專(zhuān)利名稱：核酸擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有用的靶核酸的檢測(cè)方法及在遺傳工程中有用的DNA的合成方法。本發(fā)明涉及以核酸為模板的擴(kuò)增方法及利用該方法得到的靶核酸的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
DNA合成可用于遺傳工程領(lǐng)域中的多種研究用途。除短鏈DNA如寡核苷酸外，絕大多數(shù)DNA的合成是通過(guò)其中應(yīng)用有DNA聚合酶的酶促法合成的。這些方法的一個(gè)示例是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其在美國(guó)專(zhuān)利NO.4,683,195、4,683,202及4,800,159中有詳細(xì)描述。另一個(gè)示例是結(jié)合了PCR和逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄-PCR(RT-PCR)法，在Trends in Biotechnology，10146-152(1992)中有描述。
上述提到的方法的開(kāi)發(fā)使得能夠?qū)Ω信d趣的DNA或RNA的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。
上文提及的DNA合成法是如通過(guò)包括3個(gè)步驟的反應(yīng)進(jìn)行的。為了對(duì)感興趣的DNA區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，此三個(gè)步驟為雙鏈DNA解離(變性)為單鏈DNA、將引物退火到單鏈DNA上及從引物開(kāi)始合成互補(bǔ)鏈(延伸)。另外，可利用命名為“穿梭PCR”的反應(yīng)來(lái)進(jìn)行PCR合成(″PCRhou saizensen″(Recent advances in PCR methodology)，Tanpakushitsu Kakusan Kouso，Bessatsu，(Protein，Nucleic Acidand Enzyme，Supplement)，41(5)425-428(1996))，其中的3個(gè)步驟中的2個(gè)步驟，也即退火和延伸步驟是在同一溫度下進(jìn)行的。
另外，可利用1989年6月14日公開(kāi)的EP 320,308中描述的連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)法或PCR Protocols，Academic Press Inc.，1990，pp.245-252中描述的基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增體系(TAS)法來(lái)進(jìn)行DNA合成。在上述4個(gè)方法中，為了為下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)再生單鏈靶分子，這就需要在高溫和低溫下進(jìn)行多次重復(fù)反應(yīng)。由于反應(yīng)為上述溫度所限制，所以反應(yīng)體系應(yīng)利用不連續(xù)相或循環(huán)來(lái)進(jìn)行。
因此，這些方法要求利用一臺(tái)昂貴的熱循環(huán)儀隨著時(shí)間變化在寬溫度范圍內(nèi)對(duì)溫度進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)節(jié)。此外，反應(yīng)需要時(shí)間來(lái)將溫度調(diào)節(jié)到2或3個(gè)預(yù)先確定的值。時(shí)間損失隨循環(huán)數(shù)目成比例增加。
為了解決這些問(wèn)題，所以我們開(kāi)發(fā)了可在等溫條件下進(jìn)行的核酸擴(kuò)增方法。其示例包括JPB-B 7-114718中描述的鏈置換擴(kuò)增(SDA)法、自我維持的序列復(fù)制(3SR)法、日本專(zhuān)利No.2650159中描述的基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)法、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)方法、法日本專(zhuān)利No.2710159中描述的Qβ復(fù)制酶法、及美國(guó)專(zhuān)利No.5,824,517、WO 99/09211、WO 95/25180和WO 99/49081中描述的多種修飾SDA法。寡核苷酸的等溫酶合成法在美國(guó)專(zhuān)利NO.5,916,777中有描述。在這些等溫核酸擴(kuò)增或寡核苷酸合成法的反應(yīng)中，從引物開(kāi)始的延伸步驟和/或引物退火到單鏈延伸產(chǎn)物(或退火到起始靶序列上)上的步驟是在等溫反應(yīng)混合物中同時(shí)進(jìn)行的，而其后緊隨的是從引物開(kāi)始的延伸步驟。
在這些等溫核酸擴(kuò)增方法中，SDA法是DNA最終擴(kuò)增成功的體系的示例。SDA法是在樣品中、通過(guò)利用DNA聚合酶和限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)雙鏈進(jìn)行置換的靶核酸序列(及其互補(bǔ)鏈)擴(kuò)增方法。此方法要求有4種引物用于擴(kuò)增，其中兩個(gè)應(yīng)該設(shè)計(jì)含有限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)。對(duì)于DNA的大量合成來(lái)講，此方法要求利用修飾的脫氧核糖核苷三磷酸作為底物。修飾的脫氧核糖核苷三磷酸的一個(gè)示例是(α-S)脫氧核糖核苷三磷酸，其中α-位磷酸基的氧原子為硫原子(S)所替代。如果在如遺傳檢驗(yàn)中進(jìn)行常規(guī)的反應(yīng)，那與修飾的脫氧核糖核苷三磷酸相關(guān)的成本問(wèn)題就變的嚴(yán)重了。此外，在此方法中，將修飾的核苷酸如(α-S)脫氧核糖核苷酸結(jié)合到擴(kuò)增后的DNA片段中可能會(huì)使具有限制性酶的擴(kuò)增后DNA片段的可切割性喪失，例如，當(dāng)用于限制性酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析時(shí)。
美國(guó)專(zhuān)利NO.5,824,517中描述的修飾的SDA法是一種利用嵌合引物進(jìn)行的DNA擴(kuò)增方法，此嵌合引物由RNA和DNA組成，并且其含有至少在3′末端定位有DNA的必需結(jié)構(gòu)元件。在WO 99/09211中描述的修飾的SDA法要求利用限制性酶來(lái)產(chǎn)生突出的末端。WO 95/25180中描述的修飾的SDA法要求利用至少兩對(duì)引物。WO99/49081中描述的修飾的SDA法要求利用至少兩對(duì)引物和至少一個(gè)修飾的脫氧核糖核苷三磷酸。另一方面，美國(guó)專(zhuān)利NO.5,916,777中描述的寡核苷酸合成法包括利用在3′末端含有核糖核苷酸的引物合成DNA、利用引物完成反應(yīng)、用可將其分離開(kāi)來(lái)的內(nèi)切核酸酶在引物延伸鏈的引物和延伸鏈之間導(dǎo)入切口、消化模板并回收引物進(jìn)行重復(fù)利用。此寡核苷酸合成方法要求從反應(yīng)體系中分離引物并隨后將其退火到模板上以便在本方法中重復(fù)利用引物。另外，WO00/28082中描述的環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)法要求有4種引物用于擴(kuò)增并且利用此方法合成擴(kuò)增后的產(chǎn)物是不同大小的DNA，而對(duì)這些DNA中用于擴(kuò)增的靶定區(qū)域進(jìn)行了重復(fù)。
如上所述，傳統(tǒng)的等溫核酸擴(kuò)增方法仍然具有多種問(wèn)題。因此，我們想要的是低運(yùn)轉(zhuǎn)成本的核酸擴(kuò)增方法，通過(guò)此方法我們可獲得進(jìn)一步進(jìn)行了遺傳工程操作的DNA片段。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是提供靶核酸擴(kuò)增方法，而此擴(kuò)增方法是在樣品中利用嵌合寡核苷酸引物，通過(guò)DNA合成反應(yīng)而以高敏感度特異性擴(kuò)增靶核酸，提供利用該方法獲得的擴(kuò)增片段的檢測(cè)方法，提供利用該擴(kuò)增方法和這些方法中應(yīng)用的嵌合寡核苷酸來(lái)制備靶核酸的方法。發(fā)明概述作為深入研究的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明者們構(gòu)建了優(yōu)良的基因擴(kuò)增反應(yīng)體系。通過(guò)開(kāi)發(fā)了一個(gè)方法來(lái)完成了此構(gòu)建工作，其中此方法包括在具有3′末端或3′末端側(cè)核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物、內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶存在的條件下對(duì)感興趣的DNA區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。從而，完成本發(fā)明。此方法是利用嵌合寡核苷酸引物進(jìn)行的核酸擴(kuò)增方法，在此處稱為ICAN(等溫和嵌合引物起始的核酸擴(kuò)增)法。
本發(fā)明的第一方面涉及靶核酸的擴(kuò)增方法，此方法包括(a)將作為模板的核酸、脫氧核糖核苷三磷酸、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、至少一種引物和RNA酶H混合來(lái)制備反應(yīng)混合物，其中，此引物是基本上與作為模板的核酸的核苷酸序列互補(bǔ)的嵌合寡核苷酸引物，并且此引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；及(b)對(duì)反應(yīng)混合物孵育足夠時(shí)間以產(chǎn)生反應(yīng)產(chǎn)物。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面中，選用了進(jìn)一步含有嵌合寡核苷酸引物的反應(yīng)混合物，而此嵌合寡核苷酸引物含有與作為模板的核苷酸序列基本同源的序列。
本發(fā)明的第二方面涉及核酸擴(kuò)增方法，此方法包括(a)用至少一種與作為模板的核酸的核苷酸序列基本互補(bǔ)的引物及DNA聚合酶處理作為模板的核酸，以合成與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈并合成雙鏈核酸，其中，此引物是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(b)在RNA酶H存在下，用具有鏈置換活性的DNA聚合酶對(duì)互補(bǔ)于在前面的步驟中獲得的、作為模板的雙鏈核酸的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以引起鏈置換并合成置換后的鏈及雙鏈核酸；及(c)在步驟(b)中重新利用步驟(b)中獲得的雙鏈核酸作為模板。
本發(fā)明的第三方面涉及利用至少兩種引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法，此方法包括a)用至少一種與作為模板的核酸的核苷酸序列基本互補(bǔ)的引物及DNA聚合酶處理作為模板的核酸，以合成與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈，其中，此引物是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(b)在RNA酶H存在下，用具有鏈置換活性的DNA聚合酶對(duì)互補(bǔ)于在前面的步驟中獲得的、作為模板的雙鏈核酸的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以引起鏈置換并合成置換后的鏈及雙鏈核酸；(c)在步驟(b)中重新利用步驟(b)中獲得的雙鏈核酸作為模板；(d)利用至少一種與步驟(a)中所用的引物不同的引物及DNA聚合酶處理步驟(b)中獲得的、作為模板的置換后的鏈，以合成與置換后的鏈互補(bǔ)的引物延伸鏈，其中與步驟(a)中所用的引物不同的此引物是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物基本上與置換后鏈的核苷酸序列互補(bǔ)，并且含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(e)在RNA酶H存在下，用具有鏈置換活性的DNA聚合酶對(duì)互補(bǔ)于在前面的步驟中獲得的、作為模板的雙鏈核酸的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以引起鏈置換并合成置換后的鏈及雙鏈核酸；及(f)在步驟(e)中重新利用步驟(e)中獲得的雙鏈核酸作為模板。
在本發(fā)明的第二或第三個(gè)方面中，具有鏈置換活性的DNA聚合酶可用作DNA聚合酶。
本發(fā)明的第四方面涉及核酸擴(kuò)增方法，此方法包括(a)利用分別與雙鏈核酸模板的每條鏈的核苷酸序列基本互補(bǔ)的兩種引物及具有鏈置換活性的DNA聚合酶處理作為模板的雙鏈核酸分子，以合成與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈，并獲得由相互退火的合成的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸，其中每個(gè)引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(b)利用內(nèi)切核酸酶，切割步驟(a)中獲得的、由引物延伸鏈組成的雙鏈核酸的包含核糖核苷酸的位點(diǎn)；及(c)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶從步驟(b)中獲得的、其中的引物延伸鏈被切割的雙鏈核酸的各個(gè)引物部分的3′末端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以實(shí)現(xiàn)鏈置換并獲得由模板和引物延伸鏈組成的雙鏈核酸。
本發(fā)明的第五方面涉及核酸擴(kuò)增方法，此方法包括(a)利用分別與雙鏈核酸模板的每條鏈的核苷酸序列基本互補(bǔ)的兩種引物及具有鏈置換活性的DNA聚合酶處理作為模板的雙鏈核酸分子，以合成與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈，并獲得由相互退火的合成的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸，其中每個(gè)引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(b)利用內(nèi)切核酸酶，切割步驟(a)中獲得的、由引物延伸鏈組成的雙鏈核酸的包含核糖核苷酸的位點(diǎn)；及(c)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶從步驟(b)中獲得的、其中的引物延伸鏈被切割的雙鏈核酸的各個(gè)引物部分的3′末端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以實(shí)現(xiàn)鏈置換并獲得由相互退火的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸。
本發(fā)明的第六方面涉及核酸擴(kuò)增方法，此方法包括(a)利用分別與雙鏈核酸模板的每條鏈的核苷酸序列基本互補(bǔ)的兩種引物及具有鏈置換活性的DNA聚合酶處理作為模板的雙鏈核酸分子，以合成與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈，并獲得由相互退火的合成的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸，其中每個(gè)引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(b)利用內(nèi)切核酸酶，切割步驟(a)中獲得的、由引物延伸鏈組成的雙鏈核酸的包含核糖核苷酸的位點(diǎn)；(c)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶從步驟(b)中獲得的、其中的引物延伸鏈被切割的雙鏈核酸的各個(gè)引物部分的3′末端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以實(shí)現(xiàn)鏈置換并獲得由相互退火的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸和由相互退火的模板組成的、與步驟(a)中的兩種引物退火的雙鏈核酸；(d)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶從步驟(c)中獲得的、與兩種引物退火的雙鏈核酸的各個(gè)引物部分的3′末端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以實(shí)現(xiàn)鏈置換并獲得由相互退火的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸和由相互退火的模板組成的、與步驟(a)中的兩種引物退火的雙鏈核酸；和(e)在步驟(d)中，重新利用步驟(d)中獲得的、與兩引物退火的雙鏈核酸。
本發(fā)明的第七方面涉及核酸擴(kuò)增方法，此方法包括(a)利用分別與雙鏈核酸模板的每條鏈的核苷酸序列基本互補(bǔ)的兩種引物及具有鏈置換活性的DNA聚合酶處理作為模板的雙鏈核酸分子，以合成與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈，并獲得由相互退火的合成的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸，其中每個(gè)引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；
(b)利用內(nèi)切核酸酶，切割步驟(a)中獲得的、由引物延伸鏈組成的雙鏈核酸的包含核糖核苷酸的位點(diǎn)；(c)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶從步驟(b)中獲得的、其中的引物延伸鏈被切割的雙鏈核酸的各個(gè)引物部分的3′末端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以實(shí)現(xiàn)鏈置換并獲得由相互退火的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸和由相互退火的模板組成的、與步驟(a)中的兩種引物退火的雙鏈核酸；(d)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶從步驟(c)中獲得的、與兩種引物退火的雙鏈核酸的各個(gè)引物部分的3′末端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以實(shí)現(xiàn)鏈置換并獲得由模板和引物延伸鏈組成的雙鏈核酸；(e)利用內(nèi)切核酸酶，切割步驟(d)中獲得的、由模板和引物延伸鏈組成的雙鏈核酸的包含核糖核苷酸的位點(diǎn)；和(f)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶從步驟(e)中獲得的、其中的引物延伸鏈被切割的雙鏈核酸的引物部分的3′末端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以合成置換后的鏈。
在第4-7方面，內(nèi)切核糖核酸酶，如RNA酶H可用作內(nèi)切核酸酶。
在其中應(yīng)用了RNA酶H的第1-7方面中，可以選用來(lái)自于大腸桿菌、棲熱袍菌屬細(xì)菌、棲熱菌屬細(xì)菌、火球菌屬細(xì)菌、古生球菌屬細(xì)菌、芽胞桿菌屬細(xì)菌等的RNA酶H。
在本發(fā)明的第1-7方面，在靶核酸的核酸序列中，進(jìn)行特異性擴(kuò)增的區(qū)域的合適長(zhǎng)度的示例為200bp或更小。
對(duì)于本發(fā)明的第1-7方面，可以選用下列通式所表示的嵌合寡核苷酸引物通式5′-dNa-Nb-dNc-3′(a等于或大于11的整數(shù)；b等于或大于1的整數(shù)；c0或等于或大于1的整數(shù)；dN脫氧核糖核苷酸和/或核苷酸類(lèi)似物；N未修飾的核糖核苷酸和/或修飾的核糖核苷酸，其中dNa中的一些dNs可為Ns所替換，并且可對(duì)3′末端的核苷酸進(jìn)行修飾，這樣不會(huì)發(fā)生通過(guò)DNA聚合酶的作用而進(jìn)行的從3′末端開(kāi)始的延伸)。
這些嵌合寡核苷酸引物的范例是c為0的引物以及其中的核苷酸類(lèi)似物是脫氧肌苷核糖(deoxyriboinosine)核苷酸或脫氧尿嘧啶核糖(deoxyribouracil)核苷酸、而修飾的核糖核苷酸為(α-S)核糖核苷酸的引物。此外，當(dāng)應(yīng)用這樣的嵌合寡核苷酸引物時(shí)，DNA延伸反應(yīng)是在適合于引物的DNA延伸反應(yīng)溫度下進(jìn)行的。
第1-7方面的擴(kuò)增方法包括在含有可促進(jìn)核酸退火到引物上的物質(zhì)的退火溶液中，將作為模板的核酸分子退火到嵌合寡核苷酸引物上，而這些引物基本上是與作為模板的核酸的核苷酸序列互補(bǔ)的。例如，退火溶液可含有亞精胺和/或丙二胺。等于或大于90℃下，對(duì)含有作為模板的核酸及與作為模板的核酸序列基本互補(bǔ)的嵌合寡核苷酸引物的退火溶液進(jìn)行孵育，隨后將溶液冷卻到進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的溫度或低于此溫度，從而來(lái)進(jìn)行退火。
可在緩沖溶液中進(jìn)行本發(fā)明1-7方面的擴(kuò)增反應(yīng)，而此緩沖溶液中含有選自N-二[羥乙基]甘氨酸和HEPES的緩沖成分。
在本發(fā)明的1-7方面中，例如，選自大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段、來(lái)自于嗜熱脂肪芽胞桿菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的BstDNA聚合酶及來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶的DNA聚合酶可用作具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
在本發(fā)明1-7方面的一個(gè)實(shí)施方案中，來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶被用作具有鏈置換活性的DNA聚合酶，而來(lái)自于大腸桿菌、火球菌屬細(xì)菌或古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H用作內(nèi)切核酸酶。RNA酶H的范例是來(lái)自于大腸桿菌的I型RNA酶H或來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌或古生球菌屬細(xì)菌的II型RNA酶H。
在本發(fā)明的第1-7方面中，可以利用具有內(nèi)切核酸酶活性的DNA聚合酶。來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶可用作這樣的DNA聚合酶，并且在允許DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)存在下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。允許Bca DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)的范例是錳離子。
在抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)存在下，可利用本發(fā)明第1-7方面中的擴(kuò)增方法對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增。抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)的范例為乙膦甲酸。
可利用單鏈DNA或雙鏈DNA作為模板來(lái)實(shí)施本發(fā)明的第1-7方面。如果作為模板的核酸是雙鏈DNA，那可在將其轉(zhuǎn)化為單鏈DNA后再進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
作為模板的核酸可以是以RNA為模板通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA。一方面，擴(kuò)增反應(yīng)是在以RNA為模板通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA后進(jìn)行的。具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。例如，可利用具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性和鏈置換活性的DNA聚合酶來(lái)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)并合成與模板互補(bǔ)的延伸鏈。這樣的DNA聚合酶的范例是來(lái)自于嗜熱脂肪芽胞桿菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶或來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶。
在本發(fā)明的第1-7方面中，可在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)?？稍诿撗鹾颂呛塑杖姿犷?lèi)似物如脫氧尿嘧啶三磷酸或其衍生物存在下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
本發(fā)明的第8方面涉及用于核酸擴(kuò)增的組合物，其包含(a)至少一種與作為模板的核酸的核苷酸序列基本互補(bǔ)的引物，其中此引物是嵌合寡核苷酸引物，此引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸及核苷酸類(lèi)似物、定位于引物的3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(b)內(nèi)切核酸酶；及(c)具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
本發(fā)明的第9方面涉及用于核酸擴(kuò)增的組合物，其包含有(a)至少兩種基本上與作為模板的雙鏈核酸的各條鏈的核苷酸序列分別互補(bǔ)的引物，其中此引物是嵌合寡核苷酸引物，此引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸及核苷酸類(lèi)似物、定位于引物的3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(b)內(nèi)切核酸酶；及(c)具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
本發(fā)明的第10方面涉及用于核酸擴(kuò)增的組合物，其是通過(guò)將作為模板的核酸、脫氧核糖核苷三磷酸、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、至少一種引物和內(nèi)切核酸酶混合而獲得的，其中此引物是嵌合寡核苷酸引物，此引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸及核苷酸類(lèi)似物、定位于引物的3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)。
本發(fā)明的第11方面涉及用于核酸擴(kuò)增的組合物，其是通過(guò)將作為模板的核酸、脫氧核糖核苷三磷酸、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、至少兩種引物和內(nèi)切核酸酶混合而制得的，其中每種引物都是嵌合寡核苷酸引物，此引物與作為模板的雙鏈核酸的每條鏈的核苷酸序列基本互補(bǔ)，并且此引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸及核苷酸類(lèi)似物、定位于引物的3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)。
本發(fā)明第8-11方面的組合物中包含的引物的范例為下面通式表示的嵌合寡核苷酸引物通式5′-dNa-Nb-dNc-3′(a等于或大于11的整數(shù)；b等于或大于1的整數(shù)；c0或等于或大于1的整數(shù)；dN脫氧核糖核苷酸和/或核苷酸類(lèi)似物；N未修飾的核糖核苷酸和/或修飾的核糖核苷酸，其中dNa中的一些dNs可為Ns所替換，并且可對(duì)3′末端的核苷酸進(jìn)行修飾，這樣不會(huì)發(fā)生通過(guò)DNA聚合酶的作用而進(jìn)行的從3′末端開(kāi)始的延伸)。
這些嵌合寡核苷酸引物的范例是c為0的引物以及其中的核苷酸類(lèi)似物是脫氧肌苷核糖核苷酸或脫氧尿嘧啶核糖核苷酸、而修飾的核糖核苷酸為(α-S)核糖核苷酸的引物。
本發(fā)明的第8-11方面的組合物含有適于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的緩沖成分。例如，其可含有選自N-二[羥乙基]甘氨酸和HEPES的緩沖成分。
通過(guò)含有選自大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段、來(lái)自于嗜熱脂肪芽胞桿菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶作為具有鏈置換活性的DNA聚合酶的組合物來(lái)例示本發(fā)明的第8-11方面。內(nèi)切核糖核酸酶如RNA酶H可用作內(nèi)切核酸酶。RNA酶H的范例是來(lái)自于大腸桿菌的、來(lái)自于棲熱袍菌屬細(xì)菌的、來(lái)自于棲熱菌屬細(xì)菌的、來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌的、來(lái)自于古生球菌屬細(xì)菌的或來(lái)自于芽胞桿菌屬細(xì)菌的RNA酶H。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的第8-11方面的組合物中包含有來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶作為具有鏈置換活性的DNA聚合酶，來(lái)自于大腸桿菌、火球菌屬細(xì)菌或古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H作為內(nèi)切核酸酶。RNA酶H的范例是來(lái)自于大腸桿菌的I型RNA酶H或來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌或古生球菌屬細(xì)菌的II型RNA酶H。
本發(fā)明的第8-11方面的組合物包含有具有內(nèi)切核酸酶活性的DNA聚合酶。來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶可用作這樣的DNA聚合酶，其可在允許DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)存在下進(jìn)行應(yīng)用。允許Bca DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)的范例是錳離子。
本發(fā)明的第8-11方面的組合物包含有可抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)?？梢种艱NA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)的范例為乙膦甲酸。此外，此組合物可含有脫氧核糖核苷三磷酸類(lèi)似物，如脫氧尿嘧啶三磷酸或其衍生物。
本發(fā)明的第12方面涉及用于本發(fā)明第1-3方面的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增組合物，此組合物包含(a)RNA酶H；及(b)具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
本發(fā)明的第13方面涉及用于本發(fā)明第4-7方面的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增組合物，此組合物包含(a)RNA酶H；及(b)具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
內(nèi)切核糖核酸酶，如RNA酶H可用作本發(fā)明第13方面的組合物中所包含的內(nèi)切核酸酶。
選自來(lái)自于大腸桿菌的、來(lái)自于棲熱袍菌屬細(xì)菌的、來(lái)自于棲熱菌屬細(xì)菌的、來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌的、來(lái)自于古生球菌屬細(xì)菌的或來(lái)自于芽胞桿菌屬細(xì)菌的RNA酶H的RNA酶H可用作本發(fā)明第12或13方面的組合物中所包含的RNA酶H，而本發(fā)明的第12或第13方面的組合物是包含有RNA酶H的。
本發(fā)明第12或13方面的組合物可進(jìn)一步包含適于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的緩沖成分。例如，此組合物含有選自N-二[羥乙基]甘氨酸和HEPES的緩沖成分。
通過(guò)含有選自大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段、來(lái)自于嗜熱脂肪芽胞桿菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶作為具有鏈置換活性的DNA聚合酶的組合物來(lái)例示本發(fā)明的第12或13方面。內(nèi)切核糖核酸酶如RNA酶H可用作內(nèi)切核酸酶。RNA酶H的范例是來(lái)自于大腸桿菌的、來(lái)自于棲熱袍菌屬細(xì)菌的、來(lái)自于棲熱菌屬細(xì)菌的、來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌的、來(lái)自于古生球菌屬細(xì)菌的或來(lái)自于芽胞桿菌屬細(xì)菌的RNA酶H。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的第12或13方面的組合物中包含有來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶作為具有鏈置換活性的DNA聚合酶，來(lái)自于大腸桿菌、火球菌屬細(xì)菌或古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H作為內(nèi)切核酸酶。RNA酶H的范例是來(lái)自于大腸桿菌的I型RNA酶H或來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌或古生球菌屬細(xì)菌的II型RNA酶H。
本發(fā)明的第12或13方面的組合物包含有具有內(nèi)切核酸酶活性的DNA聚合酶。來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的BcaDNA聚合酶可用作這樣的DNA聚合酶，其可在允許DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)存在下進(jìn)行應(yīng)用。允許Bca DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)的范例是錳離子。
本發(fā)明的第12或13方面的組合物包含有可抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)?？梢种艱NA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)的范例為乙膦甲酸。此外，此組合物可含有脫氧核糖核苷三磷酸類(lèi)似物，如脫氧尿嘧啶三磷酸或其衍生物。
本發(fā)明第14方面涉及用于本發(fā)明第1-3方面的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增試劑盒，此試劑盒含有(a)RNA酶H；及(b)具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
本發(fā)明第15方面涉及用于本發(fā)明第4-7方面的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增試劑盒，此試劑盒含有(a)內(nèi)切核酸酶；及(b)具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
內(nèi)切核糖核酸酶，如RNA酶H可用作本發(fā)明第15方面的試劑盒中所包含的內(nèi)切核酸酶。
通過(guò)含有選自來(lái)自于大腸桿菌的、來(lái)自于棲熱袍菌屬細(xì)菌的、來(lái)自于棲熱菌屬細(xì)菌的、來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌的、來(lái)自于古生球菌屬細(xì)菌的或來(lái)自于芽胞桿菌屬細(xì)菌的RNA酶H的RNA酶H的試劑盒例示了本發(fā)明第14或15方面包含有RNA酶H的試劑盒。
本發(fā)明第14或15方面的試劑盒可進(jìn)一步包含有適于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的緩沖成分。例如，此組合物含有選自N-二[羥乙基]甘氨酸和HEPES的緩沖成分。此試劑盒可含有退火溶液，而此退火溶液含有可促進(jìn)作為模板的核酸退火到與作為模板的核酸的核苷酸序列基本互補(bǔ)的引物上的物質(zhì)。例如，退火溶液可含有亞精胺和/或丙二胺。
通過(guò)含有選自大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段、來(lái)自于嗜熱脂肪芽胞桿菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶的DNA聚合酶來(lái)例示本發(fā)明第14或15方面的試劑盒中包含的、并具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明第14或15方面中的試劑盒含有來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶，也含有來(lái)自于大腸桿菌、火球菌屬細(xì)菌或古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H。RNA酶H的范例是來(lái)自于大腸桿菌的I型RNA酶H或來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌或古生球菌屬細(xì)菌的II型RNA酶H。
本發(fā)明的第14或15方面的試劑盒可以含有具有內(nèi)切核酸酶活性的DNA聚合酶。來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶可用作這樣的DNA聚合酶。此試劑盒可含有允許DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)。允許Bca DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)的范例是錳離子。
本發(fā)明的第14或15方面的試劑盒含有可抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)。可抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)的范例為乙膦甲酸。此外，此試劑盒可含有脫氧核糖核苷三磷酸類(lèi)似物，如脫氧尿嘧啶三磷酸或其衍生物。
本發(fā)明第16方面涉及用于本發(fā)明第1-3方面的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增試劑盒，此試劑盒以包裝形式存在，并且含有說(shuō)明以指導(dǎo)具有鏈置換活性的DNA聚合酶及RNA酶H的應(yīng)用。
本發(fā)明第17方面涉及用于本發(fā)明第4-7方面的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增試劑盒，此試劑盒以包裝形式存在，并且含有說(shuō)明以指導(dǎo)具有鏈置換活性的DNA聚合酶及內(nèi)切核酸酶的應(yīng)用。
本發(fā)明第18方面涉及用于核酸擴(kuò)增的試劑產(chǎn)品，由包裝材料和用于對(duì)包裹在包裝材料中的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的試劑組成，其中用于擴(kuò)增核酸的試劑包括具有鏈置換活性的DNA聚合酶和/或RNA酶H，并且在粘貼到包裝材料的標(biāo)簽中或粘貼到包裝材料的說(shuō)明書(shū)中說(shuō)明了所述用于擴(kuò)增核酸的試劑可以用于在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
本發(fā)明的第19方面涉及用于核酸擴(kuò)增的試劑產(chǎn)品，由包裝材料和用于對(duì)包裹在包裝材料中的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的試劑組成，其中用于擴(kuò)增核酸的試劑包括具有鏈置換活性的DNA聚合酶和/或內(nèi)切核酸酶，并且在粘貼到包裝材料的標(biāo)簽中或粘貼到包裝材料的說(shuō)明書(shū)中說(shuō)明了所述用于擴(kuò)增核酸的試劑可以用于在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
本發(fā)明第20方面涉及樣品中靶核酸的檢測(cè)方法，此方法包括(a)利用本發(fā)明第1-7方面中的核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行核酸擴(kuò)增；及(b)對(duì)步驟(a)中擴(kuò)增的核酸進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明第20方面中的檢測(cè)方法可包括利用探針對(duì)擴(kuò)增后的核酸進(jìn)行檢測(cè)。此探針可以是已標(biāo)記有標(biāo)記物質(zhì)的探針。例如，可選用用間隔了導(dǎo)致淬滅狀態(tài)的距離的兩種或多種熒光物質(zhì)標(biāo)記的RNA探針。
本發(fā)明第21方面涉及用于第20方面的嵌合寡核苷酸引物?？赏ㄟ^(guò)下列通式所表示的嵌合寡核苷酸引物來(lái)例示嵌合寡核苷酸引物通式5′-dNa-Nb-dNc-3′(a等于或大于11的整數(shù)；b等于或大于1的整數(shù)；c0或等于或大于1的整數(shù)；dN脫氧核糖核苷酸和/或核苷酸類(lèi)似物；N未修飾的核糖核苷酸和/或修飾的核糖核苷酸，其中dNa中的一些dNs可為Ns所替換，并且可對(duì)3′末端的核苷酸進(jìn)行修飾，這樣不會(huì)發(fā)生通過(guò)DNA聚合酶的作用而進(jìn)行的從3′末端開(kāi)始的延伸)。
這些嵌合寡核苷酸引物的范例是c為0的引物以及其中的核苷酸類(lèi)似物是脫氧肌苷核糖核苷酸或脫氧尿嘧啶核糖核苷酸、而修飾的核糖核苷酸為(α-S)核糖核苷酸的引物。
本發(fā)明第21方面的引物的范例是用于檢測(cè)病原微生物或與疾病相關(guān)的基因的引物。用于檢測(cè)病原微生物，如腸出血性大腸桿菌、肉毒梭菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核分支桿菌、衣原體、乳頭狀瘤病毒、丙型肝炎病毒或類(lèi)病毒的嵌合寡核苷酸引物也包括在本發(fā)明之中。
本發(fā)明第22方面涉及用于檢測(cè)腸出血性大腸桿菌的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有選自SEQ ID NO31-34、47、48、51-53、64-72、84、85、113、114、130和131的核苷酸序列。
本發(fā)明第23方面涉及用于檢測(cè)類(lèi)病毒的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有選自SEQ ID NO59、60、119、120、122和123的核苷酸序列。
本發(fā)明第24方面涉及用于檢測(cè)肉毒梭菌的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有SEQ ID NO116或117所表示的核苷酸序列。
本發(fā)明第25方面涉及用于檢測(cè)乳頭狀瘤病毒的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有SEQ ID NO96或97所表示的核苷酸序列。
本發(fā)明第26方面涉及用于檢測(cè)丙型肝炎病毒的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有選自SEQ ID NO101、102、138、139、200、201、205和206的核苷酸序列。
本發(fā)明第27方面涉及用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有SEQ ID NO136或137所表示的核苷酸序列。
本發(fā)明第28方面涉及用于檢測(cè)結(jié)核分支桿菌的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有選自SEQ ID NO155、156、159-162、194和195的核苷酸序列。
本發(fā)明第29方面涉及用于檢測(cè)衣原體的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有選自SEQ ID NO157、158、203和204的核苷酸序列。
本發(fā)明第30方面涉及用于本發(fā)明第1-5方面中的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增試劑盒，此試劑盒含有第20-29方面的嵌合寡核苷酸引物。
本發(fā)明第31方面涉及用于本發(fā)明第20方面的靶核酸檢測(cè)方法的靶核酸檢測(cè)試劑盒，此試劑盒含有本發(fā)明第21-29方面的嵌合寡核苷酸引物。
本發(fā)明第32方面涉及用于本發(fā)明第20方面的方法中的探針。
本發(fā)明第33方面涉及與通過(guò)本發(fā)明第1-7方面的方法擴(kuò)增得到的核酸進(jìn)行雜交的探針。
本發(fā)明第34方面涉及與利用本發(fā)明第21-29方面的嵌合寡核苷酸引物擴(kuò)增得到的區(qū)域進(jìn)行雜交的探針。
本發(fā)明第32-34方面中的探針可為已標(biāo)記有標(biāo)記物質(zhì)，如用間隔了導(dǎo)致淬滅狀態(tài)的距離的兩種或多種熒光物質(zhì)標(biāo)記的RNA探針。
本發(fā)明第35方面涉及用于本發(fā)明第20方面的核酸檢測(cè)方法中的試劑盒，此試劑盒含有本發(fā)明第32-34方面的探針。
本發(fā)明第36方面涉及核酸擴(kuò)增方法，此方法包括利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶來(lái)實(shí)現(xiàn)模板交換反應(yīng)。
本發(fā)明第36方面所用的具有鏈置換活性的DNA聚合酶的示例為來(lái)自于大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段、來(lái)自于嗜熱脂肪芽胞桿菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶。
本發(fā)明第37方面涉及含有固定化核酸的物質(zhì)的制備方法，而此物質(zhì)中的核酸是排列在預(yù)定的區(qū)域中的，此方法包括(a)利用本發(fā)明第1-7方面的核酸擴(kuò)增方法來(lái)擴(kuò)增待固定化的核酸；及(b)將步驟(a)中擴(kuò)增得到的核酸排列并固定在預(yù)定的區(qū)域中。
本發(fā)明第38方面涉及含有固定化核酸的物質(zhì)，而此物質(zhì)中的核酸是利用本發(fā)明第37方面的方法制備并排列在預(yù)定的區(qū)域中的。
本發(fā)明第39方面涉及大量制備核酸的方法，此方法包括(a)利用本發(fā)明第1-7方面的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增核酸；及(b)收集步驟(a)中擴(kuò)增得到的核酸。
本發(fā)明第40方面涉及核酸擴(kuò)增方法，此方法包括(a)復(fù)制含有待擴(kuò)增序列的DNA或RNA以制備作為模板的核酸；及(b)利用本發(fā)明第1-7方面的核酸擴(kuò)增方法來(lái)對(duì)步驟(a)中獲得的作為模板的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。
本發(fā)明第41方面涉及對(duì)核酸中的核苷酸序列進(jìn)行確定的方法，此方法包括按照本發(fā)明第1-7、第39或40方面的方法來(lái)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
附圖簡(jiǎn)述

圖1圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖2圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖3圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖4圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖5圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖6圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖7圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖8圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖9圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖10圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。AICAN；BPCR。
圖11圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖12圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖13圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖14圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖15圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖16圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖17圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖18圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖19圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖20圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖21圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖22圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖23圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖24圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖25圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖26圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖27圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖28圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜和斑點(diǎn)印跡圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖29圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖30為一圖表，其對(duì)比了按照本發(fā)明的方法和PCR法擴(kuò)增得到的產(chǎn)物的量。
圖31圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖32圖解了擴(kuò)增后DNA片段的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖33圖解了本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法的一個(gè)方面。
圖34圖解了本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法的一個(gè)方面。
圖35圖解了本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法的一個(gè)方面。
圖36圖解了本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法的一個(gè)方面。
圖37圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖38圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
圖39圖解了擴(kuò)增后DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，而此DNA片段是按照本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的。
發(fā)明詳述正如此處所用的，脫氧核糖核苷酸(也稱作dN)指糖部分由D-2-脫氧核糖組成的核苷酸。此脫氧核糖核苷酸包括，如以腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤和胸腺嘧啶做堿基部分的脫氧核糖核苷酸。此外，此脫氧核糖核苷酸也包括具有修飾的堿基如7-脫氮鳥(niǎo)苷和脫氧核糖核苷酸類(lèi)似物如脫氧肌苷核苷酸的脫氧核糖核苷酸。
正如此處所用的，核糖核苷酸(也稱作N)指糖部分由D-核糖組成的核苷酸。此核糖核苷酸包括，如以腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤和尿嘧啶做堿基部分的核糖核苷酸。核糖核苷酸也包括修飾的核糖核苷酸，如α-位磷酸基團(tuán)的氧原子為硫原子所取代(也稱作(α-S)核糖核苷酸或(α-S)N)的修飾核苷酸或其衍生物。
正如此處所用的，嵌合寡核苷酸引物指含有脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的引物。此引物可含有核苷酸類(lèi)似物和/或修飾的核糖核苷酸。
本發(fā)明中所用的嵌合寡核苷酸引物包括任何具有定位于引物的3′-末端或3′-末端側(cè)的核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物可在本發(fā)明的方法中用于核酸鏈的延伸，可利用內(nèi)切核酸酶對(duì)其進(jìn)行切割，并且其可用來(lái)實(shí)現(xiàn)鏈置換反應(yīng)。
正如此處所用的，3′-末端側(cè)指從核酸，如引物的中心到核酸的3′-末端的部分。同樣的，5′-末端側(cè)指從核酸的中心到核酸的5′-末端的部分。
正如此處所用的，內(nèi)切核酸酶可為任何作用于從嵌合寡核苷酸引物開(kāi)始延伸DNA而生成的雙鏈DNA并在含有核糖核苷酸的引物部分對(duì)其進(jìn)行特異性切割的內(nèi)切核酸酶，此處的嵌合寡核苷酸引物是已退火到作為模板的核酸上的嵌合寡核苷酸引物。
正如此處所用的，DNA聚合酶指可利用DNA鏈作模板從頭合成DNA鏈的酶。DNA聚合酶包括天然DNA聚合酶和具有上述活性的變體酶。例如，這樣的酶包括具有鏈置換活性的DNA聚合酶、缺乏5′→3′核酸外切酶活性的DNA聚合酶、及具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性或內(nèi)切核酸酶活性的DNA聚合酶。
正如此處所用的，“鏈置換活性”指可實(shí)現(xiàn)鏈置換的活性，也即，其可在作為模板的核酸序列基礎(chǔ)上開(kāi)始DNA復(fù)制并置換DNA鏈以釋放退火到模板鏈上的互補(bǔ)鏈。此外，由于鏈置換作用而從作為模板的核酸中釋放出的DNA鏈在此處可稱為“置換后的鏈”。
在下文中，對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)的描述。
(1)用于本發(fā)明中的嵌合寡核苷酸引物本發(fā)明的方法中選用的引物是嵌合寡核苷酸引物，此引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物的至少一個(gè)。這樣的引物也包括寡核苷酸引物，此引物具有未修飾的核糖核苷酸和/或修飾的核糖核苷酸。
本發(fā)明的方法中選用的嵌合寡核苷酸引物是具有與作為模板的核酸的部分核苷酸序列基本互補(bǔ)的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。其有助于在選用的條件下延伸DNA鏈。此外，核糖核苷酸定位于嵌合寡核苷酸引物的3′-末端或3′-末端側(cè)。一般將引物設(shè)計(jì)為可與待擴(kuò)增區(qū)域的上游部分相互補(bǔ)，也即相應(yīng)于作為模板的核酸中待擴(kuò)增區(qū)域的核苷酸序列的3′部分。正如此處所用的，“基本互補(bǔ)的核苷酸序列”只在所用的反應(yīng)條件下，可與模板DNA退火的核苷酸序列。
本發(fā)明中的方法中所用的嵌合寡核苷酸引物可含有一或多個(gè)修飾的核糖核苷酸。正如此處所用的，核糖核苷酸可為定位于嵌合寡核苷酸引物的3′-末端或3′-末端側(cè)的未修飾的核糖核苷酸和/或修飾的核糖核苷酸，其可為內(nèi)切核酸酶所識(shí)別或切割。此核糖核苷酸包括上述未修飾的核糖核苷酸和修飾的核糖核苷酸。只要其不使引物的功能喪失，未修飾的核糖核苷酸、修飾的核糖核苷酸、或其結(jié)合可用作本發(fā)明中的嵌合寡核苷酸引物。修飾的核糖核苷酸的示例包括，但并不局限于結(jié)合到磷酸基團(tuán)上的氧原子為硫原子所替代的(α-S)核糖核苷酸、以及核糖第2位的羥基為甲氧基所替代的核糖核苷酸。這些含有修飾的核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物可利用如(α-S)核糖核苷三磷酸或2-OMe-RNA-CE亞磷酰胺試劑(Glen Research)來(lái)制備，而(α-S)核糖核苷三磷酸可利用美國(guó)專(zhuān)利NO.5,003,097中描述的通過(guò)硫化反應(yīng)試劑(Glen Research)進(jìn)行的方法來(lái)制備。
本發(fā)明的擴(kuò)增方法中選用的嵌合寡核苷酸引物可設(shè)計(jì)為含有修飾的核糖核苷酸，而此核糖核苷酸可給予其對(duì)內(nèi)切核酸酶切割的抗性。這樣的引物是有用的，因?yàn)槲覀冊(cè)跀U(kuò)增反應(yīng)步驟中可通過(guò)內(nèi)切核酸酶控制切割位點(diǎn)。
在本發(fā)明的方法中可選用一或兩種嵌合寡核苷酸引物，這要依賴于所需的擴(kuò)增后DNA片段的形式(單鏈或雙鏈)。特別的，當(dāng)所需的為單鏈DNA時(shí)，選用一種嵌合寡核苷酸引物，而當(dāng)所需的為雙鏈DNA時(shí)，就要選用兩種引物。
對(duì)本發(fā)明的方法中選用的嵌合寡核苷酸引物的長(zhǎng)度沒(méi)有特別的限制，但其優(yōu)選的為約12-100個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的為約15-40個(gè)核苷酸，對(duì)此沒(méi)有任何限制。優(yōu)選的，嵌合寡核苷酸的核苷酸序列與作為模板的核酸基本互補(bǔ)，這樣其在選用的反應(yīng)條件下就可與作為模板的核酸退火。在引物的3′-末端或3′-末端側(cè)含有可為內(nèi)切核酸酶所識(shí)別的序列，而內(nèi)切核酸酶在下文描述的步驟中有應(yīng)用。
例如，雖然沒(méi)有限制本發(fā)明的意圖，但具有下列通式所表示的結(jié)構(gòu)的寡核苷酸可在本發(fā)明的DNA合成方法中用作引物通式5′-dNa-Nb-dNc-3′(a等于或大于11的整數(shù)；b等于或大于1的整數(shù)；c0或等于或大于1的整數(shù)；dN脫氧核糖核苷酸和/或核苷酸類(lèi)似物；N未修飾的核糖核苷酸和/或修飾的核糖核苷酸，其中dNa中的一些dNs可為Ns所替換，并且可對(duì)3′末端的核苷酸進(jìn)行修飾，這樣不會(huì)發(fā)生通過(guò)DNA聚合酶的作用而進(jìn)行的從3′末端開(kāi)始的延伸)。
例如，通式所表示的嵌合寡核苷酸引物可優(yōu)選的用于本發(fā)明中，其中通式中的a＝等于或大于11的整數(shù)、b＝1且c＝0、b＝2且c＝0、b＝3-5且c＝0、或b＝2且c＝0-5。本發(fā)明中的方法中選用的嵌合寡核苷酸引物的3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸的長(zhǎng)度優(yōu)選為1-15聚體，更優(yōu)選的為1-10聚體，最優(yōu)選的為1-5聚體。對(duì)通式中C的值沒(méi)有特別限制，在本發(fā)明的方法中可選用任何值。一般來(lái)講，優(yōu)選5或更小的值。在反應(yīng)中，C的值選2而不是4、2而不是3、選1而不是2時(shí)獲得了較好的結(jié)果。特別的，在c＝0的情況下的反應(yīng)最有效。
本發(fā)明中選用的嵌合寡核苷酸引物具有一種結(jié)構(gòu)，而在此結(jié)構(gòu)中，內(nèi)切核酸酶可在含有核糖核苷酸的位點(diǎn)處識(shí)別或切割利用DNA聚合酶從引物開(kāi)始延伸的DNA鏈(引物延伸鏈)，而此核糖核苷酸定位于嵌合寡核苷酸引物的3′末端或3′末端側(cè)。雖然沒(méi)有限制本發(fā)明的意圖，但例如，當(dāng)RNA酶H作用于從通式所表示的、已與作為模板的核酸退火的嵌合寡核苷酸引物開(kāi)始延伸形成的雙鏈DNA時(shí)，可在核糖核苷酸部分對(duì)嵌合寡核苷酸引物進(jìn)行切割。隨后，產(chǎn)生了在寡核苷酸引物和通過(guò)延伸合成的DNA鏈間導(dǎo)入了切口的雙鏈DNA。然后，利用DNA聚合酶從切口位點(diǎn)開(kāi)始進(jìn)行鏈置換反應(yīng)。因此，任何可用于從引物的3′末端開(kāi)始延伸核酸鏈的嵌合寡核苷酸引物、可利用內(nèi)切核酸酶進(jìn)行切割的嵌合寡核苷酸引物、以及DNA聚合酶利用其可實(shí)現(xiàn)鏈置換反應(yīng)的嵌合寡核苷酸引物可用于本發(fā)明的方法中。此外，本發(fā)明的嵌合寡核苷酸引物包括一嵌合寡核苷酸引物，對(duì)其3′末端進(jìn)行了修飾這樣就可避免利用DNA聚合酶的作用進(jìn)行DNA延伸，但利用內(nèi)切核酸酶對(duì)其切割后就可立即從3′末端進(jìn)行DNA延伸。
此外，用于RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列可包含在嵌合寡核苷酸引物的5′末端側(cè)。這些RNA聚合酶的示例為T(mén)7 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
此外，本發(fā)明的方法中選用的嵌合寡核苷酸引物可含有核苷酸類(lèi)似物和其他物質(zhì)。說(shuō)的更精確一些，只要引物實(shí)現(xiàn)通過(guò)DNA聚合酶的作用而從3′末端開(kāi)始的聚合延伸反應(yīng)的功能不喪失，本發(fā)明的一或多種嵌合寡核苷酸引物中就可包含一或多種核苷酸類(lèi)似物。核苷酸類(lèi)似物的多種類(lèi)型可結(jié)合使用。核苷酸類(lèi)似物的示例包括，但并不局限于脫氧肌苷核苷酸、脫氧尿嘧啶核苷酸、具有修飾堿基如7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤的核苷酸類(lèi)似物、具有核糖衍生物的核苷酸類(lèi)似物等。此外，只要它們保留上述功能，本發(fā)明中選用的嵌合寡核苷酸引物可含有脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或具有多種修飾如添加已標(biāo)記的化合物的核苷酸類(lèi)似物。
在引物中摻入核苷酸類(lèi)似物可有效的抑制引物高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成并可有效抑制其與模板形成的退火結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定化。為了同樣的目的，可將核糖核苷酸摻入引物中。雖然沒(méi)有對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制的意圖，但可優(yōu)選選用修飾的核糖核苷酸如(α-S)核糖核苷酸來(lái)防止引物為非特異性內(nèi)切核酸酶所消化(RNA酶)。
按照亞磷酰胺法，利用如Applied Biosystems Inc.(ABI)的394型DNA合成儀就可合成含有所需核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。另外，包括磷酸三酯法、H-磷酸酯法和硫代膦酸酯法在內(nèi)的任何方法都可用于合成嵌合寡核苷酸引物。
(2)本發(fā)明中應(yīng)用的內(nèi)切核酸酶任何能夠作用于從上文(1)中描述的嵌合寡核苷酸引物開(kāi)始的、通過(guò)DNA延伸作用產(chǎn)生的雙鏈DNA并切割延伸鏈以實(shí)現(xiàn)鏈置換反應(yīng)的內(nèi)切核酸酶都可選用在本發(fā)明之中，而嵌合寡核苷酸引物是已與作為模板的核酸退火的。說(shuō)的更精確些，內(nèi)切核酸酶是在雙鏈DNA的嵌合寡核苷酸引物部分中產(chǎn)生切口的酶?？捎糜诒景l(fā)明中的內(nèi)切核酸酶的示例包括，但并不局限于核糖核酸酶。在核糖核酸酶中，優(yōu)選的選用可作用于由DNA和RNA組成的雙鏈核酸的RNA部分的內(nèi)切核糖核酸酶H(RNA酶H)。包括嗜中溫和抗熱核酸酶在內(nèi)的、具有上述活性的內(nèi)切核酸酶可優(yōu)選的應(yīng)用于本發(fā)明之中。例如，源自大腸桿菌的RNA酶H可用于本發(fā)明的方法中在約50-70℃下進(jìn)行的反應(yīng)中，而此反應(yīng)在下文實(shí)施例中有所描述。優(yōu)選用于本發(fā)明中的抗熱核酸酶的實(shí)例包括，但并不局限于商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的核糖核酸酶、HybridaseTM耐熱RNA酶H(Epicenter Technologies)及源自芽胞桿菌屬嗜熱細(xì)菌的、源自棲熱菌屬細(xì)菌的、源自火球菌屬細(xì)菌的、源自棲熱袍菌屬細(xì)菌的、源自古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H等。此外，天然內(nèi)切核酸酶及變體內(nèi)切核酸酶都是優(yōu)先選用的。按照參考實(shí)施例中所描述的酶單位測(cè)定法，此處的RNA酶H的酶單位為表達(dá)值。
