分的方法(JP-A-58-36345)；利用低溫沉淀和還原劑等等方法，其中在低溫下減小11S球蛋白的溶解度(稱作低溫沉淀)，并在pH為6.5或更高的存在亞硫酸鹽化合物、谷胱甘肽和半胱氨酸的水體系中處理大豆蛋白源，然后在20℃或更低的溫度下調節(jié)pH到5.5至7.0，這樣就分離出富含7S球蛋白的可溶部分和富含11S球蛋白的不溶部分(JP-A-61-187755)。
這些已知的分離方法都包含了對7S球蛋白和11S球蛋白在一定的pH和離子強度、在一定的鹽存在下、在一定的溫度等等條件下溶解度不同的有效利用，雖然其實現(xiàn)了一定程度的分離，但其僅為一種實驗室方法，而不是工業(yè)方法，并且仍然存在涉及實用性的問題。例如，JP-A-61-187755中公開的方法含有涉及實用性的缺點，例如由于低溫沉淀極大地依賴于溫度，因此需要冷卻到5℃的低溫，并且為了使用工業(yè)用的低離心力完成分離，還需要添加大量的亞硫酸鹽化合物，還包含涉及分離精確性的缺點，例如11S球蛋白不可避免地遷移到可溶的部分中。
為了獲得富含7S球蛋白的蛋白質，嘗試了分離出利用遺傳學生產的11S球蛋白缺損的大豆，即富含7S球蛋白的種子(Breeding Science，46，11，1996)，還可以找到這種種子的應用(Breeding Science，50，101，2000)和專利(US6,171,640 B1)。
如上所述，已經(jīng)研究和開發(fā)了一種分離富含7S球蛋白的部分和富含11S球蛋白的部分的方法，使用此方法減少了可溶部分和不溶部分之間的相互遷移，還方便和有效地完成了工業(yè)規(guī)模的生產。
另外一方面，Samoto等人報道了在大豆得到的蛋白質中，有一類作為細胞質膜、蛋白體或油體膜(油體結合蛋白)成分與極性的脂類有高的親和力的蛋白質，從工業(yè)生產分離出的大豆蛋白中得到了約高達35％的這種蛋白質(Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(5)，935-940(1998)).油體結合蛋白是主要包括膜蛋白的蛋白質的通用術語，特別是用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定的分子量為34kDa，24kD和18kD的，且含有大約10到12％重量的極性脂類的膜蛋白，其極性脂可用氯仿∶甲醇以2∶1混合的極性溶劑混合物提取。
傳統(tǒng)的分離僅集中在7S和11S上，而沒有注意到能污染每一部分的油體結合蛋白，原因是使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析時，油體結合蛋白不象7S和11S一樣可以絕對地確定并且常常被忽視。換言之，僅用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定的純度常常較真實的純度高，為了獲得真正高純度的7S或11S蛋白，應該考慮到油體結合蛋白的作用。這樣，傳統(tǒng)的7S/11S部分的分離僅僅以7S與11S蛋白之間的比例作為每部分的純度進行處理。而每部分都與油體結合蛋白有關，而且在許多情況下，實際的情況是純度稍低的相對粗的部分，其蛋白組分的特點是含有大量的油體結合蛋白。
本發(fā)明的目的之一是提供一種特別在工業(yè)規(guī)模中高精度和高效率地分離7S球蛋白和11S球蛋白的新方法。本發(fā)明的另一個目的是得到一種蛋白部分，其特征是混入的油體結合蛋白含量降低，且7S球蛋白和11S球蛋白的純度高。
本發(fā)明還提供了一種高純度的7S球蛋白大豆蛋白或高純度的11S球蛋白大豆蛋白，并通過生產過程中使用肌醇六磷酸酶分解肌醇六磷酸降低了肌醇六磷酸的含量，這在分離過程中也改進了分離的精度。