只要可用于本發(fā)明的方法中，RNA酶H并不局限于特定的RNA酶H。例如，RNA酶H可為來(lái)源于多種病毒、噬菌體、原核或真核生物的RNA酶H。RNA酶H可為細(xì)胞RNA酶H或病毒RNA酶H。細(xì)胞RNA酶H的示例為大腸桿菌RNA酶HI，而病毒RNA酶H的示例為HIV-1。I型、II型或III型RNA酶H可選用在本發(fā)明的方法中。例如，優(yōu)選選用源自大腸桿菌的RNA酶HI、或源自火球菌屬細(xì)菌或古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶HH，對(duì)此沒(méi)有任何限制。
利用本發(fā)明的方法中選用的RNA酶H進(jìn)行的切割反應(yīng)的效率依引物3′末端附近的核苷酸序列不同而變動(dòng)，并可影響所需DNA的擴(kuò)增效率。因此，為所選用的RNA酶H設(shè)計(jì)最佳的引物是很自然的事情。
正如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入切口”或“切口”指對(duì)雙鏈核酸的兩條鏈中的一條進(jìn)行內(nèi)部切割。例如，RNA酶H作用于由DNA和含有核糖核苷酸的DNA組成的雜交雙鏈核酸，從而在兩鏈中的核糖核苷酸部分選擇性切割含有核糖核苷酸的鏈，這樣就在雜交雙鏈核酸中導(dǎo)入了一個(gè)切口。
(3)本發(fā)明中的DNA聚合酶具有可作用于DNA的鏈置換活性的DNA聚合酶可用于本發(fā)明中。特別的，優(yōu)選基本缺乏5′→3′內(nèi)切核酸酶活性的DNA聚合酶。
正如此處所用的，“鏈置換活性”指可實(shí)現(xiàn)鏈置換的活性，說(shuō)的更確切些，其可在作為模板的核酸序列基礎(chǔ)上進(jìn)行DNA復(fù)制并置換DNA鏈以釋放退火到模板鏈上的互補(bǔ)鏈。此外，由于鏈置換作用而從作為模板的核酸中釋放出的DNA鏈在此處稱為“置換后的鏈”。
任何具有鏈置換活性的DNA聚合酶可用于本發(fā)明中。其示例包括源自芽胞桿菌屬嗜熱細(xì)菌如熱堅(jiān)芽孢桿菌(下文稱為B.ca)和嗜熱脂肪芽胞桿菌(下文稱為B.st)并缺乏5′→3′內(nèi)切核酸酶活性的DNA聚合酶變體、以及大腸桿菌DNA聚合酶I的大片段(克列諾片段)。本發(fā)明優(yōu)選的選用嗜中溫和抗熱DNA聚合酶。
B.ca為嗜熱細(xì)菌，其最佳生長(zhǎng)溫度約為70℃。已知源自此細(xì)菌的Bca DNA聚合酶具有DNA依賴型DNA聚合酶活性、RNA依賴型聚合酶活性(逆轉(zhuǎn)錄活性)、5′→3′外切核酸酶活性和3′→5′外切核酸酶活性。此酶可為從其最初來(lái)源純化的酶或可為利用遺傳工程技術(shù)制備得到的重組體蛋白。可利用遺傳工程技術(shù)或其他方法對(duì)此酶進(jìn)行修飾，如取代、缺失、添加或插入。這些酶的示例包括BcaBEST DNA聚合酶(TakaraShuzo)，而此酶為缺乏5′→3′外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶。
已知某些DNA聚合酶在特定條件下具有內(nèi)切核酸酶活性，如RNA酶H活性。這樣的DNA聚合酶可用于本發(fā)明的方法中。在一個(gè)方面中，可在允許RNA酶H活性表達(dá)的條件，如Mn2+存在的條件下選用DNA聚合酶。在這種情況下，可在不添加RNA酶H的情況下實(shí)施本發(fā)明的方法。本發(fā)明的發(fā)明者們第一次證明了Bca DNA聚合酶可在含有Mn2+的緩沖液中展示RNA酶活性，并且證明可在不含有除Bca DNA聚合酶以外的任何酶的反應(yīng)混合物中實(shí)施本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法。上述提及的方法不限于Bca DNA聚合酶的應(yīng)用。已知具有RNA酶H活性的DNA聚合酶，如源自嗜熱棲熱菌的Tth DNA聚合酶可用于本發(fā)明中。
(4)本發(fā)明中選用的緩沖溶液的組成本發(fā)明中選用的是含有緩沖成分、鎂鹽或另一種金屬鹽、及dNTP的反應(yīng)緩沖液?？上攵?，需要根據(jù)對(duì)選用的金屬的要求和對(duì)選用的酶的要求來(lái)優(yōu)化鹽的類(lèi)型和濃度。優(yōu)選選用的緩沖成分的示例包括，但并不局限于N-二[羥乙基]甘氨酸、Tricine、HEPES、tris及磷酸鹽(如磷酸鈉和磷酸鉀)。在這些緩沖成分中，本發(fā)明優(yōu)選的選用含有N-二[羥乙基]甘氨酸、Tricine、HEPES、tris及磷酸鹽作緩沖成分的緩沖液。雖然沒(méi)有對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制的意圖，但如，當(dāng)反應(yīng)溫度較高時(shí)，優(yōu)先選用溫度變化可導(dǎo)致很小的pH變化的N-二[羥乙基]甘氨酸緩沖液。依賴于選用的RNA酶H的類(lèi)型，優(yōu)先的選用HEPES緩沖液。因此，要根據(jù)選用的反應(yīng)溫度、內(nèi)切核酸酶或DNA聚合酶等來(lái)選擇最佳的緩沖液。緩沖成分的最終濃度為5-100mM，優(yōu)選20-50mM。pH為6.0-9.5，優(yōu)選7.0-9.2。例如，優(yōu)先選用pH7.5-9.2、含有22-46mMTricine的緩沖液或pH7.0-8.0、含有25-50mM磷酸鉀的緩沖液。優(yōu)先選用的鎂鹽的示例包括，但并不局限于氯化鎂、醋酸鎂或硫酸鎂。鎂鹽的終濃度為1-20mM，優(yōu)選2-10mM。作為DNA延伸反應(yīng)底物的混合物中dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物)的終濃度為0.1-3.0mM，優(yōu)選0.2-1.2mM。50μl反應(yīng)溶液中選用的引物的量為1-1000pmol，優(yōu)選10-150pmol。此外，例如為了穩(wěn)定擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)混合物中可含有添加劑?；旌衔镏锌商砑咏K濃度為≤0.1％的牛血清白蛋白、終濃度為≤10％的二甲亞砜(DMSO)、終濃度為≤4 mM的二鹽酸腐胺或終濃度為≤0.01％的丙二胺。此外，反應(yīng)混合物中也可含有NMP(1-甲基-2-吡咯酮)、甘油、聚乙二醇、二甲亞砜和/或甲酰胺。我們預(yù)期這些有機(jī)溶劑的添加將會(huì)減少寡核苷酸引物的非特異性退火。
可通過(guò)添加抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)如乙膦甲酸(PFA)來(lái)施行本發(fā)明中的方法。如果添加了可抑制逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)，就可減少除靶核酸之外的非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。
在另一方面中，在擴(kuò)增反應(yīng)前，作為模板的核酸與本發(fā)明選用的嵌合寡核苷酸引物的退火可在本發(fā)明的檢測(cè)、擴(kuò)增或制備方法中有效的減少寡核苷酸引物的非特異性退火。優(yōu)選利用含有可促進(jìn)退火的物質(zhì)如多胺(如精胺或亞精胺)或丙二胺的退火溶液來(lái)進(jìn)行退火。優(yōu)選的，含有多胺的退火溶液也含有鹽。例如，退火溶液可含有氯化鈉、氯化鉀、醋酸鉀、醋酸鈉等及多胺，而沒(méi)有任何限制。
一般通過(guò)在雙鏈核酸變性溫度(如90℃或更高溫度)下孵育含有引物和作為模板的核酸的退火溶液，然后將退火溶液冷卻到本發(fā)明的方法中的反應(yīng)溫度或更低溫度下來(lái)進(jìn)行退火。
退火后，通過(guò)向反應(yīng)混合物中進(jìn)一步添加其他必需組分，如DNA聚合酶、RNA酶H及dNTP來(lái)起始本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。
在50μl反應(yīng)體積中，作為內(nèi)切核酸酶范例的、源自大腸桿菌的RNA酶H的含量?jī)?yōu)選為3-200U，更優(yōu)選為15-60U。類(lèi)似的，在50μl反應(yīng)混合物中，作為內(nèi)切核酸酶范例的、源自火球菌屬細(xì)菌或源自古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H的含量?jī)?yōu)選為3-200U，更優(yōu)選為4-40U。在50μl反應(yīng)混合物中，作為DNA聚合酶范例的BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)的含量?jī)?yōu)選為0.5-100U，更優(yōu)選為1-22U。
當(dāng)內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶組合用于本發(fā)明的方法中時(shí)，如，優(yōu)先選用的是源自大腸桿菌的RNA酶H、源自火球菌屬細(xì)菌的RNA酶H、或源自古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H與BcaBEST DNA聚合酶的組合，而沒(méi)有任何限制。我們認(rèn)為，內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶的優(yōu)選單位可依酶的類(lèi)型而變化。在這樣的情況下，可以檢測(cè)靈敏度或擴(kuò)增產(chǎn)物量的提高為指標(biāo)對(duì)添加的酶量和選用的緩沖溶液的組成進(jìn)行調(diào)節(jié)。在任一情況下，很自然的要依賴選用的酶的類(lèi)型來(lái)對(duì)反應(yīng)緩沖溶液的組成等進(jìn)行優(yōu)化。
(5)本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法通過(guò)利用上文(1)中所述的至少一種寡核苷酸引物結(jié)合上文(2)中所述的內(nèi)切核酸酶和上文(3)中所述的DNA聚合酶來(lái)實(shí)施本發(fā)明中的方法。另外，在上述允許RNA酶H活性表達(dá)的條件下可選用具有RNA酶H活性的DNA聚合酶。
用于PCR等的dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物)可優(yōu)選的用作核苷三磷酸底物，而這些核苷三磷酸在本發(fā)明的方法中的延伸反應(yīng)中可作為底物。只要其可作為選用的DNA聚合酶的底物，dNTP就可含有dNTP(脫氧核糖核苷三磷酸)類(lèi)似物如7-脫氮-dGTP、dITP的三磷酸鹽等。也可選用dNTP或dNTP類(lèi)似物的衍生物。也可含有具有功能基團(tuán)的衍生物，如具有氨基的dUTP。嵌合寡核苷酸引物也可用于本方法中。按照傳統(tǒng)的合成方法，可利用如DNA合成儀來(lái)制備引物。嵌合寡核苷酸引物與正常寡核苷酸引物可結(jié)合用于本發(fā)明的方法中。
如果選用的酶的活性在反應(yīng)過(guò)程中可能降低，那就要在本發(fā)明的方法中的反應(yīng)過(guò)程中進(jìn)一步添加酶。雖然沒(méi)有對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制的意圖，但如，在選用了RNA酶H的反應(yīng)中可進(jìn)一步添加源自大腸桿菌的RNA酶H。添加的酶可與反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的反應(yīng)混合物中含有的酶相同，或其可為展示相同活性的不同的酶。因此，只要反應(yīng)過(guò)程中酶的添加提供了效用，如提高了檢測(cè)靈敏度或增加了擴(kuò)增產(chǎn)物量，待添加的酶的類(lèi)型和性質(zhì)并非是特定的。
可從含有作為模板的核酸的任何樣品中制備或分離可用作本發(fā)明中的模板的核酸(DNA或RNA)。另外，按照本發(fā)明，樣品可直接用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)中。含有核酸的樣品的示例包括，但并不局限于取自生物體的樣品如全血、血清、血塊黃層、尿、糞便、腦脊液、精液、唾液、組織(如癌組織或淋巴結(jié))及細(xì)胞培養(yǎng)物(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物)、含有核酸如類(lèi)病毒、病毒、細(xì)菌、真菌、酵母菌、植物和動(dòng)物的樣品、懷疑被污染或已感染有微生物如病毒或細(xì)菌(如食品或生物制劑)的樣品、以及含有有機(jī)體如土壤和廢水的樣品。樣品可為含有核酸的制劑，而此制劑是按照已知的方法對(duì)上述樣品進(jìn)行加工制得的?？捎糜诒景l(fā)明的制劑的示例包括細(xì)胞破壞產(chǎn)物或通過(guò)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)分離得到的樣品、樣品中的核酸、或?qū)ζ渲械奶禺愋院怂岱肿尤鏼RNA進(jìn)行了富集的樣品。此外，優(yōu)先選用核酸，如利用已知方法、對(duì)樣品中含有的核酸進(jìn)行擴(kuò)增而得到的DNA或RNA。
通過(guò)如利用去污劑溶解、超聲、利用玻璃珠振蕩或攪拌、或弗氏壓碎器來(lái)處理上述的物質(zhì)，從而制備含有核酸的制劑，對(duì)此沒(méi)有任何限制。在某些情況下，對(duì)制劑進(jìn)行進(jìn)一步加工以對(duì)核酸進(jìn)行純化是有利的(如在內(nèi)源核酸酶存在的情況下)。在這樣的情況下，核酸是通過(guò)已知的方法如苯酚提取、色譜法、離子交換法、凝膠電泳法或密度梯度離心法進(jìn)行純化的。
當(dāng)需要對(duì)含有源自RNA的序列的核酸進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，可利用cDNA作模板來(lái)實(shí)施本發(fā)明中的方法，而此cDNA是以RNA為模板、通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的。任何可使引物用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的RNA都可用于本發(fā)明的方法中，這樣的RNA包括樣品中的總RNA、RNA分子如mRNA、tRNA和rRNA及特異性RNA分子。
在選用的反應(yīng)條件下，任何可退火到模板RNA上的引物可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。此引物可為含有與作為模板的特異性RNA互補(bǔ)的核苷酸序列的引物(特異性引物)、寡-dT(脫氧胸腺嘧啶)引物、以及具有隨機(jī)序列的引物(隨機(jī)引物)。鑒于特異性退火，用于逆轉(zhuǎn)錄的引物的長(zhǎng)度優(yōu)選為6個(gè)核苷酸或更多，更優(yōu)選為9個(gè)核苷酸或更多?？紤]到寡核苷酸合成，優(yōu)選的引物長(zhǎng)度為100個(gè)核苷酸或少于100個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為30個(gè)核苷酸或少于30個(gè)核苷酸。嵌合寡核苷酸引物可用作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的引物。嵌合寡核苷酸引物也可用作本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法中的鏈置換反應(yīng)引物，而此核酸擴(kuò)增方法是以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得的cDNA為模板進(jìn)行的。這樣的引物可為具有上文(1)中所描述的特性并可用于利用RNA進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的任何引物。
任何具有以RNA為模板合成cDNA的活性的酶都可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中。其示例包括源自多種來(lái)源的逆轉(zhuǎn)錄酶，如源自禽類(lèi)成髓細(xì)胞瘤病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV RTase)、源自Molony鼠白血病病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV RTase)及Rous-伴隨病毒2逆轉(zhuǎn)錄酶(RAV-2RTase)。此外，也可選用具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶。本發(fā)明優(yōu)選在高溫下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的酶，如源自棲熱菌屬細(xì)菌的DNA聚合酶(如Tth DNA聚合酶)及源自芽胞桿菌屬嗜熱細(xì)菌的DNA聚合酶。例如，雖然沒(méi)有限制本發(fā)明的意圖，但優(yōu)選源自芽胞桿菌屬嗜熱細(xì)菌的DNA聚合酶如源自B.st的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)及Bca DNA聚合酶。例如，Bca DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)不要求錳離子。此外，在高溫條件下，在抑制模板RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)形成的同時(shí)可以合成cDNA。只要它們具有活性，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的天然酶和變體酶都可選用。
在另一方面，在含有待擴(kuò)增的核苷酸序列的DNA或RNA復(fù)制完成后，復(fù)制產(chǎn)物可用作本發(fā)明的方法中的作為模板的核酸。復(fù)制方法的示例包括，但并不局限于一方法，此方法包括利用載體對(duì)適當(dāng)?shù)乃拗鬟M(jìn)行轉(zhuǎn)化，而此載體中已經(jīng)插入了含有待擴(kuò)增的核苷酸序列的核酸片段，培養(yǎng)生成的轉(zhuǎn)化體、從中提取載體并對(duì)其進(jìn)行利用，而此載體中已經(jīng)插入了含有待擴(kuò)增的核苷酸序列的核酸片段?？蛇x用任何可在宿主中穩(wěn)定復(fù)制的載體。例如，優(yōu)選pUC系列載體、pBluescript系列載體、pGEM系列載體、粘粒載體及噬菌體載體?？蛇x用任何能供養(yǎng)所選用的質(zhì)粒的載體。例如，極易培養(yǎng)的大腸桿菌就是一范例。
在復(fù)制方法的另一方面中，在利用RNA聚合酶和含有作為模板的核苷酸序列的核酸片段對(duì)含有待擴(kuò)增核苷酸片段的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后，此RNA可直接用作本發(fā)明的方法中的模板或在通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將其轉(zhuǎn)化為cDNA后用作本發(fā)明的方法中的模板。只要其含有RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列，含有待擴(kuò)增核苷酸序列的核酸片段并不局限于特定的核酸片段。可將其插入到具有RNA聚合酶啟動(dòng)子序列的載體中，可將其與連接物或在其末端含有RNA聚合酶啟動(dòng)子序列的盒相連，或利用含有RNA聚合酶啟動(dòng)子序列的引物和適當(dāng)?shù)哪０鍖?duì)其進(jìn)行酶促合成。因此，利用含有如上所述定位的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列，可以RNA形式、對(duì)含有待擴(kuò)增核苷酸序列的核酸片段進(jìn)行復(fù)制或擴(kuò)增。可選用含有RNA聚合酶啟動(dòng)子序列的任何載體。例如，優(yōu)選pUC系列載體、pBluescript系列載體、pGEM系列載體、粘粒型載體及噬菌體型載體。優(yōu)選以環(huán)形形式或線性化后的形式存在的載體。任何RNA聚合酶可用于復(fù)制或擴(kuò)增方法中。例如，優(yōu)選SP6 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶等。
在本發(fā)明中，雙鏈DNA如上述分離的基因組DNA或PCR片段及單鏈DNA如利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)從總RNA或mRNA開(kāi)始制備得到的cDNA可優(yōu)選用作模板DNA。優(yōu)選已變性為單鏈DNA的或沒(méi)有進(jìn)行這樣的變性的雙鏈DNA作模板。
如果利用線性雙鏈DNA如PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作模板，本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法中的變性步驟就可省略。通過(guò)將本發(fā)明的方法中所選用引物的退火位點(diǎn)定位在DNA末端以內(nèi)約50個(gè)堿基，這樣就可省掉變性步驟。如果對(duì)具有源自RNA的序列的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，可通過(guò)向本發(fā)明的、含有RNA酶H的擴(kuò)增反應(yīng)混合物中添加RNA-cDNA雙鏈核酸來(lái)起始此擴(kuò)增反應(yīng)，而此RNA-cDNA雙鏈核酸是以RNA為模板、通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來(lái)獲得的，而擴(kuò)增反應(yīng)混合物中的RNA酶H是用來(lái)消化RNA鏈并將核酸鏈轉(zhuǎn)化為單鏈cDNA的。此外，在本發(fā)明的DNA合成方法中，可利用一種DNA聚合酶實(shí)施以RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和以通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的cDNA為模板而進(jìn)行的DNA擴(kuò)增反應(yīng)。這樣的DNA聚合酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性和鏈置換活性。
由于存在整個(gè)靶序列或至少在核酸片段中存在足夠長(zhǎng)的靶序列部分，所以模板的合適長(zhǎng)度就是可為引物序列提供充分結(jié)合的長(zhǎng)度。
如果作為模板的DNA是雙鏈核酸，則可將此DNA變性為單鏈DNA以使引物結(jié)合到在本發(fā)明的方法中的模板DNA鏈上，對(duì)此沒(méi)有任何限制。對(duì)于變性來(lái)講，優(yōu)選在變性溫度下(如約95℃)來(lái)孵育雙鏈DNA。其他變性方法包括利用升高的pH來(lái)進(jìn)行變性的方法。在這種情況下，為了使寡核苷酸引物與靶核酸結(jié)合，所以在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)就要將pH降低。將雙鏈DNA變性為單鏈DNA后，或如以RNA作為模板、通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA(單鏈DNA)后，在等溫條件下就可對(duì)核酸進(jìn)行連續(xù)擴(kuò)增。
“連續(xù)”指在反應(yīng)溫度沒(méi)有任何變化或反應(yīng)混合物的組成沒(méi)有任何變化的情況下進(jìn)行反應(yīng)。正如此處所用的，“等溫”指溫度基本不變的反應(yīng)條件，這樣酶和核酸鏈就能在每步中發(fā)揮其作用。
可在正常溫度(如37℃)下，利用嗜中溫DNA聚合酶如克列諾片段來(lái)施行本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。也可在高溫(如，50℃或更高溫度，或60℃或更高溫度)下，利用抗熱的酶類(lèi)(如內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶)來(lái)進(jìn)行。在這樣的情況下，引物的非特異性退火受到抑制，從而造成DNA擴(kuò)增的特異性提高。此外，解決了利用DNA作模板來(lái)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的問(wèn)題，從而提高了DNA聚合酶的延伸能力。在此方法中可連續(xù)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和核酸擴(kuò)增。在這種情況下，將逆轉(zhuǎn)錄酶與上述反應(yīng)結(jié)合或利用具有逆轉(zhuǎn)錄活性的DNA聚合酶來(lái)對(duì)具有衍生自RNA的序列的DNA進(jìn)行擴(kuò)增。
在本發(fā)明的每個(gè)方面中，雖然沒(méi)有限制本發(fā)明的意圖，但優(yōu)選的，與作為模板的單鏈DNA互補(bǔ)的嵌合寡核苷酸引物首先退火到DNA上。隨后，在DNA聚合酶作用下，與模板DNA互補(bǔ)的DNA(引物延伸鏈)從引物的3′末端沿模板DNA剩余的序列進(jìn)行延伸來(lái)合成雙鏈DNA。內(nèi)切核酸酶作用于雙鏈DNA并從頭開(kāi)始從引物延伸鏈的引物部分重新延伸DNA。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，雖然本發(fā)明沒(méi)有受理論的限制，但內(nèi)切核酸酶作為切口酶來(lái)進(jìn)行作用，而此切口酶可在雙鏈DNA中導(dǎo)入切口或可改變由嵌合寡核苷酸引物和模板DNA組成的雙鏈DNA的結(jié)構(gòu)。具有鏈置換活性的DNA聚合酶從雙鏈DNA中導(dǎo)入的切口的3′端開(kāi)始重新延伸DNA鏈，這樣就在從切口的3′端開(kāi)始釋放下游DNA的同時(shí)生成了新的引物延伸鏈。因此，新生成的引物延伸鏈替代了以前合成的引物延伸鏈。
可利用兩種引物，也即一個(gè)與作為模板的核酸互補(bǔ)的嵌合寡核苷酸引物及另一個(gè)與置換后的鏈互補(bǔ)的嵌合寡核苷酸引物來(lái)施行本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法。在這種情況下，一種引物結(jié)合到模板DNA鏈上以引起鏈置換反應(yīng)，而另一種引物結(jié)合到鏈置換反應(yīng)釋放出的置換后的鏈上以起始另一個(gè)鏈置換反應(yīng)。非常明白，如果選用了本發(fā)明的這一方面，含有一種引物的反應(yīng)產(chǎn)物可用作另一引物的模板。因此，隨著模板數(shù)量的增加，擴(kuò)增產(chǎn)物的量以非線性方式增加。
當(dāng)以雙鏈DNA為模板、利用分別退火到兩條鏈上的嵌合寡核苷酸引物來(lái)施行本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法時(shí)，這兩條鏈都可作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板。如果反應(yīng)是在雙鏈DNA變性后起始的，那就要在雙鏈DNA變性前或后將嵌合寡核苷酸引物、四種脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、DNA聚合酶和內(nèi)切核酸酶添加到反應(yīng)混合物中。如果利用熱處理來(lái)使雙鏈DNA變性且沒(méi)有應(yīng)用抗熱酶，那優(yōu)選在變性后向反應(yīng)混合物中添加此酶。
在本發(fā)明的以雙鏈DNA為模板且選用了兩種嵌合寡核苷酸引物的核酸擴(kuò)增方法中，雖然依賴于反應(yīng)條件等因素，但在從引物開(kāi)始的延伸反應(yīng)過(guò)程中，在模板延伸鏈中間物間可發(fā)生模板交換，這樣就可產(chǎn)生由合成的引物延伸鏈相互退火而組成的雙鏈核酸。在雙鏈核酸的兩端含有嵌合寡核苷酸引物。隨后，可從兩端重新起始包含有鏈置換作用的互補(bǔ)鏈延伸反應(yīng)。結(jié)果，產(chǎn)生了在一端具有引物序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，如果在反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生了模板交換，那就再一次產(chǎn)生了與上述雙鏈核酸相似的雙鏈核酸。
本發(fā)明提供了核酸擴(kuò)增方法，其包括利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶來(lái)實(shí)現(xiàn)模板交換反應(yīng)。在存在雙鏈核酸模板的模板交換反應(yīng)中，合成了兩個(gè)分別與兩條鏈的核苷酸序列基本互補(bǔ)的嵌合寡核苷酸引物、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、兩條與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈。在引物延伸鏈的合成過(guò)程中，發(fā)生了每條引物延伸鏈從模板到另一引物延伸鏈的模板交換。
正如此處所用的，模板交換反應(yīng)指一個(gè)反應(yīng)，其包括當(dāng)通過(guò)鏈置換反應(yīng)從雙鏈核酸的兩端合成互補(bǔ)鏈時(shí)，DNA聚合酶使模板進(jìn)行了交換，其后以另一新合成的互補(bǔ)鏈為模板、利用DNA聚合酶合成了互補(bǔ)鏈。換言之，模板交換反應(yīng)指一反應(yīng)，其包括利用引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶處理雙鏈核酸模板以產(chǎn)生與模板互補(bǔ)的延伸鏈，其中在延伸鏈合成過(guò)程中，合成了引物延伸鏈的DNA聚合酶主動(dòng)將原始模板與其他的引物延伸鏈進(jìn)行了交換。雖然沒(méi)有限制本發(fā)明的意圖，但如按照下文實(shí)施例32中所描述的方法就可確定實(shí)現(xiàn)模板交換反應(yīng)的DNA聚合酶的能力。
本發(fā)明優(yōu)選利用能夠在鏈置換反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)模板交換反應(yīng)的DNA聚合酶。例如，尤其優(yōu)選缺乏5′→3′外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶的變體酶。這樣的酶，如BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)可通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)得。按照日本專(zhuān)利NO.2978001中描述的方法，也可從含有這些酶的基因的大腸桿菌HB101/pU1205(FERM BP-3720)來(lái)制備這些酶。從1991年5月10日(原始保藏日期)始，大腸桿菌HB101/pU1205(FERM BP-3720)已經(jīng)保藏于國(guó)際專(zhuān)利生物保藏機(jī)構(gòu)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本。
雖然沒(méi)有限制本發(fā)明的意圖，但例如，我們認(rèn)為本發(fā)明中核酸擴(kuò)增方法的反應(yīng)方式如下所述。
在本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法中，在RNA酶H存在下，利用兩個(gè)分別與作為模板的核酸的兩條鏈的核苷酸序列互補(bǔ)的嵌合寡核苷酸引物及具有鏈置換活性的DNA聚合酶處理作為模板的雙鏈核酸，這樣就合成了與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈?？色@得由合成的引物延伸鏈相互退火而組成的雙鏈核酸及由模板相互退火而組成的雙鏈核酸，而作為模板交換反應(yīng)的結(jié)果，兩種引物是退火到模板上的。將后者的雙鏈核酸重新用作模板。
利用RNA酶H在含有核糖核苷酸的位點(diǎn)切割由相互退火的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸。利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，分別從雙鏈核酸引物部分的3′端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核酸進(jìn)行延伸以實(shí)現(xiàn)鏈置換?？色@得由引物延伸鏈相互退火而組成的雙鏈核酸及由模板相互退火而組成的雙鏈核酸，而作為模板交換反應(yīng)的結(jié)果，兩種引物是退火到模板上的。
如果沒(méi)有發(fā)生模板交換反應(yīng)，可獲得分別由模板和引物延伸鏈組成的兩種雙鏈核酸。
利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，分別從雙鏈核酸引物部分的3′端開(kāi)始對(duì)與模板互補(bǔ)的核酸進(jìn)行延伸以實(shí)現(xiàn)鏈置換作用，而此雙鏈核酸是與兩引物退火的。作為模板交換反應(yīng)的結(jié)果，可獲得由引物延伸鏈相互退火而組成的雙鏈核酸及由模板相互退火而組成的雙鏈核酸，而作為模板交換反應(yīng)的結(jié)果，兩種引物是退火到模板上的。將與兩引物退火的雙鏈核酸重新用作模板。
如果沒(méi)有發(fā)生模板交換反應(yīng)，可獲得分別由模板和引物延伸鏈組成的兩種雙鏈核酸。
利用RNA酶H在含有核糖核苷酸的位點(diǎn)切割這兩種雙鏈核酸。利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，分別從雙鏈核酸引物部分的3′端開(kāi)始對(duì)與模板互補(bǔ)的核酸進(jìn)行延伸以實(shí)現(xiàn)鏈置換。
在本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法中，在RNA酶H存在下，利用兩種分別與作為模板的核酸的兩條鏈的核苷酸序列互補(bǔ)的嵌合寡核苷酸引物及具有鏈置換活性的DNA聚合酶處理雙鏈核酸模板，這樣就合成了與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈。如果沒(méi)有發(fā)生模板交換反應(yīng)，可獲得分別由模板和引物延伸鏈組成的兩種雙鏈核酸。
在本發(fā)明的擴(kuò)增方法中，可在含有核糖核苷酸的位點(diǎn)對(duì)嵌合寡核苷酸引物延伸鏈進(jìn)行切割，這樣就從不含有核糖核苷酸的切割中產(chǎn)生了5′片段(引物部分)。因此，內(nèi)切核酸酶不再對(duì)從產(chǎn)生的引物部分開(kāi)始延伸的引物延伸鏈進(jìn)行切割。結(jié)果，生成了末端含有引物序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。
如上所述，在本發(fā)明的核酸擴(kuò)增中可產(chǎn)生不含引物序列的擴(kuò)增產(chǎn)物和在一或兩端含有引物序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。這些產(chǎn)物包括在本文的擴(kuò)增產(chǎn)物之內(nèi)。
圖33-36例示了本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的實(shí)施例。換言之，圖33-36例示了本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法中的典型的核酸擴(kuò)增。
圖33-36例示了典型的核酸擴(kuò)增，此核酸擴(kuò)增是在作為雙鏈核酸模板的DNA、在模板DNA核苷酸序列信息基礎(chǔ)上合成的一對(duì)嵌合寡核苷酸引物(圖中，嵌合寡核苷酸引物在它們的3′端具有3個(gè)核糖核苷酸；圖中的空心圓表示核糖核苷酸)、具有鏈置換活性的鏈置換型DNA合成酶(DNA聚合酶)、可在DNA-RNA雜交位點(diǎn)進(jìn)行切割的核糖核酸酶RNA酶H、以及摻入延伸鏈中的底物dNTP存在下進(jìn)行的。
如圖33中所展示的，在模板DNA核苷酸序列信息基礎(chǔ)上合成的一對(duì)嵌合寡核苷酸引物退火到模板DNA的特定部分。如步驟1所示，作為鏈置換反應(yīng)的結(jié)果，分別從兩個(gè)嵌合寡核苷酸引物的3′端開(kāi)始對(duì)DNA鏈進(jìn)行延伸。
其次，如圖34中所示，如步驟2所示，作為模板交換反應(yīng)的結(jié)果，從上游和下游開(kāi)始延伸的某些引物延伸鏈從最初的模板中釋放出來(lái)。這些引物延伸鏈在其3′部分相互退火。互補(bǔ)鏈從退火后的延伸鏈開(kāi)始延伸，從而形成由相互退火的引物延伸鏈組成的雙鏈DNA。此外，產(chǎn)生了由與上述嵌合寡核苷酸引物對(duì)退火的、由相互退火的置換后的鏈組成的雙鏈DNA。此雙鏈DNA在圖34中用作起始物質(zhì)。
如圖35中的步驟3所示，在雙鏈DNA的DNA-RNA雜交位點(diǎn)，利用RNA酶H作用僅對(duì)含有源自圖34中的雙鏈DNA的嵌合寡核苷酸引物的RNA的一條鏈進(jìn)行切割，從而在雙鏈DNA中導(dǎo)入切口，而此處的雙鏈DNA是由引物延伸鏈相互退火組成的。
隨后，從雙鏈DNA的切口開(kāi)始發(fā)生了鏈置換反應(yīng)，并如圖35的步驟4所示對(duì)DNA進(jìn)行延伸。其后，在某種程度上，或以圖35的步驟5所示的某一比率發(fā)生了與圖34的步驟2類(lèi)似的模板交換反應(yīng)，產(chǎn)生了由擴(kuò)增產(chǎn)物組成的雙鏈DNA，也即相互退火的引物延伸鏈。
此外，產(chǎn)生了由相互退火的置換后的鏈組成的雙鏈DNA，它與上述嵌合寡核苷酸引物對(duì)退火。
其次，如圖36所展示的，作為鏈置換反應(yīng)的結(jié)果，分別從圖35中雙鏈DNA的嵌合寡核苷酸引物的3′端開(kāi)始對(duì)DNA鏈進(jìn)行延伸，而圖35中的雙鏈DNA是由相互退火的置換后的鏈組成的，而置換后的鏈?zhǔn)桥c嵌合寡核苷酸引物對(duì)退火的。在某種程度上發(fā)生了與步驟2和步驟5中的模板交換反應(yīng)相類(lèi)似的模板交換反應(yīng)，產(chǎn)生了由相互退火的引物延伸鏈組成的雙鏈DNA。對(duì)此雙鏈DNA進(jìn)行圖35中的步驟3。反應(yīng)從步驟3重新開(kāi)始。產(chǎn)生了由相互退火的置換后的鏈組成的雙鏈DNA，并將此雙鏈DNA用作圖36的起始物質(zhì)，而此處的置換后的鏈?zhǔn)桥c嵌合寡核苷酸引物對(duì)退火的。結(jié)果，發(fā)生了可重復(fù)產(chǎn)生這些雙鏈核酸的鏈反應(yīng)，這樣就可特異性擴(kuò)增和制備與嵌合寡核苷酸引物對(duì)相結(jié)合的區(qū)域。
在本發(fā)明中的利用嵌合寡核苷酸進(jìn)行的核酸擴(kuò)增方法中產(chǎn)生了多聚體，而這些多聚體中的待擴(kuò)增區(qū)域是相互連接在一起的。多聚體具有一結(jié)構(gòu)，而此結(jié)構(gòu)中的多個(gè)待擴(kuò)增區(qū)域是在同一方向上進(jìn)行重復(fù)擴(kuò)增的。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析觀察到的多聚體是梯狀條帶。我們認(rèn)為，這些多聚體的產(chǎn)生是受待擴(kuò)增區(qū)域、待擴(kuò)增區(qū)域的大小、側(cè)翼區(qū)、選用的嵌合寡核苷酸引物的核苷酸序列、反應(yīng)條件等的影響。
上述多聚體含有多個(gè)待擴(kuò)增區(qū)域。例如，當(dāng)計(jì)劃對(duì)含有待擴(kuò)增區(qū)的核酸進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，多聚體是很有用的，因?yàn)樵诶煤线m的探針進(jìn)行雜交時(shí)，其可與多種探針雜交并產(chǎn)生強(qiáng)信號(hào)。利用結(jié)合使用的限制性酶等進(jìn)行消化，可從多聚體中獲得單體形式的待擴(kuò)增區(qū)域或其部分。
在置換以前延伸的DNA鏈的同時(shí)，本發(fā)明中選用的DNA聚合酶應(yīng)會(huì)使鏈從引物部分的3′端向下游延伸。重要的是DNA聚合酶不應(yīng)展示出可消化置換后的鏈的5′→3′外切核酸酶活性。例如，源自大腸桿菌DNA聚合酶I的外切核酸酶缺陷變體克列諾片段、源自Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)的類(lèi)似片段、及源自B.ca(Takara Shuzo)的BcaBEST DNA聚合酶用作這樣的DNA聚合酶是有益的。也可選用Gene，9713-19(1991)中描述的測(cè)序酶1.0和測(cè)序酶2.0(UnitedStates Biochemical)、T5 DNA聚合酶和29 DNA聚合酶。如果添加適當(dāng)?shù)囊种苿┛梢种破?′→3′外切核酸酶活性，那在本發(fā)明的DNA合成法中可選用正常具有5′→3′外切核酸酶活性的聚合酶。
可在變化的溫度條件下或在等溫條件下實(shí)施本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法。變化的溫度指改變每步的反應(yīng)溫度，這樣溫度的改變不會(huì)影響各步的反應(yīng)。特別的，變化的溫度指將溫度改變?yōu)檫m于，如引物的每個(gè)退火、互補(bǔ)鏈的合成反應(yīng)、互補(bǔ)鏈的切口及置換反應(yīng)等的溫度。
另一方面，等溫指每個(gè)步驟的反應(yīng)溫度是不變的，每步都是在基本恒定的溫度下進(jìn)行。在這兩種情況下，很自然要對(duì)溫度進(jìn)行選擇以優(yōu)化反應(yīng)條件。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的一個(gè)特點(diǎn)是在核酸合成過(guò)程中不需要對(duì)溫度進(jìn)行上下調(diào)節(jié)。因此，本發(fā)明提供了等溫合成核酸的方法。多種傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增方法要求對(duì)溫度進(jìn)行上下調(diào)節(jié)以使靶核酸從合成的鏈中解離出來(lái)。這些方法要求特殊的反應(yīng)設(shè)備，如熱循環(huán)儀來(lái)達(dá)到其目的。然而，本發(fā)明的方法僅僅利用可保持恒定溫度的設(shè)備就可得以施行。如上所述，可在單一溫度下施行本發(fā)明的方法。優(yōu)選的，通過(guò)選擇反應(yīng)溫度嚴(yán)格水平來(lái)施行本發(fā)明的方法，這樣，引物的非特異性退火減少，并且引物可特異性退火到作為模板的核酸上。雖然沒(méi)有限制本發(fā)明的意圖，但可利用上述的熱抗性酶，在高溫條件下實(shí)施本發(fā)明的方法。此外，優(yōu)選在可充分保留選用的酶的活性的適當(dāng)溫度下施行本發(fā)明的方法，這樣就可將反應(yīng)效率維持在高水平。因此，雖然依賴選用的酶來(lái)變化反應(yīng)溫度，但反應(yīng)溫度優(yōu)選的約為20℃-80℃，更優(yōu)選的約為30℃-75℃，最優(yōu)選的約為50℃-70℃。當(dāng)在特定的高溫條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，優(yōu)選的利用較正常溫度下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)選用的引物長(zhǎng)的引物?？赏ㄟ^(guò)如，參照其Tm值來(lái)確定適于反應(yīng)溫度的引物的序列和長(zhǎng)度。此外，可選用商業(yè)渠道可購(gòu)得的、用來(lái)設(shè)計(jì)引物的軟件如OLIGOTM引物分析軟件(Takara Shuzo)。例如，當(dāng)選用的反應(yīng)溫度為55℃-60℃或65℃時(shí)，本發(fā)明的方法中選用的引物的長(zhǎng)度可為，如12-100個(gè)核苷酸，優(yōu)選14-50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選15-40個(gè)核苷酸。升高溫度所帶來(lái)的影響的示例為存在模板DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)形成問(wèn)題的溶液。即使以高GC含量的核酸作為模板，升高的反應(yīng)溫度也可使其進(jìn)行擴(kuò)增。此外，在對(duì)長(zhǎng)鏈區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增中也有類(lèi)似的效果。在對(duì)鏈長(zhǎng)約為60bp-20kbp，特別的是約為110 bp-4.3kbp，更特別的是約為130bp-1500bp的核酸進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)可觀察到這樣的效應(yīng)。
按照核酸模板的GC含量來(lái)調(diào)整反應(yīng)溫度，這樣就可提高擴(kuò)增反應(yīng)的效率。例如，如果選用具有低GC含量的核酸作為模板，雖然反應(yīng)溫度依賴于待擴(kuò)增核酸的鏈長(zhǎng)及引物的Tm值，但本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)可在50-55℃下進(jìn)行。
在本發(fā)明的方法中，選用具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶(如BcaBEST DNA聚合酶)可很容易的施行從RNA開(kāi)始的核酸擴(kuò)增，其包括從RNA制備cDNA這一步(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng))。此外，獨(dú)立施行從RNA制備cDNA這一步得到的產(chǎn)物，也即cDNA可在本發(fā)明的方法中用作DNA模板。
在每種情況下，重復(fù)本發(fā)明的方法中的反應(yīng)，直至以適當(dāng)?shù)姆绞剑缑甘Щ罨蚪档头磻?yīng)溫度使其中止，或直至反應(yīng)缺乏一種底物為止。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法可用于多種利用核酸擴(kuò)增的操作中，包括對(duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)、標(biāo)記和序列分析。
此外，本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法可用作原位核酸擴(kuò)增法、在固體基質(zhì)如DNA芯片上進(jìn)行的核酸擴(kuò)增法、或?qū)Χ鄠€(gè)區(qū)域同時(shí)擴(kuò)增的多重核酸擴(kuò)增法。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增法的一個(gè)特征為其制備單鏈DNA的能力。在制備單鏈核酸的方法中可選用一或兩種嵌合寡核苷酸引物。例如，如果選用兩種寡核苷酸引物，就可利用與所謂的不對(duì)稱PCR類(lèi)似的引物比例來(lái)施行本發(fā)明的方法，而不對(duì)稱PCR是利用一種相對(duì)于另一種引物遠(yuǎn)遠(yuǎn)超量的寡核苷酸引物來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的。引物比例優(yōu)選1∶10-1∶500，更優(yōu)選1∶10-1∶100，對(duì)此沒(méi)有任何限制。結(jié)果，從一條鏈得到的替代產(chǎn)物的量遠(yuǎn)超過(guò)從另一條鏈得到的替代產(chǎn)物的量。
按照本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法，可制備基本不含互補(bǔ)鏈的單鏈DNA。例如，在短時(shí)間內(nèi)，可很容易的制備用于制備具有固定化核酸的物質(zhì)如DNA芯片的單鏈DNA、用于靶核酸檢測(cè)的單鏈DNA探針、或用于長(zhǎng)鏈PCR的大引物。利用本發(fā)明的方法僅可選擇性擴(kuò)增有義序列或反義序列。因此，作為具有有義序列或反義序列的核酸的制備方法，本發(fā)明也是有益的。
通過(guò)在N-二[羥乙基]甘氨酸、Tricine、HEPES、磷酸鹽或tris緩沖溶液中施行本發(fā)明的方法，我們甚至可以痕量核酸為模板對(duì)所需的核酸區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。
此外，本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法不需要可隨時(shí)間變化而對(duì)溫度進(jìn)行調(diào)節(jié)的特殊反應(yīng)設(shè)備。因此，可在大體積反應(yīng)混合物中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。從而，可在工業(yè)上大量制備核酸(如，用于醫(yī)藥應(yīng)用)。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法中的引物利用率約為100％，其較傳統(tǒng)方法如PCR中的利用率高5-10倍。
利用本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法可制得對(duì)作為模板的核酸的核苷酸鏈有高精確度的擴(kuò)增產(chǎn)物。當(dāng)對(duì)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列進(jìn)行分析從而確定了本發(fā)明的DNA合成方法中的錯(cuò)誤頻率時(shí)，利用本發(fā)明的方法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物中的錯(cuò)誤頻率與利用LA-PCR制得的擴(kuò)增產(chǎn)物中的錯(cuò)誤頻率相當(dāng)，而已知LA-PCR可以高精確度對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增。換言之，本發(fā)明的方法具有與LA-PCR相當(dāng)?shù)木_度。
(6)本發(fā)明的靶核酸檢測(cè)方法及用于此方法的試劑盒可利用本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法來(lái)對(duì)樣品中的靶核酸進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)方法包括(a)利用上述的、本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增；及
(b)對(duì)上步驟擴(kuò)增的靶核酸進(jìn)行檢測(cè)。
在上述步驟(a)中，如果以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和核酸擴(kuò)增反應(yīng)可以一步完成。雖然沒(méi)有限制本發(fā)明的意圖，但例如，AMV RTase、MMLV RTase或RAV-2 RTase與Bca DNA聚合酶的結(jié)合可優(yōu)選的用作逆轉(zhuǎn)錄酶和鏈置換型DNA聚合酶的結(jié)合。
本發(fā)明中的方法可用于對(duì)樣品的特定基因進(jìn)行檢測(cè)和定量。換言之，可對(duì)懷疑含有核酸，如DNA或RNA的所有樣品中的特定基因進(jìn)行檢測(cè)和定量。含有待檢測(cè)和定量的特定基因的樣品的示例包括，但并不局限于取自生物體的樣品如全血、血清、血塊黃層、尿、糞便、腦脊液、精液、唾液、組織(如癌組織或淋巴結(jié))及細(xì)胞培養(yǎng)物(如哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)菌培養(yǎng)物)、含有核酸如類(lèi)病毒、病毒、細(xì)菌、真菌、酵母菌、植物和動(dòng)物的樣品、懷疑污染或已感染有微生物如病毒或細(xì)菌(如食品或生物制劑)的樣品、以及含有有機(jī)體樣品如土壤和廢水。例如，在存在源自這些靶微生物的特定基因的基礎(chǔ)上或在源自這些靶微生物的特定基因含量的基礎(chǔ)上，可對(duì)樣品中的類(lèi)病毒、病毒、真菌、細(xì)菌或其他微生物進(jìn)行檢測(cè)或定量。特別的，在衛(wèi)生和環(huán)境領(lǐng)域中，病原微生物的檢測(cè)方法是有益的。此外，本發(fā)明中的方法可用于區(qū)分生物體的基因型或確定基因的表達(dá)水平。特別的，在醫(yī)藥領(lǐng)域中，檢測(cè)或確定與疾病相關(guān)的基因，如與細(xì)胞癌化相關(guān)的基因的表達(dá)狀態(tài)是有益的。在檢測(cè)應(yīng)用中，RNA和DNA都可優(yōu)選的用作作為模板的核酸。
本發(fā)明中的靶核酸檢測(cè)方法可用于區(qū)分靶核酸的核苷酸序列中的差異。在此方面中，對(duì)選用的嵌合寡核苷酸引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，這樣引物的3′端部分的定位就靠近待區(qū)分的靶核苷酸序列的特定堿基。例如，對(duì)嵌合寡核苷酸引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，這樣在堿基和引物的3′末端堿基間形成了氫鍵。如果在引物3′末端部分的核苷酸序列與模板核苷酸序列間存在誤配，那利用上述擴(kuò)增反應(yīng)的嵌合寡核苷酸引物對(duì)靶核酸進(jìn)行的擴(kuò)增就不會(huì)發(fā)生，也就沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物生成。利用本發(fā)明的方法可獲得與基因中特定堿基相關(guān)的信息，如點(diǎn)突變或單鏈多態(tài)性(SNP)。
通過(guò)從含有核酸的樣品直接進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增可對(duì)本發(fā)明的靶核酸檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)施。在這種情況下，對(duì)待擴(kuò)增的靶核酸的鏈長(zhǎng)沒(méi)有限制。例如，200bp或更短的區(qū)域，優(yōu)選150bp或更短的區(qū)域?qū)τ诎泻怂岬撵`敏檢測(cè)來(lái)講是有效的。通過(guò)對(duì)本發(fā)明的嵌合寡核苷酸引物進(jìn)行設(shè)計(jì)以獲得上述待擴(kuò)增的鏈長(zhǎng)，可對(duì)樣品中的靶核酸進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)。
此外，利用含有N-二[羥乙基]甘氨酸、Tricine、HEPES、磷酸鹽或tris作緩沖成分的反應(yīng)緩沖液及含如上文(4)示范的、含有亞精胺或丙二胺的退火溶液，本發(fā)明中的檢測(cè)方法甚至可對(duì)痕量核酸樣品中的靶核酸進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)。在這種情況下，對(duì)選用的內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶沒(méi)有特別的限制。例如，優(yōu)選源自大腸桿菌、火球菌屬細(xì)菌及古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H與BcaBEST DNA聚合酶的結(jié)合。我們認(rèn)為，優(yōu)選的內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶單位可依選用的酶類(lèi)型的不同而變化。在這種情況下，利用檢測(cè)靈敏度的升高或擴(kuò)增產(chǎn)物量為指標(biāo)，可對(duì)緩沖溶液的組成和添加的酶量進(jìn)行調(diào)整。
在本發(fā)明的檢測(cè)方法中，dUTP在靶核酸擴(kuò)增過(guò)程中可作為底物而摻入。因此，如果dUTP作為底物，通過(guò)利用尿嘧啶N-糖苷酶(UNG)降解擴(kuò)增產(chǎn)物可防止擴(kuò)增產(chǎn)物的存留感染。
已知的核酸檢測(cè)方法可用于步驟(b)中。這些方法的示例包括通過(guò)電泳法對(duì)特定大小的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)及通過(guò)與探針進(jìn)行雜交來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。此外，結(jié)合利用磁珠的檢測(cè)方法是優(yōu)選的。在利用電泳進(jìn)行的檢測(cè)中，經(jīng)常利用熒光物質(zhì)如溴乙啶。利用探針進(jìn)行的雜交可與利用電泳進(jìn)行的檢測(cè)進(jìn)行結(jié)合。可利用放射性同位素或非放射性物質(zhì)如生物素或熒光物質(zhì)對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記。此外，利用步驟(a)中標(biāo)記的核苷酸可促進(jìn)對(duì)摻入標(biāo)記核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行的檢測(cè)，或可增強(qiáng)利用標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)的信號(hào)。熒光偏振法、熒光能量交換等也可用于檢測(cè)。通過(guò)構(gòu)建合適的檢測(cè)體系就可對(duì)靶核酸進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)或定量。此外，優(yōu)選利用雜交層析法通過(guò)肉眼進(jìn)行檢測(cè)。
在本發(fā)明的檢測(cè)方法中可選用利用兩或多種熒光物質(zhì)標(biāo)記的核糖核苷酸(RNA)探針，熒光物質(zhì)間隔導(dǎo)致淬滅狀態(tài)的距離。此探針不發(fā)射熒光。當(dāng)探針退火到對(duì)與探針互補(bǔ)的靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增得到的DNA上時(shí)，RNA酶H消化了此探針。隨后探針上熒光物質(zhì)間的距離增加，從而使得熒光物質(zhì)發(fā)射熒光。因此，熒光發(fā)射表明有靶核酸存在。如果RNA酶H用于本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法中，那僅通過(guò)向反應(yīng)混合物中添加探針就可對(duì)靶核酸進(jìn)行檢測(cè)。例如，熒光物質(zhì)6-羧基熒光素(6-FAM)和N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)的結(jié)合可優(yōu)選用于探針標(biāo)記。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了可用于上述靶核酸檢測(cè)法的探針。只要在正常雜交條件下，其可與通過(guò)本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增得到的靶核酸進(jìn)行雜交，那對(duì)本發(fā)明中的探針就沒(méi)有特別的限制。由對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行的特異性檢測(cè)來(lái)看，優(yōu)選可在正常條件，如本領(lǐng)域中的熟練技術(shù)人員已知的嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交的探針。嚴(yán)格的雜交條件在，如T.Maniatis et al.(eds.)，Molecular Cloning；A LaboratoryManual 2nd ed.，1989，Cold Spring Hafbor Laboratory中有描述。特別的，嚴(yán)格的雜交條件的示例如下在含有0.5％SDS的6×SSC(1×SSC；0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉，pH7.0)、5×Denhardt′s(0.1％牛血清白蛋白(BSA)，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％Ficol1400)和100μg/ml鮭魚(yú)精子DNA中，在低于選用的探針的Tm約25℃的溫度下孵育4小時(shí)到過(guò)夜。含有上述標(biāo)記的探針可用作探針來(lái)促進(jìn)對(duì)靶核酸的檢測(cè)。
本發(fā)明中在等溫條件下進(jìn)行的核酸擴(kuò)增方法不要求利用設(shè)備如熱循環(huán)儀。在本發(fā)明的擴(kuò)增方法中可利用一或兩種引物，而這種引物數(shù)要小于傳統(tǒng)方法中所用的引物數(shù)。既然試劑，如用于PCR的dNTP等可用于本發(fā)明的方法中，那相對(duì)于傳統(tǒng)方法來(lái)講，運(yùn)轉(zhuǎn)成本就降低了。因此，本發(fā)明的方法可優(yōu)選的用于，如進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)的遺傳檢驗(yàn)領(lǐng)域中。本發(fā)明的方法可在更短的時(shí)間內(nèi)較PCR提供了更大量的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的方法可用作方便、快捷、靈敏的基因檢測(cè)方法。
在基因組水平的遺傳分析中，為了對(duì)大量核苷酸序列進(jìn)行分析，我們?cè)噲D開(kāi)發(fā)更小的反應(yīng)體系并提高整合程度。為了這一目的，我們利用最新的超精細(xì)處理技術(shù)開(kāi)發(fā)了此體系，而超精細(xì)處理技術(shù)可將基本的基因組分析方法(如從細(xì)胞中提取DNA、DNA擴(kuò)增反應(yīng)、電泳、雜交、對(duì)感興趣的DNA進(jìn)行檢測(cè)等)整合到幾平方厘米到指尖大小的微芯片上。
我們目前考慮將PCR應(yīng)用到此基因擴(kuò)增反應(yīng)體系中。然而，由于PCR要求有隨時(shí)間重復(fù)控制溫度上下變化的方法，所以此體系將會(huì)很復(fù)雜。與此相比，由于利用本發(fā)明中在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法可簡(jiǎn)化此體系，那將此方法用于上述整合體系會(huì)很合適。利用本發(fā)明的技術(shù)可以構(gòu)建高度整合的體系。
(7)本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明提供了可用于上述的、本發(fā)明的核酸擴(kuò)增和檢測(cè)法中的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，此試劑盒以包裝形式存在，并且含有與DNA聚合酶和內(nèi)切核酸酶在鏈置換反應(yīng)中的應(yīng)用有關(guān)的說(shuō)明書(shū)。另外，含有具有鏈置換活性的DNA聚合酶、內(nèi)切核酸酶、以及用于鏈置換反應(yīng)的緩沖溶液的試劑盒優(yōu)選用于本發(fā)明的方法中。另外，按照說(shuō)明書(shū)，也可選擇并應(yīng)用可通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)的、具有鏈置換活性和/或內(nèi)切核酸酶活性的DNA聚合酶。此外，此試劑盒可含有用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的試劑，而此試劑是在以RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中選用的。DNA聚合酶可選自上文(3)中描述的、本發(fā)明中選用的DNA聚合酶。內(nèi)切核酸酶可選自在上文(2)中描述的內(nèi)切核酸酶。含有上文(4)中描述的反應(yīng)緩沖組合物的緩沖溶液可優(yōu)選的用作鏈置換反應(yīng)的緩沖溶液。
“說(shuō)明書(shū)”是描述試劑盒使用方法如鏈置換反應(yīng)試劑溶液的制備方法、推薦反應(yīng)條件等的打印材料。說(shuō)明書(shū)包括小冊(cè)子或傳單、或粘貼到試劑盒上的標(biāo)簽形式的使用說(shuō)明手冊(cè)，及在含有試劑盒的包裝的表面上的說(shuō)明。說(shuō)明書(shū)也包括通過(guò)電子媒介如互聯(lián)網(wǎng)公開(kāi)的或提供的信息。
本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步含有緩沖溶液和上文(4)中所示范的退火溶液，而這些緩沖溶液是以N-二[羥乙基]甘氨酸、Tricine、HEPES、磷酸鹽或tris作緩沖成分的。此外，其可含有具有鏈置換活性的DNA聚合酶及RNA酶H。此外，此試劑盒可含有修飾的脫氧核糖核苷酸或脫氧核糖核苷三磷酸類(lèi)似物。
在上述的說(shuō)明書(shū)和擴(kuò)增反應(yīng)試劑之外，應(yīng)用于核酸檢測(cè)方法的試劑盒可進(jìn)一步含有可用于靶核酸擴(kuò)增的、適當(dāng)?shù)那逗瞎押塑账嵋锛翱捎糜跀U(kuò)增后的靶核酸檢測(cè)的試劑，如探針。
此外，本發(fā)明中的試劑盒包括含有本發(fā)明中選用的嵌合寡核苷酸引物的試劑盒和/或上述的、本發(fā)明中的探針。
(8)本發(fā)明的組合物本發(fā)明提供了用于上述的、本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法或本發(fā)明的核酸檢測(cè)方法中的組合物。例如，此組合物可含有上文(2)所描述的內(nèi)切核酸酶和上文(3)所描述的DNA聚合酶。組合物可進(jìn)一步含有可用于擴(kuò)增反應(yīng)的緩沖成分、鎂鹽、dNTP等。此外，其可含有修飾的脫氧核糖核苷酸或脫氧核糖核苷三磷酸類(lèi)似物。上文(4)中的那些物質(zhì)可用作緩沖成分和其他的添加劑。
在一尤其優(yōu)選的方面中，組合物可含有適量的、上文列出的、可用于本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的多種組分。僅向組合物中添加適當(dāng)?shù)哪０搴颓逗瞎押塑账嵋锞涂蛇M(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。如果待擴(kuò)增的對(duì)象是事先已知的，則組合物優(yōu)選的含有適于擴(kuò)增該擴(kuò)增對(duì)象的嵌合寡核苷酸引物。
(9)含有排列在本發(fā)明的預(yù)定區(qū)域中的固定化核酸的物質(zhì)及制備該物質(zhì)的方法DNA芯片(也叫做DNA微陣列或DNA陣列)是含有固定化核酸的物質(zhì)，其中多種基因片段或DNA排列并固定化在固體基質(zhì)如玻璃上的預(yù)定的區(qū)域內(nèi)或預(yù)定的位置上。DNA芯片可用于檢測(cè)核酸樣品中存在的核酸，而這些核酸與在DNA芯片上的預(yù)定區(qū)域中排列和固定化的DNA是互補(bǔ)的。通過(guò)將DNA芯片與從樣品中制備的核酸樣品，優(yōu)選已標(biāo)記的核酸樣品接觸以進(jìn)行雜交，這樣來(lái)進(jìn)行實(shí)施檢驗(yàn)。由于DNA芯片可用于對(duì)一個(gè)操作樣品中的多種核酸進(jìn)行檢測(cè)或定量，所以其是可顯著促進(jìn)基因表達(dá)分析和突變或多態(tài)性分析的非常有用的工具。在對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖冃院?，可將在其預(yù)定區(qū)域中排列并固定化有雙鏈核酸的DNA芯片用于雜交?？蓪⒃谄漕A(yù)定區(qū)域中排列并固定化有與待檢測(cè)靶核酸互補(bǔ)的雙鏈核酸的DNA芯片優(yōu)選的用于靶核酸檢測(cè)。
如上所述，利用本發(fā)明的方法可對(duì)所需的DNA以單鏈形式進(jìn)行擴(kuò)增。雖然可選用擴(kuò)增產(chǎn)物的任何純化方法，但優(yōu)選的是利用異丙醇沉淀來(lái)進(jìn)行純化。這樣得到的DNA，優(yōu)選基本不含其互補(bǔ)鏈的單鏈DNA，可優(yōu)選的用作固定化到DNA芯片上的DNA片段。因此，本發(fā)明的方法優(yōu)選的用作那些排列并固定化在預(yù)定區(qū)域的DNA芯片的DNA的制備方法。任何不溶基質(zhì)可用作基質(zhì)，而這些基質(zhì)上的預(yù)定的區(qū)域中可排列并固定化制得的DNA，但優(yōu)選的是利用玻璃或塑料制得的盤(pán)狀基質(zhì)及利用硝酸纖維素或尼龍制得的膜狀基質(zhì)。已知的核酸固定化方法可用于核酸固定化?？蓪NA直接固定化到基質(zhì)上。另外，可通過(guò)適當(dāng)?shù)倪B接體對(duì)DNA進(jìn)行固定化或在與多個(gè)DNA分子連接后對(duì)其進(jìn)行固定化。此外，由于通過(guò)本發(fā)明的制備方法可將修飾的脫氧核糖核苷酸摻入擴(kuò)增后的核酸中，所以利用修飾基團(tuán)就可制備具有固定化核酸的物質(zhì)。
可對(duì)與含有固定化核酸的物質(zhì)上的核酸進(jìn)行雜交的靶核酸進(jìn)行檢測(cè)或定量，而在此物質(zhì)中，利用本發(fā)明的方法擴(kuò)增的DNA排列并固定化在預(yù)定的區(qū)域中(如DNA芯片)。將從懷疑含有用于雜交的靶核酸的樣品中制備的核酸樣品與該物質(zhì)接觸就可完成這樣的檢測(cè)或定量，而此樣品是從懷疑含有用于雜交的靶核酸的樣品中制備的。在這些物質(zhì)中，相對(duì)于傳統(tǒng)的物質(zhì)，DNA芯片可以更方便的操作、更高的靈敏度及更高的重復(fù)性對(duì)靶核酸進(jìn)行檢測(cè)。
(9)本發(fā)明的大量核酸制備方法如上所述，本發(fā)明的一方面提供了可在等溫條件下進(jìn)行的核酸擴(kuò)增方法。在一方法中，將用作待擴(kuò)增核酸的模板的核酸與反應(yīng)所需的多種成分混合，反應(yīng)混合物在等溫條件下進(jìn)行反應(yīng)，這樣制備了所需的核酸。因?yàn)镻CR要求隨著時(shí)間變化來(lái)改變反應(yīng)混合物的溫度，所以反應(yīng)體積就限制在可對(duì)溫度進(jìn)行控制的程度上(一般為200μl或更少)。因此，很難對(duì)體積進(jìn)行擴(kuò)大。另一方面，在本發(fā)明的方法中沒(méi)有這樣的限制。通過(guò)增加反應(yīng)混合物的體積可制備得到大量的核酸。在本發(fā)明的方法中，雖然沒(méi)有限制本發(fā)明的意圖，但此體積，例如，優(yōu)選大于200μl，更優(yōu)選300μl或更大體積，最優(yōu)選500μl或更大體積。在本發(fā)明的方法中，從一個(gè)模板分子合成了大量的互補(bǔ)鏈分子。此外，可以這些互補(bǔ)鏈分子作模板合成核酸。因此，通過(guò)選擇合適的模板和引物，就可對(duì)所需的核酸進(jìn)行大量的、高效的制備。此外，從設(shè)備和能量方面來(lái)看，與PCR不同，本發(fā)明的方法不要求特殊的設(shè)備或復(fù)雜的溫度變化這個(gè)事實(shí)對(duì)其來(lái)說(shuō)是有利的。因此，此方法是工業(yè)上大量制備核酸的優(yōu)良方法。
利用如上文(4)中示范的反應(yīng)緩沖液和退火溶液，甚至可以從本發(fā)明的制備方法中的痕量核酸模板擴(kuò)增或制備感興趣的核酸。在這種情況下，對(duì)選用的內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶沒(méi)有特別的限制。例如，優(yōu)選結(jié)合應(yīng)用源自大腸桿菌的RNA酶H與BcaBEST DNA聚合酶。我們認(rèn)為，內(nèi)切核酸酶和DNA聚合酶的優(yōu)選單位可依選用的酶的類(lèi)型而變化。在這樣的情況下，可利用應(yīng)用產(chǎn)物的最大量為指標(biāo)，對(duì)緩沖溶液的組成和添加的酶量進(jìn)行調(diào)整。
此外，本發(fā)明的方法作為大量供應(yīng)多種DNA片段，如固定化到DNA芯片上的那些片段的方法是有用的。特別的，在一實(shí)施方案中，在一個(gè)簡(jiǎn)單反應(yīng)步驟中就可獲得大量的DNA片段。在另一實(shí)施方案中，少量的引物可用于獲取多種DNA片段。一個(gè)核酸擴(kuò)增步驟可結(jié)合到后者的實(shí)施方案中，而通過(guò)已知的核酸擴(kuò)增方法如PCR，此核酸事先可在本發(fā)明的方法中作為模板。利用少量引物可對(duì)所有作為模板的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，例如，在利用含有標(biāo)記序列的隨機(jī)引物進(jìn)行的核酸擴(kuò)增方法(Nucleic Acids Research，24(19)3778-3783(1996))或在利用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行簡(jiǎn)并寡核苷酸引導(dǎo)的PCR(DOP-PCR；Genomics，13718-725(1992))基礎(chǔ)上進(jìn)行擴(kuò)增?？衫靡换驇追N引物施行本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法來(lái)對(duì)上述提及的步驟中的所有作為模板的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)對(duì)用于本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法中的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，使其與添加到隨機(jī)引物或簡(jiǎn)并引物中的標(biāo)記序列相對(duì)應(yīng)，從而來(lái)完成此核酸擴(kuò)增。因此，相對(duì)于傳統(tǒng)方法，將制備作為模板的核酸的合適步驟與本發(fā)明的方法結(jié)合可以較低成本來(lái)大量提供多種DNA片段。
包含有核酸的藥物組合物可含有用于在細(xì)胞中表達(dá)有用多肽的雙鏈DNA或用于抑制感興趣的基因表達(dá)的單鏈反義DNA。利用適當(dāng)?shù)姆绞?，例如，基因轉(zhuǎn)移載體如脂質(zhì)體，對(duì)生物體給予這樣的核酸。本發(fā)明中的核酸制備方法優(yōu)選的用于大量制備用于醫(yī)藥用途的單鏈或雙鏈核酸。此外，利用本發(fā)明的方法可迅速的制備含有，如可抑制體內(nèi)核酸降解的dNTP類(lèi)似物的核酸。
由于本發(fā)明中的DNA擴(kuò)增片段由正常的核苷酸組成，所以可利用DNA中的限制性酶位點(diǎn)將擴(kuò)增后的DNA，如亞克隆到載體中。此外，例如，可利用限制性酶對(duì)DNA進(jìn)行處理以進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析而沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何問(wèn)題。因此，此DNA可廣泛用于遺傳檢驗(yàn)領(lǐng)域中。此外，可將RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列整合到擴(kuò)增后的片段中。例如，擴(kuò)增后的片段可用作模板來(lái)合成RNA，而此RNA可用作探針。當(dāng)然，利用熒光標(biāo)記的dNTP而不是正常dNTP施行本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法，這樣就可制備熒光標(biāo)記的DNA探針。
本發(fā)明的核酸擴(kuò)增方法的特征如下所列1.其可從少量模板擴(kuò)增大量核酸。當(dāng)使用兩種引物時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物以二次方的比率增加。
2.其可在等溫條件下進(jìn)行。在這種情況下，其不要求利用設(shè)備如熱循環(huán)儀。因此，反應(yīng)體積可很容易的增加。
3.一般來(lái)說(shuō)，擴(kuò)增反應(yīng)是利用一或兩種嵌合寡核苷酸引物及兩種酶(DNA聚合酶和內(nèi)切核酸酶)來(lái)進(jìn)行的。
4.由于大量的DNA鏈?zhǔn)菑囊环N引物分子合成的，所以引物量不會(huì)限制擴(kuò)增產(chǎn)物的量。此外，引物的利用率約為100％，這遠(yuǎn)高于PCR中的引物利用率。
5.依目的不同，可對(duì)單鏈或雙鏈DNA進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。
6.因?yàn)閿U(kuò)增反應(yīng)不要求有dNTP類(lèi)似物如(α-S)dNTP，所以試劑成本很低。此外，可獲得不含有dNTP類(lèi)似物的天然形式的核酸。
7.通過(guò)結(jié)合利用本發(fā)明的方法和另一種核酸擴(kuò)增方法，其可以低成本大量供應(yīng)擴(kuò)增后的DNA片段。
8.相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，本發(fā)明的檢測(cè)法具有相同或更高的檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明的檢測(cè)法可在較具有相同靈敏度的傳統(tǒng)方法短的時(shí)間內(nèi)完成。
9.此方法適于核酸擴(kuò)增、自動(dòng)檢測(cè)、在微芯片或納米芯片上的少量且高度整合的檢測(cè)方法中進(jìn)行檢測(cè)。
如上所述，本發(fā)明的方法適于基因檢測(cè)和工業(yè)上的核酸制備。實(shí)施例下列實(shí)施例更詳細(xì)的例示了本發(fā)明，但沒(méi)有限制其范圍的意圖。參考實(shí)施例1從嗜熱熱堅(jiān)芽孢桿菌中制備RNA酶H將熱堅(jiān)芽孢桿菌YT-G(購(gòu)自Deutsche Sammlung vonMikroorganismen；DSM406)接種到100ml含有0.2％胰蛋白胨(DifcoLaboratories)和1.5％酵母提取物(Difco Laboratories)(pH6.5)的培養(yǎng)基中，60℃下振蕩培養(yǎng)140分鐘并將其用作預(yù)培養(yǎng)物。將30ml預(yù)培養(yǎng)物接種到組成相同的3L培養(yǎng)基中，60℃下，以2.5L/min的速度通氣并在轉(zhuǎn)速為250rpm下攪拌培養(yǎng)5小時(shí)。
在5000xg下對(duì)培養(yǎng)物離心15min，收集細(xì)胞。將402g(濕重)細(xì)胞懸浮在1000ml含有10mM巰基乙醇、0.5M NaCl、1mM EDTA和20μMPAPMSF的50mM tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，并利用MINI-Lab(APVGAULIN/RANNIE)使其裂解。通過(guò)離心去除細(xì)胞碎片以收集上清液。
將聚乙烯亞胺溶液添加到上清液中至其濃度為0.1％。攪拌后，混合物靜置1小時(shí)。隨后離心收集上清液。將硫酸銨添加到上清液中至50％的飽和度。離心收集沉淀，并將沉淀物溶解在含有10mM巰基乙醇、0.1mM EDTA、50mM NaCl和10％甘油的20mM tris-HCl緩沖溶液(pH7.5)中。在相同緩沖液中對(duì)此溶液進(jìn)行透析。將透析后的樣品加入到已用相同的緩沖液平衡過(guò)的280ml DE52柱(Whatman)中，收集非吸附的部分。
進(jìn)一步利用420ml緩沖液沖洗柱子進(jìn)行平衡，并收集沖洗級(jí)分。將從DE52柱層析收集的非吸附級(jí)分和沖洗級(jí)分混合在一起，并將其添加到已利用含有10mM巰基乙醇、0.1mM EDTA、50mM NaCl和10％甘油的20mM tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡過(guò)的240ml P-11柱(Whatman)上。隨后利用含有0-0.5M NaCl的平衡緩沖液進(jìn)行洗脫。
將得到的活性級(jí)分置于透析管中。4℃下，將此管置于固體聚乙二醇中脫水濃縮。隨后將酶濃縮物添加到已利用含有5mM巰基乙醇、0.5mM EDTA、30mM NaCl和50％甘油的25mM tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡過(guò)的300ml Superdex G-200柱(Amersham Pharmacia Biotech)中。利用平衡緩沖液進(jìn)行洗脫以獲得活性級(jí)分。將活性級(jí)分添加到已利用含有10mM巰基乙醇、0.1mM EDTA、50mM NaCl和10％甘油的20mMtris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡過(guò)的15ml肝素瓊脂糖柱(AmershamPharmacia Biotech)中。利用含有0-0.5M NaCl的平衡緩沖液進(jìn)行洗脫。
將得到的活性級(jí)分添加到已用含有10mM巰基乙醇、0.1mM EDTA、50mM NaCl和10％甘油的20mM tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡過(guò)的5ml Hitrap-SP柱(Amersham Pharmacia Biotech)中。利用含有0-0.5M NaCl的平衡緩沖液進(jìn)行洗脫。將得到的活性級(jí)分添加到已用含有5mM巰基乙醇、0.5mM EDTA、30mM NaCl和50％甘油的25mMtris-HCl緩沖液(pH7.5)重新平衡過(guò)的300ml Superdex G-200柱(Amersham Pharmacia Biotech)上。得到的活性成分可用作RNA酶H制劑(一種酶溶液)。
抗熱RNA酶H的活性測(cè)定如下將1mg聚(rA)或聚(dT)(購(gòu)自Amersham Pharmacia Biotech)溶解在1ml含有1mM EDTA的40mM tris-HCl(pH7.7)中來(lái)制備聚(rA)溶液和聚(dT)溶液。
隨后將聚(rA)溶液(終濃度為20μg/ml)和聚(dT)溶液(終濃度為30μg/ml)添加到含有4mM MgCl2、1mM DTT、0.003％BSA和4％甘油的40mM tris-HCl(pH7.7)中。此混合物在37℃下反應(yīng)10分鐘，隨后將其冷卻到4℃以制備聚(rA)-聚(dT)溶液。
將1μl酶溶液添加到100μl聚(rA)-聚(dT)溶液中。混合物在40℃下反應(yīng)10min。向其中添加10μl 0.5 M EDTA以中止反應(yīng)。隨后測(cè)定其在260nm下的吸光度。作為對(duì)照，將10μl 0.5M EDTA添加到反應(yīng)混合物中，得到的混合物在40℃下反應(yīng)10分鐘，隨后測(cè)定其吸光度。從不含EDTA的反應(yīng)混合物的吸光度中扣除對(duì)照吸光度就得到了一個(gè)值(在吸光度上有差別)。從而，在吸光度差異的基礎(chǔ)上，利用酶反應(yīng)確定了從聚(rA)-聚(dT)雜種中釋放出的核苷酸的濃度。按照下列方程式，一個(gè)單位的RNA酶H定義為在10分鐘內(nèi)釋放1nmol核糖核苷酸相對(duì)應(yīng)的A260升高值。如果選用稀釋后的酶溶液，在稀釋率基礎(chǔ)上利用下列方程得到的值是正確的單位＝[吸光度差異×反應(yīng)容積(ml)]/0.0152參考實(shí)施例2熱堅(jiān)芽孢桿菌RNA酶HII基因的克隆(1)從熱堅(jiān)芽孢桿菌中制備基因組DNA將熱堅(jiān)芽孢桿菌YT-G(DSM406)接種到60ml LB培養(yǎng)基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和0.5％NaCl，pH 7.2)中，并在65℃下培養(yǎng)20小時(shí)。培養(yǎng)后，對(duì)培養(yǎng)物離心收集細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在2ml 25％蔗糖和50mM tris-HCl(pH 8.0)中。向其中添加已溶于水中的0.2ml10mg/ml氯化溶菌酶制劑(Nacalai Tesque)。混合物在20℃下反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，向反應(yīng)混合物中添加12ml含有150mM NaCl、1mMEDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)的混合物、0.1ml 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)及1ml 10％十二烷基硫酸鈉。混合物在37℃下孵育1小時(shí)。
隨后將2.1ml 5M NaCl和2ml CTAB-NaCl溶液[10％溴棕三甲銨(Nacalai Tesque)和0.7M NaCl]添加到混合物中，將產(chǎn)生的混合物混合完全，并在65℃下孵育10min。向其中添加等體積的氯仿/異戊醇(24；1，v/v)混合物。將生成的混合物輕輕混合10min，隨后在10000xg下離心10min。離心完成后，向得到的上清液中添加等體積的苯酚飽和溶液與100mM tris-HCl(pH8.0)/氯仿/異戊醇(25∶24∶1，v/v)的混合物。將生成的混合物輕輕混合10min，隨后在10000xg下離心10min。離心完成后，向得到的上清液中添加0.6體積的2-丙醇。利用玻璃棒盤(pán)繞生成的纖維狀沉淀物，利用70％乙醇水溶液進(jìn)行沖洗，風(fēng)干，隨后溶解在0.5ml TE緩沖液中以獲得基因組DNA溶液。
(2)克隆RNA酶HII基因的中間部分在源自多種生物體的RNA酶HII的氨基酸序列中的保守部分MotifI和Motif III的基礎(chǔ)之上，合成SEQ ID NO1和2所表示的寡核苷酸(Biochemistry，38605-608(1999))。
利用參考實(shí)施例2-(1)中制備的1μl熱堅(jiān)芽孢桿菌基因組溶液為模板、以100pmol BsuII-3和100pmol BsuII-6為引物，在100μl容器中進(jìn)行PCR。按照粘貼的使用指導(dǎo)，利用TaKaRa Taq聚合酶(Takara Shuzo)作為PCR反應(yīng)的DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。PCR操作如下94℃反應(yīng)30秒，45℃下反應(yīng)30秒及72℃下反應(yīng)1min，持續(xù)50個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，利用苯酚處理反應(yīng)混合物，隨后進(jìn)行乙醇沉淀來(lái)純化DNA。得到的DNA是利用T4 DNA聚合酶(Takara Shuzo)形成的鈍末端DNA，隨后對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以從凝膠中回收長(zhǎng)約0.4kb的擴(kuò)增后DNA片段。利用T4 DNA連接酶(Takara Shuzo)將長(zhǎng)約0.4kb的DNA片段與已用Sma I(Takara Shuzo)消化過(guò)的pUC119(Takara Shuzo)連接。利用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。培養(yǎng)生成的轉(zhuǎn)化體以獲得其中已插入有長(zhǎng)約0.4kb DNA的質(zhì)粒21-12。
(3)克隆RNA酶II基因的上游部分確定了在參考實(shí)施例2-(2)中獲得的質(zhì)粒21-12中長(zhǎng)約0.4kb的插入片段的核苷酸序列。在此確定的核苷酸序列的基礎(chǔ)之上，合成了SEQ ID NO3和4所代表的寡核苷酸RNII-S1和RNII-S2。
利用BamHI(Takara Shuzo)消化參考實(shí)施例2-(1)中制備的熱堅(jiān)芽孢桿菌基因組DNA并利用T4 DNA連接酶將其與Sau3AI盒(Takara Shuzo)相連。按照粘貼到TaKaRa LA PCR體外克隆試劑盒(Takara Shuzo)上的指導(dǎo)說(shuō)明，以連接混合物為模板、以RNII-S2為第一次PCR的引物而以RNII-S1為第二次PCR引物進(jìn)行PCR。首先利用苯酚提取，然后利用乙醇沉淀從第二次PCR后的溶液中純化DNA。此DNA是利用T4 DNA聚合酶擴(kuò)增的鈍末端DNA。隨后對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以從凝膠中回收長(zhǎng)約1.Skb的擴(kuò)增后DNA片段。利用T4 DNA連接酶將此長(zhǎng)約1.5kb的DNA片段連接到已用Sma I消化過(guò)的pUC119上。利用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。
對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)以獲取其中已插入有長(zhǎng)約1.5kb的DNA的質(zhì)粒B25N16。
(4)克隆整個(gè)RNA酶II基因在參考實(shí)施例2-(3)中確定的質(zhì)粒21-12中長(zhǎng)約0.4kb的插入片段的核苷酸序列基礎(chǔ)上，合成了SEQ ID NO5和6所代表的寡核苷酸RNII-S5和RNII-S6。
以參考實(shí)施例2-(2)中制備的質(zhì)粒21-12為模板進(jìn)行PCR、以RNII-S5和RNII-S6為引物進(jìn)行PCR。按照試劑盒上粘貼的操作指導(dǎo)，以TaKaRa Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo)為DNA聚合酶進(jìn)行PCR。此PCR執(zhí)行如下94℃下反應(yīng)30秒、55℃下反應(yīng)30秒及72℃下反應(yīng)30秒，循環(huán)25次。PCR完成后，對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠中回收長(zhǎng)約0.3kb的擴(kuò)增后DNA片段。利用DIG High-prime(Roche Diagnostics)、通過(guò)洋地黃毒甙配基對(duì)長(zhǎng)約0.3kb的DNA片段進(jìn)行標(biāo)記。
以洋地黃毒甙配基標(biāo)記的DNA為探針，利用HindIII(TakaraShuzo)、Sac I(Takara Shuzo)或HindIII及SacI進(jìn)行Southern雜交以消化參考實(shí)施例2-(1)中制備的熱堅(jiān)芽孢桿菌基因組DNA。按照粘貼到其上的操作指導(dǎo)，利用DIG熒光檢測(cè)試劑盒(RocheDiagnostics)來(lái)進(jìn)行雜交和檢測(cè)。結(jié)果，長(zhǎng)約4.5kb、5.8kb和1.3kb的DNA片段分別與探針進(jìn)行了雜交以利用HindIII、SacI、HindIII及Sac進(jìn)行消化。
在這些結(jié)果基礎(chǔ)上，利用HindIII對(duì)熱堅(jiān)芽孢桿菌基因組DNA進(jìn)行消化，并對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以從凝膠中回收長(zhǎng)約4.5kb的DNA。利用SacI對(duì)獲得的DNA片段進(jìn)行消化，并對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以從凝膠中回收長(zhǎng)約1.3kb的DNA。利用T4 DNA連接酶將獲得的DNA與已利用HindIII及SacI消化過(guò)的pUC19(Takara Shuzo)連接。利用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101。
將獲得的轉(zhuǎn)化體復(fù)制平鋪到Hybond-NTM(Amersham PharmaciaBiotech)上。隨后，按照傳統(tǒng)方法，利用上述提及的洋地黃毒甙配基標(biāo)記的探針進(jìn)行菌落雜交。從而，從獲得的正克隆中制備得到了質(zhì)粒pRHB1。
隨后確定了插入到pRHB1的DNA的核苷酸序列。對(duì)比由此核苷酸序列得到的氨基酸序列和枯草芽胞桿菌RNA酶HII的氨基酸序列，表明pRHB1中的DNA缺失從起始密碼子開(kāi)始的長(zhǎng)約40bp的區(qū)域。隨后，如下構(gòu)建了完全長(zhǎng)度的RNA酶H基因。
利用HindIII消化參考實(shí)施例2-(3)中制備的B25N16，并對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以從凝膠中回收長(zhǎng)約160bp的DNA片段。利用T4DNA連接酶將長(zhǎng)約160bp的DNA片段與已用HindIII消化過(guò)的pRHB1連接在一起。利用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101。從得到的轉(zhuǎn)化體中制備質(zhì)粒。
然后，在起始密碼子附近推測(cè)的核苷酸序列基礎(chǔ)上，合成了SEQ IDNO7所代表的寡核苷酸RNII-Nde。以從轉(zhuǎn)化體制備的質(zhì)粒為模板、以RNII-Nde及RNII-S6為引物進(jìn)行PCR。選取可從中擴(kuò)增長(zhǎng)約0.7kb的DNA片段的質(zhì)粒，并將其命名為pRHB11。
對(duì)插入到獲得的pRHB11質(zhì)粒中的DNA片段的核苷酸序列進(jìn)行確定。分析結(jié)果顯示存在可能編碼RNA酶HII的開(kāi)放閱讀框架。此核苷酸序列在SEQ ID NO8有展示。SEQ ID NO9展示了源自此核苷酸列的RNA酶HII的氨基酸序列。
質(zhì)粒pRHB11轉(zhuǎn)化過(guò)的大腸桿菌大腸桿菌HB101命名為大腸桿菌JM109/pRHB11，并于2000年9月5日(原始保藏日期)保藏于國(guó)際專(zhuān)利生物保藏機(jī)構(gòu)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏號(hào)為FERM BP-7655。
(5)熱堅(jiān)芽孢桿菌RNA酶II基因的表達(dá)將利用pRHB11或pRHB1轉(zhuǎn)化過(guò)的大腸桿菌HB101接種到5ml含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并在37℃下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)結(jié)束后，將離心收集后的細(xì)胞懸浮在0.5ml TE緩沖溶液中并進(jìn)行超聲處理。離心得到的上清液用作粗細(xì)胞提取物。
將10mM tris-HCl(pH8.0)、1mM二硫蘇糖醇(Nacalai Tesque)、0.003％牛血清白蛋白(fraction V，Sigma)、4％甘油、20μg/ml聚(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)及30μg/ml聚(rA)(AmershamPharmacia Biotech)混合在一起?；旌衔镌?7℃下孵育10min并用作RNA酶H活性測(cè)定的底物溶液。
將1μl1M MnCl2添加到100μl底物溶液中。40℃下孵育混合物。將10μl粗細(xì)胞提取物的10倍稀釋液添加到混合物中以起始反應(yīng)。40℃下反應(yīng)30min后，向其中加入10μl 0.5M EDTA中止反應(yīng)。隨后測(cè)定其在260nm下的吸光度。結(jié)果，從含有pRHB11的大腸桿菌HBI01制備得到的粗細(xì)胞提取物的反應(yīng)混合物在260nm下的吸光度要明顯高于從含有pRHB1的大腸桿菌HB101制備得到的粗細(xì)胞提取物的反應(yīng)混合物在260nm下的吸光度。因此，這證明pRHB11含有RNA酶H基因并且含有pRHB11的大腸桿菌表達(dá)了RNA酶H活性。
(6)制備純化的RNA酶HII制劑將參考實(shí)施例2-(4)中利用pRHB11轉(zhuǎn)化獲得的大腸桿菌HB101接種到1L含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并在37℃下振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)完成后，將離心收集的細(xì)胞懸浮在52.3ml超聲緩沖液[50mM tris-HCl(pH8.0)，2mM 2-巰基乙醇、10％甘油、2mM苯甲基磺酰氟]中并進(jìn)行超聲處理。在12000rpm下對(duì)超聲后的懸浮液離心10min，將得到的上清液在60℃下加熱15min。隨后重新在12000rpm下對(duì)其離心10min以收集上清液。從而，得到了50.0ml加熱后的上清液。
將溶液添加到已用緩沖溶液C[50mM tris-HCl(pH8.0)、2mM 2-巰基乙醇、10％甘油]平衡過(guò)的RESOURSE Q柱(Amersham PharmaciaBiotech)中，并利用FPLC體系(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行層析。結(jié)果，RNA酶HII從RESOURSE Q柱中流下。將51ml RNA酶HII級(jí)分添加到已用緩沖液C平衡過(guò)的RESOURSE S柱(AmershamPharmacia Biotech)上，通過(guò)FPLC體系進(jìn)行0-500mM NaCl線性梯度洗脫。約在240mM NaCl處洗脫得到含有RNA酶II的級(jí)分。將3.0mlRNA酶II級(jí)分分兩部分添加到已用含有50mM NaCl的緩沖液C平衡過(guò)的PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech)上。就得到的7.0ml洗脫液添加到已用含有50mM NaCl的緩沖液C平衡過(guò)的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，并利用FPLC體系進(jìn)行50-550mM NaCl的線性梯度洗脫。約在310mM NaCl處洗脫得到了含有RNA酶II的級(jí)分。利用Centricon-10(Amicon)進(jìn)行超濾濃縮得到了4.4mlRNA酶II級(jí)分。將280μl濃縮物添加到已用含有100mM NaCl和0.1mMEDTA的50mM tris-HCl(pH 8.0)平衡過(guò)的Superdex 200凝膠過(guò)濾柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，并利用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫。結(jié)果，RNA酶HII在相應(yīng)于35KD分子量的位置洗脫出來(lái)。此分子量與RNA酶HII的單體形式相對(duì)應(yīng)。將洗脫得到的RNA酶HII用作BcaRNA酶HII制劑。
對(duì)獲得的Bca RNA酶HII制劑的酶活性進(jìn)行如下測(cè)定。
將100μl已在40℃下孵育過(guò)的反應(yīng)混合物[20mM HEPES-氫氧化鉀(pH7.8)、0.01％牛血清白蛋白(Takara Shuzo)、1％二甲亞砜、10mM二氯化錳、20μg/ml聚(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)、30μg/ml聚(rA)(Amersham Pharmacia Biotech)]添加到1μl Bca RNA酶HII制劑中。將混合物在40℃下反應(yīng)10min。隨后向其中添加10μl 0.5MEDTA(pH 8.0)中止反應(yīng)。隨后測(cè)定其在260nm下的吸光度。
結(jié)果，在Bca RNA酶HII制劑中觀察到RNA酶H活性。參考實(shí)施例3克隆熱堅(jiān)芽孢桿菌RNA酶HIII基因(1)克隆RNA酶HIII基因片段在枯草芽胞桿菌和其他生物體中保存完好的區(qū)域的氨基酸序列基礎(chǔ)之上，合成了用于篩選編碼RNA酶HIII基因的、SEQ ID NO10-13所表示的引物BsuIII-1、BsuIII-3、BsuIII-6和BsuIII-8，而上述氨基酸序列是在枯草芽胞桿菌和其他生物體RNA酶HIII的氨基酸序列同源性的基礎(chǔ)上確定的[Biochemistry，38605-608(1999)]。
在50μl容器中，以參考實(shí)施例2-(1)中制備的200ng熱堅(jiān)芽孢桿菌基因組DNA為模板、以100pmol BsuIII-1和100pmol BsuIII-8為引物進(jìn)行第一次PCR。隨后，在100μl容器中，以1μl此反應(yīng)混合物為模板、以100pmol BsuIII-3和100pmol BsuIII-6為引物進(jìn)行第二次PCR。按照附加的操作指導(dǎo)，在此兩PCR中選用TaKaRa Taq聚合酶(Takara Shuzo)為DNA聚合酶。PCR操作如下94℃下反應(yīng)30秒，45℃下反應(yīng)30秒及72℃下反應(yīng)1min，持續(xù)25(第一次PCR)或30(第二次PCR)個(gè)循環(huán)。
長(zhǎng)約450bp的擴(kuò)增后DNA片段是利用T4 DNA聚合酶(TakaraShuzo)得到的鈍末端DNA片段，隨后對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以從凝膠中回收長(zhǎng)約450bp的擴(kuò)增后DNA片段。利用T4 DNA連接酶(TakaraShuzo)將此長(zhǎng)約450bp的DNA片段連接到已用Sma I(Takara Shuzo)消化過(guò)的pUC119(Takara Shuzo)上。利用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。培養(yǎng)生成的轉(zhuǎn)化體以獲取其中已插入有長(zhǎng)約450bp DNA片段的質(zhì)粒pBCA3204。
(2)利用Southern雜交法克隆RNA酶HIII基因?qū)⒖紝?shí)施例3-(1)中得到的pBCA3204的插入DNA片段的核苷酸序列進(jìn)行確定。在對(duì)此核苷酸序列確定的基礎(chǔ)上，合成了SEQ IDNO14和15所表示的引物RNIII-S3和BcaRNIII-3。在100μl容器中，以RNIII-S3和BcaRNIII-3為引物、以pBCA3204為模板，進(jìn)行PCR。按照附加的指導(dǎo)說(shuō)明，選用TaKaRa Z-Taq(Takara Shuzo)做為DNA聚合酶進(jìn)行PCR。PCR操作如下98℃下反應(yīng)0秒，55℃下反應(yīng)反應(yīng)0秒及72℃下反應(yīng)20秒，重復(fù)30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行苯酚-氯仿提取、乙醇沉淀和瓊脂糖凝膠電泳以從凝膠中回收長(zhǎng)約0.4kb的DNA片段。利用DIG DNA標(biāo)記試劑盒(BoehringerMannheim)對(duì)長(zhǎng)約0.4kb的DNA片段進(jìn)行標(biāo)記以制備探針。
利用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI或XbaI(購(gòu)自Takara Shuzo)將參考實(shí)施例2-(1)制備的20μg熱堅(jiān)芽孢桿菌基因組DNA完全消化。隨后，取每種消化后DNA的一半量進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。利用0.4N氫氧化鈉將這些DNA從瓊脂糖凝膠上轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，并在120℃下固定30分鐘。60℃下，在含有30ml雜交緩沖液[43.4g/L氯化鈉、17.6g/L檸檬酸鈉、1％封閉劑(Boehringer Mannheim)、0.1％ N-lauroyl肌氨酸、0.02％十二烷基硫酸鈉(SDS)]的密封袋中對(duì)此膜進(jìn)行4小時(shí)的預(yù)孵育，隨后，60℃下，在含有包含有探針的5ml雜交緩沖液的密封袋中對(duì)其孵育16小時(shí)。
室溫下，將此膜在含有0.1％SDS的50ml 2×SSC(17.5g/L NaCl，8.8g/L檸檬酸鈉)中沖洗兩次，45℃下，在含有0.1％SDS的50ml 0.5×SSC(4.3g/L氯化鈉，1.9g/L檸檬酸鈉)中沖洗兩次。隨后，利用DIG核酸檢測(cè)試劑盒(Boehringer Mannheim)檢測(cè)到具有與探針互補(bǔ)的序列的長(zhǎng)約8kb的EcoRI片段、長(zhǎng)約4.5kb的PstI片段及長(zhǎng)約1kb的HindIII片段。
對(duì)利用PstI完全消化的、剩余的一半熱堅(jiān)芽孢桿菌基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠中收集長(zhǎng)約4.5kb的PstI片段。隨后，將此DNA片段連接到已利用PstI消化的、且已利用堿性磷酸酶(TakaraShuzo)去磷酸化的質(zhì)粒載體pTV119N上。利用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。
在50μl容器中，以RNIII-S3和BcaRNIII-3為引物、以一個(gè)菌落為模板進(jìn)行PCR以篩選可能含有RNA酶HIII基因的菌落。按照附加的使用指導(dǎo)，選用TaKaRa-Z Taq(Takara Shuzo)進(jìn)行PCR。PCR操作如下98℃下反應(yīng)0秒，55℃下反應(yīng)0秒及72℃下反應(yīng)20秒，持續(xù)30個(gè)循環(huán)。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，在菌落N(xiāo)o.88中含有我們感興趣的基因。
以從菌落N(xiāo)o.88制備的質(zhì)粒為模板，利用引物對(duì)RN-N(TakaraShuzo)和BcaRNIII-3或引物對(duì)M4(Takara Shuzo)和RNIII-S3進(jìn)行PCR以檢驗(yàn)是否整個(gè)RNA酶HIII基因都包含在質(zhì)粒中。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，整個(gè)RNA酶HIII基因都包含在命名為pBCA3P88的質(zhì)粒中。
(3)確定含有RNA酶HIII基因的DNA片段的核苷酸序列利用雙脫氧法，確定參考實(shí)施例3-(2)中質(zhì)粒pBCA3P88的插入DNA片段的核苷酸序列。
對(duì)確定的核苷酸序列進(jìn)行的分析表明，其中存在編碼包括RNA酶HIII N-末端氨基酸序列在內(nèi)的氨基酸序列的開(kāi)放閱讀框架。開(kāi)放閱讀框架的核苷酸序列及由此核苷酸序列得到的RNA酶HIII的氨基酸序列分別如SEQ ID NO16和SEQ ID NO17所示。
(4)構(gòu)建RNA酶HIII的表達(dá)質(zhì)粒在體積為100μl的容器中，以參考實(shí)施例3-(2)中描述的質(zhì)粒pBCA3P88為模板、以SEQ ID NO18所代表的BcaRNIIINde和M13引物M4(Takara Shuzo)為引物進(jìn)行PCR，而B(niǎo)caRNIIINde是對(duì)上文提及的、RNA酶HIII的開(kāi)放閱讀框架周?chē)男蛄羞M(jìn)行設(shè)計(jì)得到的。按照附加的使用指導(dǎo)，選用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR操作如下94℃下反應(yīng)30秒，55℃下反應(yīng)30秒及72℃下反應(yīng)3min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)。利用NdeI(Takara Shuzo)對(duì)長(zhǎng)約4kb的擴(kuò)增后DNA片段進(jìn)行消化，并對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以從凝膠中回收長(zhǎng)約1.4kb的NdeI片段。將此長(zhǎng)約1.4kb的DNA片段連接到已利用NdeI消化過(guò)且已利用堿性磷酸酶(Takara Shuzo)去磷酸化后的pTV119Nd(一種質(zhì)粒，其中，pTV119N中的NcoI位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為NdeI位點(diǎn))上。利用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。
然后，在體積為50μl的容器中，以一個(gè)克隆為模板，以RN-N(Takara Shuzo)和BcaRNIII-3為引物，進(jìn)行PCR以篩選質(zhì)粒，而此質(zhì)粒中NdeI片段的RNA酶HIII的下游是與載體pTV119Nd中的1ac啟動(dòng)子相連的。隨后篩選可能含有RNA酶HIII的菌落。按照附加的指導(dǎo)說(shuō)明，利用TaKaRa-Z Taq(Takara Shuzo)進(jìn)行PCR。PCR操作如下98℃下反應(yīng)0秒，55℃下反應(yīng)0秒及72℃下反應(yīng)20秒，持續(xù)30個(gè)循環(huán)。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，菌落N(xiāo)o.2含有質(zhì)粒，而此質(zhì)粒的NdeI片段中的RNA酶HIII基因的下游是與載體pTV119Nd中的1ac啟動(dòng)子相連的。將此質(zhì)粒命名為pBCA3Nd2。
利用雙脫氧法對(duì)插入到質(zhì)粒中的DNA片段的核苷酸序列進(jìn)行確定，結(jié)果表明除起始密碼子GTG變?yōu)锳TG之外，PCR沒(méi)有引起任何突變。
將利用質(zhì)粒pBCA3Nd2轉(zhuǎn)化過(guò)的大腸桿菌JM109命名為大腸桿菌JM109/pBCA3Nd2，并于2000年9月5日(原始保藏日期)保藏于國(guó)際專(zhuān)利生物保藏機(jī)構(gòu)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏號(hào)為FERM BP-7653。
(5)制備純化的RNA酶HIII制劑將利用參考實(shí)施例3-(4)中得到的pBCA3Nd2轉(zhuǎn)化過(guò)的大腸桿菌JM109接種到2L含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃下振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)完成后，將離心收集的細(xì)胞懸浮在39.6ml超聲緩沖液[50mM tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，2mM苯甲基磺酰氟]中并進(jìn)行超聲處理。在轉(zhuǎn)速為12000rpm下，對(duì)超聲處理后的懸浮液離心10分鐘，60℃下，將得到的上清液加熱處理15分鐘。隨后，在12000rpm下對(duì)其再次離心10分鐘并收集上清液。從而得到了39.8ml加熱處理后的上清液。
將加熱處理后的上清液添加到已用緩沖液A[50mM tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA]平衡過(guò)的RESOURSE Q柱(Amersham PharmaciaBiotech)上，并利用FPLC體系(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行層析。結(jié)果，RNA酶HIII從RESOURSE Q柱中流下。
將45ml RNA酶HIII級(jí)分在2L緩沖液B[50mM tris-HCl(pH7.0)，1mM EDTA]中透析2小時(shí)。在相同條件下重復(fù)此透析2或多次。將55.8ml透析后的酶液添加到已用緩沖液B平衡過(guò)的RESOURSE S柱(AmershamPharmacia Biotech)上，利用FPLC體系進(jìn)行0-500mM NaCl線性梯度洗脫。在105mM NaCl處收集到含有RNA酶HIII的級(jí)分。
向7.0ml級(jí)分中添加含有1M NaCl的緩沖液B使NaCl濃度達(dá)到150mM。將混合物添加到已用含有150mM NaCl的緩沖液B平衡過(guò)的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)上。結(jié)果，RNA酶HIII從HiTrap-肝素柱中流下。
利用Centricon-10(Amicon)對(duì)7.5ml RNA酶HIII級(jí)分進(jìn)行超濾濃縮。將190μl濃縮液添加到已用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH7.0)平衡過(guò)的Superdex 200凝膠過(guò)濾柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，并利用同種緩沖液進(jìn)行洗脫。結(jié)果，RNA酶HIII在相當(dāng)于分子量為33KD的位置洗脫下來(lái)。此分子量與單體形式的RNA酶HIII的分子量相對(duì)應(yīng)。
將洗脫得到的RNA酶HIII用作Bca RNA酶HIII制劑。
獲得的Bca RNA酶HIII制劑的酶活性測(cè)定如下將在40℃孵育的100μl反應(yīng)混合物[20mM HEPES-氫氧化鉀(pH7.8)，0.01％牛血清白蛋白(Takara Shuzo)，1％二甲亞砜4mM醋酸鎂，20μg/ml聚(dT)(Amersham Pharmacia Biotech)，30μg/ml聚(rA)(Amersham Pharmacia Biotech)]添加到1μl Bca RNA酶HIII制劑中?；旌衔镌?0℃下反應(yīng)10分鐘。向其中添加10μl0.5MEDTA(pH 8.0)中止反應(yīng)。隨后在260nm下測(cè)定其吸光度。結(jié)果，我們?cè)贐ca RNA酶HIII制劑中觀察到RNA酶H活性。參考實(shí)施例4；克隆激烈熱球菌RNA酶HII基因(1)從激烈熱球菌中制備基因組DNA將2L含有1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)、0.5％酵母提取物(Difco Laboratories)、1％可溶性淀粉(Nacalai Tesque)、3.5％Jamarine S Solid(Jamarine Laboratory)、0.5％Jamarine S Liquid(Jamarine Laboratory)、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeSO4·7H2O、0.0001％CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001％ZnSO4、0.1ppmCuSO4·5H2O、0.1ppm KAl(SO4)2，0.1ppmH3BO4、0.1ppm Na2MoO4·2H2O及0.25ppm NiCl2·6H2O的培養(yǎng)基置于2L培養(yǎng)基容器中，120℃下滅菌20min，通氮?dú)庖则?qū)除其中的溶解氧，隨后將激烈熱球菌(購(gòu)自Deutsche Sammlung von Mikroorganismen；DSM3638)接種到培養(yǎng)基中，并在95℃下靜置培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)完成后，離心收集細(xì)胞。
隨后懸浮在將收集的細(xì)胞4ml 25％蔗糖、50mM tris-HCl(pH8.0)中。向其中添加0.4ml 10mg/ml氯化溶菌酶制劑(Nacalai Tesque)水溶液。此混合物在20℃下反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，向其中添加24ml含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)、0.2ml 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)及2ml 10％十二烷基硫酸鈉水溶液的混合物。將此混合物在37℃下孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，對(duì)此混合物進(jìn)行苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀以制備約1mg基因組DNA。
(2)克隆RNA酶HII基因Pyrococcus horikoshii的整個(gè)基因組序列已公開(kāi)[DNAResearch，555-76(1998)]。已知存在編碼基因組中的RNA酶HII(PH1650)的同系物的基因(SEQ ID NO19，National Institute ofTechnology and Evaluation的主頁(yè)http//www.nite.go.jp/)。
對(duì)PH1650基因和激烈熱球菌部分公開(kāi)的基因組序列(the homepage of University of Utah，Utah Genome Center；http//www.genome.utah.edu/sequence.html)間的同源性進(jìn)行搜索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了高度同源的序列。在此同源序列基礎(chǔ)上合成了引物1650Nde(SEQ ID NO20)和1650Bam(SEQ ID NO21)。
在100μl容器中，以參考實(shí)施例4-(1)中獲得的200ng激烈熱球菌基因組DNA為模板，以20pmol 1650Nde和20pmol 1650Bam為引物，進(jìn)行PCR。按照附加的操作指導(dǎo)，利用TaKaRa Ex Taq(TakaraShuzo)做DNA聚合酶來(lái)進(jìn)行PCR。PCR操作如下94℃下反應(yīng)30秒，55℃下反應(yīng)30秒，及72℃下反應(yīng)1min，持續(xù)30個(gè)循環(huán)。利用NdeI和BamHI(購(gòu)自Takara Shuzo)消化長(zhǎng)約0.7kb的擴(kuò)增后DNA片段。將得到的DNA片段插入到質(zhì)粒載體pET3a(Novagen)的NdeI位點(diǎn)與BamHI位點(diǎn)間以獲得質(zhì)粒pPFU220。
(3)確定含有RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列按照雙脫氧法，對(duì)參考實(shí)施例4-(2)中獲得的pPFU220的DNA插入片段的核苷酸序列進(jìn)行確定。
對(duì)確定后的核苷酸序列進(jìn)行的分析表明，其中存在可能編碼RNA酶HII的開(kāi)放閱讀框架。開(kāi)放閱讀框架的核苷酸序列如SEQ ID NO22所示。從此核苷酸序列得到的RNA酶HII氨基酸序列如SEQ ID NO23所示。
將利用質(zhì)粒pPFU220轉(zhuǎn)化過(guò)的大腸桿菌JM109命名為大腸桿菌JM109/pPFU220，并于2000年9月5日(原始保藏日期)保藏于國(guó)際專(zhuān)利生物保藏機(jī)構(gòu)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏號(hào)為FERM BP-7654。
(4)制備純化的RNA酶HII制劑利用參考實(shí)施例4-(2)中獲得的pPFU220轉(zhuǎn)化大腸桿菌HMS174(DE3)(Novagen)。將轉(zhuǎn)化后的含有pPFU220的HMS174(DE3)接種到2L含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并在37℃下振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)完成后，將離心收集的細(xì)胞懸浮在66.0ml超聲緩沖液[50mM tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，2mM苯甲基磺酰氟]中并進(jìn)行超聲處理。在12000rpm下對(duì)超聲后的懸浮液離心10min，將得到的上清液在60℃下加熱15min。隨后重新在12000rpm下對(duì)其離心10min以收集上清液。從而，得到了61.5ml加熱后的上清液。
將加熱處理后的溶液添加到已用緩沖溶液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡過(guò)的RESOURSE Q柱(Amersham PharmaciaBiotech)中，并利用FPLC體系(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行層析。結(jié)果，RNA酶HII從RESOURSE Q柱中流下。
將60ml RNA酶HII級(jí)分添加到已用緩沖液A平衡過(guò)的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，通過(guò)FPLC體系進(jìn)行0-500mMNaCl線性梯度洗脫。約在150mM NaCl處洗脫得到含有RNA酶II的級(jí)分。利用Centricon-10(Amicon)對(duì)2.0ml RNA酶II級(jí)分進(jìn)行超濾濃縮。將250μl濃縮物添加到已用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH8.0)平衡過(guò)的Superdex 200凝膠過(guò)濾柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，并利用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫。結(jié)果，RNA酶HII在相應(yīng)于17KD分子量的位置洗脫出來(lái)。此分子量與RNA酶HII的單體形式相對(duì)應(yīng)。
將洗脫得到的RNA酶HII用作Pfu RNA酶HII制劑。
如參考實(shí)施例3-(5)中所述，對(duì)獲得的Pfu RNA酶HII制劑進(jìn)行酶活性測(cè)定。結(jié)果，在Pfu RNA酶HII制劑中觀察到RNA酶H活性。參考實(shí)施例5克隆海棲熱袍菌RNA酶HII基因(1)從海棲熱袍菌中制備基因組DNA將2L含有1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％可溶性淀粉、3.5％Jamarine S Solid、0.5％ Jamarine S Liquid、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeSO4·7H2O、0.0001％ CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001％ZnSO4、0.1ppm CuSO4·5H2O、0.1ppm KAl(SO4)2，0.1ppm H3BO3、0.1ppm Na2MoO4·2H2O及0.25ppm NiCl2·6H2O的培養(yǎng)基置于2L培養(yǎng)基容器中，120℃下滅菌20min，通氮?dú)庖则?qū)除其中的溶解氧，隨后將海棲熱袍菌(購(gòu)自Deutsche Sammlung yonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSM3109)接種到培養(yǎng)基中，并在85℃下靜置培養(yǎng)16小時(shí)。
從300ml培養(yǎng)物中離心收集細(xì)胞，隨后將其懸浮在3ml TE緩沖液[10mM tris-HCl(pH 7.5)，1mM EDTA]中。向其中添加150μl 10％十二烷基硫酸鈉水溶液(Nacalai Tesque)和15μl 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)?；旌衔镌?7℃下孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，向混合物中添加0.5ml 5M NaCl。完全混合后，向混合物中添加0.4mlCTAB-NaCl溶液[10％溴棕三甲銨(Nacalai Tesque)，0.7M NaCl]。完全混合后，混合物在65℃下孵育10分鐘。向其中添加1.5ml氯仿/異戊醇混合物(24∶1，v/v)。將混合物輕輕混勻10min，并在20000xg下離心5分鐘。離心完成后，向得到的上清液中添加等體積的、飽和苯酚與100mM tris-HCl(pH8.0)/氨仿/異戊醇(25∶24∶1，v/v)的混合物。將混合物輕輕混勻10min，并在20000xg下離心5分鐘。離心完成后，向上清液中添加0.6體積的2-丙醇。利用70％乙醇水溶液沖洗在10000xg下離心5min后得到的沉淀物，風(fēng)干，隨后溶解在200μl TE中以形成基因組DNA溶液。
(2)克隆RNA酶HII基因?yàn)榱艘院珶崤劬蚪MDNA為模板進(jìn)行PCR，從而得到含有RNA酶H基因的擴(kuò)增后DNA片段，所以在部分核苷酸序列基礎(chǔ)之上(http//www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.html)，合成了SEQ ID NO24-27所表示的寡核苷酸915-F1、915-F2、915-R1和915-R2，而此部分核苷酸序列已鑒定為海棲熱袍菌基因組DNA的核苷酸序列中的RNA酶HII基因。
以參考實(shí)施例5-(1)中制備的海棲熱袍菌基因組DNA為模板，以915-F1和915-R1、915-F1和915-R2、915-F2和915-R1或915-F2和915-R2為引物對(duì)，進(jìn)行PCR。按照附加的操作指導(dǎo)，選用TaKaRa ExTaq為DNA聚合酶來(lái)進(jìn)行PCR。PCR操作如下95℃下反應(yīng)0.5min，55℃下反應(yīng)0.5min及72℃下反應(yīng)1.5min，持續(xù)25個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，對(duì)各個(gè)PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以提取和純化長(zhǎng)約0.7kb的擴(kuò)增后DNA片段。利用HindIII和XbaI(購(gòu)自Takara Shuzo)消化通過(guò)引物對(duì)915-F1和915-R1或915-F1和915-R2擴(kuò)增得到的DNA，并利用T4 DNA連接酶將其與已經(jīng)HindIII和XbaI消化后的pUC19連接。利用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。對(duì)得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)以制備其中插入有長(zhǎng)約0.7kbDNA的質(zhì)粒DNA。結(jié)果，獲得了含有利用915-F1和915-R1擴(kuò)增得到的DNA的質(zhì)粒No.1和No.2，及含有利用915-F1和915-R2擴(kuò)增得到的DNA的質(zhì)粒No.3和No.4。
此外，利用NcoI(Takara Shuzo)和XbaI雙重消化通過(guò)引物對(duì)915-F2和915-R1或915-F2和915-R2擴(kuò)增得到的DNA，并利用T4 DNA連接酶將其與經(jīng)由NcoI和XbaI雙重消化的pTV119N(Takara Shuzo)連接。利用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。
對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)以制備其中插入有長(zhǎng)約0.7kbDNA的質(zhì)粒DNA。結(jié)果，得到了含有利用915-F2和915-R1擴(kuò)增得到的DNA的質(zhì)粒No.5和No.6，及含有利用915-F2和915-R2擴(kuò)增得到的DNA的質(zhì)粒No.7。
將利用質(zhì)粒No.7轉(zhuǎn)化過(guò)的大腸桿菌JM109命名為大腸桿菌JM109/pTM-RNH，并于2000年9月5日(原始保藏日期)保藏于國(guó)際專(zhuān)利生物保藏機(jī)構(gòu)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏號(hào)為FERM BP-7652。
(3)表達(dá)海棲熱袍菌RNA酶HII基因?qū)⒗觅|(zhì)粒No.1-7中的一種質(zhì)粒或pUC19轉(zhuǎn)化過(guò)的大腸桿菌JM109接種到含有100μg/ml氨芐青霉素的5ml LB培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，pH7.2)中，并在37℃下振蕩培養(yǎng)。當(dāng)在660nm下的吸光度達(dá)到0.5時(shí)，向其中添加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷直至其濃度為1mM，并將細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)完成后，將離心收集的細(xì)胞懸浮在1ml TE緩沖液中并進(jìn)行超聲處理。80℃下，對(duì)超聲處理后懸浮液進(jìn)行10分鐘加熱處理。離心得到的上清液用作粗細(xì)胞提取物。如參考實(shí)施例2-(5)中所述，對(duì)粗細(xì)胞提取物進(jìn)行吸光度測(cè)定。結(jié)果，當(dāng)在MnCl2存在下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，從含有質(zhì)粒No.3、5、6或7的大腸桿菌JM109制備的粗細(xì)胞提取物在260nm處的吸光度要明顯高于從含有pUC19的大腸桿菌JM109制備的粗細(xì)胞提取物在260nm處的吸光度。因此，這證明質(zhì)粒No.3、5、6和7含有RNA酶H基因，并且含有這些質(zhì)粒中的一種質(zhì)粒的大腸桿菌表達(dá)了此RNA酶H活性。
對(duì)質(zhì)粒中的DNA插入片段的部分核苷酸序列進(jìn)行了確定，而已證明此質(zhì)?？稍诖竽c桿菌中表達(dá)RNA酶活性。對(duì)已進(jìn)行確定的核苷酸序列進(jìn)行的分析表明，其中含有可能編碼RNA酶HII的開(kāi)放閱讀框架。開(kāi)放閱讀框架的核苷酸序列在SEQ ID NO143中有示。衍生自此核苷酸序列的RNA酶HII的氨基酸序列在SEQ ID NO144中有示。隨后，我們發(fā)現(xiàn)，在質(zhì)粒No.7的DNA插入片段的部分核苷酸序列中可觀察到可能由PCR引起的堿基替代，而此替代造成了其編碼的氨基酸殘基發(fā)生變化。
(4)制備純化的RNA酶HII制劑利用參考實(shí)施例5-(2)中獲得的pTM-RNH轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。將含有pTM-RNH的轉(zhuǎn)化后大腸桿菌JM109接種到1L含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并在37℃下振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)完成后，將離心收集的細(xì)胞懸浮在31.0ml超聲緩沖液[50mM tris-HCl(pH8.0)，2mM 2-巰基乙醇、10％甘油、2mM苯甲基磺酰氟]中并進(jìn)行超聲處理。在12000rpm下對(duì)超聲后的懸浮液離心10min，將得到的上清液在70℃下加熱15min。隨后重新在12000rpm下對(duì)其離心10min以收集上清液。從而，得到了32.0ml加熱處理后的上清液。
將加熱處理后的上清液添加到已用緩沖溶液C[50mM tris-HCl(pH8.0)、2mM 2-巰基乙醇、10％甘油]平衡過(guò)的RESOURSE Q柱(Amersham Pharmacia Biotech)中，并利用FPLC體系(AmershamPharmacia Biotech)進(jìn)行層析。結(jié)果，RNA酶HII從RESOURSE Q柱中流下。將32.5ml RNA酶HII級(jí)分添加到已用緩沖液C平衡過(guò)的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，通過(guò)FPLC體系進(jìn)行0-500mM NaCl線性梯度洗脫。約在240mM NaCl處洗脫得到含有RNA酶II的級(jí)分。將2.0ml RNA酶II級(jí)分添加到已用含有50mMNaCl的緩沖液C平衡過(guò)的PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech)上。將得到的3.5ml洗脫液添加到已用含有50mM NaCl的緩沖液C平衡過(guò)的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，并利用FPLC體系進(jìn)行50-550mM NaCl的線性梯度洗脫。結(jié)果，約在295mM NaCl處洗脫得到了含有RNA酶II的級(jí)分。利用Centricon-10(Amicon)進(jìn)行超濾濃縮得到了4.4ml RNA酶II級(jí)分。將RNA酶HII洗脫液用作Tma RNA酶HII制劑。
如參考實(shí)施例2-(6)所述，對(duì)制得的Tma RNA酶HII制劑進(jìn)行酶活性測(cè)定。結(jié)果，在Tma RNA酶HII制劑中觀察到RNA酶H活性。參考實(shí)施例6從Pyrococcus horikoshii中克隆RNA酶HII基因(1)從Pyrococcus horikoshii中制備基因組DNA將2L含有1％胰蛋白胨(Difco Laboratories)、0.5％酵母提取物(Difco Laboratories)、1％可溶性淀粉(Nacalai Tesque)、3.5％Jamarine S Solid(Jamarine Laboratory)、0.5％Jamarine S Liquid(Jamarine Laboratory)、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeSO4·7H2O、0.0001％CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001％ZnSO4、0.1ppmCuSO4·5H2O、0.1ppm KAl(SO4)2，0.1ppm H3BO4、0.1ppm Na2MoO4·2H2O及0.25ppm NiCl2·6H2O的培養(yǎng)基置于2L培養(yǎng)基容器中，120℃下滅菌20min，通氮?dú)庖则?qū)除其中的溶解氧，隨后將Pyrococcus horikoshii OT3(購(gòu)自the Institute of Physical andChemical Research(RIKEN)；JCM9974)接種到培養(yǎng)基中，并在95℃下靜置培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)完成后，離心收集細(xì)胞。
隨后將收集的細(xì)胞懸浮在4ml25％蔗糖、50mM tris-HCl(pH 8.0)中。向其中添加0.4ml 10mg/ml氯化溶菌酶制劑(Nacalai Tesque)水溶液。此混合物在20℃下反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，向其中添加24ml含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)、0.2ml 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)及2ml 10％十二烷基硫酸鈉水溶液的混合物。此混合物在37℃下孵育1小時(shí)。
反應(yīng)完成后，對(duì)此混合物進(jìn)行苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀以制備約1mg基因組DNA。
(2)克隆RNA酶HII基因Pyrococcus horikoshii的整個(gè)基因組序列已公開(kāi)[DNAResearch，5；55-76(1998)]。已知存在編碼基因組中的RNA酶HII(PH1650)的同系物的基因(SEQ ID NO145，National Institte ofTechnology and Evaluation的主頁(yè)http//www.nite.go.jp/)。
在此PH1650基因(SEQ ID NO145)的序列的基礎(chǔ)上合成了引物PhoNde(SEQ ID NO146)和PhoBam(SEQ ID NO147)。