上述生產方法得到的可溶部分的7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值是0.4或更高，通過選擇適當?shù)臈l件，其可以達到0.8或更高，0.85或更高，或0.9或更高，這樣就很容易地得到了高純度的蛋白質。該可溶部分也是一種大豆蛋白，除了含有7S球蛋白外，還含有僅少量的11S球蛋白或其它蛋白質，特別是其中含有含量低至蛋白固體總量的10％或更少的油體結合蛋白，這樣就提供了嚴格意義上的高純度的7S球蛋白。另一部分，即不溶部分的11S球蛋白/(11S球蛋白+7S球蛋白)的比值是0.7或更高，通過選擇適當?shù)臈l件，其可以達到0.8或更高，0.85或更高，或0.9或更高，這樣就很容易地得到了高純度的蛋白質。
這里所述的7S球蛋白或11S球蛋白的相對含量是指用光密度分析法測定SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳帶的譜圖的面積比(下述的校正純度除外)。
當使用硫酸鈉從幾乎未改性的酸沉淀球蛋白中精確地獲得油體結合蛋白時，其在酸沉淀球蛋白中的濃度為30％到35％(Biosci.Biotechnol.Biochem.，62(5)，935-940(1998)，op.cit.)，這種酸沉淀球蛋白固體含有3到4％重量的可用氯仿∶甲醇(2∶1，v/v)提取的極性脂類，這種脂類還以10到12％的含量存在于油體結合蛋白中，這說明上述的極性脂類(此后有時稱作“氯仿·甲醇可提的油份”)主要存在于酸沉淀球蛋白的油體結合蛋白中，并且油體結合蛋白的量可以通過氯仿·甲醇可提的油重量份的10倍計算得到。這種計算還可用于如用己烷將油體結合蛋白脫脂的物質，可以用于用己烷脫脂后未用己烷提取的物質。根據(jù)本發(fā)明，上述富含7S球蛋白的可溶部分中氯仿·甲醇可提的油份的含量為1％或更少，其對應的油體結合蛋白的含量在10％的水平或更少。
另一部分，即不溶的部分，11S球蛋白/(11S球蛋白+7S球蛋白)的比值是0.7或更高，不溶部分中所含的11S球蛋白可以專門在接近中性(pH6.5至8.5)的水溶液中提取，因為這種條件下11S球蛋白溶解了而油體結合蛋白仍然是不溶的，這樣就提供了富含11S球蛋白及含量降低的油體結合蛋白的大豆蛋白質部分(其11S球蛋白/(11S球蛋白+7S球蛋白)的比值是0.7或更高)，其中含有油體結合蛋白為20％/總蛋白或更少，即，含有的可用氯仿∶甲醇(2∶1)提取的極性脂類為2％或更少。
上述兩部分均可以使用肌醇六磷酸酶分解肌醇六磷酸，以提供一種肌醇六磷酸的含量降低了的蛋白部分，其肌醇六磷酸的含量降低至所得蛋白質的1.2％或更少。如果進行肌醇六磷酸酶處理的目的是為了提高分離效率時，優(yōu)選在分離之前的任意時間進行酶處理。
優(yōu)選實施方案的詳細描述本發(fā)明使用的分析方法說明如下。*總蛋白；基于Kjeldahl方法，測定氮含量并乘以系數(shù)6.25轉換為總蛋白。*SDS-聚丙烯酰胺電泳；基于Laemmli的方法(Nature，227，680(1970))，使用濃度為10到20％的梯度凝膠進行分析。樣品的量為10μg。*肌醇六磷酸；使用Alii Mohamed(Cereal Chemistry 63，475-478，1986)的方法。*可用氯仿-甲醇提取的油部分；將干燥的樣品與大約50倍體積的氯仿和甲醇的混合物(2∶1，v/v)共混，回流提取的固體的重量比確定為氯仿·甲醇可提的油份。*純度(SPE標準)；上述SDS-聚丙烯酰胺電泳得到的譜帶通過光密度計測定，純度用相應帶面積與總面積的％面積表示(基于SPE)。所述的7S球蛋白的含量是指α、α′、β亞基的總量，而11S球蛋白的含量是指酸性多肽(A)和堿性多肽(B)的總量。*校正純度；基于上面得到的純度(基于SPE)和混雜的油體結合蛋白，校正的純度按以下所述的方法計算。用A％表示樣品的純度(基于SPE)，由于樣品中除7S球蛋白和11S球蛋白外，還含有10倍于氯仿·甲醇可提的油重量份的油體結合蛋白，因此純度以包括7S球蛋白、11S球蛋白和油體結合蛋白的全部蛋白質為基準計算。
校正純度(％)＝(100(％)-氯仿·甲醇可提的油份(％)*10)*A(％)/100本發(fā)明優(yōu)選實施方案如下所述。
本發(fā)明使用的原料大豆可以是任何的商業(yè)大豆或通過育種或基因工程得到的某一部分缺損的大豆等。
含大豆蛋白的溶液可以是含水的大豆?jié){或從中得到的大豆乳，優(yōu)選使用含水的脫脂大豆?jié){或從中得到的脫脂大豆乳及酸沉淀的大豆蛋白漿或分離出的大豆蛋白溶液。
根據(jù)本發(fā)明，為了分離出富含7S球蛋白的部分和富含11S球蛋白的部分，優(yōu)選無變性或低變性的大豆蛋白溶液。在pH為3.8到6.8，優(yōu)選pH4.0到6.6，更優(yōu)選pH4.2到6.2的弱酸性條件下，在30到75℃，優(yōu)選35到65℃，更優(yōu)選40到60℃的溫度下加熱大豆蛋白溶液，然后調節(jié)pH達到pH5.6到6.6，優(yōu)選pH5.6到6.4，這樣就容易地分離出了富含7S球蛋白的部分和富含11S球蛋白的部分。在生產過程的任何一步中，特別是分成可溶部分和不溶部分之前，使用肌醇六磷酸酶分解與大豆蛋白共存的肌醇六磷酸，借此使富含7S球蛋白的部分和富含11S球蛋白的部分的分離更容易。肌醇六磷酸酶處理適合與加熱同時進行。根據(jù)肌醇六磷酸酶的來源不同，使用條件可以不同，但肌醇六磷酸酶通常在pH3.5到9.0，溫度在20到70℃下，以0.1到100單位/重量(g)蛋白質的濃度使用5分鐘到3個小時。1個單位的肌醇六磷酸酶活性對應的酶量是在反應初期的條件為pH5.5和37℃下，1分鐘從肌醇六磷酸中分離出1μ摩爾的磷酸鹽的酶量。
在上述的加熱步驟中，加熱持續(xù)時間的長短或有無還原劑與pH和溫度不同，其對分離方法的實施沒有嚴重影響，它們是不重要的。pH超出pH3.8至6.8的范圍，或溫度超出30℃至75℃的范圍可能導致7S球蛋白和11S球蛋白的分離困難。分離使用的pH小于5.6可能導致不希望的7S球蛋白向不溶部分的遷移量的增加，pH超過6.6可能導致不希望的11S球蛋白向可溶部分遷移量的增加。
加熱步驟之后，分離操作可以在相同的溫度下進行，優(yōu)選確保低溫以控制微生物。使用已知的分離操作(如過濾和離心)完成分離，特別是使用連續(xù)離心機(如傾析器)也可以完成簡單的分離。當然不排除使用非連續(xù)離心機如間歇式離心機。
本發(fā)明中作為可溶部分的7S球蛋白部分和不溶部分的11S球蛋白部分的分離情況可以依據(jù)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳得到的譜圖(純度(基于SPE))進行驗證。
然而，由于在SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中油體結合蛋白的著色力差，因此基于SPE的純度忽視了油體結合蛋白，因而認為上面的公式(100(％)-氯仿·甲醇可提的油份(％)*10)*A(％)/100表示的校正純度(％)更接近實際的純度。
分離后的可溶部分可以直接用作富含7S球蛋白的部分，也可以濃縮、中和、滅菌或干燥后使用。例如可以通過改變可溶部分的pH值以接近其等電點(pH4.5至5.3，優(yōu)選pH4.7至5.1)，然后回收沉淀的凝乳實現(xiàn)濃縮，通常之后進行中和、熱滅菌，然后是干燥。熱滅菌可以采用已知的HTST、OHT方法等。根據(jù)用途，使用例如蛋白酶的酶處理可以在溶液態(tài)進行。