在100μl容器中，以參考實(shí)施例6-(1)中獲得的100ng Pyrococcushorikoshii基因組DNA為模板，以20pmol PhoNde和20pmol PhoBam為引物，進(jìn)行PCR。按照附加的操作指導(dǎo)，利用TaKaRa Ex Taq(TakaraShuzo)做DNA聚合酶來(lái)進(jìn)行PCR。PCR操作如下94℃下反應(yīng)30秒，55℃下反應(yīng)30秒，及72℃下反應(yīng)1min，持續(xù)40個(gè)循環(huán)。利用NdeI和BamHI(購(gòu)自Takara Shuzo)消化長(zhǎng)約0.7kb的擴(kuò)增后DNA片段。隨后，將得到的DNA片段結(jié)合到質(zhì)粒載體pET3a(Novagen)的NdeI位點(diǎn)與BamHI位點(diǎn)間以獲得質(zhì)粒pPHO238。
(3)確定含有RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列按照雙脫氧法，對(duì)參考實(shí)施例6-(2)中獲得的pPHO238的DNA插入片段的核苷酸序列進(jìn)行確定。
對(duì)經(jīng)確定后的核苷酸序列進(jìn)行的分析表明，其中存在可能編碼RNA酶HII的開(kāi)放閱讀框架。開(kāi)放閱讀框架的核苷酸序列在SEQ ID NO148中有示。由此核苷酸序列得到的RNA酶HII氨基酸序列在SEQ IDNO149中有示。
將利用質(zhì)粒pPHO238轉(zhuǎn)化過(guò)的大腸桿菌JM109命名為大腸桿菌JM109/pPHO238，并于2000年9月5日(原始保藏日期)保藏于國(guó)際專(zhuān)利生物保藏機(jī)構(gòu)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏號(hào)為FERM BP-7692。
(4)制備純化的RNA酶HII制劑利用參考實(shí)施例6-(2)中獲得的pPHO238轉(zhuǎn)化的大腸桿菌HMS174(DE3)(Novagen)。將轉(zhuǎn)化后的含有pPHO238的HMS174(DE3)接種到1L含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并在37℃下振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)完成后，將離心收集的細(xì)胞懸浮在34.3ml超聲緩沖液[50mM tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA，2mM苯甲基磺酰氟]中并進(jìn)行超聲處理。在12000rpm下對(duì)超聲后的懸浮液離心10min，將得到的上清液在80℃下加熱15min。隨后重新在12000rpm下對(duì)其離心10min以收集上清液。從而，得到了33.5ml加熱后的上清液。
將加熱處理后的溶液添加到已用緩沖溶液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡過(guò)的RESOURSE Q柱(Amersham PharmaciaBiotech)中，并利用FPLC體系(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行層析。結(jié)果，RNA酶HII從RESOURSE Q柱中流下。
在2L緩沖液B(50mM tris-HCl(pH7.0)，1mM EDTA)中對(duì)35.0mlRNA酶HII級(jí)分進(jìn)行2小時(shí)的透析。將34.5ml透析后的酶液添加到已用緩沖液B平衡過(guò)的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)上并利用FPLC體系進(jìn)行0-500mM NaCl的線性梯度洗脫。約在150mMNaCl處洗脫得到含有RNA酶II的級(jí)分。
向4.0ml級(jí)分中添加緩沖液B直至NaCl濃度達(dá)到50mM。將混合物添加到已用含有50mM NaCl的緩沖液B平衡過(guò)的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，利用FPLC體系進(jìn)行50-550mMNaCl線性梯度洗脫。結(jié)果，約在160mM NaCl收集到含有RNA酶HII的級(jí)分。
利用Centricon-10(Amicon)對(duì)6.9ml RNA酶II級(jí)分進(jìn)行超濾濃縮。將250μl濃縮物分為兩部分，并添加到已用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH7.0)平衡過(guò)的Superose 6凝膠過(guò)濾柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，利用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫。結(jié)果，RNA酶HII在相應(yīng)于24.5KD分子量的位置洗脫出來(lái)。此分子量與RNA酶HII的單體形式相對(duì)應(yīng)。
將洗脫得到的RNA酶HII用作Pho RNA酶HII制劑。
如參考實(shí)施例3-(5)中所述，對(duì)獲得的Pho RNA酶HII制劑進(jìn)行酶活性測(cè)定。結(jié)果，在Pho RNA酶HII制劑中觀察到RNA酶H活性。參考實(shí)施例7從閃爍古生球菌中克隆RNA酶HII基因(1)從閃爍古生球菌中制備基因組DNA將從8ml細(xì)胞培養(yǎng)物中收集的閃爍古生球菌(購(gòu)自DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSM4139)細(xì)胞懸浮在100μl 25％蔗糖、50mM tris-HCl(pH8.0)中。向其中添加20μl 0.5M EDTA和10μl 10mg/ml氯化溶菌酶制劑(NacalaiTesque)水溶液。此混合物在20℃下反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，向其中添加800μl含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM tris-HCl(pH8.0)、10μl 20mg/ml蛋白酶K(Takara Shuzo)及50μl10％十二烷基硫酸鈉水溶液的混合物。此混合物在37℃下孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，對(duì)此混合物進(jìn)行苯酚-氯仿提取、乙醇沉淀并風(fēng)干，隨后將其溶解在50μl TE中以獲得基因組DNA溶液。
(2)克隆RNA酶HII基因閃爍古生球菌的整個(gè)基因組序列已公開(kāi)[Nature，390364-370(1997)]。已知存在編碼基因組中的RNA酶HII(AF0621)的同系物的基因(SEQ ID NO150，http//www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.htlm)。
在AF0621基因(SEQ ID NO150)的序列的基礎(chǔ)上合成了引物AfuNde(SEQ ID NO151)和AfuBam(SEQ ID NO152)。
在100μl容器中，以參考實(shí)施例7-(1)中獲得的100ng閃爍古生球菌基因組DNA為模板，以20pmol AfuNde和20pmol AfuBam為引物，進(jìn)行PCR。按照附加的操作指導(dǎo)，利用Pyrobest DNA聚合酶(TakaraShuzo)做DNA聚合酶來(lái)進(jìn)行PCR。PCR操作如下94℃下反應(yīng)30秒，55℃下反應(yīng)30秒，及72℃下反應(yīng)1min，持續(xù)40個(gè)循環(huán)。利用NdeI和BamHI(購(gòu)自Takara Shuzo)消化長(zhǎng)約0.6kb的擴(kuò)增后DNA片段。隨后，將得到的DNA片段結(jié)合到質(zhì)粒載體pTV119Nd(一種質(zhì)粒，其中，pTV119N中的NcoI位點(diǎn)轉(zhuǎn)化為NdeI位點(diǎn))的NdeI位點(diǎn)與BamHI位點(diǎn)間以構(gòu)建質(zhì)粒pAFU204。
(3)確定含有RNA酶HII基因的DNA片段的核苷酸序列按照雙脫氧法，對(duì)參考序列7-(2)中獲得的pAFU204的DNA插入片段的核苷酸序列進(jìn)行確定。
對(duì)經(jīng)確定后的核苷酸序列進(jìn)行的分析表明，其中存在可能編碼RNA酶HII的開(kāi)放閱讀框架。開(kāi)放閱讀框架的核苷酸序列在SEQ ID NO153中有示。從此核苷酸序列得到的RNA酶HII氨基酸序列在SEQ IDNO154中有示。
將利用質(zhì)粒pAFU204轉(zhuǎn)化過(guò)的大腸桿菌JM109命名為大腸桿菌JM109/pAFU204，并于2001年2月22日(原始保藏日期)保藏于國(guó)際專(zhuān)利生物保藏機(jī)構(gòu)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏號(hào)為FERM BP-7691。
(4)制備純化的RNA酶HII制劑利用參考實(shí)施例7-(2)中獲得的pAFU204轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109。將轉(zhuǎn)化后的含有pAFU204的JM109接種到2L含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并在37℃下振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。培養(yǎng)完成后，將離心收集的細(xì)胞懸浮在37.1ml超聲緩沖液[50mM tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，2mM苯甲基磺酰氟]中并進(jìn)行超聲處理。在12000rpm下對(duì)超聲后的懸浮液離心10min，將得到的上清液在70℃下加熱15min。隨后重新在12000rpm下對(duì)其離心10min以收集上清液。從而，得到了40.3ml加熱后的上清液。
將加熱處理后的溶液添加到已用緩沖溶液A[50mM tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA]平衡過(guò)的RESOURSE Q柱(Amersham PharmaciaBiotech)中，并利用FPLC體系(Amersham Pharmacia Biotech)進(jìn)行層析。結(jié)果，RNA酶HII從RESOURSE Q柱中流下。
將RNA酶HII級(jí)分添加到已用緩沖液A平衡過(guò)的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，并利用FPLC體系(AmershamPharmacia Biotech)進(jìn)行層析。結(jié)果，RNA酶HII從RESOURSE Q柱中流下。
在2L含有50mM NaCl緩沖液B(50mM tris-HCl(pH7.0)，1mMEDTA)中對(duì)40.0ml RNA酶HII級(jí)分進(jìn)行2小時(shí)的透析。重復(fù)兩次這樣的透析。將40.2ml透析后的酶液添加到已用含有50mM NaCl的緩沖液B平衡過(guò)的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，利用FPLC體系進(jìn)行50-550mM NaCl線性梯度洗脫。結(jié)果，約在240mM NaCl處收集到含有RNA酶HII的級(jí)分。
利用Centricon-10(Amicon)對(duì)7.8ml RNA酶II級(jí)分進(jìn)行超濾濃縮。將600μl濃縮物分為四部分，將每一部分分別添加到已用含有100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM tris-HCl(pH7.0)平衡過(guò)的Superose 6凝膠過(guò)濾柱(Amersham Pharmacia Biotech)上，利用相同的緩沖液進(jìn)行洗脫。結(jié)果，RNA酶HII在相應(yīng)于30.0KD分子量的位置洗脫出來(lái)。此分子量與RNA酶HII的單體形式相對(duì)應(yīng)。
將上述洗脫得到的RNA酶HII用作Afu RNA酶HII制劑。
如參考實(shí)施例3-(5)中所述，對(duì)獲得的Afu RNA酶HII制劑進(jìn)行酶活性測(cè)定。結(jié)果，在Afu RNA酶HII制劑中觀察到RNA酶H活性。
參考實(shí)施例8按照下列方法對(duì)源自本發(fā)明的方法中選用的大腸桿菌的RNA酶H進(jìn)行酶活力單位測(cè)定(1)制備選用的試劑溶液用于活性確定的反應(yīng)混合物下列物質(zhì)以指定的終濃度溶解在無(wú)菌水中40mM tris-鹽酸鹽(37℃下，pH7.7)、4mM氯化鎂、1mM DTT、0.003％BSA、4％甘油和24μM聚(dT)。
聚[8-3H]腺苷酸溶液；將370kBq聚[8-3H]腺苷酸溶液溶解在200μl無(wú)菌水中多聚腺苷酸溶液；將多聚腺苷酸溶解在無(wú)菌超純水中，濃度為3mM。
酶稀釋液；下列物質(zhì)以指定的終濃度溶解在無(wú)菌水中；25mM tris-鹽酸鹽(37℃下，pH7.5)、5mM 2-巰基乙醇、0.5mM EDTA(37℃下，pH7.5)、30mM氯化鈉和50％甘油。
制備熱變性的小牛胸腺DNA將200mg小牛胸腺DNA懸浮并溶脹在100ml TE緩沖液中。在UV260nm的吸光度測(cè)定的基礎(chǔ)上，利用無(wú)菌超純水將其稀釋到濃度為1mg/ml。將稀釋液在100℃下加熱10min，隨后在冰浴中迅速冷卻。
(2)活性測(cè)定方法將7μl聚[8-3H]腺苷酸溶液添加到985μl反應(yīng)混合物中以確定上文(1)中制備的酶液的活性。將此混合物在37℃下孵育10分鐘。向混合物中添加8μl腺苷酸使其濃度達(dá)到24μM。將混合物進(jìn)一步在37℃下孵育5分鐘。從而，制備了1000μl聚[8-3H]rA-聚-dT反應(yīng)混合物。隨后去200μl反應(yīng)混合物在30℃下孵育5分鐘。向其中添加1μl的適當(dāng)系列稀釋后的酶液。每隔一定時(shí)間從反應(yīng)混合物中取出50μl樣品以用于隨后的測(cè)定。從添加酶液到采樣的時(shí)間定義為Y，以分鐘表示。通過(guò)添加1μl酶稀釋液而不是酶溶液，制備了用于總CPM測(cè)定或用做空白的50μl反應(yīng)混合物。向樣品中添加100μl 100mM焦磷酸鈉、50μl熱變性的小牛胸腺DNA溶液及300μl 10％三氯乙酸(300μl超純水用于總CPM測(cè)定)。將混合物在0℃下孵育5分鐘，隨后在10000rpm下離心10min。離心完成后，將得到的250μl上清液置于小玻璃瓶中。向其中添加10ml水溶膠-2(NEN Life Science Products)。在液體閃爍計(jì)數(shù)器中測(cè)定CPM。
(3)酶活力單位計(jì)算按下列方程式計(jì)算每種酶的酶活力單位酶活力單位/ml＝{(測(cè)定的CPM-空白CPM)×1.2*×20×1000×稀釋率}200(μl)/(總CPM×Y(min.)×50(μl)×9**)1.2*；每50μl酶液的總CPM中含有的聚[8-3H]rA-聚-dT量，以nmol表示。
9**；糾正系數(shù)實(shí)施例1利用本發(fā)明中的方法檢測(cè)腸出血性大腸桿菌O-157本實(shí)施例中選用的引物的序列在序列表SEQ ID NO31-34中有示。利用每個(gè)都含有SEQ ID NO31或32的引物構(gòu)建其引物結(jié)合體以用于檢測(cè)編碼O-157 vero毒素(VT)1的序列，以及利用每個(gè)都含有SEQ ID NO33或34的引物構(gòu)建其引物結(jié)合體以用于檢測(cè)編碼O-157veto毒素(VT)2的序列。培養(yǎng)腸出血性大腸桿菌O-157(ATCC編號(hào)43895)，收集細(xì)胞，將細(xì)胞以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度懸浮在無(wú)菌水中，在98℃下對(duì)其加熱處理10min，這樣制備得到了熱水提取物，以此熱水提取物為模板。反應(yīng)混合物的組成如下。
在48μl反應(yīng)體積中含有27mM磷酸緩沖液(pH7.3)、0.01％牛血清白蛋白(BSA)、5％二甲亞砜(DMSO)、每種dNTP各1mM、8mM醋酸鎂、每種引物各60pmol、相當(dāng)于104-106個(gè)細(xì)胞的DNA的模板DNA(熱水提取物)及無(wú)菌蒸餾水。在98℃下將反應(yīng)混合物加熱1min使其熱變性，隨后冷卻到55℃。向其中添加5.5U BcaBEST DNA聚合酶和60U大腸桿菌RNA酶H。反應(yīng)混合物在55℃下孵育60min。其后，在90℃加熱此混合物2min以使酶變性。每種反應(yīng)混合物各取3μl并在4％NuSieve 3∶1瓊脂糖(Takara Shuzo)上進(jìn)行電泳。結(jié)果，利用一種引物對(duì)和相當(dāng)于104個(gè)細(xì)胞DNA的模板DNA就可對(duì)O-157 veto毒素1和2進(jìn)行檢測(cè)，這進(jìn)一步確定了本發(fā)明的方法可用做毒性細(xì)菌檢測(cè)方法。實(shí)施例2(1)對(duì)本發(fā)明的方法中選用的緩沖液類(lèi)型的效應(yīng)進(jìn)行檢驗(yàn)。在本實(shí)施例中，選用可對(duì)含有SEQ ID NO39和40所表示的序列的λDNA進(jìn)行擴(kuò)增的引物。反應(yīng)操作如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，在98℃下，將10μl含有每種引物各120pmol、0.01％丙二胺水溶液、10ng或1ng模板DNA的混合物加熱變性2分鐘，隨后在冰上冷卻以使引物退火到模板DNA上。將在擴(kuò)增后隨后就利用Suprec02(Takara Shuzo)進(jìn)行純化的擴(kuò)增后產(chǎn)物(1005bp)作為模板，而此擴(kuò)增后產(chǎn)物是利用λDNA(TakaraShuzo)為模板及以SEQ ID NO41和42所表示的序列為引物進(jìn)行PCR得到的。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有每種dNTP各0.625mM、5.0mM醋酸鎂、0.0125％牛血清白蛋白(BSA)，1.25％二甲亞砜(DMSO)、30U大腸桿菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的三種反應(yīng)緩沖液(42.5mM Tricine-氫氧化鉀(pH8.5)、42.5mM N-二[羥乙基]甘氨酸-氫氧化鉀緩沖液(pH8.3)及42.5mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8))中的一種，使終體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在60℃下孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳以進(jìn)行進(jìn)一步的證明。隨后，觀察到以多種模板進(jìn)行擴(kuò)增后得到的感興趣的片段。特別的，從含有N-二[羥乙基]甘氨酸-氫氧化鉀緩沖液(pH8.5)的反應(yīng)體系中可獲得更大量的擴(kuò)增產(chǎn)物。
(2)對(duì)利用HEPES-氫氧化鉀緩沖液取得的活性提高進(jìn)行檢驗(yàn)。以含有插入到多克隆位點(diǎn)中的長(zhǎng)約150bp的DNA片段的pUC19質(zhì)粒DNA為模板。此模板的制備如下。
利用含有SEQ ID NO134和135所表示的序列的pUC19 upper 150PCR引物和pUC19 lower PCR引物、以100pg pUC19質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR。利用Microcon-100對(duì)擴(kuò)增后的片段進(jìn)行純化，利用DNA鈍化試劑盒(Takara Shuzo)進(jìn)行鈍末端化，并將其亞克隆到質(zhì)粒pUC19的HincII位點(diǎn)中。利用含有插入的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。利用QIAGEN質(zhì)粒微型試劑盒(Qiagen)從細(xì)胞中純化具有插入DNA的質(zhì)粒，并將其作為模板。
將PCR擴(kuò)增后的DNA片段用做模板，而此擴(kuò)增后片段是通過(guò)以上述制備的pUC19-150質(zhì)粒DNA為模板、利用含有SEQ ID NO35和36所表示的核苷酸序列的引物MCS-F和MCS-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的。將含有SEQ ID NOS37和38所表示的核苷酸序列的引物MF2N3(24)和MR1N3(24)作為嵌合寡核苷酸引物。結(jié)合利用這些引物而獲得的擴(kuò)增后片段的大小約為350bp。
選擇HEPES-氫氧化鉀緩沖液體系作為待測(cè)緩沖液。磷酸鉀緩沖液體系和Tricine緩沖液體系作為對(duì)照。反應(yīng)緩和物組成如下所示。
反應(yīng)混合物A10ng PCR擴(kuò)增后片段，引物MF2N 3(24)和MR1N3(24)各50pmol，0.01％丙二胺水溶液及無(wú)菌水，反應(yīng)體積為10μl。
反應(yīng)混合物B制備下列三種類(lèi)型緩沖液體系。
磷酸鉀緩沖液體系制備40μl含有終濃度為35mM磷酸鉀緩沖液(pH7.5)、1.25％DMSO、0.0125％BSA、5mM醋酸鎂、每種dNTP各0.625mM、60U大腸桿菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶的反應(yīng)混合物。
Tricine緩沖液體系；制備40μl含有終濃度為42.5mM Tricine緩沖液(pH8.7)、12.5mM氯化鉀、12.5mM硫酸銨、1.25％DMSO、0.0125％BSA、5mM醋酸鎂、每種dNTP各0.625mM、30U大腸桿菌RNA酶H及5.5U BcaBEST DNA聚合酶的反應(yīng)混合物。
HEPES-氫氧化鉀緩沖液體系；制備40μl含有終濃度為25mMHEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、125mM醋酸鉀、1.25％DMSO、0.0125％BSA、5mM醋酸鎂、每種dNTP各0.625mM、30U大腸桿菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶的反應(yīng)混合物。
將反應(yīng)混合物A在98℃下加熱變性2min，冷卻到60℃或65℃，隨后在冰上靜置。將一份反應(yīng)緩和物B添加到置于冰上的反應(yīng)混合物A中，將其混合并使體積達(dá)到50μl。在60℃或65℃下孵育反應(yīng)混合物1小時(shí)。反應(yīng)完成后，將其冷卻到4℃，并向每種反應(yīng)緩沖液中添加1/10體積0.5 M EDTA中止反應(yīng)。每種反應(yīng)混合物各取3μl，在3％NuSieve3∶1瓊脂糖凝膠上對(duì)其進(jìn)行電泳。結(jié)果，不管反應(yīng)溫度如何，在此三種緩沖液體系中都觀察到感興趣的擴(kuò)增后片段。特別的，在此實(shí)施例中，在HEPES-氫氧化鉀緩沖液體系中觀察到最大量的擴(kuò)增產(chǎn)物和最高的活性。實(shí)施例3(1)對(duì)本發(fā)明的方法中引物與模板退火的條件進(jìn)行檢驗(yàn)在WO 97/32010中描述的黃桿菌亞種SA-0082(1995年3月29日已經(jīng)保藏于國(guó)際專(zhuān)利生物保藏機(jī)構(gòu)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏號(hào)為FERM P-14872，并保藏于國(guó)際專(zhuān)利生物保藏機(jī)構(gòu)通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki 305-8566，日本，保藏號(hào)為FERM BP-5402(要求轉(zhuǎn)移到國(guó)際托管權(quán)威機(jī)構(gòu)的日期為；1996年2月15日))的部分核苷酸序列基礎(chǔ)上，選用含有SEQ ID NO43和44所表示的序列的引物。在本實(shí)施例中，選用擴(kuò)增后的且隨后利用Suprec02(TakaraShuzo)進(jìn)行純化的擴(kuò)增產(chǎn)物(573bp)做為DNA模板，而此擴(kuò)增后產(chǎn)物是以黃桿菌亞種SA-0082的基因組DNA為模板、結(jié)合利用SEQ IDNO45和46所表示的引物進(jìn)行PCR得到的。反應(yīng)操作如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，將2μl兩種退火溶液(500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺，或0.05％丙二胺)中的一種添加到每種引物濃度均為120pmol的溶液中。每種終體積均為10μl的混合物中進(jìn)一步含有10ng或1ng PCR擴(kuò)增片段，在98℃下使其加熱變性2min。變性后，混合物在冰上迅速冷卻以使引物退火到模板上。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有每種dNTP各0.625mM、5.0mM醋酸鎂、0.0125％牛血清白蛋白(BSA)，1.25％二甲亞砜(DMSO)、30U大腸桿菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的三種反應(yīng)緩沖液(42.5mM Tricine-氫氧化鉀(pH8.5)、42.5mM N-二[羥乙基]甘氨酸-氫氧化鉀緩沖液(pH8.3)及42.5mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8))中的一種，使終體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在52℃下孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖1所示。圖1例示了結(jié)合利用退火溶液和緩沖液進(jìn)行反應(yīng)的電泳結(jié)果。泳道1；分子量標(biāo)記(100bp梯，TakaraShuzo)；泳道2；丙二胺/Tricine(模板；10ng)；泳道3；丙二胺/HEPES(模板；10ng)；泳道4；丙二胺/HEPES(模板；1ng)；泳道5；丙二胺/N-二[羥乙基]甘氨酸(模板；10ng)；泳道6；丙二胺/N-二[羥乙基]甘氨酸(模板；1ng)；泳道7；500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺/N-二[羥乙基]甘氨酸(模板；10ng)；泳道8；500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺/N-二[羥乙基]甘氨酸(模板；1ng)；泳道9；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道10；丙二胺/Tricine(模板；1ng)；泳道11；500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺/Tricine(模板；1ng)；泳道12；丙二胺/HEPES(模板；1ng)；泳道13；500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺/HEPES(模板；1ng)；泳道14；丙二胺/N-二[羥乙基]甘氨酸(模板；1ng)；及泳道15；500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺/N-二[羥乙基]甘氨酸(模板；1ng)如圖1所示，不管模板DNA的量，當(dāng)含有500mM氫氧化鉀+8μM亞精胺的退火溶液用于此三種緩沖溶液中的引物與DNA模板退火時(shí)，我們可獲得更大量的感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。特別的，在本實(shí)施例中，結(jié)合使用含有500mM氫氧化鉀+8μM亞精胺的退火溶液與N-二[羥乙基]甘氨酸-氫氧化鉀緩沖溶液會(huì)收到好的效果。
(2)如果源自λDNA的PCR擴(kuò)增片段作為模板時(shí)，對(duì)退火溶液的效用進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)施例中選用實(shí)施例2(1)所述的嵌合寡核苷酸引物。以實(shí)施例2(1)中制備的PCR擴(kuò)增片段或λDNA為模板DNA。反應(yīng)操作如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，將2μl三種退火溶液(500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺，0.05％丙二胺，或無(wú)菌水)中的一種添加到120pmol引物中。制備10μl進(jìn)一步含有10ng或1ng PCR擴(kuò)增片段的混合物。在98℃下對(duì)此混合物加熱變性2min，隨后在冰上迅速冷卻以使引物與模板退火。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有每種dNTP各0.625mM、5.0mM醋酸鎂、0.0125％牛血清白蛋白(BSA)，1.25％二甲亞砜(DMSO)、30U大腸桿菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的三種反應(yīng)緩沖液(42.5mM Tricine-氫氧化鉀(pH8.5)、42.5mM N-二[羥乙基]甘氨酸-氫氧化鉀緩沖液(pH8.3)及42.5mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8))中的一種，使終體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在60℃下孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖2所示。圖2例示了結(jié)合利用模板、反應(yīng)溶液和退火溶液進(jìn)行反應(yīng)的電泳結(jié)果。泳道1；標(biāo)記物(100bp梯)；泳道2；10ng模板，結(jié)合利用Tricine/500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺；泳道3；1ng模板，結(jié)合利用Tricine/500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺；泳道4；10ng模板，結(jié)合利用N-二[羥乙基]甘氨酸/500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺；泳道5；1ng模板，結(jié)合利用N-二[羥乙基]甘氨酸/500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺；泳道6；10ng模板，結(jié)合利用HEPES/500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺；泳道7；1ng模板，結(jié)合利用HEPES/500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺；泳道8；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道9；10ng模板，結(jié)合利用Tricine/丙二胺；泳道10；1ng模板，結(jié)合利用Tricine/丙二胺；泳道11；10ng模板，結(jié)合利用N-二[羥乙基]甘氨酸/丙二胺；泳道12；1ng模板，結(jié)合利用N-二[羥乙基]甘氨酸/丙二胺；泳道13；10ng模板，結(jié)合利用HEPES/丙二胺；泳道14；1ng模板，結(jié)合利用HEPES/丙二胺；泳道15；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道16；10ng模板，結(jié)合利用Tricine/水；泳道17；1ng模板，結(jié)合利用Tricine/水；泳道18；10ng模板，結(jié)合利用N-二[羥乙基]甘氨酸/水；泳道19；1ng模板，結(jié)合利用N-二[羥乙基]甘氨酸/水；泳道20；10ng模板，結(jié)合利用HEPES/水；及泳道21；1ng模板，結(jié)合利用HEPES/水。
如圖2所示，不管模板DNA的使用量，我們?cè)诮Y(jié)合利用三種緩沖液和三種退火溶液進(jìn)行退火時(shí)觀察到了我們感興趣的擴(kuò)增片段。特別的，在進(jìn)一步證明了結(jié)合利用N-二[羥乙基]甘氨酸緩沖液和含有500mM氫氧化鉀+8μM亞精胺的退火溶液時(shí)可獲得更大量的擴(kuò)增片段。實(shí)施例4檢驗(yàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶(RTase)抑制劑的存在對(duì)本發(fā)明的方法的影響。乙膦甲酸(PFA)可用做RTase的抑制劑。本實(shí)施例選用了SEQ ID NO47和48所表示的引物。在本實(shí)施例中，選用擴(kuò)增后的并隨后利用Suprec02(Takara Shuzo)進(jìn)行純化的擴(kuò)增產(chǎn)物(576bp)做為DNA模板，而此擴(kuò)增后產(chǎn)物是以腸出血性大腸桿菌O-157的基因組DNA為模板、利用SEQ ID NO49和50所表示的引物進(jìn)行PCR得到的。反應(yīng)操作如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，向每種引物濃度均為120pmol的溶液和含有500mM氫氧化鉀及8μM亞精胺的2μl退火溶液中添加1ng PGR擴(kuò)增片段，制備得到10μl混合物。將此混合物在98℃下其加熱變性2min。隨后，混合物在冰上迅速冷卻以使引物退火到模板上。
退火完成后，向退火混合物中添加40μl含有每種dNTP各0.625mM、42.5mM Tricine-氫氧化鉀緩沖液(pH8.5)5.0mM醋酸鎂、0.0125％牛血清白蛋白(BSA)，1.25％二甲亞砜(DMSO)、30U大腸桿菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的混合物及500μg/ml或50μg/ml的PFA，使其終體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在55℃下孵育1小時(shí)。另外也制備一不添加有PFA的體系作為對(duì)照。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取9μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖3所示。圖3例示了可展示逆轉(zhuǎn)錄酶活性抑制劑的效用的電泳結(jié)果。泳道1；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道2；不添加PFA；泳道3；添加500μg/ml PFA；泳道4；添加50μg/ml PFA。
如圖3所示，當(dāng)添加有PFA時(shí)，非特異性擴(kuò)增受到抑制并觀察到感興趣的擴(kuò)增片段。特別的，其進(jìn)一步證明，沒(méi)有觀察到在未添加PFA的體系中可觀察到的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，在添加有500μg/ml PFA的體系中明顯的擴(kuò)增了感興趣的擴(kuò)增片段。實(shí)施例5對(duì)本發(fā)明的方法中的待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與檢測(cè)靈敏度間的關(guān)系進(jìn)行檢驗(yàn)。
(1)合成了用于擴(kuò)增SEQ ID NO51-53所表示的大腸桿菌O-157vero毒素的引物。也選用了實(shí)施例4中選用的嵌合寡核苷酸引物。利用每種引物組合進(jìn)行擴(kuò)增的片段的長(zhǎng)度如下247bp(SEQ ID NO51和48)；168bp(SEQ ID NOS52和53)；206bp(SEQ ID NOS52和48)；135bp(SEQ ID NOS47和53)；及173bp(SEQ ID NOS47和48)。在本實(shí)施例中，以實(shí)施例4中制備的長(zhǎng)約576bp的、純化的、PCR擴(kuò)增片段作為模板DNA。反應(yīng)操作如下簡(jiǎn)單來(lái)講，將10μl含有每種引物各60pmol、2μl 0.05％丙二胺水溶液和10fg-10ng PCR擴(kuò)增片段的混合物在98℃下加熱變性2min，隨后在熱循環(huán)儀Personal(Takara Shuzo)中將其冷卻到55℃以使引物退火到模板上。
退火完成后，向退火混合物中添加40μl含有每種dNTP各0.625mM、42.5mM Tricine-氫氧化鉀緩沖液(pH8.5)、5.0mM醋酸鎂、0.0125％牛血清白蛋白(BSA)，1.25％二甲亞砜(DMSO)、30U大腸桿菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶及無(wú)菌水的混合物，使其終體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在55℃下孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取5μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。作為對(duì)照，對(duì)利用SEQ ID NO54和55所表示的引物擴(kuò)增得到的10fg-1pg PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)合利用這些引物擴(kuò)增得到了長(zhǎng)為135bp的片段。制備了每種引物各含60pmol的50μl PCR溶液、5μl 10×Ex Taq緩沖液(Takara Shuzo)、1.25U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)及濃度為0.2mM的各種dNTP。PCR操作如下94℃下反應(yīng)30秒，55℃下反應(yīng)30秒及72℃下反應(yīng)30秒，持續(xù)25或30個(gè)循環(huán)(2分38秒/循環(huán))。反應(yīng)結(jié)束后，從每種反應(yīng)混合物中各取1μl(ICAN)或5μl(PCR)混合物，在3.0％瓊脂糖凝膠上對(duì)它們進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖4和表1所示。
表1擴(kuò)增長(zhǎng)度(bp)檢測(cè)限ICAN(總時(shí)間70分鐘)247 100pg168 100fg206 100pg135 10fg173 100fgPCR(25個(gè)循環(huán)，總時(shí)間約66分鐘)135 100fgPCR(30個(gè)循環(huán)，總時(shí)間約80分鐘)135 10fg圖4例示了可展示通過(guò)ICAN(添加1/50反應(yīng)混合物)和PCR(添加1/10反應(yīng)混合物)擴(kuò)增的135bp片段的檢測(cè)限的電泳結(jié)果。泳道1；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道2；ICAN，以1pg擴(kuò)增片段為模板；泳道3；ICAN，以100fg擴(kuò)增片段為模板；泳道4；ICAN，以10fg擴(kuò)增片段為模板；泳道5；PCR(25個(gè)循環(huán))，以1pg擴(kuò)增片段為模板；泳道6；PCR(25個(gè)循環(huán))，以100fg擴(kuò)增片段為模板；泳道7；PCR(25個(gè)循環(huán))以10fg擴(kuò)增片段為模板；泳道8；PCR(30個(gè)循環(huán))以1pg擴(kuò)增片段為模板；泳道9；PCR(30個(gè)循環(huán))以100fg擴(kuò)增片段為模板；及泳道10；PCR(30個(gè)循環(huán))以10fg擴(kuò)增片段為模板。
如表1所示，其進(jìn)一步確定了ICAN具有幾乎與PCR相同的檢測(cè)靈敏度。此外，PCR的總反應(yīng)時(shí)間為80分鐘，而利用本發(fā)明中的方法達(dá)到相同的檢測(cè)靈敏度需要的的時(shí)間為70分鐘，這進(jìn)一步證明了利用本發(fā)明中的方法可縮短反應(yīng)時(shí)間。
(2)合成了用于擴(kuò)增含有SEQ ID NO39、40和56所表示的核苷酸序列的λDNA的引物。利用每種引物組合進(jìn)行擴(kuò)增的片段的長(zhǎng)度如下151bp(SEQ ID NO39和40)；及125bp(SEQ ID NO56和40)。在本實(shí)施例中，以實(shí)施例2(1)中制備的模板DNA為模板。反應(yīng)操作如下簡(jiǎn)單來(lái)講，將2μl退火溶液(500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺)、1fg-1ng模板添加到每種引物均為120pmol的溶液中，添加蒸餾水使其體積達(dá)到10μl。將此混合物在98℃下加熱變性2min，隨后在冰上迅速冷卻以使引物退火到模板上。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有每種dNTP各0.625mM、42.5mM Tricine-氫氧化鉀(pH8.5)、5.0mM醋酸鎂、0.0125％牛血清白蛋白(BSA)，1.25％二甲亞砜(DMSO)、30U大腸桿菌RNA酶H和11UBcaBEST DNA聚合酶的的混合物，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在60℃下孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如表2所示。
表2擴(kuò)增長(zhǎng)度(bp) 檢測(cè)限12510fg151100fg如表2所示，其進(jìn)一步證明，當(dāng)λDNA為模板時(shí)，通過(guò)對(duì)最理想的區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)可獲得10fg的檢測(cè)限。
(3)通過(guò)在質(zhì)粒T7Blue T-載體(Takara Shuzo)中插入一擴(kuò)增片段(長(zhǎng)；340bp)制備得到一質(zhì)粒。此擴(kuò)增片段的制備在JP-A 9-140383中有描述，其是以用于擴(kuò)增含有SEQ ID NO57和58所表示的核苷酸序列的菊花類(lèi)病毒基因的合成引物為引物，以源自感染了類(lèi)病毒的菊花的RNA為模板擴(kuò)增得到的。利用此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109活性細(xì)胞(Takara Shuzo)。37℃下，將轉(zhuǎn)化體在5ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)。按照使用指南，利用QIAGEN質(zhì)粒微型試劑盒(Qiagen)從收集的細(xì)胞中純化此質(zhì)粒。在利用Beckman DU-600(Beckman)對(duì)質(zhì)粒濃度進(jìn)行測(cè)定的基礎(chǔ)上，制備在1μl無(wú)菌水中含有0fg、1fg、10fg、100fg、1pg、10pg、100pg或1ng此種質(zhì)粒的稀釋液。從制得的質(zhì)粒稀釋液中各取1μl用做每個(gè)50μl ICAN反應(yīng)體系的模板。本實(shí)施例中選用含有SEQ ID NO59和60所表示的核苷酸序列的引物CSVD-F2和CSVD-R6。反應(yīng)操作如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，制備10μl含有濃度均為50pmnol的各種引物、1μl已制備的質(zhì)粒溶液及終濃度為0.01％的丙二胺的混合物。將此混合物在98℃下加熱2分鐘，冷卻到60℃，在此溫度下的熱循環(huán)儀Personal(Takara Shuzo)中孵育1分鐘，隨后將其置于冰上。
退火完成后，向混合物中添加終濃度為20mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸鎂、500μM的每種dNTP、30U大腸桿菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物置于60℃下的熱循環(huán)儀Personal中并反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取3μl，在3.0％NuSieve 3∶1瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果，在利用10fg模板進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物中觀察到感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物(長(zhǎng)約90bp，長(zhǎng)約70bp及長(zhǎng)約50bp)。實(shí)施例6對(duì)本發(fā)明的方法中選用的引物進(jìn)行檢驗(yàn)。
(1)對(duì)引物的Tm值和反應(yīng)溫度進(jìn)行檢驗(yàn)。合成了用于擴(kuò)增含有SEQ ID NO43和61-63所表示的核苷酸序列的黃桿菌菌種SA-0082的引物。構(gòu)建這些引物以對(duì)GC含量約為20％、長(zhǎng)為160bp或更短的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。利用每種引物組合來(lái)擴(kuò)增的片段的長(zhǎng)度如下126bp(SEQID NO43和62)；158bp(SEQ ID NO43和63)；91bp(SEQ ID NO61和62)；及123bp(SEQ ID NOS61和63)。本實(shí)施例中，選用實(shí)施例3(1)中制備的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做模板DNA。反應(yīng)如下進(jìn)行。簡(jiǎn)單來(lái)講，制備了10μl含有濃度均為120pmol的各種引物、2μl三種退火溶液(500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺，0.05％丙二胺，或水)中的一種及1fg-10ng模板的混合物。將此混合物在98℃加熱變性2分鐘，隨后在冰上冷卻以使引物退火到模板上。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有每種dNTP各0.625mM、5.0mM醋酸鎂、0.0125％牛血清白蛋白(BSA)、1.25％二甲亞砜(DMSO)、30U大腸桿菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的三種反應(yīng)緩沖液(17mM Tricine-氫氧化鉀(pH8.5)、17mM N-二[羥乙基]甘氨酸-氫氧化鉀緩沖液(pH8.3)及20mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8))中的一種，使其終體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在52、55或60℃下孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果，在反應(yīng)溫度為52℃的反應(yīng)混合物中觀察到了感興趣的擴(kuò)增片段。特別的，在結(jié)合利用含有500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺的退火溶液及Tricine或N-二[羥乙基]甘氨酸緩沖液的反應(yīng)混合物中觀察到更大量的感興趣的擴(kuò)增片段。圖2和表3中展示了反應(yīng)溫度為52℃時(shí)的引物對(duì)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度及檢測(cè)靈敏度。
表3擴(kuò)增長(zhǎng)度(bp) 檢測(cè)限126 100fg158 1pg911fg123 100fg圖5例示了電泳結(jié)果，而此電泳結(jié)果展示了當(dāng)對(duì)富含AT區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度與模板DNA量之間的關(guān)系。泳道1；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道2；長(zhǎng)為91bp的擴(kuò)增片段，1pg模板；泳道3；長(zhǎng)為91bp的擴(kuò)增片段，100fg模板；泳道4；長(zhǎng)為91bp的擴(kuò)增片段，10fg模板；泳道5；長(zhǎng)為91bp的擴(kuò)增片段，1fg模板；泳道6；長(zhǎng)為123bp的擴(kuò)增片段，1pg模板；泳道7；長(zhǎng)為123bp的擴(kuò)增片段，100fg模板；泳道8；長(zhǎng)為123bp的擴(kuò)增片段，10fg模板；泳道9；長(zhǎng)為126bp的擴(kuò)增片段，1pg模板；泳道10；長(zhǎng)為126bp的擴(kuò)增片段，100fg模板；泳道11；長(zhǎng)為126bp的擴(kuò)增片段，10fg模板；泳道12；長(zhǎng)為158bp的擴(kuò)增片段，1pg模板；泳道13；長(zhǎng)為158bp的擴(kuò)增片段，100fg模板；及泳道14；長(zhǎng)為158bp的擴(kuò)增片段，10fg模板。
如圖5和表3所示，其證明了當(dāng)利用富含AT的模板和一組富含AT的引物施行本發(fā)明的方法時(shí)，依賴于引物的Tm值而利用較低的反應(yīng)溫度會(huì)取得好的結(jié)果。
(2)引物的高級(jí)結(jié)構(gòu)可能影響本發(fā)明的方法中的反應(yīng)性。隨后，檢查了對(duì)引物進(jìn)行的修飾，而這些修飾是為了避免引物的高級(jí)結(jié)構(gòu)形成并使引物迅速退火到目標(biāo)模板上。選用了SEQ ID NO47、48和64-69所表示的引物。特別的，選用含有SEQ ID NO47所表示的核苷酸序列的引物、含有SEQ ID NOS64-66所表示的核苷酸序列并在其從3′末端始第4、5或6位堿基上含有肌苷脫氧核糖核酸的引物120I4、121I5和122I6、含有SEQ ID NO104所表示的核苷酸序列的引物、及含有SEQ ID NOS67-69所表示的序列并在其從3′末端始第4、5或6位堿基上含有肌苷脫氧核糖核酸的引物123I4、124I5和125I6。在本實(shí)施例中，選用在實(shí)施例4中制備的DNA模板。反應(yīng)操作如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，將10μl含有50pmol各種引物、2μl 0.05％丙二胺水溶液、1ng-10ng模板DNA及無(wú)菌蒸餾水的混合物在98℃下加熱2分鐘，冷卻到55℃，并利用此溫度下的熱循環(huán)儀(GeneAmp PCR System 9600，Applied Biosystems)中孵育1分鐘。
退火完成后，向退火混合物中添加濃度均為0.625mM的多種dNTP、42.5mM Tricine-氫氧化鉀緩沖液(pH8.5)、5.0mM醋酸鎂、0.0125％BSA、1.25％DMSO、30U大腸桿菌RNA酶H或5U源自嗜熱棲熱菌(Tth)的抗熱性RNA酶H(Toyobo，下文中稱為T(mén)th RNA酶H)及5.5U BcaBEST DNA聚合酶，添加蒸餾水使其終體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在55℃下孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取5μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖6所示。
圖6例示了電泳結(jié)果，而此電泳結(jié)果展示了當(dāng)選用大腸桿菌RNA酶H和Tth RNA酶H時(shí)，含有肌苷脫氧核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物的效用。泳道2-9表示利用大腸桿菌RNA酶H獲得的結(jié)果。泳道10-17表示利用Tth RNA酶H獲得的結(jié)果。泳道1；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道2；SEQ ID NO47和48所代表的引物對(duì)，1ng模板；泳道3；引物對(duì)120I4和123I4，1ng模板；泳道4；引物對(duì)121I5和124I5，1ng模板；泳道5；引物對(duì)122I6和125I6，1ng模板；泳道6SEQ IDNO47和48所代表的引物對(duì)，10ng模板；泳道7；引物對(duì)120I4和123I4，10ng模板；泳道8；引物對(duì)121I5和124I5，10ng模板；泳道9；引物對(duì)122I6和125I6，1ng模板；泳道10；SEQ ID NO47和48所代表的引物對(duì)，1ng模板；泳道11；引物對(duì)120I4和123I4，1ng模板；泳道12；引物對(duì)121I5和124I5，1ng模板；泳道13；引物對(duì)122I6和125I6，1ng模板；泳道14；SEQ ID NO47和48所代表的引物對(duì)，10ng模板；泳道15；引物對(duì)120I4和123I4，10ng模板；泳道16；引物對(duì)121I5和124I5，10ng模板；及泳道17；引物對(duì)122I6和125I6，10ng模板如圖6所示，當(dāng)選用含有在從引物3′末端始第4或5位堿基上結(jié)合有肌苷的引物時(shí)，不管模板的使用量，在使用大腸桿菌RNA酶H或嗜熱棲熱菌抗熱性RNA酶H時(shí)都觀察到感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物增加。這些結(jié)果證明，通過(guò)在適當(dāng)位點(diǎn)結(jié)合肌苷可提高ICAN的反應(yīng)性。
(3)鑒于與(2)相同的目的，對(duì)選用的引物進(jìn)行檢驗(yàn)。合成了含有SEQ ID NO84和85所表示的核苷酸序列的寡核苷酸引物1S和4S，而這兩種引物3′末端的3個(gè)堿基為α-S(或α-硫)核糖核苷酸，也即，在RNA中含有5′-硫代磷酸酯鍵。此外，合成了含有SEQ ID NO70和71所表示的核苷酸序列并在從3’末端開(kāi)始的3個(gè)堿基中和脫氧核糖核苷酸的部分序列中含有核糖核苷酸，也即從引物3′末端始的11-13位上的核糖核苷酸的寡核苷酸引物1N3N3和4N3N3。選用實(shí)施例4中制備的模板DNA。擴(kuò)增反應(yīng)操作如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，利用熱循環(huán)儀將10μl含有濃度均為50pmol的多種引物、2μl 0.05％丙二胺水溶液、10ng模板DNA和無(wú)菌水的混合物在98℃下加熱2min，隨后置于冰上冷卻。
退火完成后，向退火混合物中添加40μl含有濃度均為0.625mM的多種dNTP、42.5mM Tricine-氫氧化鉀緩沖液(pH8.5)、5.0mM醋酸鎂、0.0125％BSA，1.25％DMSO、30U大腸桿菌RNA酶H或5U Tth RNA酶H及5.5U BcaBEST DNA聚合酶，添加蒸餾水使其終體積達(dá)到50μl。55℃下，將反應(yīng)混合物在熱循環(huán)儀中孵育1小時(shí)。
反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取5μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果，不管選用的RNA酶H的類(lèi)型，在結(jié)合利用引物1S和4S或1N3N3和4N3N3時(shí)在預(yù)期的位置清晰觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，在本發(fā)明的方法中利用5′-phophothioate對(duì)引物3′-末端進(jìn)行的修飾是有效的。此外，其也進(jìn)一步證明，在除引物3′-末端外的適當(dāng)?shù)膬?nèi)部位點(diǎn)利用核糖核苷酸進(jìn)行替代對(duì)提高本發(fā)明的方法的反應(yīng)性是有效的。實(shí)施例7在特殊金屬離子存在下，對(duì)本發(fā)明的方法中的具有大腸桿菌RNA酶H活性的DNA聚合酶的利用進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)10μl含有120pmol實(shí)施例2(1)選用的每種嵌合寡核苷酸引物、2μl含有500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺的退火溶液、1ng實(shí)施例2(1)中選用的模板DNA及無(wú)菌水的混合物在98℃下加熱變性2分鐘，隨后在冰上迅速冷卻以使引物與模板退火。退火完成后，向混合物中添加40μl含有濃度均為0.625mM的多種dNTP、42.5mM Tricine-氫氧化鉀緩沖液(pH8.5)、5.0mM醋酸鎂、0.0125％BSA、1.25％DMSO、11U BcaBEST DNA聚合酶及終濃度分別為0.5、2.5、5.0或10mM的二氯化錳(Nacalai Tesque)的混合物，添加蒸餾水使其終體積達(dá)到50μl。60℃下，將反應(yīng)混合物在熱循環(huán)儀中孵育1小時(shí)。此外，以不添加二氯化錳的混合物和添加有30U大腸桿菌RNA酶H而不添加二氯化錳的混合物做對(duì)照。反應(yīng)完成后，從每種混合物中各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖7所示。
圖7例示了電泳結(jié)果，而此電泳結(jié)果展示了利用BcaBEST DNA聚合酶的RNA酶H活性進(jìn)行ICAN的結(jié)果。泳道1分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道2；不添加氯化錳/添加大腸桿菌RNA酶H；1泳道3；不添加氯化錳/不添加大腸桿菌RNA酶H；泳道4；添加0.5mM氮化錳/不添加大腸桿菌RNA酶H；泳道5；添加2.5mM氯化錳/不添加大腸桿菌RNA酶H；泳道6；添加5.0mM氯化錳/不添加大腸桿菌RNA酶H；及泳道7；添加10.0mM氯化錳/不添加大腸桿菌RNA酶H。
如圖7所示，在添加有2.5mM氯化錳而不存在大腸桿菌RNA酶H的反應(yīng)體系中觀察到感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例8利用實(shí)際的生物樣品對(duì)本發(fā)明中的方法進(jìn)行了檢驗(yàn)。
(1)以從腸出血性 大腸桿菌O-157(ATCC編號(hào)43895)的培養(yǎng)物中制得的熱水提取物為模板進(jìn)行檢測(cè)。42℃下，將腸出血性大腸桿菌O-157在含有新生霉素的mEC培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時(shí)，隨后在95℃下加熱10min。通過(guò)利用無(wú)菌水對(duì)提取物進(jìn)行稀釋?zhuān)频孟喈?dāng)于0、1、10、102、103、104或105個(gè)細(xì)胞的O-157熱水提取物。在與實(shí)施例5(1)相同的條件下，利用一種O-157熱水提取物對(duì)Vero毒素2(VT2)基因進(jìn)行擴(kuò)增。此外，在與實(shí)施例5(1)中所描述的相同的條件下，利用相同的模板進(jìn)行PCR，作為對(duì)照。反應(yīng)完成后，從每種混合物中取1μl(ICAN)或5μl(PCR)，在3.0％瓊脂糖凝膠上對(duì)其進(jìn)行電泳。結(jié)果如表4和圖8所示。
表4擴(kuò)增長(zhǎng)度(bp) 檢測(cè)限(細(xì)胞)ICAN(總時(shí)間70分鐘)135 102173 103PCR(25個(gè)循環(huán)；總時(shí)間約66分鐘)135 103PCR(30個(gè)循環(huán)；總時(shí)間約80分鐘)135 102圖8例示了電泳結(jié)果，而此電泳結(jié)果展示了利用ICAN或PCR對(duì)大腸桿菌O157進(jìn)行的檢測(cè)。待擴(kuò)增片段的鏈長(zhǎng)為135bp。泳道1；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道2；ICAN，104個(gè)細(xì)胞；泳道3；ICAN，103個(gè)細(xì)胞；泳道4；ICAN，102個(gè)細(xì)胞；泳道5；PCR，25個(gè)循環(huán)，104個(gè)細(xì)胞；泳道6；PCR，25個(gè)循環(huán)，103個(gè)細(xì)胞；泳道7；PCR，25個(gè)循環(huán)，102個(gè)細(xì)胞；泳道8；PCR，30個(gè)循環(huán)，104個(gè)細(xì)胞；泳道9；PCR，30個(gè)循環(huán)，103個(gè)細(xì)胞；及泳道10；PCR，30個(gè)循環(huán)，102個(gè)細(xì)胞。
如表4和圖8所示，其進(jìn)一步本發(fā)明中的檢測(cè)方法的檢測(cè)靈敏度與PCR的檢測(cè)靈敏度相當(dāng)，并且本發(fā)明中的檢測(cè)法所需的檢測(cè)時(shí)間較PCR少。
(2)利用實(shí)施例2和4中選用的、SEQ ID NO40和56所表示的引物對(duì)λDNA進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)操作如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，制備了10μl含有濃度均為120pmol的多種引物、2μl含有500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺的退火溶液、10fg-1ngλDNA(Takara Shuzo)及無(wú)菌水的混合物。將混合物在98℃加熱變性2分鐘。隨后在冰上迅速冷卻以使引物與模板退火。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有濃度均為0.625mM的多種dNTP、42.5mM Tricine-氫氧化鉀(pH8.5)、5.0mM醋酸鎂、0.0125％BSA，1.25％ DMSO、30U大腸桿菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的混合物，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在60℃下孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如表5所示。
表5擴(kuò)增長(zhǎng)度(bp)檢測(cè)限125 1pg如表5所示，其進(jìn)一步證明本發(fā)明中的方法在λDNA檢測(cè)方面是有效的。
(3)以黃桿菌亞種SA-0082基因組DNA為模板，以實(shí)施例6(1)中選用的、SEQ ID NO61和62所代表的引物進(jìn)行檢測(cè)。按照傳統(tǒng)方法，從WO 97/32010中描述的黃桿菌屬物種培養(yǎng)物中制備基因組DNA模板。反應(yīng)進(jìn)行如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，制備了10μl含有濃度均為120pmol的多種引物、2μl含有500mM氫氧化鉀和8μM亞精胺的退火溶液、10fg-1ng基因組DNA及無(wú)菌水的混合物。將混合物在98℃加熱變性2分鐘。隨后在冰上迅速冷卻以使引物與模板退火。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有濃度均為0.625mM的多種dNTP、42.5mM Tricine-氫氧化鉀(pH8.5)、5.0mM醋酸鎂、0.0125％BSA，1.25％DMMSO、30U大腸桿菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的混合物，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在52℃下孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如表6和圖9所示。
表6擴(kuò)增長(zhǎng)度(bp) 檢測(cè)限91 100fg圖9例示了電泳結(jié)果，而此電泳結(jié)果展示了黃桿菌屬物種進(jìn)行的檢測(cè)。泳道1；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道2；1ng模板；泳道3；10pg模板；泳道4；1pg模板；泳道5；100fg模板；及泳道6；10fg模板。
如表6和圖9所示，其進(jìn)一步證明了本發(fā)明中的方法在細(xì)菌檢測(cè)方面是有效的。實(shí)施例9對(duì)結(jié)合利用了本發(fā)明中的擴(kuò)增方法和雜交方法的靶核酸檢測(cè)方法進(jìn)行檢驗(yàn)。選取腸出血性大腸桿菌O-157為靶。如實(shí)施例8(1)中所述制備模板DNA。GC含量約為40％、長(zhǎng)約100bp的區(qū)域選作待擴(kuò)增片段。選取含有SEQ ID NO51和72所表示的核苷酸序列的引物VT2-IF20和VT2-I R20-2為引物。反應(yīng)進(jìn)行如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，制備了10μl含有50pmol引物VT2-IF20和VT2-IR20-2、含有0.01％propylenediamin的退火溶液、相當(dāng)于0-104個(gè)細(xì)胞的熱水提取物及無(wú)菌水的混合物。將此混合物在98℃下加熱變性2分鐘，冷卻到55℃，并在相同溫度的熱循環(huán)儀Personal(Takara Shuzo)中孵育1分鐘，隨后在冰上冷卻以進(jìn)行退火。
退火完成后，向混合物中添加終濃度20mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、1％DMSO、0.01％BSA、濃度均為0.625mM的多種dNTP、30U大腸桿菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶的混合物，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物置于溫度已設(shè)定為55℃的熱循環(huán)儀Personal中并在此溫度下孵育60分鐘。作為對(duì)照，按照操作指南，利用O-157 Typing Set(Takara Shuzo)在熱循環(huán)儀Personal中進(jìn)行了PCR。PCR操作如下94℃下反應(yīng)1min，55℃下反應(yīng)1min，及72℃下反應(yīng)1min，持續(xù)35個(gè)循環(huán)。此反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)需要約4分鐘，而總時(shí)間約需145分鐘。預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為404bp。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物各取3μl，在3％NuSieve 3∶1瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖28A所示。圖28A展示了利用ICAN或PCR對(duì)腸出血性大腸桿菌O157 vero毒素II基因進(jìn)行檢測(cè)的電泳結(jié)果。泳道M1；分子量標(biāo)記(50-2000bp)；泳道M2；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道N；陰性對(duì)照；泳道1相當(dāng)于1個(gè)細(xì)胞的模板；泳道2；相當(dāng)于10個(gè)細(xì)胞的模板；泳道3；相當(dāng)于102個(gè)細(xì)胞的模板；泳道4；相當(dāng)于103個(gè)細(xì)胞的模板；及泳道5；相當(dāng)于104個(gè)細(xì)胞的模板。另外，表7展示了利用ICAN和PCR對(duì)相當(dāng)于1或10個(gè)細(xì)胞的DNA進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增水平比較結(jié)果。
表7大腸桿菌O-157細(xì)胞的數(shù)目0 1 10ICAN - + +++PCR - + ++-；沒(méi)有進(jìn)行擴(kuò)增；+至+++表示三個(gè)等級(jí)的擴(kuò)增程度如圖28A和表7所示，在利用本發(fā)明的檢測(cè)法及PCR檢測(cè)法中的利用相當(dāng)于1個(gè)細(xì)胞的熱水提取物進(jìn)行的反應(yīng)體系中都觀察到感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。以含有SEQ ID NO73表示的核苷酸序列并在5′-末端用生物素標(biāo)記的寡核苷酸VT2為探針，對(duì)利用ICAN獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交。斑點(diǎn)印跡雜交操作如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，將1μl反應(yīng)混合物在98℃下加熱變性5min，在冰上迅速冷卻，并將其印記到Hybond-NTM(Amersham PHarmacia Biotech)上。UV照射后，將膜置于雜交袋中。向其中添加10μl含有0.5M磷酸氫二鈉(pH7.2)、1mM乙烯二胺四乙酸和7％十二烷基硫酸鈉的雜交溶液。隨后在42℃下進(jìn)行30min預(yù)雜交。將10μl 100ng/μl VT2探針溶液熱變性并添加到預(yù)雜交反應(yīng)體系中。在42℃雜交60min后，室溫下，在含有66.6mM氯化鈉、66.6mM檸檬酸鈉和0.1％氯化鈉的溶液中沖洗膜兩次，42℃下，在6ml添加有2μl 5mg/ml辣根過(guò)氧化物酶streptoavidin共軛物(PIERCE)的沖洗緩沖液(0.3M氯化鈉，17.3mM二水合磷酸氫二鈉，2.5mM EDTA，0.1％十二烷基硫酸鈉)中孵育12min，隨后在室溫下利用沖洗緩沖液沖洗兩次。隨后，室溫下，在10ml 0.1M檸檬酸鹽緩沖液(pH5.0)對(duì)膜進(jìn)行沖洗，并在含有5ml 0.1M檸檬酸鹽緩沖液、5μl3％過(guò)氧化氫和250μl 2mg/ml四甲基聯(lián)苯胺(TMB，Nacalai Tesque)乙醇溶液的混合物中避光反應(yīng)10min。變色后，利用去離子水中止反應(yīng)。結(jié)果如圖28B所示。圖28B展示了利用ICAN對(duì)腸出血性大腸桿菌O-157 vero毒素II基因進(jìn)行檢測(cè)的斑點(diǎn)印跡雜交結(jié)果。這些結(jié)果與上述電泳結(jié)果一致。因此，本發(fā)明中的方法的檢測(cè)靈敏度與PCR的相當(dāng)。相對(duì)于PCR，利用本發(fā)明的ICAN可將需要的反應(yīng)總時(shí)間縮短1/2或更短的時(shí)間。進(jìn)一步證明了本發(fā)明的ICAN作為病原等的檢測(cè)方法是有效的。實(shí)施例10(1)以從培養(yǎng)物細(xì)胞中獲得的RNA為模板，對(duì)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和本發(fā)明中的方法的結(jié)合利用進(jìn)行檢驗(yàn)。反應(yīng)操作如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，將1.5×105個(gè)細(xì)胞/ml的TRAW264.7細(xì)胞(ATCC TIB 71)懸浮在含有10％胎牛血清(Gibco)的Dulbecco′s修飾后Eagle′S培養(yǎng)基(Bio Whittaker，12-604F)中。向6孔微量滴定板的每個(gè)孔中添加5ml懸浮液，并在5％CO2存在下，在37℃下孵育過(guò)夜。向每孔中添加50μl 100μg/ml脂多糖(LPS，Sigma)水溶液和50μl 1000U/μl干擾素-γ(IFN-γ，GenzymeTechne)水溶液。對(duì)滴定板額外孵育4小時(shí)。隨后按照粘貼到試劑盒上的使用指導(dǎo)，利用RNeasy微型試劑盒(Qiagen)從細(xì)胞中制備RNA。提供一組不添加LPS或IFN-γ內(nèi)應(yīng)混合物以作為陰性對(duì)照。
將60μl含有3μg制備的RNA、10mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.3)、50mM KCl、5mM MgCl2、濃度均為1mM的多種dNTP、150pmol隨機(jī)6聚體引物、60U核糖核酸酶抑制劑(Takara Shuzo)和15U逆轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)(Takara Shuzo，2620A)的混合物在30℃孵育10min、在42℃下孵育1小時(shí)，隨后利用熱循環(huán)儀(GeneAmp PCR System 9600，Applied Biosystems)在99℃下對(duì)其孵育5min，這樣制得了cDNA。
在鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)(GeneBank標(biāo)號(hào)NM-010927)的mRNA核苷酸序列基礎(chǔ)上，合成了含有SEQ ID NO74和75所表示的核苷酸序列的引物。
制備了10μl含有濃度均為50pmol的多種引物、2μl 0.05％丙二胺水溶液、1μl模板cDNA(相當(dāng)于50ng RNA)和無(wú)菌水的混合物。在98℃下使混合物熱變性2分鐘，冷卻到55℃，并在此溫度下的熱循環(huán)儀中孵育1分鐘以使引物退火到模板上。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有每種dNTP各0.625mM、42.5mM Tricine-氫氧化鉀緩沖液(pH8.5)、5.0mM醋酸鎂、0.0125％BSA、1.25％DMSO、15U大腸桿菌RNA酶H和11U BcaBEST DNA聚合酶的的混合物，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在55℃的熱循環(huán)儀中孵育1小時(shí)。將反應(yīng)后樣品在-20℃下冷凍保存至對(duì)其進(jìn)行分析。作為對(duì)照的PCR操作如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，在熱循環(huán)儀中使50μl含有每種引物各50pmol、1μl cDNA(相當(dāng)于50ng RNA)、5μl 10×ExTaq緩沖液(Takara Shuzo)、1.25U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(TakaraShuzo)及每種dNTP各0.2mM的反應(yīng)混合物進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序如下；94℃下反應(yīng)2min，1個(gè)循環(huán)；94℃下反應(yīng)30秒，55℃下反應(yīng)30秒及72℃下反應(yīng)30秒，持續(xù)30個(gè)循環(huán)；以及72℃下反應(yīng)5min，1個(gè)循環(huán)。將反應(yīng)后樣品在-20℃下冷凍保存直至對(duì)其進(jìn)行分析。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取5μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖10所示。
圖10例示了電泳結(jié)果，而此電泳結(jié)果展示了對(duì)RT-ICAN(A)和RT-PCR(B)進(jìn)行的對(duì)比。泳道1；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道2陰性對(duì)照組；及泳道3；LPS和IFN-γ處理組。
如圖10所展示的，當(dāng)以從細(xì)胞培養(yǎng)物中制備的、利用LPS和IFN-γ處理過(guò)的cDNA為模板時(shí)，在本發(fā)明的方法和PCR中都觀察到了擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，其進(jìn)一步證明，由于本發(fā)明的方法相對(duì)于PCR法需要較短的反應(yīng)時(shí)間，所以本發(fā)明的方法作為逆轉(zhuǎn)錄后DNA擴(kuò)增方法是更有效的。實(shí)施例11在本發(fā)明的擴(kuò)增反應(yīng)中可能使最適反應(yīng)溫度為37℃的大腸桿菌RNA酶H失活。隨后，向反應(yīng)混合物中添加大腸桿菌RNA酶H，檢測(cè)其效用。選用一擴(kuò)增片段(1071bp)為模板DNA，而此擴(kuò)增片段是通過(guò)以SEQ ID NO78和79所表示的引物GMO-PCR-F和GMO-PCR-R為引物、以從其中已導(dǎo)入菜花樣花葉病毒35S啟動(dòng)子和EPSPS基因的重組體大豆中提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR得到的。此外，也選用了含有SEQ ID NO80-83所表示的核苷酸序列的引物GMO-S1、S2、A1和A2。反應(yīng)進(jìn)行如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，制備了10μl含有濃度均為50pmol的多種引物、0.01％丙二胺、1pg-10ng模板DNA和無(wú)菌水的混合物。在98℃使混合物熱變性2分鐘，并冷卻到55℃以使引物退火到模板上。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有終濃度均為0.625mM的多種dNTP、34mM Tricine-氫氧化鉀緩沖液(pH8.7)、4.0mM醋酸鎂、0.01％BSA、1％DMSO、30U大腸桿菌RNA酶H和505U BcaBEST DNA聚合酶的混合物，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在55℃的熱循環(huán)儀中孵育25分鐘。反應(yīng)起始25min后，向其中進(jìn)一步添加30U大腸桿菌RNA酶H。將反應(yīng)混合物在55℃下孵育30分鐘。將反應(yīng)混合物在55℃下孵育55分鐘來(lái)作為對(duì)照。反應(yīng)完成后，從每種混合物中取出3μl混合物，在3％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果，其進(jìn)一步證明，不管與任一種引物S1/A1、S1/A2、S2/A1和S2/A2結(jié)合使用的模板DNA的濃度，在反應(yīng)中添加大腸桿菌RNA酶H提高了擴(kuò)增效率。實(shí)施例12對(duì)本發(fā)明中作為模板的核酸的擴(kuò)增或復(fù)制方法與本發(fā)明的方法的結(jié)合利用進(jìn)行了檢驗(yàn)。反應(yīng)進(jìn)行如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，利用含有實(shí)施例5(3)中制備的菊花類(lèi)病毒基因和T7 RNA聚合酶(Takara Shuzo)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄獲得RNA復(fù)制片段，而此質(zhì)粒是在大腸桿菌中作為模板進(jìn)行復(fù)制的。利用含有SEQ ID NO57和58所表示的核苷酸序列的引物和cDNA合成試劑盒(Takara Shuzo)合成cDNA。如實(shí)施例5(3)中所述，以cDNA片段或復(fù)制的質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果，其進(jìn)一步證明，以質(zhì)粒形式復(fù)制的核酸及利用RNA聚合酶、以cDNA形式從RNARNA復(fù)制的核酸都可用做本發(fā)明的方法中的模板。實(shí)施例13(1)合成引物在鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA的核苷酸序列的基礎(chǔ)上，合成了SEQ ID NO86和87所表示的寡核苷酸引物NS1和NS2。
(2)以PCR產(chǎn)物為模板，利用ICAN進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增在98℃下，將10μl含有濃度均為50pmol的合成寡核苷酸引物、2μl 0.05％丙二胺水溶液、10fg-10pg模板DNA的混合物加熱2分鐘，隨后利用熱循環(huán)儀(GeneAmp PCR Sys tem9600，Applied Biosystems)在60℃下對(duì)其加熱2min以使引物退火到模板上。選用iNOS cDNA(741bp)作模板，而此模板是利用SEQ ID NO132和133所代表的引物NS-PCR1和NS-PCR2擴(kuò)增得到并隨后利用Suprec02(TakaraShuzo)進(jìn)行純化的。將40μl含有0.625mM的每種dNTP、40mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、125mM醋酸鉀、5.0mM醋酸鎂、0.0125％BSA、1.25％DMSO、0.0156μg Pfu RNA酶H和0.66μg BcaBEST DNA聚合酶的反應(yīng)混合物添加到加熱后的溶液中。將反應(yīng)混合物置于60℃下的熱循環(huán)儀中孵育1小時(shí)。每種反應(yīng)混合物各取5μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖11所示。圖11表示利用Pfu RNA酶H進(jìn)行ICAN的結(jié)果。泳道1；分子量標(biāo)記(100bp)；泳道2；10fg模板；泳道3；100fg模板；泳道4；1pg模板；及泳道5；10pg模板。
如圖11所示，在利用100fg模板的情況下觀察到感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例14(1)制備RNA將濃度為1.5×105個(gè)細(xì)胞/ml的TRAW264.7細(xì)胞(ATCC TIB 71)懸浮在含有10％胎兒牛血清(Gibco)的Dulbecco′s修飾后Eagle′s培養(yǎng)基(Bio Whittaker)中。向6孔微量滴定板的每個(gè)孔中添加5ml懸浮液，并在5％CO2存在下，在37℃下孵育過(guò)夜。向每孔中添加50μl100μg/ml脂多糖(LPS，Sigma)水溶液和50μl 1000U/μl干擾素-γ(IFN-γ，Genzyme Techne)水溶液。對(duì)滴定板額外孵育4小時(shí)。隨后按照粘貼到試劑盒上的使用指導(dǎo)，利用RNeasy微型試劑盒(Qiagen)從細(xì)胞中制備RNA。提供一組不添加LPS或IFN-γ的混合物以作為陰性對(duì)照。
將60μl含有3μg已制備的RNA、10mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.3)、50mM KCl、5mM MgCl2、濃度均為1mM的多種dNTP、150pmol隨機(jī)6聚體引物、60U核糖核酸酶抑制劑(Takara Shuzo)和15U逆轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)(Takara Shuzo，2620A)的混合物在30℃孵育10min、在42℃下孵育1hr，隨后利用熱循環(huán)儀(GeneAmp PCR System 9600，Applied Biosystems)在99℃下對(duì)其孵育5min以使酶失活，這樣制得了cDNA。
在鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA的核苷酸序列基礎(chǔ)上，合成了含有SEQ ID NO92和93所表示的核苷酸序列的引物NS5和NS6。此外，也合成了SEQ ID NO88和89所代表的PCR引物NS3和NS4。
將50μl含有50pmol引物NS5和NS6、1μl上述合成的cDNA溶液(相當(dāng)于50ng RNA)或模板溶液的10、100、1000或10000倍水稀釋液、每種dNTP各0.5mM、32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、4.0mM醋酸鎂、0.01％BSA、1％DMSO、0.0156μg PfuRNA酶H和0.66U BcaBEST DNA聚合酶的混合物在60℃下的熱循環(huán)儀中孵育1小時(shí)。將反應(yīng)后樣品在-20℃下冷凍保存直至對(duì)其進(jìn)行分析。
另一方面，利用一PCR作為對(duì)照。在熱循環(huán)儀中使50μl含有50pmol引物NS3和NS4、1μl cDNA溶液(相當(dāng)于50ng RNA)或其10、100、1000或10000倍水稀釋液、5μl 10×Ex Taq緩沖液(TakaraShuzo)、1.25U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)及每種dNTP各0.2mM的反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序如下；94℃下反應(yīng)2min，1個(gè)循環(huán)；94℃下反應(yīng)30秒，55℃下反應(yīng)30秒及72℃下反應(yīng)30秒，持續(xù)35個(gè)循環(huán)；以及72℃下反應(yīng)5min，1個(gè)循環(huán)。將反應(yīng)后樣品在-20℃下冷凍保存直至對(duì)其進(jìn)行分析。
從每種反應(yīng)混合物(ICAN或PCR)中各取5μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖12所示。圖12展示了iNOS基因的檢測(cè)結(jié)果，而此檢測(cè)是利用Pfu RNA酶H通過(guò)ICAN或通過(guò)PCR進(jìn)行的。泳道1；100bp DNA梯標(biāo)記；泳道2陰性對(duì)照cDNA的10000倍稀釋?zhuān)挥镜?；陰性對(duì)照cDNA的1000倍稀釋?zhuān)挥镜?；陰性對(duì)照cDNA的100倍稀釋?zhuān)挥镜?；陰性對(duì)照cDNA的10倍稀釋?zhuān)挥镜?；陰性對(duì)照cDNA的原始溶液；泳道7；添加LPS和IFN-γ的cDNA組的10000稀釋溶液；泳道8；添加LPS和IFN-γ的cDNA組的1000稀釋溶液；泳道9；添加LPS和IFN-γ的cDNA組的100稀釋溶液；泳道10；添加LPS和IFN-γ的cDNA組的10稀釋溶液；及泳道11；添加LPS和IFN-γ的cDNA組的原始溶液。
如圖12所展示的，只有當(dāng)以從細(xì)胞培養(yǎng)物中制備的、利用LPS和IFN-γ處理過(guò)的cDNA為模板時(shí)，在ICAN和PCR反應(yīng)混合物中都觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)于ICAN來(lái)說(shuō)，在利用cDNA的1000倍稀釋的情況下觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物增加。對(duì)于PCR來(lái)講，在利用cDNA的100倍稀釋液的情況下觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物增加。實(shí)施例15(1)在DNA的核苷酸序列基礎(chǔ)上合成了SEQ ID NOS90和91所表示的寡核苷酸引物4和5。寡核苷酸引物4是GC含量為75％的有義引物。寡核苷酸引物5是GC含量為80％的反義引物。
將10μl含有120pmol引物4和5、2μl 0.05％丙二胺溶液和10ng模板的反應(yīng)體系在98℃加熱變性2分鐘，隨后在并上迅速冷卻以使引物與模板退火。選用實(shí)施例2中描述的、利用Suprec02純化后的PCR產(chǎn)物(1005bp)作模板。
(2)退火完成后，向退火混合物中添加40μl含有每種dNTP各0.62 5mM、42.5mM Bicine-氫氧化鉀緩沖液(pH8.3)、5.0mM醋酸鎂、0.0125％ BSA、1.25％ DMSO、0.5μl海棲熱袍菌RNA酶HII(0.58μg/ml)和2.2U BcaBEST DNA聚合酶的混合物并在60、65或70℃下利用ICAN反應(yīng)1小時(shí)。ICAN完成后，每種反應(yīng)混合物各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖13所示。圖3例示了利用海棲熱袍菌RNA酶HII進(jìn)行ICAN的電泳結(jié)果。泳道1；分子量標(biāo)記(100bp)；泳道2；反應(yīng)溫度為60℃；泳道3；反應(yīng)溫度為65℃；及泳道4；反應(yīng)溫度為70℃如圖13所示，在各個(gè)反應(yīng)溫度條件下都觀察到了擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例16(1)對(duì)以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板、按照ICAN施行的DNA片段擴(kuò)增進(jìn)行檢驗(yàn)。將1μl含有10fg-10pg模板的溶液與1μl 0.4N NaOH混合。將混合物在37℃下孵育5分鐘以使模板變性。選用實(shí)施例13中描述的、利用Suprec02(Takara Shuzo)純化的PCR擴(kuò)增的iNOS cDNA(741bp)為模板。利用1μl 0.4N HCl對(duì)變性模板溶液進(jìn)行中和。隨后，向其中加入47μl含有50pmol的引物NS1和NS2、每種dNTP各0.5mM、32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、4.0mM醋酸鎂、0.01％ BSA、1.0％ DMSO、0.0156μg Pfu RNA酶H和0.66UBcaBEST DNA聚合酶的反應(yīng)混合物。將此混合物在60℃下的熱循環(huán)儀中孵育1小時(shí)。從每種反應(yīng)混合物中取5μl，并在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。結(jié)果如圖14所示。圖14展示了利用堿變性模板進(jìn)行ICAN的結(jié)果。泳道1分子量標(biāo)記(100bp)；泳道2；10fg模板；泳道3；100fg模板；泳道4；1pg模板；及泳道5；10pg模板。
如圖14所示，在選用1pg模板的情況下觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例17(1)對(duì)不利用變性模板、按照ICAN施行的DNA片段擴(kuò)增進(jìn)行檢驗(yàn)。選用SEQ ID NO92和93所表示的引物NS5和NS6作為引物。選用實(shí)施例13中制備的模板作為模板DNA。
向其中加入50μl含有10fg-100pg作為陰性對(duì)照的模板或水、50pmol的引物NS5和NS6、每種dNTP各0.5mM、32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、4.0mM醋酸鎂、0.01％BSA、1.0％DMSO、0.0156μg Pfu RNA酶H和1U BcaBEST DNA聚合酶(TakaraShuzo)的反應(yīng)混合物。將此混合物在60℃下的熱循環(huán)儀中孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中取5μl，并在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。結(jié)果如圖15所示。圖15展示了不利用變性模板進(jìn)行ICAN的結(jié)果。泳道1；100bp DNA梯標(biāo)記；泳道2；陰性對(duì)照(水)；泳道3；10fg模板；泳道4；100fg模板；泳道5；1pg模板；泳道6；10pg模板；及泳道7；100pg模板。
如圖15所示，在選用1pg模板的情況下觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例18(1)在載體質(zhì)粒pDON-AI DNA(Takara Shuzo)中的包裝區(qū)域的核苷酸序列的基礎(chǔ)上，合成了SEQ ID NO94和95所表示的引物pDON-AI-1和pDON-AI-2。
(2)在不利用變性模板的情況下，利用ICAN進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增將包含有作為陰性對(duì)照的1μl 1fg-1ng pDON-AI DNA溶液或作為陰性對(duì)照的1μl水、50pmol各種引物、每種dNTP各0.5mM、32mMHEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、4.0mM醋酸鎂、0.01％BSA、1.0％DMSO、0.0156μg參考實(shí)施例4中制備的Pfu RNA酶H和1U BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)的50μl反應(yīng)混合物在60℃的熱循環(huán)儀中孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中取5μl混合物，并在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。結(jié)果如圖16所示。圖16展示了利用非變性環(huán)形雙鏈DNA為模板實(shí)施本發(fā)明中的方法的電泳結(jié)果。泳道1；100bp DNA梯標(biāo)記；泳道2；陰性對(duì)照(水)；泳道3；10fg模板；泳道4；100fg模板；泳道5；1pg模板；泳道6；10pg模板；泳道7；100pg模板；及泳道8；1ng模板。
如圖16所示，其進(jìn)一步證明了在選用1pg模板的情況下可獲得感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例19檢驗(yàn)了利用本發(fā)明的方法對(duì)人乳頭狀瘤病毒16基因進(jìn)行的檢測(cè)。選用從感染人乳頭狀瘤病毒16的細(xì)胞CaSki細(xì)胞(DainipponPHarmaceutical；細(xì)胞中含有人乳頭狀瘤病毒16的500個(gè)拷貝)中提取的DNA作為模板。含有SEQ ID NO96和97所表示的核苷酸序列的引物HPV16 S3和HPV16 A2用做對(duì)HPV16進(jìn)行檢測(cè)的引物。利用引物對(duì)擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)期大小約為120bp。反應(yīng)進(jìn)行如下。
制備了10μl含有1pg、3pg、30pg、100pg、300pg、1ng、3ng或10ng模板DNA、50pmol引物HPV16 S3和HPV16 A2及終濃度為0.01％的丙二胺的混合物。在熱循環(huán)儀Personal中，將混合物在98℃下孵育2分鐘，并在55℃下孵育1min。隨后置于冰上。向混合物中添加終濃度為20mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸鎂、500μM的每種dNTP、30U大腸桿菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物置于55℃下的熱循環(huán)儀Personal中并反應(yīng)1小時(shí)。作為對(duì)照，按照熱循環(huán)儀Personal的操作指南，利用人肉頭狀瘤病毒引物HPVp16(forward，reverse)(Takara Shuzo)進(jìn)行PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)期大小為140bp。
反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中各取3μl，在4.0％NuSieve 3∶1瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖17A所示。圖17A展示了利用ICAN和PCR對(duì)HPV16基因進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。泳道M1；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道M2；分子量標(biāo)記(50-2000bp)；泳道1；無(wú)模板；泳道2；1pg模板；泳道3；3pg模板；泳道4；30pg模板；泳道5；100pg模板；泳道6；300pg模板；泳道7；1ng模板；泳道8；3ng模板；及泳道9；10ng模板。
如圖17A所示，其進(jìn)一步證明，在分別利用3pg模板DNA進(jìn)行ICAN和1pg模板DNA進(jìn)行PCR的情況下觀察到感興趣的擴(kuò)增片段。
此外，以含有SEQ ID NO98所表示的核苷酸序列的寡核苷酸HPV16為探針，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交。如實(shí)施例9所述進(jìn)行雜交。結(jié)果如圖17B所示。圖17B展示了通過(guò)PCR和ICAN對(duì)HPV16基因進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交檢測(cè)的結(jié)果。泳道1；無(wú)模板；泳道2；1pg模板；泳道3；3pg模板；泳道4；30pg模板；泳道5；100pg模板；泳道6；300pg模板；泳道7；1ng模板；泳道8；3ng模板；及泳道9；10ng模板。
如圖17B所示，ICAN和PCR的檢測(cè)靈敏度幾乎相同。因此，其進(jìn)一步證明，這些方法可有效的對(duì)病毒等進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例20檢驗(yàn)了對(duì)臨床標(biāo)本DNA樣品中的人乳頭狀瘤病毒16基因進(jìn)行的檢測(cè)。在得到哈許可的情況下，選用通過(guò)傳統(tǒng)方法從6個(gè)臨床標(biāo)本中制得的DNA作為模板。利用PCR對(duì)從這些臨床標(biāo)本制得的樣品中含有的感染性HPV的類(lèi)型進(jìn)行了檢驗(yàn)。選取實(shí)施例19中描述的引物HPV16 S3和HPV16 A2作為引物來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。利用TE緩沖液調(diào)節(jié)從臨床標(biāo)本制得的模板DNA樣品的濃度為100ng/μl。除模板用量外，反應(yīng)混合物組成和反應(yīng)條件與實(shí)施例19中的相同。此外，利用反應(yīng)混合物進(jìn)行類(lèi)似的反應(yīng)，以不含模板DNA的反應(yīng)混合物為陰性對(duì)照，而以含有500pg制備自感染HPV16的CaSki細(xì)胞的DNA的反應(yīng)混合物為陽(yáng)性對(duì)照。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中各取3μl，利用4％NuSieve 3∶1瓊脂糖進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖18A所示。圖18A展示了對(duì)臨床標(biāo)本中的HPV16基因進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。泳道M；分子量標(biāo)記；泳道1-6；臨床標(biāo)本；泳道7；陰性對(duì)照；及泳道8；陽(yáng)性對(duì)照。
如圖18A中所示，在利用ICAN對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)的情況下觀察到長(zhǎng)約120bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，而此樣品已經(jīng)通過(guò)傳統(tǒng)的PGR證明感染有HPV16。在感染有其他類(lèi)型HPV的樣品中和未感染的樣品中沒(méi)有觀察到擴(kuò)增現(xiàn)象。
此外，如實(shí)施例9中所描述的，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交。結(jié)果如圖18B和表8所示。圖18B展示了對(duì)臨床標(biāo)本中的HPV16基因進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交檢測(cè)的結(jié)果。泳道1-6；臨床標(biāo)本；泳道7；陰性對(duì)照；及泳道8；陽(yáng)性對(duì)照。
如圖18所示，這些結(jié)果與通過(guò)電泳獲得的結(jié)果一致，這進(jìn)一步證明，利用電泳及斑點(diǎn)印跡雜交可獲得與利用PCR得到的結(jié)果相類(lèi)似的結(jié)果。因此，其進(jìn)一步證明，利用本發(fā)明的方法可對(duì)實(shí)際臨床標(biāo)本中的HPV16進(jìn)行檢測(cè)，并可有效的對(duì)病毒等進(jìn)行檢測(cè)。
表8樣品 PCR分型 利用HPV16檢測(cè)引物進(jìn)行的ICAN擴(kuò)增NO.3 未感染的 -NO.4 未感染的 -NO.6 18型-NO.7 16型+NO.8 67型-NO.9 16型+無(wú)模板* -陽(yáng)性對(duì)照 * +-；無(wú)擴(kuò)增；+觀察到擴(kuò)增實(shí)施例21檢驗(yàn)了對(duì)臨床標(biāo)本中的HCV進(jìn)行的檢測(cè)。在獲得患者許可的情況下，按照粘貼到試劑上的指導(dǎo)，利用TRIzol試劑(LifeTechnologies)從感染HCV的5個(gè)患者血清標(biāo)本的每個(gè)標(biāo)本中獲取300μl標(biāo)本樣品，最后將其溶解在6μl可注射水(OtsukaPHarmaceutical)中以獲取RNA樣品。將以類(lèi)似方法從健康個(gè)體的300μl血清中提取的RNA作為陰性對(duì)照。首先，利用RNA PCR試劑盒(AMW)ver 2.1(Takara Shuzo)，制備了4μl含有1×RNA PCR緩沖液、5mM MgCl2、1mM各種dNTP、1U AMV逆轉(zhuǎn)錄病毒XL、10pmol SEQ ID NO99和100所代表的引物HCV-F和HCV-R及2μl RNA樣品的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物。將此混合物在30℃下溫?zé)?0min，隨后在50℃反應(yīng)30min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完成后，進(jìn)行ICAN。選用含有SEQ ID NO101和102所表示的核苷酸序列的引物HCV-F2和HCV-R1作為ICAN引物。反應(yīng)進(jìn)行如下。
制備了10μl含有每種引物各50pmol、3μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物和終濃度為0.01％的丙二胺。利用3μl無(wú)菌水作空白。將混合物在98℃下加熱2min，迅速冷卻到60℃，并在同樣溫度的熱循環(huán)儀Personal中孵育1分鐘，在冰上貯存。
退火完成后，向混合物中添加終濃度為20mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸鎂、500μM的每種dNTP、30U大腸桿菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物置于60℃的熱循環(huán)儀MP中并反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取3μl，在3％NuSieve 3∶1瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖19A所示。圖19A展示了對(duì)臨床標(biāo)本中的HCV的檢測(cè)結(jié)果。泳道B；以無(wú)菌水為模板；泳道1；取自健康個(gè)體的樣品；泳道2-6；取自感染HCV的患者的樣品；及泳道M分子量標(biāo)記(50-2000bp)。
如圖19A所示，僅在取自HCV患者的RNA樣品中觀察到源自HCV基因組核苷酸序列的、預(yù)期長(zhǎng)約107bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，但在取自正常個(gè)體血清的樣品及空白中沒(méi)有觀察到這樣的擴(kuò)增片段。此外，如實(shí)施例9中所述，以SEQ ID NO103表示的、5′-末端生物素標(biāo)記的HCV為探針，對(duì)ICAN擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交。結(jié)果如圖19B所示。圖19B中的電泳結(jié)果顯示的泳道為樣品泳道。
如圖19所示，其進(jìn)一步證明，電泳結(jié)果與斑點(diǎn)印跡雜交結(jié)果相一致。這些結(jié)果證明，本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)實(shí)際臨床標(biāo)本中的HCV，并可對(duì)病毒等進(jìn)行有效檢測(cè)。實(shí)施例22對(duì)腺病毒檢測(cè)方法進(jìn)行檢驗(yàn)。
在腺病毒(GenBank編號(hào)JO1917)核苷酸序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了SEQ ID NO104-106所表示的、用于擴(kuò)增E1A(腫瘤基因)、E1A-1(有義)、E1A-2(反義)和E1A-3(反義)的引物。選用了腺病毒(ATCC編號(hào)VR-5)。模板制備如下。在0.1％SDS和0.2mg/ml蛋白酶K存在下，在37℃下對(duì)100μl含有濃度為8.73×1010PFU/ml的腺病毒的溶液孵育1小時(shí)。通過(guò)硅膠吸附對(duì)DNA進(jìn)行純化。利用無(wú)菌水對(duì)選用的純化DNA進(jìn)行稀釋以制備相當(dāng)于103、104、105或106PFU的腺病毒DNA。反應(yīng)進(jìn)行如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，將10μl含有60pmol引物E1A-1和E1A-2(待擴(kuò)增鏈長(zhǎng)112bp)或E1A-1和E1A-3(待擴(kuò)增鏈長(zhǎng)91bp)、2μl0.05％丙二胺和模板的ofa反應(yīng)體系在98℃下加熱變性2分鐘，隨后在并上迅速冷卻以使引物退火到模板上。
退火完成后，向混合物中添加40μl含有每種dNTP各0.625mM、42.5mM Tricine-氫氧化鉀緩沖液(pH8.5)、5.0mM醋酸鎂、0.0125％BSA、1.25％DMSO、15U大腸桿菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶的混合物，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在60℃下孵育1hr。作為對(duì)照，利用與上述相同的模板，以含有SEQ ID NOS107，108和142所表示的核苷酸序列的、用于PCR擴(kuò)增E1A(腫瘤基因)、E1A-1(有義)、E1A-2(反義)和E1A-3(反義)的引物為引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。此PCR檢測(cè)操作如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，制備了50μl含有60pmol引物E1A-1和E1A-2(待擴(kuò)增鏈長(zhǎng)112bp)或E1A-1和E1A-3(待擴(kuò)增鏈長(zhǎng)91bp)、5μl 10×Ex Taq緩沖液(Takara Shuzo)、1.25U TaKaRaEx Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)及每種dNTP各0.2mM的反應(yīng)混合物。PCR反應(yīng)條件如下；94℃下反應(yīng)30秒，55℃下反應(yīng)30秒及72℃下反應(yīng)30秒，持續(xù)30個(gè)循環(huán)。
反應(yīng)完成后，從ICAN反應(yīng)混合物和PCR反應(yīng)混合物中各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖20和表19所示。圖20展示了對(duì)源自腺病毒顆粒的病毒E1A基因的檢測(cè)結(jié)果。泳道1-10展示了結(jié)合利用引物E1A-1和E1A-2獲得的結(jié)果。泳道11-20展示了結(jié)合利用引物E1A-1和E1A-3獲得的結(jié)果。泳道1分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道2；利用與106PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的ICAN；泳道3；利用與105PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的ICAN；泳道4利用與104PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的ICAN；泳道5；利用與103PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的ICAN；泳道6；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道7；利用與106PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的PCR；泳道8；利用與105PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的PCR；泳道9；利用與104PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的PCR；及泳道10；利用與103PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的PCR。此外，泳道11分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道12；利用與106PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的ICAN；泳道13；利用與105PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的ICAN；泳道14；利用與104PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的ICAN；泳道15；利用與103PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的ICAN；泳道16；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道17；利用與106PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的PCR；泳道18；PCR利用與105PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的PCR；泳道19；利用與104PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的PCR；及泳道20；利用與103PFU相當(dāng)?shù)腄NA進(jìn)行的PCR。
表9擴(kuò)增長(zhǎng)度 檢測(cè)限ICAN PCR11210410491 104104如圖20和表9所示，其進(jìn)一步證明，利用ICAN進(jìn)行的腺病毒E1A基因檢測(cè)的檢測(cè)靈敏度與通過(guò)PCR進(jìn)行的檢測(cè)靈敏度相當(dāng)。實(shí)施例23檢驗(yàn)了對(duì)感染了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的細(xì)胞中的整合病毒基因進(jìn)行的檢測(cè)。如下所述制備感染了逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞和基因組DNA。簡(jiǎn)單來(lái)講，按照磷酸鈣法，將載體質(zhì)粒pDON-AI(Takara Shuzo)導(dǎo)入包裝細(xì)胞GPE+86中。從導(dǎo)入后細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中制備了嗜親性載體。利用嗜親性載體感染NIH/3T3細(xì)胞并將感染后的細(xì)胞在含有G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天，這樣就制得了利用病毒載體感染的細(xì)胞。按照傳統(tǒng)方法，從4×104個(gè)感染了逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞中獲得了27μg基因組DNA。選用實(shí)施例18(1)中描述的引物pIDON-AI-1和pDON-AI-2作為引物。反應(yīng)進(jìn)行如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，將10μl含有60pmol每種引物、2μl 0.25％丙二胺水溶液和0.1ng-1000ng基因組模板DNA的反應(yīng)體系在98℃下加熱2分鐘，隨后在60℃的熱循環(huán)儀(Takara Shuzo)中使引物與模板退火。
退火完成后，向反應(yīng)混合物中添加40μl含有每種dNTP各0.625mM、40mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(PH7.8)、125mM醋酸鉀、5.0mM醋酸鎂、0.0125％ BSA、1.25％ DMSO、30U大腸桿菌RNA酶H和5.5UBcaBEST DNA聚合酶的混合物，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在60℃循環(huán)儀中孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，從反應(yīng)混合物中各取5μl混合物，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。此外，為了比較ICAN和PCR的DNA檢測(cè)靈敏度，利用SEQ ID NOS111和112所表示的引物pDON-AI-3和pDON-AI-4進(jìn)行PCR。此PCR操作如下。制備了50μl含有0.1ng-100ng模板、60pmol各種引物、5μl 10×Ex Taq緩沖液、1.25U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶及每種dNTP各0.2mM的反應(yīng)混合物。利用熱循環(huán)儀Personal使混合物進(jìn)行如下反應(yīng)；94℃下反應(yīng)30秒，55℃下反應(yīng)30秒及72℃下反應(yīng)30秒，持續(xù)35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中各取5μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖21所示。圖21展示了利用ICAN和PCR對(duì)感染了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的細(xì)胞的整合病毒基因的檢測(cè)結(jié)果。泳道1；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道2；1000ng模板；泳道3；100ng模板；泳道4；10ng模板；泳道5；1ng模板；及泳道6；0.1ng模板。
如圖21所示，在利用1ng模板DNA進(jìn)行的ICAN和利用1ng模板進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR混合物中都觀察到了感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例24對(duì)結(jié)合利用了本發(fā)明中的擴(kuò)增方法和雜交方法的靶核酸檢測(cè)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，從而對(duì)大腸桿菌O-157 vero毒素基因進(jìn)行檢測(cè)。選取腸出血性大腸桿菌O-157的vero毒素基因作為靶。如實(shí)施例8(1)中所述制備模板DNA。GC含量約為40％、長(zhǎng)約80bp的區(qū)域選作待擴(kuò)增區(qū)域。選取含有SEQ ID NO113和114所表示的核苷酸序列的引物VT1-IF4和VT1-IR1作為引物。反應(yīng)進(jìn)行如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，制備了5μl含有60pmol引物VT1-IF4和VT1-IR1、0.01％丙二胺溶液、相當(dāng)于0-105個(gè)細(xì)胞的熱水提取物及無(wú)菌水的混合物。將此混合物在98℃下加熱變性2分鐘，迅速冷卻到55℃，并在相同溫度的熱循環(huán)儀Personal(Takara Shuzo)中孵育1分鐘，隨后置于冰上進(jìn)行退火。
退火完成后，向混合物中添加終濃度20mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸鎂、濃度均為500uM的多種dNTP、15U大腸桿菌RNA酶H和2.75U BcaBEST DNA聚合酶的混合物，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到25μl。將反應(yīng)混合物置于溫度已設(shè)定為55℃的熱循環(huán)儀Personal中并在此溫度下孵育60分鐘。作為對(duì)照，按照操作指南，利用O-157 Typing Set(Takara Shuzo)在熱循環(huán)儀Personal中對(duì)熱水提取物進(jìn)行PCR。此PCR操作如下94℃下反應(yīng)1min，55℃下反應(yīng)1min，及72℃下反應(yīng)1min，持續(xù)35個(gè)循環(huán)。此反應(yīng)所需的總反應(yīng)時(shí)間約為145分鐘。預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為349bp。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取3μl，在3％NuSieve 3∶1瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。ICAN結(jié)果如圖22所示。圖22展示了對(duì)O-157vero毒素I基因的檢測(cè)結(jié)果。泳道M；分子量標(biāo)記(50-2000bp)；泳道N；以無(wú)菌水為模板；泳道1相當(dāng)于1個(gè)細(xì)胞的模板；泳道2；相當(dāng)于10個(gè)細(xì)胞的模板；泳道3；相當(dāng)于102個(gè)細(xì)胞的模板；及泳道4；相當(dāng)于103個(gè)細(xì)胞的模板。另外，表10展示了利用ICAN和PCR進(jìn)行的檢測(cè)結(jié)果。
表10大腸桿菌O-157細(xì)胞的數(shù)目0 1 10ICAN - + +++PCR - + ++-；沒(méi)有進(jìn)行擴(kuò)增；+至+++表示三個(gè)等級(jí)的擴(kuò)增程度如表10所示，在ICAN和PCR檢測(cè)法中，在利用相當(dāng)于1個(gè)細(xì)胞的熱水提取物進(jìn)行的反應(yīng)體系中都觀察到感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，以含有SEQ ID NO115表示的核苷酸序列并在5′-末端用生物素標(biāo)記的寡核苷酸VT1為探針，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交。如實(shí)施例19所述進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交。其結(jié)果與電泳結(jié)果相一致。因此，其進(jìn)一步證明，ICAN的檢測(cè)靈敏度與PCR相當(dāng)。此外，相對(duì)于PCR，利用本發(fā)明的ICAN可將所需的反應(yīng)總時(shí)間縮短至1/2或更短。因此，其進(jìn)一步證明，本發(fā)明的ICAN作為病原等的檢測(cè)方法是有效的。實(shí)施例25對(duì)肉毒A型毒素基因的檢測(cè)方法進(jìn)行檢驗(yàn)。從來(lái)自于食物中毒案例的肉毒梭菌中制備DNA，選取A-190型DNA作為模板。此肉毒梭菌菌株保藏在Department of Hygiene，Kagawa NutritionUniversity。合成含有SEQ IOD NO116和117所代表的核苷酸序列的引物BotA S2和BotA A2來(lái)作為檢測(cè)引物。利用引物對(duì)擴(kuò)增得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約為150bp。制備1μl含有100fg、1pg、10pg或100pg源自產(chǎn)生A型毒素的肉毒梭菌的DNA的水溶液，以此作為模板。反應(yīng)進(jìn)行如下。
制備10μl含有濃度為50pmol引物對(duì)、 0.01％丙二胺及1μl模板DNA溶液的混合物。在實(shí)施例19中所描述的反應(yīng)條件下，利用反應(yīng)混合物中的組合物對(duì)混合物進(jìn)行ICAN。作為對(duì)照，按照使用指南，在熱循環(huán)儀Personal中利用肉毒A型毒素基因檢測(cè)引物組BAS-1和BAS-2(Takara Shuzo)來(lái)進(jìn)行PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)期大小為284bp。
反應(yīng)結(jié)束后，從各反應(yīng)混合物中取3μl混合物，在4％NuSieve 3∶1瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖23A所示。圖23A展示了利用ICAN和PCR對(duì)肉毒A型毒素基因進(jìn)行的檢測(cè)結(jié)果。泳道M1分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道M2；分子量標(biāo)記(50-2000bp標(biāo)記物)；泳道1無(wú)模板；泳道2；100fg模板；泳道3；10pg模板；及泳道4；100pg模板。
如圖23A所示，在利用100fg模板DNA進(jìn)行ICAN時(shí)觀察到感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。另一方面，在利用100fg模板DNA進(jìn)行PCR時(shí)沒(méi)有觀察到感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，利用含有SEQ ID NO118所表示的核苷酸序列的BotA探針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交。如實(shí)施例9中所述進(jìn)行斑點(diǎn)印跡雜交。結(jié)果如23B所示。如圖23B所示，在利用100fg模板DNA進(jìn)行ICAN和在利用10pg模板DNA進(jìn)行PCR時(shí)分別觀察到有信號(hào)存在。這些結(jié)果與電泳結(jié)果相一致。實(shí)施例26對(duì)菊花類(lèi)病毒檢測(cè)進(jìn)行了檢驗(yàn)。制備了低分子量RNA的10倍系列稀釋液，而低分子量RNA是按照J(rèn)P-A 9-140383的實(shí)施例1中描述的從感染菊花stunt類(lèi)病毒(CSVd)的菊花中提取低分子量RNA的方法獲得的。利用RNA PCR試劑盒(AMW)ver 2.1(Takara Shuzo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。特別的，制備了20μl含有1×RNA PCR緩沖液、5mMMgCl2、各種dNTP各1mM、20U RNA酶抑制劑、5U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶XL、50pmol隨機(jī)9聚體、1μl RNA系列稀釋液中的一種稀釋液的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物。將反應(yīng)混合物在30℃溫?zé)?0分鐘，在55℃下反應(yīng)30分鐘，隨后在99℃下加熱5分鐘使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。冷卻后，進(jìn)行ICAN。以1μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物作為模板來(lái)對(duì)50μl反應(yīng)混合物進(jìn)行ICAN。在本實(shí)施例中，選取含有SEQ ID NO119和120所表示的核苷酸序列的引物CSVD-F4和CSVD-R3作為引物。除反應(yīng)溫度為60℃和使用熱循環(huán)儀MP外，其他條件與實(shí)施例19所描述的相同來(lái)進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，從每種反應(yīng)混合物中各取3μl并利用3％NuSieve 3∶1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。
另一方面，以1μl相同的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物為模板在50μl反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。選取SEQ ID NO109和110所表示的引物F94和R264作為引物。反應(yīng)進(jìn)行如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，按照操作指導(dǎo)，利用TaKaRaPCR擴(kuò)增試劑盒制備了反應(yīng)混合物。向其中添加引物各10pmol及1μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物以使其體積達(dá)到50μl。利用熱循環(huán)儀MP進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)進(jìn)行如下94℃下反應(yīng)30秒，55℃下反應(yīng)30秒，及72℃下反應(yīng)30秒，持續(xù)30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中各取5μl并利用3％ NuSieve 3∶1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。結(jié)果如表11所示。
表11模板RNA的稀釋比×102×103RT-ICAN ++ +RT-PCR + --；無(wú)擴(kuò)增；+擴(kuò)增；++很好的擴(kuò)增如表11所示，在以103倍稀釋的RNA樣品為模板進(jìn)行ICAN反應(yīng)時(shí)觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物存在。另一方面，在以102倍稀釋的RNA樣品為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)觀察到擴(kuò)增產(chǎn)物存在。
此外，利用斑點(diǎn)印跡雜交進(jìn)一步對(duì)ICAN擴(kuò)增產(chǎn)物和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行證實(shí)以確定其為感興趣的產(chǎn)物。斑點(diǎn)印跡雜交是以含有SEQ IDNO121所表示的核苷酸序列并在5′-末端標(biāo)記有生物素的CSVd探針進(jìn)行的。斑點(diǎn)印跡雜交如實(shí)施例9所述進(jìn)行。其結(jié)果與電泳結(jié)果相一致。在利用103倍稀釋的RNA樣品進(jìn)行ICAN和在利用102倍稀釋發(fā)RNA樣品進(jìn)行PCR時(shí)分別觀察到有信號(hào)存在，這證明ICAN較PCR靈敏。實(shí)施例27檢測(cè)了利用Pfu RNA酶H對(duì)感染了菊花dwarfing類(lèi)病毒(CSVd)的菊花中的類(lèi)病毒基因進(jìn)行的檢測(cè)。將60μl含有3μl實(shí)施例26中制備的RNA10倍稀釋液中的一種、10mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.3)、50mMKCl、5mM MgCl2、濃度均為1mM的多種dNTP、150pmol隨機(jī)6聚體引物、60U核糖核酸酶抑制劑(Takara Shuzo)和15U逆轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)(Takara Shuzo)的混合物在30℃孵育10min，在42℃下孵育1小時(shí)，隨后利用熱循環(huán)儀(GeneAmp PCR System 9600，AppliedBiosystems)在99℃下對(duì)其孵育5min使酶失活，這樣制得了cDNA。在類(lèi)病毒的mRNA核苷酸序列基礎(chǔ)上，合成了含有SEQ ID NO122-125所表示的核苷酸序列的引物Vd1、Vd2、Vd3和Vd4。
將50μl含有50pmol引物Vdl和Vd2、1μl上述合成的cDNA溶液、其作為陰性對(duì)照模板的10倍、100倍、1000倍或10000倍水稀釋液或水、每種dNTP各0.5mM、32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、4.0mM醋酸鎂、0.01％BSA、1％DMSO、0.0156μg Pfu RNA酶H和1U BcaBEST DNA聚合酶的混合物在57℃的熱循環(huán)儀中孵育1小時(shí)。將反應(yīng)后樣品在-20℃下冷凍保存以進(jìn)行分析。
以另一PCR作為對(duì)照。簡(jiǎn)單來(lái)講，在熱循環(huán)儀中使50μl含有50pmol引物Vd3和Vd4、1μl cDNA溶液、其作為陰性對(duì)照模板的10倍、100倍、1000倍或10000倍水稀釋液或水、5μl 10×Ex Taq緩沖液、1.25U TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶及每種dNTP各0.2mM的反應(yīng)混合物進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序如下；94℃下反應(yīng)2min，1個(gè)循環(huán)；94℃下反應(yīng)30秒，55℃下反應(yīng)30秒及72℃下反應(yīng)30秒，持續(xù)35個(gè)循環(huán)；以及72℃下反應(yīng)5min，1個(gè)循環(huán)。將反應(yīng)后樣品在-20℃下冷凍保存以進(jìn)行分析。
從ICAN和PCR反應(yīng)混合物中各取5μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖24所示。圖24展示了類(lèi)病毒的檢測(cè)結(jié)果，而此檢測(cè)是利用Pfu RNA酶H通過(guò)ICAN或通過(guò)PCR進(jìn)行的。泳道1；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道2陰性對(duì)照；泳道3；cDNA的10000倍稀釋液；泳道4；cDNA的1000倍稀釋液；泳道5；cDNA的100倍稀釋液；泳道6；cDNA的10倍稀釋液；及泳道；cDNA發(fā)原始溶液。
如圖24所展示的，當(dāng)以cDNA的100倍稀釋液為模板時(shí)，在ICAN和PCR中都觀察到了感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例28檢驗(yàn)了對(duì)K-ras基因進(jìn)行的檢測(cè)。
(1)從基因組DNA中進(jìn)行檢測(cè)在人c-Ki-ras的核苷酸序列基礎(chǔ)上，構(gòu)建了SEQ ID NO126和127所代表的引物c-Ki-ras-1和c-Ki-ras-2。
制備了10μl含有每種引物各60pmol、2μl 0.25％丙二胺水溶液和10ng-100ng人基因組模板DNA(Clontech)的混合物。將此混合物在98℃下加熱2min，并在53℃下的熱循環(huán)儀Personal中進(jìn)行反應(yīng)以使引物退火到模板上。
退火完成后，向退火混合物中添加40μl含有每種dNTP各0.625mM、40mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、125mM醋酸鉀、5.0mM醋酸鎂、0.0125％BSA、1.25％DMSO、30U大腸桿菌RNA酶H和5.5UBcaBEST DNA聚合酶的混合物，使其終體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物在53℃下孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取5μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。
另一方面，以另一PCR作為對(duì)照。選用SEQ ID NO128和129所表示的引物c-Ki-ras-3和c-Ki-ras-4作為引物。制備了50μl含有60pmol的各種引物、0.1-100ng模板、5μl 10×Ex Taq緩沖液、1.25UTaKaRa Ex Taq DNA聚合酶及每種dNTP各0.2mM的溶液?；旌衔镌跓嵫h(huán)儀Personal中的反應(yīng)如下；94℃下反應(yīng)30秒，55℃下反應(yīng)30秒及72℃下反應(yīng)30秒，持續(xù)30或35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中各取5μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖25所示。圖25展示了通過(guò)ICAN和PCR對(duì)人基因組DNA中的c-Ki-ras基因的檢測(cè)結(jié)果。對(duì)ICAN來(lái)講，泳道1；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道2；100ng模板；泳道3；10ng模板；泳道4；ng模板；及泳道5無(wú)模板。對(duì)PCR來(lái)講，泳道1；100ng模板；泳道2；10ng模板；泳道3；1ng模板；及泳道4；無(wú)模板。
如圖25所述，在利用1ng模板進(jìn)行的ICAN和利用10ng模板進(jìn)行的35個(gè)循環(huán)的PCR中觀察到感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖30展示了利用1ng-100ng模板進(jìn)行ICAN和PCR所獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物量的比較結(jié)果。在圖30中，陰影柱表示進(jìn)行了30個(gè)循環(huán)的PCR結(jié)果，有點(diǎn)的柱表示進(jìn)行了35個(gè)循環(huán)的PCR結(jié)果，完全閉合的柱表示ICAN結(jié)果。如圖30所展示的，其進(jìn)一步證明，通過(guò)ICAN獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物量較利用PCR獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物量大。