使用接近中性的水溶液(pH6.5至8.5)從分離后的不溶部分中提取11S球蛋白組分，這樣它就與不溶的油體結合蛋白(以及可能存在于不溶部分的沉淀組分)分開了。這一步中，優(yōu)選使用約4000G或更高的高G離心機，更優(yōu)選約5000G或更高的離心機進行11S球蛋白和油體結合蛋白的分離，這樣可獲得固體中的氯仿·甲醇可提油份的含量為2％或更低的蛋白質，同時11S球蛋白/(11S球蛋白+7S球蛋白)的比值保持在0.7或更高。
這樣得到的含有11S球蛋白的溶液可以直接用作富含11S球蛋白的大豆蛋白，或濃縮、中和、滅菌或干燥后使用。例如可以將可溶部分進行等電點沉淀(pH4.5至5.8，優(yōu)選pH4.7至5.5)，然后回收沉淀的凝乳實現(xiàn)濃縮，為了改善物理性質優(yōu)選使用此方法，同時也可以在等電點沉淀之后進行中和、熱滅菌或使用如蛋白酶進行酶處理。最普通的形式是滅菌的和干燥的形式。熱滅菌可使用已知的HTST、UHT方法等等。
下面的實施例是本發(fā)明的進一步說明。但這些實施例不是用于限制本發(fā)明的技術范圍。
上述結果表明在酸性條件為pH3.8到6.8，優(yōu)選pH4.0到6.6，更優(yōu)選pH4.2到6.2下，在30℃到75℃，優(yōu)選35℃到65℃，更優(yōu)選40℃到60℃的溫度下加熱大豆蛋白溶液，然后在pH5.8時離心，能夠方便地分離出含7S球蛋白的可溶部分和含11S球蛋白的不溶部分。


圖1是通過在上面指定的加熱條件中，溫度為60℃和pH為4.8的條件下加熱得到的可溶部分和不溶部分的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜。
表1中列出了經(jīng)過上述分離后存在于可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例(SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳譜帶的面積比通過光密度分析法確定，之后也類似地使用相同的方法)。
表1(在60℃和pH4.8條件下加熱)可溶部分 不溶部分7S∶11S 95∶5 7∶93可溶部分和不溶部分的固體中得到的氯仿甲醇可提油份的含量分別為0.9％和3.2％，這驗證了油體結合蛋白集中在不溶部分中。
上述結果表明在酸性條件為pH3.8到6.8，優(yōu)選pH4.0到6.6，更優(yōu)選pH4.2到6.2下，在30℃到75℃，優(yōu)選35℃到65℃，更優(yōu)選40℃到60℃的溫度下加熱大豆蛋白溶液，然后在pH5.8時離心，能夠方便地分離出含7S球蛋白的可溶部分和含11S球蛋白的不溶部分。
在pH5.3和溫度40℃的條件下提取后存在于可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按與實施例1相同的方法計算，并將此比例列于表2中。
表2(在pH5.3和40℃條件下提取)可溶部分 不溶部分7S∶11S 96∶4 8∶92可溶部分和不溶部分的固體中得到的氯仿甲醇可提油份的含量分別為0.8％和3.0％，這驗證了油體結合蛋白集中在不溶部分中。
由實施例1和2的結果說明在酸性條件下加熱處理的步驟使通過工業(yè)上使用的低離心力能夠從含有大豆蛋白的溶液中分離出含7S球蛋白的可溶部分和含11S球蛋白的不溶部分以及油體結合蛋白。
存在于得到的可溶部分和不溶部分中的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按與實施例1相同的方法計算，并將此比例列于表3和4中。