(2)從血樣中檢測(cè)以檸檬酸鈉或肝素為抗凝劑從每個(gè)健康個(gè)體中采集100μl血樣，并利用Dr.GenTLETM(用于全血)(Takara Shuzo)從中制備基因組DNA。利用相應(yīng)于0.04-5μl血液的DNA、按照上文(1)中所描述的通過(guò)ICAN來(lái)進(jìn)行c-Ki-ras基因檢測(cè)。此外，為了對(duì)比利用ICAN和PCR進(jìn)行的DNA檢測(cè)的靈敏度，如上文(1)所述，所以利用從0.04-5μl血樣中制備的DNA來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖26所示。圖26展示了利用ICAN和PCR對(duì)血樣中的c-Ki-ras基因進(jìn)行的檢測(cè)結(jié)果。對(duì)于ICAN來(lái)講，泳道1分子量標(biāo)記；泳道2；5μl檸檬酸化的血液；泳道3；1μl檸檬酸化的血液；泳道4；0.2μl檸檬酸化的血液；泳道5；0.04μl檸檬酸化的血液；泳道6；5μl添加有肝素的血液；泳道7；1μl添加有肝素的血液；泳道8；0.2μl添加有肝素的血液；及泳道9；0.04μl添加有肝素的血液。對(duì)于PCR來(lái)講，泳道1；分子量標(biāo)記；泳道2；5μl檸檬酸化的血液，30個(gè)循環(huán)；泳道3；1μl檸檬酸化的血液，30個(gè)循環(huán)；泳道4；0.2μl檸檬酸化的血液，30個(gè)循環(huán)；泳道5；0.04μl檸檬酸化的血液，30個(gè)循環(huán)；泳道6；5μl檸檬酸化的血液，35個(gè)循環(huán)；泳道7；1μl檸檬酸化的血液，35個(gè)循環(huán)；泳道8；0.2μl檸檬酸化的血液，35個(gè)循環(huán)；泳道9；0.04μl檸檬酸化的血液，35個(gè)循環(huán)；泳道10；5μl添加有肝素的血液，30個(gè)循環(huán)；泳道11；1μl添加有肝素的血液，30個(gè)循環(huán)；泳道12；0.2μl添加有肝素的血液，30個(gè)循環(huán)；泳道13；0.04μl添加有肝素的血液，30個(gè)循環(huán)；泳道14；5μl添加有肝素的血液，35個(gè)循環(huán)；泳道15；1μl添加有肝素的血液，35個(gè)循環(huán)；泳道16；0.2μl添加有肝素的血液，35個(gè)循環(huán)；及泳道17；0.04μl添加有肝素的血液，35個(gè)循環(huán)。
如圖26所展示的，在利用相應(yīng)于0.2μl血樣(檸檬酸化的或添加有肝素的)的基因組DNA進(jìn)行ICAN和利用相應(yīng)于0.2μl血樣(檸檬酸化的或添加有肝素的)的基因組DNA進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR時(shí)分別觀察到有感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物存在。實(shí)施例29檢驗(yàn)了利用Bca RNA酶HIII對(duì)大腸桿菌O-157 vero毒素2(VT-2)基因進(jìn)行的檢測(cè)。42℃下，將腸出血性大腸桿菌O-157在含有新生霉素的mEC培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時(shí)，隨后在95℃下加熱10min。通過(guò)利用無(wú)菌水對(duì)提取物進(jìn)行稀釋?zhuān)频孟喈?dāng)于0、1、10、102或103個(gè)細(xì)胞的O-157熱水提取物并用做模板。選取含有SEQ ID NO130和131所表示的核苷酸序列的引物VT2-IF4和VT2-IR3作為引物。利用引物對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約為146bp。反應(yīng)進(jìn)行如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，制備了10μl含有50pmol引物對(duì)、0.01％丙二胺、一種熱水提取物的混合物。將此混合物在98℃下加熱變性2分鐘，并在55℃的熱循環(huán)儀Personal(Takara Shuzo)中孵育1分鐘，隨后置于冰上冷卻。向混合物中添加34mM Tricine緩沖液(pH8.7)、10mM氯化鉀、10mM硫酸銨、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸鎂、濃度均為500uM的多種dNTP、32U如參考實(shí)施例3(5)中所述制備的Bca RNA酶HIII和5.5UBcaBEST DNA聚合酶，使其體積達(dá)到50μl。將此反應(yīng)混合物置于溫度已設(shè)定為55℃的熱循環(huán)儀中并在此溫度下反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中各取3μl，在4％NuSieve 3∶1瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖27所示。圖27展示了利用Bca RNA酶HIII對(duì)大腸桿菌O-157 vero毒素II(VT2)基因進(jìn)行的檢測(cè)結(jié)果。泳道M；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道N；陰性對(duì)照；泳道1相當(dāng)于1個(gè)細(xì)胞的模板；泳道2；相當(dāng)于10個(gè)細(xì)胞的模板；泳道3；相當(dāng)于102個(gè)細(xì)胞的模板；及泳道4；相當(dāng)于103個(gè)細(xì)胞的模板。
如圖27所示，在利用相當(dāng)于1個(gè)細(xì)胞的熱水提取物進(jìn)行ICAN時(shí)檢測(cè)到VT2基因。這些結(jié)果與實(shí)施例9中利用大腸桿菌RNA酶H進(jìn)行的ICAN和PCR得到的檢測(cè)結(jié)果相同。因此，其進(jìn)一步證明了利用BcaRNA酶HIII這種熱抗性RNA酶H進(jìn)行ICAN也可對(duì)病毒、細(xì)菌等進(jìn)行有效的檢測(cè)。實(shí)施例30檢驗(yàn)了對(duì)金黃色葡萄球菌腸毒素A基因進(jìn)行的檢測(cè)。在金黃色葡萄球菌腸毒素A基因區(qū)域的核苷酸序列的基礎(chǔ)之上，合成了SEQ IDNO136和137所表示的引物SEA-1和SEA-2。58℃下，在熱循環(huán)儀中對(duì)50μl含有1μl含有115pg或1.15ng金黃色葡萄球菌(ATCC編號(hào)13565)基因組DNA溶液或作為陰性對(duì)照的1μl水、50pmol的引物SEA-1和SEA-2、每種dNTP各0.5mM、32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、4.0mM醋酸鎂、0.01％ BSA、1.0％ DMSO、0.0156μg Pfu RNA酶H和1U BcaBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)的反應(yīng)混合物孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中取5μl，并在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。結(jié)果如圖29所示。圖29展示了金黃色葡萄球菌腸毒素A基因的電泳檢測(cè)結(jié)果。泳道1；分子量標(biāo)記(100bp梯)；泳道2；陰性對(duì)照(無(wú)菌水)；泳道3；115pg模板；及泳道4；1.15ng模板。
如圖29所示，在選用約1.15ng模板的情況下觀察到感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)施例31檢驗(yàn)了對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)進(jìn)行的檢測(cè)。在HCV的核苷酸序列的基礎(chǔ)之上，合成了含有SEQ ID NO138和139所表示的核苷酸序列的引物HCV-F3和HCV-R1。按照如下操作制備了模板DNA。簡(jiǎn)單來(lái)講，利用熱循環(huán)儀(Gene Amp PCR System 9600，Applied Biosystems)，將4μl含有如實(shí)施例21所述的從100μl健康個(gè)體血清或感染HCV的患者的血清中制備的RNA、10mM tris-鹽酸緩沖液(pH8.3)、5mMMgCl2、每種dNTP各1mM、10pmol隨機(jī)6聚體及10U逆轉(zhuǎn)錄酶XL(TakaraShuzo)的混合物在30℃下孵育10分鐘，在42℃下孵育1小時(shí)，隨后在99℃下加熱5分鐘以使酶失活，這樣就制備了cDNA。
除選用1μl cDNA反應(yīng)混合物和100pmol引物HCV-F3和HCV-R1外，如實(shí)施例13中所示，在55℃進(jìn)行ICAN 1小時(shí)。反應(yīng)完成后，每種反應(yīng)混合物各取2.5μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖31所示。圖31展示了HCV的電泳檢測(cè)結(jié)果。泳道1分子量標(biāo)記(100bp)；泳道2從健康個(gè)體血清中制備的模板；及泳道3-6從感染HCV的患者血清中制備的模板。
如圖31所示，其進(jìn)一步證明能夠從感染了HCV的患者的血清樣品中特異性檢測(cè)HCV。實(shí)施例32對(duì)本發(fā)明的擴(kuò)增方法進(jìn)行檢驗(yàn)。
(1)以實(shí)施例2(2)中制備的pUC19-150質(zhì)粒DNA為模板、以SEQ ID NO35和36所表示的引物MCS-F和MCS-R為引物進(jìn)行PCR。利用Microcon-100(Millipore)對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行純化得到長(zhǎng)約534bp的PCR擴(kuò)增片段。制備了含有15ng PCR片段、30pmol含有SEQID NO140所表示的核苷酸片段且在5′-末端利用[γ-32P]ATP進(jìn)行磷酸化標(biāo)記的引物MR2及5μl無(wú)菌蒸餾水的反應(yīng)混合物，并制備了進(jìn)一步含有30pmol含有SEQ ID NO141所表示的核苷酸序列的引物MR1的混合物。在98℃下使反應(yīng)混合物加熱變性2分鐘，隨后冷卻到55℃。向反應(yīng)混合物中添加20μl含有1U BcaBEST DNA聚合酶的反應(yīng)混合物(42.5mM Tricine緩沖液(pH8.7)，12.5mM氯化鉀，12.5mM硫酸銨，0.0125％BSA，1.25％DMSO，5mM醋酸鎂，每種dNTP各0.625mM)。將得到的混合物在55℃下反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)完成后，向5μl反應(yīng)混合物中添加2.5μl反應(yīng)中止溶液(95％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴酚藍(lán)，0.5％二甲苯藍(lán))。在94℃下使此混合物熱變性3分鐘。從每種反應(yīng)混合物中各取1.6μl，利用含有8M尿素的6％聚丙酰胺凝膠進(jìn)行電泳，并利用BAS2000(Fujix)讀取信號(hào)來(lái)檢測(cè)從引物MR1上延伸的產(chǎn)物。結(jié)果如圖32A所示。利用磷酸化標(biāo)記有[γ-32P]ATP的引物MF2對(duì)M13mp18單鏈DNA(Takara Shuzo)進(jìn)行序列分析來(lái)制備圖32A中的序列梯，并利用其確定延伸產(chǎn)物的長(zhǎng)度。泳道1結(jié)合利用MF2和MR1；及泳道2；MR1。
如圖32A所示，當(dāng)通過(guò)向模板中僅添加引物MR1來(lái)進(jìn)行延伸作用時(shí)，檢測(cè)到了從引物MR1開(kāi)始延伸到模板末端的長(zhǎng)約448bp的條帶。另一方面，通過(guò)進(jìn)一步添加引物MR2，在上述條帶之外，檢測(cè)到了與引物MR1和MF2連接的長(zhǎng)約373bp的條帶。因此，其進(jìn)一步證明，以PCR擴(kuò)增片段為模板、在BcaBEST DNA聚合酶的作用下從M1引物開(kāi)始的延伸進(jìn)行的交換要?dú)w因于此模板交換到了以從引物MF2開(kāi)始的延伸鏈為模板而進(jìn)行的延伸中。此外，在類(lèi)似的條件下，當(dāng)克列諾DNA聚合酶用做具有鏈置換活性的嗜中溫DNA聚合酶時(shí)觀察到模板交換。另一方面，當(dāng)選用不具有鏈置換活性的TaKaRa Taq DNA聚合酶(TakaraShuzo)或PyroBEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)時(shí)沒(méi)有觀察到模板交換。
(2)利用退火到引物上的模板DNA鏈對(duì)模板交換反應(yīng)進(jìn)行檢驗(yàn)。與引物MF2和MR1退火的DNA片段的制備如下。以質(zhì)粒pUC19為模板，利用引物MCSF和RV(Takara Shuzo)或引物M4(Takara Shuzo)和MCSR進(jìn)行PCR。利用Microcon-100對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行純化以獲得PCR擴(kuò)增片段MSCF-RV(236bp)和M4-MCSR(271bp)。在這兩個(gè)PCR擴(kuò)增片段中一般存在通過(guò)引物M4和RV而結(jié)合的區(qū)域。通過(guò)如下操作使模板-引物(1)和模板-引物(2)退火到一起，而模板-引物(1)中退火到引物上的模板DNA鏈沒(méi)有相互退火，而模板-引物(2)中退火到引物上的模板DNA鏈?zhǔn)窍嗷ネ嘶鸬摹?br> (1)將含有30ng MCSF-RV片段、40pmol在5′-末端磷酸化標(biāo)記有[γ-32P]ATP的引物MF2、終濃度為0.01％的丙二胺及5μl無(wú)菌水的混合物和含有30ng M4-MCSR片段、40pmol引物MR1、終濃度為0.01％的丙二胺及5μl無(wú)菌水的混合物在98℃下分別加熱變性2分鐘，隨后冷卻到55℃。從每種反應(yīng)混合物中各取2.5μl混合物并將其混合在一起以制備模板-引物。
(2)將含有15ng MCSF-RV片段、15ng M4-MCSR片段、20pmol在5′-末端磷酸化標(biāo)記有[γ-32P]ATP的引物MF2、20pmol引物MR1、終濃度為0.01％的丙二胺及5μl無(wú)菌水的反應(yīng)混合物在98℃下加熱變性2分鐘，隨后冷卻到55℃以制備模板-引物。
將20μl含有1U BcaBEST DNA聚合酶的反應(yīng)混合物(42.5mMTricine緩沖液(pH8.7)，12.5mM氯化鉀，12.5mM硫酸銨，0.0125％BSA，1.25％DMSO，5mM醋酸鎂，每種dNTP各0.625mM)添加到5μl模板-引物反應(yīng)混合物中。生成的混合物在55℃下反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)完成后，向5μl反應(yīng)混合物中添加2.5μl反應(yīng)中止溶液(95％甲酰胺，20mM EDTA，0.05％溴酚藍(lán)，0.5％二甲苯藍(lán))。在94℃下使此混合物熱變性3分鐘。從每種反應(yīng)混合物中各取1.6μl，利用含有8M尿素的6％聚丙酰胺凝膠進(jìn)行電泳，并利用BAS2000(Fujix)讀取信號(hào)來(lái)檢測(cè)從引物MR2上延伸的產(chǎn)物。結(jié)果如圖32B所示。利用磷酸化標(biāo)記有[γ-32P]ATP的引物MR1對(duì)M13mp18單鏈DNA(Takara Shuzo)進(jìn)行序列分析，從而制備圖32B中的序列梯，并利用其確定延伸產(chǎn)物的長(zhǎng)度。泳道1；模板DNA鏈沒(méi)有相互退火；及泳道2；模板DNA鏈相互退火到一起。
如圖32B所展示的，對(duì)其中退火到引物上的模板DNA鏈沒(méi)有相互退火的模板-引物來(lái)講，儀觀察到一從引物MF2延伸到模板末端的、長(zhǎng)為161bp的條帶。另一方面，對(duì)其中退火到引物上的模板DNA鏈相互退火的模板-引物來(lái)講，在上述的條帶之外還檢測(cè)到一與引物MF2和MR1結(jié)合的、長(zhǎng)為223bp的條帶。因此，其進(jìn)一步證明，如果退火到引物上的模板DNA鏈相互退火就會(huì)發(fā)生模板交換反應(yīng)。實(shí)施例33(1)利用參考實(shí)施例7中描述的源自閃爍古生球菌(Afu)的RNA酶H檢驗(yàn)對(duì)結(jié)核分支桿菌的檢測(cè)。在GenBank注冊(cè)編號(hào)為AL123456的結(jié)核分支桿菌基因組的核苷酸序列基礎(chǔ)上合成了引物MTIS2F(SEQID NO155)和MTIS2R(SEQ ID NO156)。包括引物部分在內(nèi)的與引物對(duì)相鄰的區(qū)域長(zhǎng)為103bp。利用傳統(tǒng)方法，從卡介苗疫苗(Nippon BCGSeizo)中提取作為模板的結(jié)核分支桿菌基因組DNA。制備了每μl無(wú)菌水中含有100pg、10pg、1pg、100fg、10fg或1fg基因組DNA的溶液。反應(yīng)進(jìn)行如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，將32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸鎂、500μM的每種dNTP、50pmol引物MTIS2F和MTIS2R、8.75U Afu RNA酶H、8U BcaBEST DNA聚合酶及1μl模板混合在一起，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物置于60℃下的熱循環(huán)儀Personal中并反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。
另一方面，以另一PCR為對(duì)照。選用在Rinsho Byori(theJapanese Journal of Clinical Pathology)，43(9)94 1-947(1995)中描述的引物MTIS PCR-F和MTIS PCR-R作為引物。利用此引物對(duì)得到了長(zhǎng)為276bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。按照在Ex Taq DNA聚合酶(TakaraShuzo)外附加的使用指南，利用每種引物各10pmol制備了50μl反應(yīng)混合物。將反應(yīng)混合物置于熱循環(huán)儀中并進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)包括94℃下反應(yīng)30秒，50℃下反應(yīng)30秒，及72℃下反應(yīng)30秒。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。
結(jié)果，在利用100fg模板進(jìn)行反應(yīng)的各種情況下都觀察到感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。
(2)檢驗(yàn)了利用Afu RNA酶H或Pyrococcus horikoshii(PHo)RNA酶H對(duì)沙眼衣原體進(jìn)行的檢測(cè)。在GenBank注冊(cè)編號(hào)為X06707的沙眼衣原體質(zhì)粒的核酸序列基礎(chǔ)上合成了引物CT2F(SEQ ID NO157)和CT2R(SEQ ID NO158)。包括引物部分在內(nèi)的與引物對(duì)相鄰的區(qū)域長(zhǎng)為109bp。利用傳統(tǒng)方法，從卡介苗疫苗(Nippon BCG Seizo)中提取作為模板的結(jié)核分支桿菌基因組DNA。在事先征得患者同意的情況下，對(duì)來(lái)自于患者的臨床標(biāo)本進(jìn)行苯酚-氯仿處理和乙醇沉淀，這樣制得了模板DNA。反應(yīng)進(jìn)行如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，將32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸鎂、500μM的每種dNTP、50pmol引物CT2F和CT2R、46.4U Pho RNA酶H、8UBcaBEST DNA聚合酶及1μl模板混合在一起，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物置于55℃下的熱循環(huán)儀Personal中并反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果，觀察到了感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。這些結(jié)果進(jìn)一步證明，利用本發(fā)明的方法中的Afu或Pho RNA酶H可對(duì)沙眼衣原體進(jìn)行檢測(cè)。
(3)此外，檢驗(yàn)了利用商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的磁珠作為檢測(cè)工具進(jìn)行的檢測(cè)。簡(jiǎn)單來(lái)講，如上文(1)所述，以上文(1)中選用的5′-末端進(jìn)行生物素標(biāo)記的引物MTIS2R為引物，以100ng結(jié)核分支桿菌基因組DNA為模板，進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)。將生成的擴(kuò)增片段進(jìn)行30倍、300倍、或3000倍稀釋?zhuān)⒃谝蛔詣?dòng)檢測(cè)裝置Lumipuls(Fujirebio)中利用鏈親和素包被的磁珠(Pieree)進(jìn)行檢測(cè)。
能夠結(jié)合100pmol固定化生物素的磁珠與生物素化擴(kuò)增片段在小容器的第一層上反應(yīng)5分鐘。隨后向其中添加0.1N NaOH。利用FITC標(biāo)記的探針MTISBF進(jìn)行5分鐘的雜交。對(duì)其沖洗后，向其中添加POD標(biāo)記的抗FITC抗體。反應(yīng)5分鐘并沖洗，向其中添加一種發(fā)光物質(zhì)。結(jié)果，其證明在傳統(tǒng)的自動(dòng)化檢測(cè)裝置中，利用磁珠可在短時(shí)間(20分鐘)內(nèi)進(jìn)行半定量檢測(cè)。利用光計(jì)數(shù)對(duì)發(fā)光水平進(jìn)行測(cè)定來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如表12所示。
表12結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增子 光計(jì)數(shù) S/N比×303.55×10729.6×300 1.21×10710.0×3000 0.21×1071.750 0.12×107-表12中的結(jié)果證明，利用磁珠進(jìn)行的檢測(cè)與利用傳統(tǒng)的杯碟發(fā)光法進(jìn)行的檢測(cè)具有相同的靈敏度。
(4)檢驗(yàn)了利用雜種層析法對(duì)上述擴(kuò)增片段進(jìn)行的檢測(cè)。將Streptoavidin(Nacalai Tesque)固定化到硝化纖維素膜上。將其與吸水墊連接以構(gòu)建一個(gè)雜種層析條。按照雜種層析法，層析條是用來(lái)檢測(cè)上文(3)中的擴(kuò)增片段的。利用一步TMB-印跡(Pierce)通過(guò)顏色變化來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。特別的，使含有擴(kuò)增片段的反應(yīng)混合物鋪展在硝化纖維素膜上。隨后，使0.1N NaOH溶液、FITC標(biāo)記的探針、洗滌溶液、顯色液依次在硝化纖維素膜上鋪展。結(jié)果，從源自結(jié)核分支桿菌陽(yáng)性樣品的擴(kuò)增片段中檢測(cè)到一藍(lán)色條帶。其證明此方法可作為一種快速基因檢測(cè)方法，因?yàn)椋帽景l(fā)明的方法中的這種方法可在5-10分鐘內(nèi)利用肉眼觀察到結(jié)果。實(shí)施例34(1)含有有規(guī)則條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物的Southern雜交分析在許多情況下，除感興趣的三個(gè)條帶之外，在本發(fā)明的擴(kuò)增方法中可觀察到多個(gè)高分子量有規(guī)則條帶。對(duì)這些有規(guī)則條帶進(jìn)行檢驗(yàn)。選取腸出血性大腸桿菌O-157作為靶。ICAN的模板DNA、嵌合引物及反應(yīng)條件如實(shí)施例9中所述。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中各取5μl混合物，在3％NuSieve 3∶1瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖37所示。在圖37中，各泳道代表結(jié)果如下泳道M；100bp DNA梯標(biāo)記；泳道1；陰性對(duì)照；泳道2相當(dāng)于1個(gè)細(xì)胞的熱水提取物；泳道3；相當(dāng)于10個(gè)細(xì)胞的熱水提取物；泳道4；相當(dāng)于102個(gè)細(xì)胞的熱水提取物；泳道5；相當(dāng)于103個(gè)細(xì)胞的熱水提取物；泳道6；相當(dāng)于104個(gè)細(xì)胞的熱水提取物；及泳道7；相當(dāng)于105個(gè)細(xì)胞的熱水提取。如圖37所示觀察到了梯狀條帶。
(2)有規(guī)則的擴(kuò)增產(chǎn)物的分析對(duì)上文(1)中獲得的有規(guī)則條帶的核苷酸序列進(jìn)行分析。簡(jiǎn)單來(lái)講，將(1)中制備的50μl反應(yīng)混合物在3％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。電泳完成后，從凝膠中切掉有規(guī)則的條帶。隨后利用EASYTRAP Ver.2(Takara Shuzo)從凝膠中回收擴(kuò)增后的DNA片段。利用鈍化試劑盒(Takara Shuzo)對(duì)回收后的擴(kuò)增片段進(jìn)行鈍末端化。
利用DNA連接試劑盒(Takara Shuzo)使鈍末端DNA片段與載體pGEM-3Z(Promega)連接，而此載體已為限制性酶HincII(TakaraShuzo)所消化。利用連接混合物轉(zhuǎn)化JM109(Takara Shuzo)的活性細(xì)胞。轉(zhuǎn)化完成后，37℃下，在含有0.1mM氨芐青霉素、1mM IPTG和0.02％X-半乳糖的LB瓊脂平板上培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)夜。
培養(yǎng)完成后，從平板上挑選幾個(gè)白色菌落。利用引物M13-M4和M13-RV(Takara Shuzo)進(jìn)行菌落PCR以確定插入片段存在與否。37℃下，將存在插入片段的菌落在含有0.1mM氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)完成后，利用QIAGEN質(zhì)粒微型試劑盒(Qiagen)從細(xì)胞中純化質(zhì)粒。按照傳統(tǒng)方法，利用引物M13-M4和M13-RV對(duì)在質(zhì)粒HincII位點(diǎn)的克隆片段序列進(jìn)行雙向分析。
結(jié)果，其證明利用本發(fā)明的方法獲得的有規(guī)則片段具有一結(jié)構(gòu)，而此結(jié)構(gòu)中的待擴(kuò)增區(qū)域進(jìn)行了重復(fù)。此外，其進(jìn)一步證明，此重復(fù)是在從5′-3′的同一方向上。
(3)除三個(gè)感興趣的擴(kuò)增片段外，在本發(fā)明的方法中形成了有規(guī)則的擴(kuò)增片段以檢測(cè)結(jié)核分支桿菌、HCV或沙眼衣原體，對(duì)此進(jìn)行了檢驗(yàn)。在如實(shí)施例31中所述條件下對(duì)HCV進(jìn)行檢測(cè)。在如實(shí)施例33中所述條件下對(duì)結(jié)核分支桿菌和沙眼衣原體進(jìn)行檢測(cè)。如上文(2)所述對(duì)生成的有規(guī)則擴(kuò)增片段進(jìn)行亞克隆和序列分析。結(jié)果，其證明利用本發(fā)明的方法獲得的梯狀片段具有一結(jié)構(gòu)，而此結(jié)構(gòu)中的待擴(kuò)增區(qū)域進(jìn)行了重復(fù)。此外，其進(jìn)一步證明，此重復(fù)是在從5′-3′的同一方向上。實(shí)施例35(1)對(duì)本發(fā)明中的結(jié)核分支桿菌檢測(cè)方法進(jìn)行檢驗(yàn)。首先，合成了引物K-F-1033(60)(SEQ ID NO159)和K-F-1133(62)(SEQ IDNO160)以擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌中含有相對(duì)低GC含量的區(qū)域。如實(shí)施例33(1)中所述，選取含有100fg-10pg結(jié)核分支桿菌基因組DNA的系列稀釋溶液作為模板。反應(yīng)進(jìn)行如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，將32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸鎂、500μM的每種dNTP、50pmol引物K-F-1033(60)和K-F-1133(62)、9.375U Pfu RNA酶HII、4.375U BcaBEST DNA聚合酶及1μ1模板混合在一起，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到25μl。將反應(yīng)混合物置于62℃下的熱循環(huán)儀Personal中并反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果，其證明可對(duì)利用100fg-10pg模板基因組DNA和任一RNA酶H得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。
(2)利用具有更高Tm值的引物對(duì)上文(1)所述的方法進(jìn)行檢測(cè)。首先，合成了引物K-F-1033(68)(SEQ ID NO161)和K-F-1133(68)(SEQ ID NO162)。除反應(yīng)溫度為63℃外，在與上文(1)相同的反應(yīng)條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)完成后，從混合物中各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。結(jié)果如圖38所示。圖38例示了利用Pfu RNA酶H和Afu RNA酶H擴(kuò)增得到的結(jié)核分支桿菌基因組的電泳結(jié)果。泳道1-4表示利用Pfu RNA酶HII和下列量的模板DNA獲得的擴(kuò)增結(jié)果。泳道1；10pg；泳道2；1pg；泳道3；100fg；及泳道4陰性對(duì)照。泳道5-8表示利用Afu RNA酶HII和下列量的模板DNA獲得的擴(kuò)增結(jié)果。泳道5；10pg；泳道6；1pg；泳道7；100fg；及泳道8陰性對(duì)照。泳道M表示100bp DNA梯標(biāo)記。
如圖38所示，其證明可對(duì)利用100fg模板基因組DNA和任一RNA酶H對(duì)感興趣的擴(kuò)增片段進(jìn)行檢測(cè)。這說(shuō)明利用Afu RNA酶H時(shí)可獲得更多的擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，其證明選用Afu RNA酶H時(shí)可獲得更穩(wěn)定的檢測(cè)靈敏度。
(3)檢驗(yàn)了結(jié)合利用引物K-F-1033(68)和K-F-1133(68)及含有待擴(kuò)增區(qū)域的模板質(zhì)粒而進(jìn)行的擴(kuò)增。首先，為了制備含有待擴(kuò)增區(qū)域的質(zhì)粒，合成了引物F26(SEQ ID NO163)和R1310(SEQ IDNO164)。利用這些引物和卡介苗疫苗菌株進(jìn)行PCR。隨后將生成的擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)入pT7-Blue-T載體(Takara Shuzo)中以制備質(zhì)粒。除了選用4U Bca DNA聚合酶外，反應(yīng)混合物的組分與上文(2)中所述的相同。結(jié)果，其進(jìn)一步證明可利用1fg模板來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。
(4)將結(jié)合利用引物MTIS2F和MTIS2R從而形成含有感興趣的三個(gè)擴(kuò)增片段的有規(guī)則擴(kuò)增片段時(shí)所達(dá)到的檢測(cè)靈敏度與結(jié)合利用引物K-F-1033(68)和K-F-1133(68)從而形成感興趣的三個(gè)擴(kuò)增片段時(shí)達(dá)到的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行比較。選取結(jié)核分支桿菌作為靶。當(dāng)結(jié)合利用引物MTIS2F和MTIS2R時(shí)，按照實(shí)施例33(2)所述進(jìn)行反應(yīng)，或當(dāng)結(jié)合利用引物K-F-1033(68)和K-F-1133(68)時(shí)，按照上文(2)所述進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果，在每種情況下都觀察到相同的檢測(cè)靈敏度。實(shí)施例36對(duì)本發(fā)明中不包含模板基因組DNA變性的擴(kuò)增方法進(jìn)行檢驗(yàn)。
(1)依據(jù)質(zhì)粒pDON-AI(Takara Shuzo)中的包裝區(qū)域的核苷酸序列合成了引物pDON-AI-68-1(SEQ ID NO165)和pDON-AI-68-2(SEQ ID NO166)。
(2)制備了50μl含有1μl含有10fg或1pg pDON-AI的溶液、1μl含有1ng、10ng或100ng源自實(shí)施例23中制備的、結(jié)合有pDON-AI的NIH/3T3細(xì)胞的基因組DNA溶液或1μl作為陰性對(duì)照的水、50pmol上文(1)所述的每種引物、dNTP各0.5mM、32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、4mM醋酸鎂、0.01％BSA、1％DMSO、18.5U Pfu RNA酶HII和4U BcaBEST DNA聚合酶的反應(yīng)混合物。將此混合物置于熱循環(huán)儀中并在64℃下孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，從反應(yīng)混合物中各取5μl，利用3％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行觀察。結(jié)果如圖39所示。在圖39中，這些泳道代表利用下列量的模板獲得的結(jié)果泳道M；100bp DNA梯標(biāo)記；泳道1陰性對(duì)照；泳道2；結(jié)合有pDON-AI的1ng基因DNA；泳道3；結(jié)合有pDON-AI的10ng基因組DNA；泳道4；結(jié)合有pDON-AI的100ng基因組DNA；泳道5；10fg pDNA-AI DNA；及泳道6；1pg pDON-AI DNA。
如圖39所示，對(duì)利用pDON-AI或結(jié)合有pDON-AI的基因組DNA來(lái)講都觀察到了特定DNA片段的擴(kuò)增。因此，其進(jìn)一步證明，即使選取基因組DNA作為模板，在反應(yīng)前不對(duì)模板DNA進(jìn)行變性的情況下也可對(duì)感興趣的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)施例37通過(guò)選用了TaKaRa Ex Taq聚合酶(Takara Shuzo)的LA技術(shù)對(duì)比了本發(fā)明與PCR的精確度。首先，模板質(zhì)粒制備如下。
特別的，利用PCR從人原癌基因、Wnt-5a基因(GenBank編號(hào)為L(zhǎng)20861)、核糖體蛋白S5基因(GenBank編號(hào)為XM_009371)、人NADH基因(GenBank編號(hào)為NM_000903)和人protocadherin43基因(GenBank編號(hào)為AU077347)中擴(kuò)增了每個(gè)含有SEQ ID NO167-170所表示的、長(zhǎng)為300bp的片段的區(qū)域。在這種情況下，利用特別引物進(jìn)行PCR，而這些引物的5′-末端含有限制性酶SfiI位點(diǎn)。反應(yīng)完成后，利用限制性酶SfiI(Takara Shuzo)對(duì)這些擴(kuò)增片段進(jìn)行消化。利用限制性酶AflIII(NEB)和NdeI(Takara Shuzo)對(duì)pUC19(TakaraShuzo)進(jìn)行消化并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠中切除長(zhǎng)約2kbp的片段并利用EASYTRAP(Takara Shuzo)對(duì)其進(jìn)行回收。利用DNA合成儀合成了含有SEQ ID NO171所表示的序列的DNA及與其互補(bǔ)的DNA。將這些DNA加熱變性并隨后相互退火以形成雙鏈DNA。在這些雙鏈DNA的末端具有限制性酶AflIII和NdeI的粘性末端。利用DNA連接試劑盒ver.2(Takara Shuzo)將此雙鏈合成DNA插入到利用限制性酶消化pUC19得到的片段中。生成的質(zhì)粒命名為pIC62。pIC62具有與引物ICAN2(SEQ ID NO172)和ICAN6(SEQ ID NO173)退火的序列及限制性酶SfiI位點(diǎn)。利用限制性酶SfiI消化質(zhì)粒pIC62。利用連接試劑盒ver.2(Takara Shuzo)將上文提及的、利用限制性酶SfiI消化后的PCR擴(kuò)增片段連接到質(zhì)粒上。利用此連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Takara Shuzo)。對(duì)交換體進(jìn)行培養(yǎng)，獲得了具有長(zhǎng)約300bp的DNA插入片段的質(zhì)粒，并對(duì)插入DNA的序列進(jìn)行了確定。隨后將此質(zhì)粒用做本實(shí)施例中的模板。
(2)如下制備ICAN擴(kuò)增產(chǎn)物。簡(jiǎn)單來(lái)講，制備了10μl含有10ng模板質(zhì)粒、50pmol嵌合引物ICAN2(SEQ ID NO172)和ICAN6(SEQID NO173)及0.01％丙二胺的溶液。將此溶液在98℃變性2分鐘，并在60℃的熱循環(huán)儀Personal中孵育1分鐘，隨后轉(zhuǎn)移到冰上。然后，向其中添加20mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸鎂、dNTP各500μM、30U大腸桿菌RNA酶H和5.5U BcaBEST DNA聚合酶，并利用無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。60℃下，將此反應(yīng)混合物置于熱循環(huán)儀Personal中，并孵育60分鐘。反應(yīng)完成后，在2％SeaKem GTG瓊脂糖凝膠(Takara Shuzo)上對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行電泳分析。電泳結(jié)束后，通過(guò)從瓊脂糖凝膠中切下感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物、利用SUPREC-01(TakaraShuzo)進(jìn)行回收、進(jìn)行苯酚-氯仿和處理和乙醇沉淀來(lái)回收感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。
(3)利用TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶如下制備了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。簡(jiǎn)單來(lái)講，按照TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)的附加操作指南，利用10ng上述的模板質(zhì)粒和10pmol DNA引物ICAN2(SEQID NO174)和ICAN6(SEQ ID NO175)制備了反應(yīng)混合物。將反應(yīng)混合物置于熱循環(huán)儀中并反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括在94℃下反應(yīng)30秒、55℃下反應(yīng)30秒及在72℃下反應(yīng)30秒。反應(yīng)完成后，如上文(2)所述對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。通過(guò)利用Microcon-100(Takara Shuzo)回收、苯酚-氯仿處理和乙醇沉淀而回收到了感興趣的擴(kuò)增片段。
(4)對(duì)上文(2)和(3)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行如下亞克隆。簡(jiǎn)單來(lái)講，按照操作指南，利用Perfectly Blunt克隆試劑盒(Takara Shuzo)將ICAN擴(kuò)增產(chǎn)物和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)入載體pT7 Blue(Takara Shuzo)中。利用連接混合物轉(zhuǎn)化NovaBlue Singles活性細(xì)胞(TakaraShuzo)。對(duì)每種克隆來(lái)講，從生成的轉(zhuǎn)化體中選擇10個(gè)菌落并進(jìn)行培養(yǎng)以獲取含有長(zhǎng)約0.4kb的插入DNA的質(zhì)粒。利用T7啟動(dòng)子引物(Takara Shuzo)和M3啟動(dòng)子(Takara Shuzo)對(duì)質(zhì)粒中的插入片段進(jìn)行序列分析。
通過(guò)上述的序列分析對(duì)總量約16,000個(gè)堿基進(jìn)行了分析。結(jié)果，在利用本發(fā)明的方法得到的擴(kuò)增片段和利用TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR得到的擴(kuò)增片段的約25,000個(gè)堿基中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)突變。因此，其進(jìn)一步證明，本發(fā)明的方法的精確度與高精確度LA-PCR的精確度相同。實(shí)施例38(1)利用PCR制備ICAN反應(yīng)的模板利用cDNA合成試劑盒(Takara Shuzo)從源自鼠大腦(OriGene)的polyA+RNA中制備雙鏈cDNA。以雙鏈cDNA為模板，結(jié)合利用含有SEQ ID NOS176-189所表示的核苷酸序列的引物對(duì)PCR片段進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)TA克隆獲得了質(zhì)?？寺。瑥亩鴮⑦@些片段導(dǎo)入pT7 Blue T-載體(Takara Shuzo)中。利用TaKaRa PCR熱循環(huán)儀Personal(TakaraShuzo)對(duì)50μl含有1μl(1ng)質(zhì)?？寺?、10pmol引物MCS-F(SEQID NO190)和MCS-R(SEQ ID NO191)、1.25U Ex Taq(Takara Shuzo)、5μl 10×Ex Taq緩沖液(TakaraShuzo)及每種dNTP各0.2mM的反應(yīng)混合物進(jìn)行如下反應(yīng)94℃下反應(yīng)2分鐘；94℃下反應(yīng)30秒，55℃下反應(yīng)30秒，及72℃下反應(yīng)1分鐘，持續(xù)30個(gè)循環(huán)。將得到的擴(kuò)增DNA片段用做ICAN反應(yīng)模板。
(2)以PCR產(chǎn)物為模板通過(guò)ICAN擴(kuò)增DNA片段利用Aminoallyl dUTP(Sigma)進(jìn)行ICAN反應(yīng)以將一氨基導(dǎo)入ICAN擴(kuò)增產(chǎn)物中。通過(guò)如下改變ICAN反應(yīng)中dTTP量與AminoallyldUTP量之比來(lái)對(duì)導(dǎo)入ICAN擴(kuò)增產(chǎn)物中的氨基的比率進(jìn)行檢驗(yàn)10；0、9；1、8；2、7；3和6；4。反應(yīng)進(jìn)行如下。
首先，在TaKaRa PCR熱循環(huán)儀Personal中，使10μl含有1μl上文(1)中制備的PCR反應(yīng)混合物、50pmol引物MF2N3(24)(SEQ IDNO192)和MR1N3(24)(SEQ ID NO193)及2μl 0.05％丙二胺水溶液的溶液在98℃下加熱2分鐘，隨后在65℃下加熱30秒并在冰上迅速冷卻以使引物與模板退火。向加熱后的溶液中添加40μl含有0.625mM dATP、dCTP和dGTP、0.625mM dTTP+Aminoallyl dUTP混合物、32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、5.0mM醋酸鎂、0.6U大腸桿菌RNA酶H(Takara Shuzo)及2.75U BcaBEST DNA聚合酶的混合物。65℃下，將產(chǎn)生的混合物在熱循環(huán)儀中孵育1小時(shí)。
向50μl反應(yīng)混合物中添加50μl異丙醇和5μl 3M醋酸鈉溶液(pH5.2)。將產(chǎn)生的混合物在-80℃下冷卻20分鐘，隨后離心提取上清液。向其中添加200μl 70％的乙醇溶液。通過(guò)離心獲取上清液。風(fēng)干沉淀物。將獲得的DNA重新溶解在水中。測(cè)定OD260/280來(lái)確定產(chǎn)物量。
(3)進(jìn)一步證實(shí)Aminoally1 dUTP導(dǎo)入了ICAN擴(kuò)增產(chǎn)物中。
利用5-羧基熒光素succinimidil酯(分子探針)對(duì)ICAN產(chǎn)物中的氨基進(jìn)行熒光標(biāo)記來(lái)進(jìn)一步證實(shí)ICAN產(chǎn)物中導(dǎo)入了氨基。對(duì)上述DNA溶液進(jìn)行稀釋以使其濃度為2μg/50μl。向此溶液中添加20μl 1M碳酸鈉緩沖液(pH 9.0)。隨后，向其中進(jìn)一步添加4μl 10mM FITC(Nacalai Tesque)N，N-二甲基甲酰胺溶液。將生成的混合物在20℃下反應(yīng)16小時(shí)。在利用商業(yè)購(gòu)買(mǎi)的spin column取出多余的FITC后，取10μl反應(yīng)混合物添加到2.0％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，利用FM-BIO對(duì)熒光染料進(jìn)行檢測(cè)。此外，利用EtBr染色對(duì)ICAN擴(kuò)增片段進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果，其進(jìn)一步證明，利用Aminoallyl dUTP進(jìn)行ICAN可將氨基導(dǎo)入ICAN擴(kuò)增產(chǎn)物中。這也進(jìn)一步證明，結(jié)合利用含有功能基團(tuán)的修飾核苷酸和擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光標(biāo)記可進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。
(4)利用脫氧UTP檢驗(yàn)本發(fā)明中的擴(kuò)增方法。選取結(jié)核分支桿菌作為靶。在GenBank注冊(cè)編號(hào)為AL123456的結(jié)核分支桿菌基因組的核苷酸序列基礎(chǔ)上合成了引物MTIS2F-16(SEQ ID NO194)和MTIS2R-ACC(SEQ ID NO195)。利用引物對(duì)擴(kuò)增得到的、包括引物部分在內(nèi)的區(qū)域的長(zhǎng)度為98bp。模板制備如下。簡(jiǎn)單來(lái)講，通過(guò)DNA連接試劑盒Ver.2將利用引物MTIS-PCR-F-2(SEQ ID NO196)和MTIS-PCR-R-2(SEQ ID NO197)從結(jié)核分支桿菌基因組中PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物插入到pT7 Blue T-載體(Takara Shuzo)中。利用連接質(zhì)粒來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。對(duì)生成的交換體進(jìn)行培養(yǎng)并獲取含有長(zhǎng)約400bp的導(dǎo)入DNA的質(zhì)粒。在通過(guò)OD260測(cè)定而確定的濃度的基礎(chǔ)之上，制備了每μl含有103個(gè)質(zhì)?？截惖娜芤骸?br> 將32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸鎂、500μM的dATP、dCTP和dGTP、dTTP/dUTP混合物(500/0,400/100,300/200,200/300,100/400或0/500μM)、50pmol引物MTIS 2F-16和MTIS 2R-AAC、8.75U Afu RNA酶H、8UBcaBEST DNA聚合酶及1μl模板(103個(gè)拷貝)混合在一起，添加無(wú)菌水使其體積達(dá)到50μl。將反應(yīng)混合物置于60℃下的熱循環(huán)儀Personal中并反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中各取3μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。
結(jié)果，在每種dTTP/dUTP比下都觀察到了感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。在這些結(jié)果基礎(chǔ)之上，其進(jìn)一步證明，修飾核苷酸在本發(fā)明的方法中可用做底物。實(shí)施例39對(duì)本發(fā)明的擴(kuò)增方法在一步擴(kuò)增方法中的應(yīng)用進(jìn)行檢驗(yàn)。選取HCV作為靶。
(1)制備轉(zhuǎn)錄RNA制備作為模板的轉(zhuǎn)錄RNA。在征得患者同意的情況下，從感染丙型肝炎病毒的患者中采集300μl血清，按照附加的操作指南，利用TRIzol試劑(Life Technologies)從血清中提取RNA并最后將其溶解在20μl可注射水(Otsuka PHarmaceutical)中，從而完成了轉(zhuǎn)錄RNA的制備。以上述RNA樣品為模板進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)進(jìn)行如下。按照一步RNA PCR試劑盒(Takara Shuzo)的附加指南，利用2μl RNA樣品和20pmol引物SP6-HCV-F(SEQ ID NO198)和T7-HCV-R(SEQ IDNO199)制備了50μl反應(yīng)混合物。將反應(yīng)混合物置于熱循環(huán)儀Personal中，并進(jìn)行如下反應(yīng)50℃下反應(yīng)15分；94℃下反應(yīng)2分鐘；及94℃下反應(yīng)30秒，60℃下反應(yīng)30秒，72℃下反應(yīng)30秒，持續(xù)40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后，將反應(yīng)混合物在2％SeaPlaque GTG瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。從凝膠中切除長(zhǎng)約350bp的感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。隨后按照試劑盒的附加操作指南，利用EASYTRAP Ver.2回收DNA。按照試劑盒上的附加指南，利用競(jìng)爭(zhēng)性RNA轉(zhuǎn)錄試劑盒(TakaraShuzo)并以回收的DNA為模板合成轉(zhuǎn)錄RNA。此轉(zhuǎn)錄RNA用做模板來(lái)對(duì)一步RT-ICAN進(jìn)行檢測(cè)。
(2)檢驗(yàn)一步RT-ICAN在OD260測(cè)定值基礎(chǔ)之上確定了上文(1)中制備的轉(zhuǎn)錄RNA的濃度，并制備了每μl含有104、105、106或107個(gè)拷貝的稀釋液。制備了50μl含有32mM HEPES-氫氧化鉀緩沖液(pH7.8)、100mM醋酸鉀、1％DMSO、0.01％BSA、4mM醋酸鎂、500μM的多種dNTP、50pmol引物HCV-A S(SEQ ID NO200)和HCV-A A(SEQ ID NO201)、30U PfuRNA酶H、8U BcaBEST DNA聚合酶、20U RNA酶抑制劑、0、1、2.5、3或5U AMV RTase XL(Takara Shuzo)及1μl含有可變拷貝數(shù)目的轉(zhuǎn)錄RNA的稀釋液的反應(yīng)混合物。將反應(yīng)混合物置于60℃下的熱循環(huán)儀Personal中并孵育1小時(shí)。反應(yīng)完成后，從每種反應(yīng)混合物中各取2μl，在3.0％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。
結(jié)果，當(dāng)不添加AMV RTase時(shí)，以各種稀釋液為模板都沒(méi)有觀察到感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。另一方面，在利用含有107個(gè)拷貝(添加1U AMVRTase XL)、106個(gè)拷貝(添加2.5U AMV RTase XL)、106個(gè)拷貝(添加3U AMV RTase XL)或106個(gè)拷貝(添加5U AMV RTase XL)的稀釋液為模板的情況下觀察到了感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。當(dāng)在57℃下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，在以含有105個(gè)拷貝的RNA并添加有2.5U AMV RTase XL的稀釋液為模板時(shí)觀察到了感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，當(dāng)應(yīng)用1U BcaBESTDNA聚合酶和10U Pfu RNA酶H時(shí)，甚至在不添加AMV RTase的情況下，以含有106個(gè)拷貝的稀釋液為模板也觀察到了感興趣的擴(kuò)增產(chǎn)物。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了靶核酸擴(kuò)增方法，此方法包括利用嵌合寡核苷酸引物、通過(guò)DNA合成反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增靶核酸的核苷酸序列中適于特異擴(kuò)增的區(qū)域。本發(fā)明也提供了對(duì)利用靶核酸擴(kuò)增方法得到的靶核酸的檢測(cè)方法，其包括對(duì)從靶核酸擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行檢測(cè)。此外，本發(fā)明的擴(kuò)增方法可用做有效的核酸制備方法，而此方法是通過(guò)與另一核酸擴(kuò)增方法或核酸復(fù)制方法結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明也提供了對(duì)靶核酸進(jìn)行特異性檢測(cè)的方法和對(duì)微生物，尤其是病原微生物如病毒、細(xì)菌、真菌、酵母等進(jìn)行高靈敏度定量的方法及用于這些方法中的嵌合寡核苷酸引物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了核酸的擴(kuò)增和檢測(cè)體系，此體系是自動(dòng)化的、含量少且高度整合的。
序列表文字SEQ ID NO1；PCR引物BsuII-3，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO2；PCR引物BsuII-6，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO3；PCR引物RNII-S1，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO4；PCR引物RNII-S2，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO5；PCR引物RNII-S5，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO6；PCR引物RNII-S6，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO7；PCR引物RNII-Nde，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO8；熱堅(jiān)芽孢桿菌的RNA酶HII基因中的ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO9；熱堅(jiān)芽孢桿菌的RNA酶HII的氨基酸序列。
SEQ ID NO10；PCR引物BsuIII-1，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO11；PCR引物BsuIII-3，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO12；PCR引物BsuIII-6，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO13；PCR引物BsuIII-8，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO14；PCR引物RNIII-S3，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO15；PCR引物RNIII-S3，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO16；熱堅(jiān)芽孢桿菌的RNA酶HIII中的ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO17；熱堅(jiān)芽孢桿菌的RNA酶HIII的氨基酸序列。
SEQ ID NO18；PCR引物BcaRNIIINde，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中擴(kuò)增編碼具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO19；保留在PH1650和激烈熱球菌基因組序列的一部分間的核苷酸序列。
SEQ ID NO20；PCR引物1650Nde，其可用于從激烈熱球菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO21；PCR引物1650Bam，其可用于從激烈熱球菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO22；激烈熱球菌的RNA酶HII的ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO23；激烈熱球菌的RNA酶HII的氨基酸序列。
SEQ ID NO24；PCR引物915-F1，其可用于從海棲熱袍菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO25；PCR引物915-F2，其可用于從海棲熱袍菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO26；PCR引物915-R1，其可用于從海棲熱袍菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO27；PCR引物915-R2，其可用于從海棲熱袍菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。
SEQ ID NO28；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為pUC19 upper150，用于擴(kuò)增質(zhì)粒pUC19的一部分?！昂塑账?4-25是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO29；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MR1N3，用于擴(kuò)增質(zhì)粒pUC19的一部分。“核苷酸28-30是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO30；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為M13M4。
SEQ ID NO31；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素1-編碼序列的一部分?！昂塑账?6-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO32；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素1-編碼序列的一部分?！昂塑账?5-17是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO33；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?6-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO34；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?6-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO35；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MCR-F，用于擴(kuò)增長(zhǎng)DNA片段。
SEQ ID NO36；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MCR-R，用于擴(kuò)增長(zhǎng)DNA片段。
SEQ ID NO37；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MF2N3(24)，用于擴(kuò)增長(zhǎng)DNA片段。“核苷酸22-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO38；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MR1N3(24)，用于擴(kuò)增長(zhǎng)DNA片段?！昂塑账?2-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO39；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增λDNA的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO40；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增λDNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO41；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增λDNA的一部分SEQ ID NO42；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增λDNA的一部分SEQ ID NO43；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增黃桿菌屬物種DNA的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO44；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增黃桿菌屬物種DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO45；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增黃桿菌屬物種DNA的一部分SEQ ID NO46；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增黃桿菌屬物種DNA的一部分SEQ ID NO47；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO48；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO49；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分SEQ ID NO50；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分SEQ ID NO51；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO52；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO53；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO54；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。
SEQ ID NO55；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。
SEQ ID NO56；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增λDNA的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO57；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。
SEQ ID NO58；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。
SEQ ID NO59；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分?！昂塑账?6-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO60；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO61；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增黃桿菌屬物種DNA的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO62；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增黃桿菌屬物種DNA的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO63；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增黃桿菌屬物種DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO64；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，核苷酸18是肌苷，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO65；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，核苷酸17是肌苷，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO66；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，核苷酸16是肌苷，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO67；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，核苷酸17是肌苷，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO68；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，核苷酸16是肌苷，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO69；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，核苷酸15是肌苷，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO70；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?-11和19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO71；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?-10和18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO72；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO73；設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針，用于檢測(cè)從出血性大腸桿菌O-157的vero毒素2-編碼序列擴(kuò)增的DNA片段SEQ ID NO74；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO75；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分?！昂塑账?7-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO76；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分SEQ ID NO77；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分SEQ ID NO78；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為GMO-PCR-F 20聚體SEQ ID NO79；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為GMO-PCR-R 20聚體SEQ ID NO80；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為GMO-S1 20聚體?！昂塑账?9-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO81；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為GMO-S2 20聚體?！昂塑账?9-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO82；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為GMO-A1 20聚體。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO83；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為GMO-A2 20聚體。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO84；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是(α-S)核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO85；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。“核苷酸18-20是(α-S)核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO86；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS-編碼序列的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO87；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分?！昂塑账?0-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO88；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分SEQ ID NO89；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分SEQ ID NO90；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增λDNA的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO91；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增λDNA的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO92；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分?！昂塑账?1-23是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO93；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分?！昂塑账?0-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO94；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增pDON-AI DNA的一部分?！昂塑账?7-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO95；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增pDON-AI DNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO96；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增HPV DNA的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO97；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增HPV DNA的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO98；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增HPV DNA的一部分。
SEQ ID NO99；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增HCV DNA的一部分。
SEQ ID NO100；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增HCV DNA的一部分。
SEQ ID NO101；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增HCV的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO102；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增HCV的一部分?！昂塑账?6-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO103；設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針，用于檢測(cè)擴(kuò)增部分HCV的DNA片段。
SEQ ID NO104；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增腺病毒的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO105；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增腺病毒的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO106；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增腺病毒的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO107；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增腺病毒的一部分。
SEQ ID NO108；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增腺病毒的一部分。
SEQ ID NO109；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。
SEQ ID NO110；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。
SEQ ID NO111；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增pDON-AI DNA的一部分。
SEQ ID NO112；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增pDON-AI DNA的一部分。
SEQ ID NO113；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素1-編碼序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO114；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素1-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO115；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素1-編碼序列的一部分。
SEQ ID NO116設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從肉毒梭菌中擴(kuò)增肉毒毒素A編碼序列的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO117設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從肉毒梭菌中擴(kuò)增肉毒毒素A編碼序列的一部分?！昂塑账?1-23是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO118設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針，用于檢測(cè)從肉毒梭菌擴(kuò)增肉毒毒素A編碼序列的一部分的DNA片段。
SEQ ID NO119；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO120；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO121；設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針，用于檢測(cè)擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分的DNA。
SEQ ID NO122；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO123；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO124；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。
SEQ ID NO125；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。
SEQ ID NO126；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增c-ki-ras癌基因的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO127；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增c-ki-ras癌基因的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO128；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增c-ki-ras癌基因的一部分。
SEQ ID NO129；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增c-ki-ras癌基因的一部分。
SEQ ID NO130；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素1-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO131；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素1-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO132；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分SEQ ID NO133；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分SEQ ID NO134；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為pUC19 upper 150，用于擴(kuò)增質(zhì)粒pUC19的一部分SEQ ID NO135；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為pUC19 lower NN，用于擴(kuò)增質(zhì)粒pUC19的一部分SEQ ID NO136；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為SEA-1，用于擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO137；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為SEA-2，用于擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO138；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為HCV-F3，用于擴(kuò)增HCV的一部分?！昂塑账?7-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO139；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為HCV-R1，用于擴(kuò)增HCV的一部分?！昂塑账?6-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO140；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MF2，用于擴(kuò)增pUC19質(zhì)粒DNA的一部分SEQ ID NO141；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MR1，用于擴(kuò)增pUC19質(zhì)粒DNA的一部分SEQ ID NO142；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增腺病毒的一部分。
SEQ ID NO143；海棲熱袍菌RNA酶HII基因的ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO144；海棲熱袍菌RNA酶HII基因的氨基酸序列。
SEQ ID NO145；Pyrococcus horikoshii PH1650的核苷酸序列。
SEQ ID NO146；PCR引物PhoNde，可用于從Pyrococcushorikoshii中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因SEQ ID NO147；PCR引物PhoBam，可用于從Pyrococcushorikoshii中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因SEQ ID NO148；Pyrococcus horikoshii的RNA酶HII基因的ORF的核苷酸序列SEQ ID NO149；Pyrococcus horikoshii的RNA酶HII的氨基酸序列SEQ ID NO150；閃爍古生球菌的AF0621的核苷酸序列SEQ ID NO151；PCR引物AfuNde，用于從閃爍古生球菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因SEQ ID NO152；PCR引物AfuBam，用于從閃爍古生球菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因SEQ ID NO153；閃爍古生球菌的RNA酶HII基因的ORF的核苷酸序列。
SEQ ID NO154；閃爍古生球菌的RNA酶HII的氨基酸序列。
SEQ ID NO155；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MTIS2F，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分?！昂塑账?6-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO156；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MTIS2R，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”
SEQ ID NO157；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為CT2F，用于擴(kuò)增沙眼衣原體隱蔽性質(zhì)粒DNA的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO158；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為CT2R，用于擴(kuò)增沙眼衣原體隱蔽性質(zhì)粒DNA的一部分?！昂塑账?6-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO159；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為K-F-1033(60)，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分?！昂塑账?7-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO160；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為K-R-1133(62)，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO161；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為K-F-1033(68)，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分?！昂塑账?0-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO162；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為K-R-1133(68)，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分?！昂塑账?0-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO163；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為F26，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分。
SEQ ID NO164；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為R1310，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分。
SEQ ID NO165；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為pDON-AI-68-1，用于擴(kuò)增pDON-AI DNA的一部分?！昂塑账?0-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO166；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為pDON-AI-68-2，用于擴(kuò)增pDON-AI DNA的一部分。“核苷酸21-23是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO167；人類(lèi)原癌基因Wn t-5a的核苷酸序列SEQ ID NO168；人類(lèi)核糖體蛋白S5的核苷酸序列SEQ ID NO169；人類(lèi)心肌黃酶的核苷酸序列SEQ ID NO170；人類(lèi)protocadherin的核苷酸序列
SEQ ID NO171；設(shè)計(jì)的寡核苷酸，用于制備pIC62。
SEQ ID NO172；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為ICAN2。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO173；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為ICAN6?！昂塑账?9-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO174；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為ICAN2 DNA。
SEQ ID NO175；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為ICAN6 DNA。
SEQ ID NO176；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于小從小鼠中擴(kuò)增核糖體蛋白S18編碼序列的一部分。
SEQ ID NO177；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增核糖體蛋白S18編碼序列的一部分。
SEQ ID NO178；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR)編碼序列的一部分。
SEQ ID NO179；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR)編碼序列的一部分。
SEQ ID NO180；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的因子4(Sdf4)編碼序列的一部分。
SEQ ID NO181；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的因子4(Sdf4)編碼序列的一部分。
SEQ ID NO182；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增細(xì)胞質(zhì)β-肌動(dòng)蛋白編碼序列的一部分。
SEQ ID NO183；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增細(xì)胞質(zhì)β-肌動(dòng)蛋白編碼序列的一部分。
SEQ ID NO184；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增鳥(niǎo)氨酸脫羧酶編碼序列的一部分。
SEQ ID NO185；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增鳥(niǎo)氨酸脫羧酶編碼序列的一部分。
SEQ ID NO186；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)編碼序列的一部分。
SEQ ID NO187；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)編碼序列的一部分。
SEQ ID NO188；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增酪氨酸3-單加氧酶編碼序列的一部分。
SEQ ID NO189；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增酪氨酸3-單加氧酶編碼序列的一部分。
SEQ ID NO190；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MCS-F。
SEQ ID NO191；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MCS-R。
SEQ ID NO192；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MF2N3(24)?！昂塑账?2-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO193；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MR1N3(24)?！昂塑账?2-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO194；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MTIS2F-16，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分?！昂塑账?4-16是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO195；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MTIS2R-ACC，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO196；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MTIS-PCR-F-2，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分。
SEQ ID NO197；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MTIS-PCR-R-2，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分。
SEQ ID NO198；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為SP6-HCV-F，用于擴(kuò)增HCV的一部分。
SEQ ID NO199；設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為SP6-HCV-R，用于擴(kuò)增HCV的一部分。
SEQ ID NO200；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為HCV-A S，用于擴(kuò)增HCV的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”SEQ ID NO201；設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為HCV-A A，用于擴(kuò)增HCV的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”
序列表<110>寶生物工程株式會(huì)社<120>核酸擴(kuò)增方法<130>662757<150>JP 2000-251981<151>2000-08-23<150>JP 2000-284419<151>2000-09-19<150>JP 2000-288750<151>2000-09-22<150>JP 2001-104191<151>2001-04-03<160>201<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BsuII-3，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。<400>1gtcgccagcg cagtnathyt 20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BsuII-6，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。<400>2cggtccctcg tcacyttngc 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物RNII-S1，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。<400>3cgcgcttttc cggcgtcagc 20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物RNII-S2，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。<400>4acggcgcacg cttcaatttg 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物RNII-S5，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。<400>5acgcctattt gccggggctt 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物RNII-S6，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。<400>6atgaccgacg cagcggcgat 20<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物RNII-Nde，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。<400>7tagaagaggg agaggcatat gaagcggtat acggtgaaa 39<210>8<211>780<212>DNA<213>熱堅(jiān)芽孢桿菌的RNA酶HII基因中的ORF的核苷酸序列。<400>8atgaagcggt atacggtgaa agacattgaa gcgctgcttc cgaagcttgg cgcggacgac 60ccgcgctggg agatgctgcg gcaggatgag cgaaaaagcg tgcaggcgct tcttgcccgt 120tttgaaaggc agaaagcgcg ccggcacgcc atcgagcagc ggtgggaaga actaatgcgt 180tatgagaggg aactatacgc cgctggcgtt agacggatcg ccggcattga tgaggccggg 240cgcggcccgc tggccggccc ggtcgtcgcc gccgcggtca tcttgccgaa agacgcctat 300ttgccggggc ttgacgactc gaagcggctg acgccggaaa agcgcgaggc attgtttgcg 360caaattgaag cgtgcgccgt cgccatcggc atcggcatcg tcagcgcggc ggagatcgat 420gaaaggaata tttacgaagc gacaaggcaa gcgatggcga aagcggtgaa cgccctttcc 480ccgccgcctg aacatttgct tgttgatgcg atggcggtgc cgtgcccact gccgcaacag 540cgcctcataa aaggagacgc caacagcgct tcaatcgccg ctgcgtcggt catcgccaaa 600gtgacgcgcg accggtggat gaaagaactg gatcgccgct atccacaata cgggttcgcg 660cgccatatgg gctacggaac gccggaacat ttcgaggcga tccgccgcta cggcgttacg 720cctgagcacc gtcgttcgtt cgcaccggtg agggaggtgc tgaaggcgag cgagcagctc 780<210>9<211>260<212>PRT<213>熱堅(jiān)芽孢桿菌的RNA酶HIII的氨基酸序列。<400>9Met Lys Arg Tyr Thr Val Lys Asp Ile Glu Ala Leu Leu Pro Lys1 5 10 15Leu Gly Ala Asp Asp Pro Arg Trp Glu Met Leu Arg Gln Asp Glu20 25 30Arg Lys Ser Val Gln Ala Leu Leu Ala Arg Phe Glu Arg Gln Lys35 40 45Ala Arg Arg His Ala Ile Glu Gln Arg Trp Glu Glu Leu Met Arg50 55 60Tyr Glu Arg Glu Leu Tyr Ala Ala Gly Val Arg Arg Ile Ala Gly65 70 75Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Leu Ala Gly Pro Val Val Ala80 85 90Ala Ala Val Ile Leu Pro Lys Asp Ala Tyr Leu Pro Gly Leu Asp
95 100105Asp Ser Lys Arg Leu Thr Pro Glu Lys Arg Glu Ala Leu Phe Ala110 115120Gln Ile Glu Ala Cys Ala Val Ala Ile Gly Ile Gly Ile Val Ser125 130135Ala Ala Glu Ile Asp Glu Arg Asn Ile Tyr Glu Ala Thr Arg Gln140 145150Ala Met Ala Lys Ala Val Ash Ala Leu Ser Pro Pro Pro Glu His155 160165Leu Leu Val Asp Ala Met Ala Val Pro Cys Pro Leu Pro Gln Gln170 175180Arg Leu Ile Lys Gly Asp Ala Asn Ser Ala Ser Ile Ala Ala Ala185 190195Ser Val Ile Ala Lys Val Thr Arg Asp Arg Trp Met Lys Glu Leu200 205210Asp Arg Arg Tyr Pro Gln Tyr Gly Phe Ala Arg His Met Gly Tyr215 220225Gly Thr Pro Glu His Phe Glu Ala Ile Arg Arg Tyr Gly Val Thr230 235240Pro Glu His Arg Arg Ser Phe Ala Pro Val Arg Glu Val Leu Lys245 250255Ala Ser Glu Gln Leu260<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BsuIII-1，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。<400>10ggtaaggtct tgttycargg 20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BsuIII-3，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。<400>11ggaaccggag attayttygg 20<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BsuIII-6，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。<400>12atgattgaag cagcngcnac 20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BsuIII-8，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。<400>13gtattggcga aatgnarytt 20<210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物RNIII-S3，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。<400>14cccgatcgtc gtcgccgccg 20<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物RNIII-S3，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中克隆編碼具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。<400>15gatacgtgga cactttccgc 20<210>16<211>915<212>DNA<213>熱堅(jiān)芽孢桿菌的RNA酶HIII中的ORF的核苷酸序列。<400>16gtgattcaag ccgaccaaca gctgcttgac gccttgcgcg cccactacca agacgcctta 60tccgaccggc ttccggctgg agcgttgttt gccgtcaagc gcccggatgt cgtcatcacc 120gcctaccgct caggcaaagt gctgtttcaa gggaaagcgg cggagcaaga agcagcgaaa 180tggatatcag gggcgagcgc ctcaaacgaa acagctgacc accagccgtc cgctttggca 240gctcatcaac tcgggtctct ttccgccatc ggttccgatg aagtcggcac cggcgattat 300ttcggcccga tcgtcgtcgc cgccgcctac gtggatcggc cgcatatcgc caaaatcgcg 360gcgcttggcg tgaaagattc gaaacaattg aacgatgagg caatcaaacg gatcgccccc 420gccatcatgg aaaccgtgcc gcatgcggtc accgtgttgg acaatgccga atacaaccgc 480tggcagcgaa gcggcatgcc gcagacgaaa atgaaagcgc tccttcacaa ccggacgctc 540gtgaaactcg ttgacgccat cgcgcccgcc gaaccagaag caatcatcat cgacgaattt 600ttaaaacggg attcgtattt ccgttacctt tccgatgaag atcgcattat ccgcgagcgg 660gtgcactgcc ttcccaaggc ggaaagtgtc cacgtatcag tcgccgccgc ctcgatcatc 720gcccgctatg tgtttttaga ggagatggag caattatccc gcgccgtcgg cctcctgctt 780ccaaaaggcg ccggcgccat tgtcgatgaa gccgcggcca acatcatccg cgcgcggggg 840gcggaagcgc ttgagacatg cgccaagctt catttcgcca atacaaaaaa ggcgctggac 900atcgccaaac gccgg 915<210>17<211>305<212>PRT<213>熱堅(jiān)芽孢桿菌的RNA酶HIII的氨基酸序列。<400>17Met Ile Gln Ala Asp Gln Gln Leu Leu Asp Ala Leu Arg Ala His1 5 10 15Tyr Gln Asp Ala Leu Ser Asp Arg Leu Pro Ala Gly Ala Leu Phe20 25 30Ala Val Lys Arg Pro Asp Val Val Ile Thr Ala Tyr Arg Ser Gly35 40 45Lys Val Leu Phe Gln Gly Lys Ala Ala Glu Gln Glu Ala Ala Lys50 55 60Trp Ile Ser Gly Ala Ser Ala Ser Asn Glu Thr Ala Asp His Gln65 70 75Pro Ser Ala Leu Ala Ala His Gln Leu Gly Ser Leu Ser Ala Ile80 85 90Gly Ser Asp Glu Val Gly Thr Gly Asp Tyr Phe Gly Pro Ile Val95 100 105Val Ala Ala Ala Tyr Val Asp Arg Pro His Ile Ala Lys Ile Ala110 115 120Ala Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Asn Asp Glu Ala Ile125 130 135Lys Arg Ile Ala Pro Ala Ile Met Glu Thr Val Pro His Ala Val140 145 150Thr Val Leu Asp Asn Ala Glu Tyr Asn Arg Trp Gln Arg Ser Gly155 160 165Met Pro Gln Thr Lys Met Lys Ala Leu Leu His Asn Arg Thr Leu170 175 180Val Lys Leu Val Asp Ala Ile Ala Pro Ala Glu Pro Glu Ala Ile185 190 195Ile Ile Asp Glu Phe Leu Lys Arg Asp Ser Tyr Phe Arg Tyr Leu200 205 210Ser Asp Glu Asp Arg Ile Ile Arg Glu Arg Val His Cys Leu Pro215 220 225Lys Ala Glu Ser Val His Val Ser Val Ala Ala Ala Ser Ile Ile230 235 240Ala Arg Tyr Val Phe Leu Glu Glu Met Glu Gln Leu Ser Arg Ala245 250 255Val Gly Leu Leu Leu Pro Lys Gly Ala Gly Ala Ile Val Asp Glu260 265 270Ala Ala Ala Asn Ile Ile Arg Ala Arg Gly Ala Glu Ala Leu Glu275 280 285Thr Cys Ala Lys Leu His Phe Ala Asn Thr Lys Lys Ala Leu Asp290 295 300Ile Ala Lys Arg Arg305<210>18<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物BcaRNIIINde，其可用于從熱堅(jiān)芽孢桿菌中擴(kuò)增編碼具有RNA酶HIII活性的多肽的基因。<400>18cgaacgttgt caaaccatat gattcaagcc gaccaacag 39<210>19<211>663<212>DNA<213>保留在PH1650和激烈熱球菌基因組序列的一部分間的核苷酸序列。<400>19atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660tga 663<210>20<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物1650Nde，其可用于從激烈熱球菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。<400>20caggaggaga gacatatgaa aataggggga att 33<210>21<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物1650Bam，其可用于從激烈熱球菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。<400>21gaaggttgtg gatccacttt ctaaggtttc tta 33<210>22<211>672<212>DNA<213>激烈熱球菌的RNA酶HII的ORF的核苷酸序列。<400>22ATGAAAATAG GGGGAATTGA CGAAGCAGGA AGAGGACCAG CGATAGGGCC ATTAGTAGTA 60GCTACTGTCG TCGTTGATGA GAAAAACATT GAGAAGCTCA GAAACATTGG AGTAAAAGAC 120TCCAAACAAC TAACACCCCA TGAAAGGAAG AATTTATTTT CCCAGATAAC CTCAATAGCG180GATGATTACA AAATAGTGAT AGTATCCCCA GAAGAAATCG ACAATAGATC AGGAACAATG240AACGAGTTAG AGGTAGAGAA GTTTGCTCTC GCCTTAAATT CGCTTCAGAT AAAACCAGCT300CTTATATACG CTGATGCAGC GGATGTAGAT GCCAATAGAT TTGCAAGCTT GATAGAGAGA360AGACTCAATT ATAAGGCGAA GATTATTGCC GAACACAAGG CCGATGCAAA GTATCCAGTA420GTTTCAGCAG CTTCAATACT TGCAAAGGTT GTTAGGGATG AGGAAATTGA AAAATTAAAA480AAGCAATATG GAGACTTTGG CTCTGGGTAT CCAAGTGATC CAAAAACCAA GAAATGGCTT540GAAGAGTACT ACAAAAAACA CAACTCTTTC CCTCCAATAG TCAGACGAAC CTGGGAAACT600GTAAGAAAAA TAGAGGAAAG CATTAAAGCC AAAAAATCCC AGCTAACGCT TGATAAATTC660TTTAAGAAAC CT 672<210>23<211>224<212>PRT<213>激烈熱球菌的RNA酶HII的氨基酸序列。<400>23Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile1 5 10 15Gly Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile20 25 30Glu Lys Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr35 40 45Pro His Glu Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala50 55 60Asp Asp Tyr Lys Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn65 70 75Arg Ser Gly Thr Met Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu80 85 90Ala Leu Asn Ser Leu Gln Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp95 100 105Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg110 115 120Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile Ile Ala Glu His Lys Ala Asp125 130 135Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala Ser Ile Leu Ala Lys Val140 145 150Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys Lys Gln Tyr Gly Asp155 160 165Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr Lys Lys Trp Leu170 175 180Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro Ile Val Arg185 190 195Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile Lys Ala200 205 210Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro215 220<210>24<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物915-F1，其可用于從海棲熱袍菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。<400>24aaaaagcttg ggaatagatg agctttac 28<210>25<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物915-F2，其可用于從海棲熱袍菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。<400>25aaaccatggg aatagatgag ctttac 26<210>26<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物915-R1，其可用于從海棲熱袍菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。<400>26aaatctagat cctcaacttt gtcgatgtg 29<210>27<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物915-R2，其可用于從海棲熱袍菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因。<400>27aatctagatt aaaaaagagg gagattatgg 30<210>28<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為pUC19upper 150，用于擴(kuò)增質(zhì)粒pUC19的一部分?！昂塑账?4-25是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>28ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtaug 25<210>29<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MR1N3，用于擴(kuò)增質(zhì)粒pUC19的一部分。“核苷酸28-30是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>29tttacacttt atgcttccgg ctcgtatguu 30<210>30<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為M13M4。<400>30gttttcccag tcacgac17<210>31<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素1-編碼序列的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>31tgtcattcgc tctgcaatag gua 23<210>32<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素1-編碼序列的一部分?！昂塑账?5-17是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>32caccagacaa tgtaaccgct guu 23<210>33<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?6-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>33tactgggttt ttcttcggua 20<210>34<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?6-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>34atagacatca agccctcgua 20<210>35<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MCR-F，用于擴(kuò)增長(zhǎng)DNA片段。<400>35ccattcaggc tgcgcaactg tt 22<210>36<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MCR-R，用于擴(kuò)增長(zhǎng)DNA片段。<400>36tggcacgaca ggtttcccga ct 22<210>37<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MF2N3(24)，用于擴(kuò)增長(zhǎng)DNA片段?！昂塑账?2-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>37gctgcaaggc gattaagttg ggua 24<210>38<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MR1N3(24)，用于擴(kuò)增長(zhǎng)DNA片段?！昂塑账?2-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>38ctttatgctt ccggctcgta tguu 24<210>39<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增λDNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸””<400>39cctttctctg tttttgtccg20<210>40<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增λDNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>40aagcacctca ttaccctugc20<210>41<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增λDNA的一部分<400>41gggcggcgac ctcgcgggtt ttcg 24<210>42<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增λDNA的一部分<400>42gctgcttatg ctctataaag tagg 24<210>43<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增黃桿菌屬物種DNA的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>43aggaatcttt atttaccaug 20<210>44<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增黃桿菌屬物種DNA的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>44tggtgtttaa acttattgcg 20<210>45<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增黃桿菌屬物種DNA的一部分<400>45ccatcagcta taaacacaaa cagc 24<210>46<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增黃桿菌屬物種DNA的一部分<400>46tgttttgacc aaacatagta atgc 24<210>47<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>47tcgttaaata gtatacggac a 21<210>48<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>48tgctcaataa tcagacgaag 20<210>49<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分<400>49aaatggggta ctgtgcctgt tact 24<210>50<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分<400>50ctctgtatct gcctgaagcg taag24<210>51<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>51tacctgggtt tttcttcggu a 20<210>52<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>52atagactttt cgacccaaca 20<210>53<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>53atagacatca agccctcgua 20<210>54<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。<400>54tcgttaaata gtatacggac a21<210>55<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。<400>55atagacatca agccctcgta 20<210>56<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增λDNA的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>56gaacaatgga agtcaacaaa20<210>57<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。<400>57tacttgtggt tcctgtggtg20<210>58<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。<400>58atactaaggt tccaagggct20<210>59<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分?！昂塑账?6-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>59ggaaacctgg aggaaguc 18<210>60<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>60gtgaaaaccc tgtttaggau 20<210>61<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增黃桿菌屬物種DNA的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>61acctagatat aagctctaca 20<210>62<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增黃桿菌屬物種DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>62aaatagatgt tttagcagag 20<210>63<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增黃桿菌屬物種DNA的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>63atagataaaa aaaactccac 20<210>64<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，核苷酸18是肌苷，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>64tcgttaaata gtatacgiac a 21<210>65<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，核苷酸17是肌苷，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>65tcgttaaata gtatacigac a 21<210>66<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，核苷酸16是肌苷，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>66tcgttaaata gtataiggac a 21<210>67<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，核苷酸17是肌苷，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>67tgctcaataa tcagaciaag 20<210>68<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，核苷酸16是肌苷，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>68tgctcaataa tcagaigaag 20<210>69<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，核苷酸15是肌苷，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>69tgctcaataa tcagicgaag 20<210>70<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。“核苷酸9-11和19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>70tacctggguu uttcttcggu a 21<210>71<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分。“核苷酸8-10和18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>71atagacauca agccctcgua 20<210>72<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>72gtcccctgag atatatguuc 20<210>73<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針，用于檢測(cè)從出血性大腸桿菌O-157的vero毒素2-編碼序列擴(kuò)增的DNA片段<400>73ccaacaaagt tatgtctctt cgttaaatag 30<210>74<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>74atgccattga gttcatcaac 20<210>75<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分。“核苷酸17-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>75tcttggtggc aaagatgag19<210>76<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分<400>76atgccattga gttcatcaac 20<210>77<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分<400>77tcttggtggc aaagatgag 19<210>78<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為GMO-PCR-F 20聚體<400>78atcgttgaag atgcctctgc 20<210>79<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為GMO-PCR-R 20聚體<400>79tccgtatgat cgcgcgtcat 20<210>80<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為GMO-S1 20聚體?！