表3(沒有在50℃下保存)可溶部分 不溶部分7S∶11S 95∶5 7∶93表4(保持在50℃下60分鐘)可溶部分 不溶部分7S∶11S 93∶7 8∶92根據(jù)這些結果，7S球蛋白和11S球蛋白之間的相互混雜不依賴于保持期，這說明在酸性條件下的加熱時間和保持的時間不需要特別地限定。
存在于得到的可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按與實施例1相同的方法計算，并將此比例列于表5和6中。
表5(pH5.7時分離)可溶部分 不溶部分7S∶11S 92∶8 8∶92表6(pH6.0時分離)可溶部分 不溶部分7S∶11S 83∶175∶95
根據(jù)這些結果，離心時的pH值，即含7S球蛋白的可溶部分和含11S球蛋白的不溶部分分離時的pH值，可以有某些程度的不同。
每部分在140℃下滅菌15秒，然后噴霧干燥得到兩種粉末，其為分離出的富含7S球蛋白和富含11S球蛋白的大豆蛋白。表7中列出了得到的7S球蛋白和11S球蛋白的組成。
表77S球蛋白11S球蛋白水 5.0％ 5.0％總蛋白(以干重計) 97.8％ 96.8％純度(SPE標準) 94.8％ 92.2％氯仿甲醇可提油份 0.8％ 2.0％肌醇六磷酸 2.1％ 2.0％校正純度 87.2％ 73.8％由上述的結果表明以脫脂大豆乳作為起始原料，從中得到了氯仿甲醇可提油份含量減少了的高純度的7S和11S球蛋白。
存在于經(jīng)過上述分離后得到的可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按與實施例1相同的方法計算，并將此比例列于表8中。
表8可溶部分 不溶部分7S∶11S96∶4 10∶90由這些結果說明即使使用酸沉淀的凝乳(分離出的大豆蛋白)作為要分離的大豆蛋白溶液，在酸性條件下的加熱處理步驟能夠使富含7S球蛋白的可溶部分和富含11S球蛋白的不溶部分精確地分離。
離心過程中溶液的溫度約為25℃。水化(2倍重量)得到的不溶部分并用氫氧化鈉中和。另一方面，用鹽酸調節(jié)可溶部分的pH到4.9，離心除去乳清，這樣就得到了酸沉淀的凝乳。水化(4倍重量)沉淀的凝乳并用氫氧化鈉中和。中和的部分都在140℃下滅菌15秒，然后噴霧干燥得到兩種粉末，其為分離出的富含7S球蛋白和富含11S球蛋白的大豆蛋白。
存在于經(jīng)過上述分離后得到的可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按與實施例1相同的方法計算，并將此比例和每干燥樣品重量的肌醇六磷酸含量列于表9中。
表9可溶部分 不溶部分7S∶11S 95∶5 8∶92肌醇六磷酸 0.05％0.05％由這些結果說明即使使用其中的肌醇六磷酸被肌醇六磷酸酶分解的大豆蛋白溶液，在酸性條件下的加熱處理步驟也能夠精確地分離富含7S球蛋白的可溶部分和富含11S球蛋白的不溶部分。
另一方面，樣品B的pH調為6.4，保持在4℃下過夜，離心(5000G，4℃，10分鐘)得到上清液，再調pH到4.5，離心(3000G，5分鐘)得到沉淀物，回收作為低溫沉淀的7S球蛋白。
低溫沉淀的7S球蛋白的沉淀物與4倍體積的水混合，調pH為6.0，然后分為兩份樣品B-1和B-2。樣品B-1與8單位/重量蛋白質的肌醇六磷酸酶(NOVO，PHYTASE NOVO L)混合并進行酶促反應30分鐘。反應后，用鹽酸調節(jié)樣品B-1和B-2的pH到4.9，離心(3000G，5分鐘)以除去乳清部分，得到沉淀的凝乳。水化沉淀的凝乳，用氫氧化鈉中和到pH7.0。滅菌然后噴霧干燥得到經(jīng)過肌醇六磷酸酶處理的低溫沉淀的7S球蛋白部分和未經(jīng)肌醇六磷酸酶處理的低溫沉淀的7S球蛋白部分(B-1，B-2)。
每種樣品的組成列于表10中。
表10純化過的7S球蛋白 低溫沉淀的7S球蛋白A-1 A-2 B-1B-2水 4.8％4.7％4.7％ 4.9％總蛋白 98.1％ 98.0％ 97.2％ 97.2％純度(SPE標準) 97.1％ 97.1％ 78.2％ 78.3％氯仿甲醇可提油份0.7％0.7％2.8％ 2.8％肌醇六磷酸 0.06％ 1.9％0.07％ 2.0％校正純度90.3％ 90.3％ 56.3％ 56.3％總蛋白以干重計。
由這些結果說明肌醇六磷酸酶的處理對油體結合蛋白的存在沒有影響。低溫沉淀的7S球蛋白顯示的基于SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的純度(SPE標準)高達80％，而考慮了油體結合蛋白后，其校正純度低，大約為60％，這說明了本發(fā)明的7S球蛋白的純度高。
這種酸沉淀凝乳的分散體與8單位/重量蛋白質的肌醇六磷酸酶(NOVO，“PHYTASE NOVO L””)混合并進行酶促反應30分鐘。反應后立即冷卻樣品至約30℃，用氫氧化鈉調節(jié)到pH6.0并用間歇式離心機(3000G)離心。結果是觀察到了可溶部分和不溶部分的不連續(xù)分離。離心過程中溶液的溫度約為25℃。水化(2倍重量)得到的不溶部分并用氫氧化鈉中和。另一方面，用鹽酸調節(jié)可溶部分的pH到4.9，離心除去乳清，這樣就得到了酸沉淀的凝乳。水化(4倍重量)沉淀的凝乳并用氫氧化鈉中和。中和的部分都在140℃下滅菌15秒，然后噴霧干燥得到兩種制劑，其為分離出的進行了肌醇六磷酸酶處理的富含7S球蛋白和富含11S球蛋白的大豆蛋白。
存在于經(jīng)過上述分離后得到的可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按與實施例1相同的方法計算，并將此比例和每干燥樣品重量的肌醇六磷酸含量列于表11中。
表11可溶部分 不溶部分7S∶11S 94∶67∶93肌醇六磷酸 0.06％ 0.07％
水化(脫脂大豆量的7倍)得到的不溶部分，用氫氧化鈉調節(jié)pH到7.2，提取30分鐘再離心除去不溶的部分，這樣得到了富含11S球蛋白的上清液。將一半上清液用高G離心機(5000G，10分鐘)再分離得到更澄清的上清液。用鹽酸調節(jié)富含11S球蛋白的上清液的pH到5.0，離心得到沉淀的凝乳。水化(4倍重量)沉淀的凝乳并用氫氧化鈉中和。在140℃下滅菌15秒，然后噴霧干燥得到進行了肌醇六磷酸酶處理的富含11S球蛋白的大豆蛋白。
另一方面，用鹽酸調節(jié)可溶部分的pH到4.9，離心得到沉淀的凝乳。用10倍體積的水洗滌沉淀的凝乳，水化(4倍重量)沉淀的凝乳并用氫氧化鈉中和。在140℃下滅菌15秒，然后立即噴霧干燥得到進行了肌醇六磷酸酶處理的富含7S球蛋白的大豆蛋白。
存在于經(jīng)過上述分離后得到的可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按與實施例1相同的方法計算，并將此比例和肌醇六磷酸的含量列于表12中。
表12可溶部分 不溶部分7S∶11S 94∶6 7∶93肌醇六磷酸0.06％0.09％表13中列出了富含7S球蛋白的蛋白質(表中的7S)和富含11S球蛋白的蛋白質(表中的11S)以及作為參考對照物的商品化分離蛋白(“FUJIPRO-F”，表中的SPI)三種粉末的組成。
表13水 總蛋白 7S/11S肌醇六 氯仿·甲醇比例 磷酸可提取的油份(％) (％) (％)(％)7S 4.398.295/5 0.060.711S5.594.34/96 0.092.8(未再分離)11S4.898.24/96 0.091.8(再分離)SPI5.590.230/70 1.8 3.5總蛋白以干重計。
測定富含7S球蛋白的蛋白質的氨基酸組成，結果表明甲硫氨酸+半胱氨酸的含硫氨基酸的含量是12mg/g蛋白。而純度差的7S球蛋白如胰蛋白酶抑制劑中含硫氨基酸的含量通常是15mg/g或更高，原因是混在蛋白質部分的雜蛋白含有大量的含硫氨基酸，不象徹底純化的7S球蛋白其典型的含硫氨基酸的含量是5mg/g，本發(fā)明含硫氨基酸的含量低進一步證明了本發(fā)明7S球蛋白的純度高。實施例11一重量份的與實施例1同樣脫脂的低變性脫脂大豆與10重量份的用于提取的水在40℃下混合，用鹽酸調pH到6.1。此溶液與8單位/重量蛋白質的肌醇六磷酸酶(NOVO，“PHYTASE NOVO L”)混合，然后在40℃下處理30分鐘，處理包括提取蛋白質和酶促反應，這樣得到酶處理過的漿狀提取物。冷卻酶處理過的漿狀提取物至約25℃，用鹽酸調節(jié)pH到6.1，再用間歇式離心機(3000G)離心。結果是觀察到了可溶部分和不溶部分的不連續(xù)分離。離心過程中溶液的溫度約為25℃。水化(脫脂大豆量的7倍)得到的不溶部分，用氫氧化鈉調節(jié)pH到7.2，提取30分鐘再離心除去不溶的部分，這樣得到了富含11S球蛋白的上清液。用鹽酸調節(jié)富含11S球蛋白的上清液的pH到5.0，離心得到沉淀的凝乳。水化(4倍重量)沉淀的凝乳并用氫氧化鈉中和。在140℃下滅菌15秒，然后噴霧干燥得到了肌醇六磷酸酶處理過的富含11S球蛋白的大豆蛋白。另一方面，用鹽酸調節(jié)可溶部分的pH到4.9，離心得到沉淀的凝乳。水化(4倍重量)沉淀的凝乳并用氫氧化鈉中和。在140℃下滅菌15秒，然后噴霧干燥得到進行了肌醇六磷酸酶處理的富含7S球蛋白的大豆蛋白。
存在于經(jīng)過上述分離后得到的可溶部分和不溶部分的7S球蛋白和11S球蛋白的比例按與實施例1相同的方法計算，并將此比例和固體樣品中肌醇六磷酸的含量列于表14中。
表14可溶部分 不溶部分7S∶11S 89∶117∶93肌醇六磷酸0.09％0.12％
表15未經(jīng)肌醇六磷酸酶經(jīng)過肌醇六磷酸酶處理處理沉淀量(g)12.210.6固體(g) 27.031.1回收固體(g) 3.3 3.3
上述離心分離的每種不溶部分的沉淀量列于表16中。
表16未經(jīng)肌醇六磷酸經(jīng)過肌醇六磷酸酶處理酶處理沉淀量(g) 15.5 13.5固體(g) 26.5 30.4回收固體(g) 4.1 4.1由實施例12和13的結果表明使用肌醇六磷酸酶分解肌醇六磷酸在分離含7S球蛋白的可溶部分和含11S球蛋白的不溶部分時提高了不溶部分的脫水速度，這樣分離操作更加簡單。對比例1與實施例1同樣提取的脫脂大豆乳在沸水浴沸騰10分鐘。用水冷卻后，用鹽酸調節(jié)樣品的pH到4.8，然后加熱到50℃。調過pH的脫脂大豆乳達到50℃后立即冷卻至約30℃，pH調到5.8并使用間歇式離心機(3000G)離心，但未觀察到可溶部分和不溶部分的不連續(xù)分離。因此使用8000G的間歇式離心機離心樣品以得到不溶部分和可溶部分。然而，得到的可溶部分的蛋白回收％低，僅為30.3％，并且由SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳確定的可溶部分的組成表明幾乎不含7S球蛋白。
通過這些結果發(fā)現(xiàn)在酸性條件下加熱之前進行加熱明顯對分離有不利影響。(分離的大豆蛋白的溶解圖)比較測定實施例6中得到的肌醇六磷酸未分解的7S和11S球蛋白以及實施例9中得到的肌醇六磷酸被分解的7S和11S球蛋白這四種分離的大豆蛋白的溶解圖。
溶解圖的評價是根據(jù)用鹽酸調為pH1的分離大豆蛋白溶液(1％)中通過9000G離心得到的可溶部分中含有的蛋白質占蛋白總量的比例。制備1％的溶液，調節(jié)pH和離心均在25℃下進行。
圖2和3分別表示7S球蛋白和11S球蛋白的溶解圖。
由這些結果說明分解肌醇六磷酸使7S球蛋白的溶解度在pH為4或更低時大大地增加，而pH為6.5或更高時11S球蛋白的溶解度減小。
工業(yè)應用如上所述，本發(fā)明包括在弱酸性條件下加熱含有大豆蛋白的溶液，然后在pH5.6至6.6時分離出可溶部分和不溶部分，其能以工業(yè)規(guī)模有效地實現(xiàn)。
權利要求
1.一種生產分級大豆蛋白的方法，其包括在弱酸性條件下加熱含有大豆蛋白的溶液，然后在pH5.6至6.6時分離出可溶部分和不溶部分。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中弱酸性條件是pH3.8至6.8。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其中加熱是在30至75℃的溫度下進行。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其中肌醇六磷酸是在生產過程中通過肌醇六磷酸酶分解的。
5.根據(jù)權利要求1的方法，其中可溶部分的7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值是0.4或更高。
6.根據(jù)權利要求1的方法，其中可用2∶1的氯仿∶甲醇混合物提取的極性脂類在可溶部分的固體組分中總計1％或更少。
7.根據(jù)權利要求1的方法，其中肌醇六磷酸在可溶部分的固體組分中總計1.2％或更少。
8.根據(jù)權利要求1的方法，其中不溶部分的11S球蛋白/(11S球蛋白+7S球蛋白)的比值是0.7或更高。
9.根據(jù)權利要求1的方法，其中肌醇六磷酸在不溶部分的固體組分中總計1.2％或更少。
10.根據(jù)權利要求1的方法，其中不溶部分的11S球蛋白使用接近中性的水溶液提取，然后離心得到提取部分。
11.根據(jù)權利要求9的方法，其中可用2∶1的氯仿∶甲醇混合物提取的極性脂類在提取部分的固體組分中總計2％或更少。
12.根據(jù)權利要求4的方法，其中肌醇六磷酸在提取部分的固體組分中總計1.2％或更少。
13.一種高純度7S球蛋白，其7S球蛋白/(7S球蛋白+11S球蛋白)的比值是0.4或更高并且其可用2∶1的氯仿∶甲醇混合物提取的極性脂類在固體組分中總計1％或更少。
14.根據(jù)權利要求13的高純度7S球蛋白，其中肌醇六磷酸在固體組分中總計1.2％或更少。
15.一種高純度11S球蛋白，其11S球蛋白/(11S球蛋白+7S球蛋白)的比值是0.7或更高并且其可用2∶1的氯仿∶甲醇混合物提取的極性脂類在固體組分中總計2％或更少。
16.根據(jù)權利要求15的高純度11S球蛋白，其中肌醇六磷酸在固體組分中總計1.2％或更少。
全文摘要
提供一種有效的、工業(yè)規(guī)模的將大豆蛋白分離成高純度的7S球蛋白和11S球蛋白的方法，所述方法包括在弱酸性條件下加熱含有大豆蛋白的溶液，然后在pH5.6至6.6時分離出可溶部分和不溶部分。如果需要，還可以在生產過程中使用肌醇六磷酸酶進行處理以分離出7S球蛋白和11S球蛋白。
文檔編號A23J3/00GK1466420SQ01816604
公開日2004年1月7日 申請日期2001年9月28日 優(yōu)先權日2000年10月2日
發(fā)明者石川正廣, 河野光登, 長尾恭江, 廣元彥, 彥, 江, 登 申請人:不二制油株式會社