昂塑账?9-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>80tttggagagg acacgctgac 20<210>81<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為GMO-S2 20聚體?！昂塑账?9-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>81ggacacgctg acaagctgac 20<210>82<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為GMO-A1 20聚體?！昂塑账?9-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>82ggctgtagcc actgatgcug 20<210>83<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為GMO-A2 20聚體?！昂塑账?9-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>83ttccggaaag gccagaggau 20<210>84<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是(α-S)核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>84tactgggtt tttcttcggu a 20<210>85<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌0-157中擴(kuò)增vero毒素2-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是(α-S)核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>85atagacatca agccctcgua 20<210>86<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS-編碼序列的一部分?！昂塑账?0-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>86tcatgccatt gagttcatca ac 22<210>87<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>87tggtaggttc ctgttgtttc ua 22<210>88<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分<400>88tcatgccatt gagttcatca ac 22<210>89<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分<400>89tggtaggttc ctgttgtttc ta 22<210>90<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增λDNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>90ctgcgaggcg gtggcaaggg 20<210>91<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增λDNA的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>91ctgcctcgct ggccgtgccg c 21<210>92<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分。“核苷酸21-23是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>92ctcatgccat tgagttcatc aac 23<210>93<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分?！昂塑账?0-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>93gctggtaggt tcctgttgtu uc 22<210>94<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增pDON-AI DNA的一部分。“核苷酸17-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>94agctctgtat ctggcggac 19<210>95<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增pDON-AI DNA的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>95gatcgggatt tttggactca g21<210>96<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增HPV DNA的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>96caaaagagaa c tgcaatguu u 21<210>97<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增HPV DNA的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>97gttgcttgca gtacacacau u 21<210>98<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增HPV DNA的一部分。<400>98gaggacccac aggagcgacc cagaaag 27<210>99<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增HCV DNA的一部分。<400>99cactccacca tgaatcactc 20<210>100<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增HCV DNA的一部分。<400>100ggtgcacggt ctacgagacc 20<210>101<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增HCV的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>101ctgtgaggaa ctactgtcuu c 21<210>102<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增HCV的一部分?！昂塑账?6-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>102gcagaccact atggcucu 18<210>103<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針，用于檢測(cè)擴(kuò)增部分HCV的DNA片段。<400>103gtatgagtgt cgtgcagcct ccaggacccc 30<210>104<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增腺病毒的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>104tgagacatat tatctgccac g 21<210>105<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增腺病毒的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>105aaatggctag gaggtggaag a 21<210>106<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增腺病毒的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>106ttatcagcca gtacctctuc g 21<210>107<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增腺病毒的一部分。<400>107tgagacatat tatctgccac g 21<210>108<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增腺病毒的一部分。<400>108aaatggctag gaggtggaag a 21<210>109<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。<400>109ggggaaacct ggaggaagtc 20<210>110<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。<400>110cgggtagtag ccaaaggaag 20<210>111<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增pDON-AI DNA的一部分。<400>111agctctgtat ctggcggac 19<210>112<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增pDON-AI DNA的一部分。<400>112gatcgggatt tttggactca g 21<210>113<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素1-編碼序列的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>113ggggataatt tgtttgcagu 20<210>114<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素1-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>114tcgttcaaca ataagccgua 20<210>115<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素1-編碼序列的一部分。<400>115cgcccttcct ctggatctac ccctctgaca 30<210>116<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從肉毒梭菌中擴(kuò)增肉毒毒素A編碼序列的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>116caccagaagc aaaacaaguu c21<210>117<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從肉毒梭菌中擴(kuò)增肉毒毒素A編碼序列的一部分。“核苷酸21-23是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>117ctattgatgt taacaacatt cuu 23<210>118<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針，用于檢測(cè)從肉毒梭菌擴(kuò)增肉毒毒素A編碼序列的一部分的DNA片段。<400>118gggagttaca aaattatttg agagaattta30<210>119<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。“核苷酸19-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>119cacccttcct ttagtttccu u 21<210>120<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>120cgttgaagct tcagttguuu 20<210>121<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針，用于檢測(cè)擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分的DNA。<400>121ccttcctctc ctggagaggt cttctgccct30<210>122<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>122cacccttcct ttagtttccu u 21<210>123<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>123cgttgaagct tcagttgtuu c 21<210>124<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。<400>124cacccttcct ttagtttcct t 21<210>125<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增類(lèi)病毒CSVd的一部分。<400>125cgttgaagct tcagttgttt c 21<210>126<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增c-ki-ras癌基因的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>126gactgaatat aaacttgugg 20<210>127<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增c-ki-ras癌基因的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>127ctattgttgg atcatatucg20<210>128<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增c-ki-ras癌基因的一部分。<400>128gactgaatat aaacttgtgg20<210>129<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增c-ki-ras癌基因的一部分。<400>129ctattgttggatcatattcg 20<210>130<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素1-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>130gacttttcga cccaacaaag 20<210>131<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，用于從出血性大腸桿菌O-157中擴(kuò)增vero毒素1-編碼序列的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>131atatccacag caaaataacu 20<210>132<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分<400>132cacaaggcca catcggattt c 21<210>133<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增iNOS編碼序列的一部分<400>133tgcataccac ttcaacccga g21<210>134<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為pUC19 upper 150，用于擴(kuò)增質(zhì)粒pUC19的一部分<400>134ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatg25<210>135<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為pUC19 lower NN，用于擴(kuò)增質(zhì)粒pUC19的一部分<400>135gataacactg cggccaactt acttc 25<210>136<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為SEA-1，用于擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>136tgtatgtatg gtggtgtaac g 21<210>137<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為SEA-2，用于擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>137taaccgtttc caaaggtacu g21<210>138<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為HCV-F3，用于擴(kuò)增HCV的一部分?！昂塑账?7-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>138gcgtctagcc atggcguua 19<210>139<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為HCV-R1，用于擴(kuò)增HCV的一部分?！昂塑账?6-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>139gcagaccact atggcucu18<210>140<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MF2，用于擴(kuò)增pUC19質(zhì)粒DNA的一部分<400>140ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta 30<210>141<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MR1，用于擴(kuò)增pUC19質(zhì)粒DNA的一部分<400>141tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 30<210>142<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于擴(kuò)增腺病毒的一部分。<400>142ttatcagcca gtacctcttc g 21<210>143<211>714<212>DNA<213>海棲熱袍菌RNA酶HII基因的ORF的核苷酸序列。<400>143atgggaatag atgagcttta caaaaaagag tttggaatcg tagcaggtgt ggatgaagcg 60ggaagagggt gcctcgcagg tcccgttgtg gcggccgctg tcgttctgga aaaagaaata 120gaaggaataa acgattcaaa acagctttcc cctgcgaaga gggaaagact tttagatgaa 180ataatggaga aggcagcagt tgggttagga attgcgtctc cagaggaaat agatctctac 240aacatattca atgccacaaa acttgctatg aatcgagcac tggagaacct gtctgtgaaa 300ccatcatttg tactcgttga cgggaaagga atcgagttga gcgttcccgg tacatgctta 360gtgaagggag accagaaaag caaattgata ggagcagctt ccattgttgc gaaggtcttc 420agagatagat tgatgagcga gtttcacagg atgtatccac agttttcctt ccacaaacac 480aaaggttacg ccacaaaaga acatctgaac gaaatcagaa agaacggagt tttaccaatc 540caccggctga gttttgaacc tgttttagaa cttctgaccg atgatttgtt gagggagttc 600ttcgaaaaag gcctcatctc cgaaaatcga ttcgaacgaa tattgaatct tctgggggcg 660agaaaaagtg tggttttccg gaaagaaaga acaaaccata atctccctct tttt 714<210>144<211>238<212>PRT<213>海棲熱袍菌RNA酶HII基因的氨基酸序列。<400>144Met Gly Ile Asp Glu Leu Tyr Lys Lys Glu Phe Gly Ile Val Ala1 5 10 15Gly Val Asp Glu Ala Gly Arg Gly Cys Leu Ala Gly Pro Val Val
20 25 30Ala Ala Ala Val Val Leu Glu Lys Glu Ile Glu Gly Ile Asn Asp35 40 45Ser Lys Gln Leu Ser Pro Ala Lys Arg Glu Arg Leu Leu Asp Glu50 55 60Ile Met Glu Lys Ala Ala Val Gly Leu Gly Ile Ala Ser Pro Glu65 70 75Glu Ile Asp Leu Tyr Asn Ile Phe Asn Ala Thr Lys Leu Ala Met80 85 90Asn Arg Ala Leu Glu Asn Leu Ser Val Lys Pro Ser Phe Val Leu95 100 105Val Asp Gly Lys Gly Ile Glu Leu Ser Val Pro Gly Thr Cys Leu110 115 120Val Lys Gly Asp Gln Lys Ser Lys Leu Ile Gly Ala Ala Ser Ile125 130 135Val Ala Lys Val Phe Arg Asp Arg Leu Met Ser Glu Phe His Arg140 145 150Met Tyr Pro Gln Phe Ser Phe His Lys His Lys Gly Tyr Ala Thr155 160 165Lys Glu His Leu Asn Glu Ile Arg Lys Asn Gly Val Leu Pro Ile170 175 180His Arg Leu Ser Phe Glu Pro Val Leu Glu Leu Leu Thr Asp Asp185 190 195Leu Leu Arg Glu Phe Phe Glu Lys Gly Leu Ile Ser Glu Asn Arg200 205 210Phe Glu Arg Ile Leu Asn Leu Leu Gly Ala Arg Lys Ser Val Val215 220 225Phe Arg Lys Glu Arg Thr Asn His Asn Leu Pro Leu Phe230 235<210>145<211>663<212>DNA<213>Pyrococcus horikoshii PH1650的核苷酸序列。<400>145atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660tga 663<210>146<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物PhoNde，可用于從Pyrococcus horikoshii中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>146aggaggaaaa tcatatgaag gttgctggag 30<210>147<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物PhoBam，可用于從Pyrococcus horikoshii中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>147ttacatgaag gatccaagat cacttaagga 30<210>148<211>663<212>DNA<213>Pyrococcus horikoshii的RNA酶HII基因的ORF的核苷酸序列<400>148atgaaggttg ctggagttga tgaagcgggg agggggccgg taattggccc gttagtaatt 60ggagtagccg ttatagatga gaaaaatatt gagaggttac gtgacattgg ggttaaagac 120tccaaacaat taactcctgg gcaacgtgaa aaactattta gcaaattaat agatatccta 180gacgattatt atgttcttct cgttaccccc aaggaaatag atgagaggca tcattctatg 240aatgaactag aagctgagaa attcgttgta gccttgaatt ctttaaggat caagccgcag 300aagatatatg tggactctgc cgatgtagat cctaagaggt ttgctagtct aataaaggct 360gggttgaaat atgaagccac ggttatcgcc gagcataaag ccgatgcaaa gtatgagata 420gtatcggcag catcaataat tgcaaaggtc actagggata gagagataga gaagctaaag 480caaaagtatg gggaatttgg ttctggctat ccgagtgatc cgagaactaa ggagtggctt 540gaagaatatt acaaacaata tggtgacttt cctccaatag ttaggagaac ttgggaaacc 600gctaggaaga tagaggaaag gtttagaaaa aatcagctaa cgcttgataa attccttaag 660tgatcttgga tcc 663<210>149<211>220<212>PRT<213>Pyrococcus horikoshii的RNA酶HII的氨基酸序列<400>149Met Lys Val Ala Gly Val Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Val Ile1 5 10 15Gly Pro Leu Val Ile Gly Val Ala Val Ile Asp Glu Lys Asn Ile20 25 30Glu Arg Leu Arg Asp Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr35 40 45Pro Gly Gln Arg Glu Lys Leu Phe Ser Lys Leu Ile Asp Ile Leu50 55 60Asp Asp Tyr Tyr Val Leu Leu Val Thr Pro Lys Glu Ile Asp Glu65 70 75Arg His His Ser Met Asn Glu Leu Glu Ala Glu Lys Phe Val Val80 85 90Ala Leu Asn Ser Leu Arg Ile Lys Pro Gln Lys Ile Tyr Val Asp95 100 105Ser Ala Asp Val Asp Pro Lys Arg Phe Ala Ser Leu Ile Lys Ala110 115 120Gly Leu Lys Tyr Glu Ala Thr Val Ile Ala Glu His Lys Ala Asp125 130 135Ala Lys Tyr Glu Ile Val Ser Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val140 145 150Thr Arg Asp Arg Glu Ile Glu Lys Leu Lys Gln Lys Tyr Gly Glu155 160 165Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Arg Thr Lys Glu Trp Leu170 175 180Glu Glu Tyr Tyr Lys Gln Tyr Gly Asp Phe Pro Pro Ile Val Arg185 190 195Arg Thr Trp Glu Thr Ala Arg Lys Ile Glu Glu Arg Phe Arg Lys200 205210Asn Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Leu Lys215 220<210>150<211>626<212>DNA<213>閃爍古生球菌的AF0621的核苷酸序列<400>150atgaaggcag gcatcgatga ggctggaaag ggctgcgtca tcggcccact ggttgttgca 60ggagtggctt gcagcgatga ggataggctg agaaagcttg gtgtgaaaga ctccaaaaag 120ctaagtcagg ggaggagaga ggaactagcc gaggaaataa ggaaaatctg cagaacggag 180gttttgaaag tttctcccga aaatctcgac gaaaggatgg ctgctaaaac cataaacgag 240attttgaagg agtgctacgc tgaaataatt ctcaggctga agccggaaat tgcttatgtt 300gacagtcctg atgtgattcc cgagagactt tcgagggagc ttgaggagat tacggggttg 360agagttgtgg ccgagcacaa ggcggacgag aagtatcccc tggtagctgc ggcttcaatc 420atcgcaaagg tggaaaggga gcgggagatt gagaggctga aagaaaaatt cggggatttc 480ggcagcggct atgcgagcga tccgaggaca agagaagtgc tgaaggagtg gatagcttca 540ggcagaattc cgagctgcgt gagaatgcgc tggaagacgg tgtcaaatct gaggcagaag 600acgcttgacg atttctaaac gaaacc 626<210>151<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物AfuNde，用于從閃爍古生球菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>151aagctgggtt tcatatgaag gcaggcatcg 30<210>152<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物AfuBam，用于從閃爍古生球菌中克隆編碼具有RNA酶HII活性的多肽的基因<400>152tggtaataac ggatccgttt agaaatcgtc 30<210>153<211>638212>DNA<213>閃爍古生球菌的RNA酶HII基因的ORF的核苷酸序列。<400>153catatgaagg caggcatcga tgaggctgga aagggctgcg tcatcggccc actggttgtt 60gcaggagtgg cttgcagcga tgaggatagg ctgagaaagc ttggtgtgaa agactccaaa 120aagctaagtc aggggaggag agaggaacta gccgaggaaa taaggaaaat ctgcagaacg 180gaggttttga aagtttctcc cgaaaatctc gacgaaagga tggctgctaa aaccataaac 240gagattttga aggagtgcta cgctgaaata attctcaggc tgaagccgga aattgcttat 300gttgacagtc ctgatgtgat tcccgagaga ctttcgaggg agcttgagga gattacgggg 360ttgagagttg tggccgagca caaggcggac gagaagtatc ccctggtagc tgcggcttca 420atcatcgcaa aggtggaaag ggagcgggag attgagaggc tgaaagaaaa attcggggat 480ttcggcagcg gctatgcgag cgatccgagg acaagagaag tgctgaagga gtggatagct 540tcaggcagaa ttccgagctg cgtgagaatg cgctggaaga cggtgtcaaa tctgaggcag 600aagacgcttg acgatttcta aacggatccc cgggtacc 638<210>154<211>205<212>PRT<213>閃爍古生球菌的RNA酶HII的氨基酸序列。<400>154Met Lys Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val Ile Gly1 5 10 15Pro Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu20 25 30Arg Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gln Gly Arg35 40 45Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Arg Lys Ile Cys Arg Thr Glu50 55 60Val Leu Lys Val Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala65 70 75Lys Thr Ile Asn Glu Ile Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Ile Ile80 85 90Leu Arg Leu Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val95 100 105Ile Pro Glu Arg Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu110 115 120Arg Val Val Ala Glu His Lys Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val125 130 135Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val Glu Arg Glu Arg Glu Ile140 145 150Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Ala155 160 165Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu Trp Ile Ala Ser170 175 180Gly Arg Ile Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys Thr Val Ser185 190 195Asn Leu Arg Gln Lys Thr Leu Asp Asp Phe200 205<210>155<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MTIS2F，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分?！昂塑账?6-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>155tctcgtccag cgccgcuu 18<210>156<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MTIS2R，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分?！昂塑账?9-21是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>156gacaaaggc cacgtaggcga a 21<210>157<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為CT2F，用于擴(kuò)增沙眼衣原體隱蔽性質(zhì)粒DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>157ctggatttat cggaaaccuu20<210>158<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為CT2R，用于擴(kuò)增沙眼衣原體隱蔽性質(zhì)粒DNA的一部分。“核苷酸16-18是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>158aggcctctga aacgacuu18<210>159<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為K-F-1033(60)，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分?！昂塑账?7-19是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>159cacatcgatc cggttcagc 19<210>160<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為K-R-1133(62)，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>160tgatcgtctc ggctagtgca 20<210>161<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為K-F-1033(68)，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分?！昂塑账?0-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>161gtacacatcg atccggttca gc 22<210>162<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為K-R-1133(68)，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分?！昂塑账?0-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>162gttgatcgtc tcggctagtg ca 22<210>163<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為F26，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分。<400>163ccggagactc cagttcttgg 20<210>164<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為R1310，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分。<400>164gtctctggcg ttgagcgtag20<210>165<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為pDON-AI-68-1，用于擴(kuò)增pDON-AI DNA的一部分。“核苷酸20-22是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>165actagctctg tatctggcgg ac22<210>166<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為pDON-AI-68-2，用于擴(kuò)增pDON-AI DNA的一部分。“核苷酸21-23是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>166acgatcggga tttttggact cag 23<210>167<211>300<212>DNA<213>人類(lèi)原癌基因Wnt-5a的核苷酸序列<400>167cactagattt tttgtttggg gaggttggct tgaacataaa tgaaatatcc tgtattttct 60tagggatact tggttagtaa attataatag tagaaataat acatgaatcc cattcacagg 120tttctcagcc caagcaacaa ggtaattgcg tgccattcag cactgcacca gagcagacaa 180cctatttgag gaaaaacagt gaaatccacc ttcctcttca cactgagccc tctctgattc 240ctccgtgttg tgatgtgatg ctggccacgt ttccaaacgg cagctccact gggtcccctt 300<210>168<211>300<212>DNA<213>人類(lèi)核糖體蛋白S5的核苷酸序列<400>168cgccgagtga cagagacgct caggctgtgt tctcaggatg accgagtggg agacagcagc 60accagcggtg gcagagaccc cagacatcaa gctctttggg aagtggagca ccgatgatgt 120gcagatcaat gacatttccc tgcaggatta cattgcagtg aaggagaagt atgccaagta 180cctccctcac agtgcagggc ggtatgccgc aaacgctttc cgcaaagctc agtgtcccat 240tgtggagcgc ctcactaact ccatgatgat gcacggccgc aacaacggca agaagctcat 300<210>169<211>300<212>DNA<213>人類(lèi)心肌黃酶的核苷酸序列<400>169tctatacaaa ttttcagaag gttattttct ttatcattgc taaactgatg acttaccatg 60ggatggggtc cagtcccatg accttggggt acaattgtaa acctagagtt ttatcaactt 120tggtgaacag ttttggcata atagtcaatt tctacttctg gaagtcatct cattccactg 180ttggtattat ataattcaag gagaatatga taaaacactg ccctcttgtg gtgcattgaa 240agaagagatg agaaatgatg aaaaggttgc ctgaaaaatg ggagacagcc tcttacttgc 300<210>170<211>300<212>DNA<213>人類(lèi)protocadherin的核苷酸序列<400>170agtctcttgg gatcccctaa ccagagcctt tttgccatag ggctgcacac tggtcaaatc 60agtactgccc gtccagtcca agacacagat tcacccaggc agactctcac ggtcttgatc 120aaagacaatg gggagccttc gctctccacc actgctaccc tcactgtgtc agtaaccgag 180gactctcctg aagcccgagc cgagttcccc tctggctctg ccccccggga gcagaaaaaa 240aatctcacct tttatctact tctttcccta atcctggttt ctgtggggtt tgtggtcaca 300<210>171<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸，用于制備pIC62。<400>171catgtacatc acagtagtcg ttcacagggt tttccggcca taatggcctt tcctgtgtgt 60gtgctacagc tagtcagtca 80<210>172<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為ICAN2。“核苷酸19-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>172actgactagc tgtagcacac 20<210>173<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為ICAN6?！昂塑账?9-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>173acatcacagt agtcgttcac 20<210>174<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為ICAN2 DNA。<400>174actgactagc tgtagcacac 20<210>175<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為ICAN6 DNA。<400>175acatcacagt agtcgttcac 20<210>176<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于小從小鼠中擴(kuò)增核糖體蛋白S18編碼序列的一部分。<400>176gtctctagtg atccctgaga agt 23<210>177<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增核糖體蛋白S18編碼序列的一部分。<400>177tggatacacc cacagttcgg ccc 23<210>178<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR)編碼序列的一部分。<400>178ccgcgctccg acaagtagat gga 23<210>179<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFR)編碼序列的一部分。<400>179ccaaagagtg caaggtctgc ctc 23<210>180<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的因子4(Sdf4)編碼序列的一部分。<400>180tctgatggat gcaaccgcta gac 23<210>181<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增基質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的因子4(Sdf4)編碼序列的一部分。<400>181gaactcttca tgcacgttgc ggg 23<210>182<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增細(xì)胞質(zhì)β-肌動(dòng)蛋白編碼序列的一部分。<400>182tgatggtggg aatgggtcag aag 23<210>183<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增細(xì)胞質(zhì)β-肌動(dòng)蛋白編碼序列的一部分。<400>183agaagcactt gcggtgcacg atg23<210>184<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增鳥(niǎo)氨酸脫羧酶編碼序列的一部分。<400>184gatgaaagtc gccagagcac atc23<210>185<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增鳥(niǎo)氨酸脫羧酶編碼序列的一部分。<400>185ttgatcctag cagaagcaca ggc 23<210>186<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)編碼序列的一部分。<400>186ggacaggact gaaagacttg ctc 23<210>187<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)編碼序列的一部分。<400>187gtctggcctg tatccaacac ttc 23<210>188<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增酪氨酸3-單加氧酶編碼序列的一部分。<400>188atgagctggt gcagaaggcc aag 23<210>189<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，用于從小鼠中擴(kuò)增酪氨酸3-單加氧酶編碼序列的一部分。<400>189ttcccctcct tctcctgctt ctg 23<210>190<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MCS-F。<400>190ccattcaggc tgcgcaatgt t 21<210>191<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MCS-R。<400>191tggcacgaca ggtttcccga ct 22<210>192<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MF2N3(24)。“核苷酸22-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>192gctgcaaggc gattaagttg ggua 24<210>193<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MR1N3(24)?！昂塑账?2-24是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>193ctttatgctt ccggctcgta tguu 24<210>194<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MTIS2F-16，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分。“核苷酸14-16是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>194tcgtccagcg ccgcuu 16<210>195<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為MTIS2R-ACC，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>195caaaggccac gtaggcgaac20<210>196<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MTIS-PCR-F-2，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分。<400>196cgaccgcatc aaccgggagc20<210>197<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為MTIS-PCR-R-2，用于擴(kuò)增結(jié)核分支桿菌DNA的一部分。<400>197cccaggatcc tgcgagcgta 20<210>198<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為SP6-HCV-F，用于擴(kuò)增HCV的一部分。<400>198ccatttaggt gacactatag aatactgatg ggggcgacac tccac 45<210>199<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，命名為SP6-HCV-R，用于擴(kuò)增HCV的一部分。<400>199agctctaata cgactcacta tagggtcgca agcaccctat caggc 45<210>200<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為HCV-A S，用于擴(kuò)增HCV的一部分?！昂塑账?8-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>200gggtcctttc ttggatcaac 20<210>201<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>設(shè)計(jì)的嵌合寡核苷酸引物，命名為HCV-AA，用于擴(kuò)增HCV的一部分。“核苷酸18-20是核糖核苷酸，其它核苷酸是脫氧核糖核苷酸”<400>201gacccaacac tactcggcua20
權(quán)利要求
1.核酸擴(kuò)增方法，該方法包括；(c)將作為模板的核酸、脫氧核糖核苷三磷酸、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、至少一種引物和RNA酶H混合來(lái)制備反應(yīng)混合物，其中，此引物是基本上與作為模板的核酸的核苷酸序列互補(bǔ)的嵌合寡核苷酸引物，并且此引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；及(d)對(duì)反應(yīng)混合物孵育足夠時(shí)間以產(chǎn)生反應(yīng)產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1中的方法，其中此反應(yīng)混合物進(jìn)一步含有一種嵌合寡核苷酸引物，此引物具有與作為模板的核酸的核苷酸序列基本同源的序列。
3.核酸擴(kuò)增方法，該方法包括(d)用至少一種與作為模板的核酸的核苷酸序列基本互補(bǔ)的引物及DNA聚合酶處理作為模板的核酸，以合成與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈并合成雙鏈核酸，其中，此引物是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(e)在RNA酶H存在下，用具有鏈置換活性的DNA聚合酶對(duì)互補(bǔ)于在前面的步驟中獲得的、作為模板的雙鏈核酸的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以引起鏈置換并合成置換后的鏈及雙鏈核酸；及(c)在步驟(b)中重新利用步驟(b)中獲得的雙鏈核酸作為模板。
4.用至少兩種引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法，此方法包括(a)用至少一種與作為模板的核酸的核苷酸序列基本互補(bǔ)的引物及DNA聚合酶處理作為模板的核酸，以合成與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈，其中，此引物是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(b)在RNA酶H存在下，用具有鏈置換活性的DNA聚合酶對(duì)互補(bǔ)于在前面的步驟中獲得的、作為模板的雙鏈核酸的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以引起鏈置換并合成置換后的鏈及雙鏈核酸；(c)在步驟(b)中重新利用步驟(b)中獲得的雙鏈核酸作為模板；(d)利用至少一種與步驟(a)中所用的引物不同的引物及DNA聚合酶處理步驟(b)中獲得的、作為模板的置換后的鏈，以合成與置換后的鏈互補(bǔ)的引物延伸鏈，其中與步驟(a)中所用的引物不同的此引物是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物基本上與置換后鏈的核苷酸序列互補(bǔ)，并且含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(e)在RNA酶H存在下，用具有鏈置換活性的DNA聚合酶對(duì)互補(bǔ)于在前面的步驟中獲得的、作為模板的雙鏈核酸的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以引起鏈置換并合成置換后的鏈及雙鏈核酸；及(f)在步驟(e)中重新利用步驟(e)中獲得的雙鏈核酸作為模板。
5.權(quán)利要求3或4中的方法，其中的DNA聚合酶是至少一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
6.核酸擴(kuò)增方法，此方法包括(c)利用分別與雙鏈核酸模板的每條鏈的核苷酸序列基本互補(bǔ)的兩種引物及具有鏈置換活性的DNA聚合酶處理作為模板的雙鏈核酸分子，以合成與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈，并獲得由相互退火的合成的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸，其中每個(gè)引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(d)利用內(nèi)切核酸酶，切割步驟(a)中獲得的、由引物延伸鏈組成的雙鏈核酸的包含核糖核苷酸的位點(diǎn)；及(e)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶從步驟(b)中獲得的、其中的引物延伸鏈被切割的雙鏈核酸的各個(gè)引物部分的3′末端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以實(shí)現(xiàn)鏈置換并獲得由模板和引物延伸鏈組成的雙鏈核酸。
7.核酸擴(kuò)增方法，此方法包括(a)利用分別與雙鏈核酸模板的每條鏈的核苷酸序列基本互補(bǔ)的兩種引物及具有鏈置換活性的DNA聚合酶處理作為模板的雙鏈核酸分子，以合成與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈，并獲得由相互退火的合成的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸，其中每個(gè)引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(b)利用內(nèi)切核酸酶，切割步驟(a)中獲得的、由引物延伸鏈組成的雙鏈核酸的包含核糖核苷酸的位點(diǎn)；及(c)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶從步驟(b)中獲得的、其中的引物延伸鏈被切割的雙鏈核酸的各個(gè)引物部分的3′末端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以實(shí)現(xiàn)鏈置換并獲得由相互退火的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸。
8.核酸擴(kuò)增方法，此方法包括(f)利用分別與雙鏈核酸模板的每條鏈的核苷酸序列基本互補(bǔ)的兩種引物及具有鏈置換活性的DNA聚合酶處理作為模板的雙鏈核酸分子，以合成與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈，并獲得由相互退火的合成的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸，其中每個(gè)引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(g)利用內(nèi)切核酸酶，切割步驟(a)中獲得的、由引物延伸鏈組成的雙鏈核酸的包含核糖核苷酸的位點(diǎn)；(h)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶從步驟(b)中獲得的、其中的引物延伸鏈被切割的雙鏈核酸的各個(gè)引物部分的3′末端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以實(shí)現(xiàn)鏈置換并獲得由相互退火的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸和由相互退火的模板組成的、與步驟(a)中的兩種引物退火的雙鏈核酸；(i)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶從步驟(c)中獲得的、與兩種引物退火的雙鏈核酸的各個(gè)引物部分的3′末端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以實(shí)現(xiàn)鏈置換并獲得由相互退火的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸和由相互退火的模板組成的、與步驟(a)中的兩種引物退火的雙鏈核酸；和(j)在步驟(d)中，重新利用步驟(d)中獲得的、與兩引物退火的雙鏈核酸。
9.核酸擴(kuò)增方法，此方法包括(g)利用分別與雙鏈核酸模板的每條鏈的核苷酸序列基本互補(bǔ)的兩種引物及具有鏈置換活性的DNA聚合酶處理作為模板的雙鏈核酸分子，以合成與模板互補(bǔ)的引物延伸鏈，并獲得由相互退火的合成的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸，其中每個(gè)引物都是嵌合寡核苷酸引物，此嵌合寡核苷酸引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸和核苷酸類(lèi)似物、定位于引物3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(h)利用內(nèi)切核酸酶，切割步驟(a)中獲得的、由引物延伸鏈組成的雙鏈核酸的包含核糖核苷酸的位點(diǎn)；(i)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶從步驟(b)中獲得的、其中的引物延伸鏈被切割的雙鏈核酸的各個(gè)引物部分的3′末端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以實(shí)現(xiàn)鏈置換并獲得由相互退火的引物延伸鏈組成的雙鏈核酸和由相互退火的模板組成的、與步驟(a)中的兩種引物退火的雙鏈核酸；(j)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶從步驟(c)中獲得的、與兩種引物退火的雙鏈核酸的各個(gè)引物部分的3′末端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以實(shí)現(xiàn)鏈置換并獲得由模板和引物延伸鏈組成的雙鏈核酸；(k)利用內(nèi)切核酸酶，切割步驟(d)中獲得的、由模板和引物延伸鏈組成的雙鏈核酸的包含核糖核苷酸的位點(diǎn)；和(l)利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶從步驟(e)中獲得的、其中的引物延伸鏈被切割的雙鏈核酸的引物部分的3′末端開(kāi)始對(duì)互補(bǔ)于模板的核苷酸序列進(jìn)行延伸，以合成置換后的鏈。
10.權(quán)利要求6-9中任意一項(xiàng)的方法，其中的內(nèi)切核酸酶是內(nèi)切核糖核酸酶。
11.權(quán)利要求10中的方法，其中的內(nèi)切核糖核酸酶是RNA酶H。
12.權(quán)利要求1-5和11中任意一項(xiàng)的方法，其中的RNA酶H選自來(lái)自于大腸桿菌的RNA酶H、來(lái)自于棲熱袍菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于棲熱菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于芽胞桿菌屬細(xì)菌的RNA酶H。
13.權(quán)利要求1-12中任意一項(xiàng)的方法，其中的待擴(kuò)增核酸區(qū)域的長(zhǎng)度為200bp或更短。
14.權(quán)利要求1-13中任意一項(xiàng)的方法，其中使用下列通式所表示的嵌合寡核苷酸引物通式5′-dNa-Nb-dNc-3′(a等于或大于11的整數(shù)；b等于或大于1的整數(shù)；c0或等于或大于1的整數(shù)；dN脫氧核糖核苷酸和/或核苷酸類(lèi)似物；N未修飾的核糖核苷酸和/或修飾的核糖核苷酸，其中dNa中的一些dNs可為Ns所替換，并且可對(duì)3′末端的核苷酸進(jìn)行修飾，這樣不會(huì)發(fā)生通過(guò)DNA聚合酶的作用而進(jìn)行的從3′末端開(kāi)始的延伸)。
15.權(quán)利要求14中的方法，其中c為0。
16.權(quán)利要求14或15中的方法，其中的核苷酸類(lèi)似物是脫氧肌苷核糖核苷酸或脫氧尿嘧啶核糖核苷酸，并且修飾的核糖核苷酸為(α-S)核糖核苷酸。
17.權(quán)利要求14-16中任意一項(xiàng)的方法，其中DNA延伸反應(yīng)是在適合于權(quán)利要求14-16中任意一項(xiàng)所定義的嵌合寡核苷酸引物的DNA延伸反應(yīng)溫度下進(jìn)行的。
18.權(quán)利要求1-17中任意一項(xiàng)的方法，其包括在含有可增強(qiáng)核酸退火到引物上的物質(zhì)的退火溶液中，將作為模板的核酸退火到嵌合寡核苷酸引物上，所述引物基本上與核酸的核苷酸序列互補(bǔ)。
19.權(quán)利要求18中的方法，其中退火溶液含有亞精胺和/或丙二胺。
20.權(quán)利要求18或19中的方法，其中在等于或大于90℃下，對(duì)含有作為模板的核酸及與所述核酸的核苷酸序列基本互補(bǔ)的嵌合寡核苷酸引物的退火溶液進(jìn)行孵育，隨后將溶液冷卻到進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)的溫度或此溫度以下，從而進(jìn)行退火。
21.權(quán)利要求1-20中任意一項(xiàng)的方法，其中的擴(kuò)增反應(yīng)是在含有選自N-二[羥乙基]甘氨酸和HEPES的緩沖成分的緩沖溶液中進(jìn)行的。
22.權(quán)利要求1-21中任意一項(xiàng)的方法，其中具有鏈置換活性的DNA聚合酶選自大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段、來(lái)自于自嗜熱脂肪芽胞桿菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶。
23.權(quán)利要求1-5和11-22中任意一項(xiàng)的方法，其中具有鏈置換活性的DNA聚合酶是來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶，并且RNA酶H選自來(lái)自于大腸桿菌的RNA酶H、來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌的RNA酶H、和來(lái)自于古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H。
24.權(quán)利要求23中的方法，其中RNA酶H是來(lái)自于大腸桿菌的I型RNA酶H，或來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌或古生球菌屬細(xì)菌的II型RNA酶H。
25.權(quán)利要求1-24中任意一項(xiàng)的方法，其中使用具有內(nèi)切核酸酶活性的DNA聚合酶。
26.權(quán)利要求25中的方法，其中的DNA聚合酶是來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bca DNA聚合酶，并且是在允許BcaDNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)存在下使用Bca DNA聚合酶。
27.權(quán)利要求26中的方法，其中允許Bca DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)是錳離子。
28.權(quán)利要求1-27中任意一項(xiàng)的方法，其中的擴(kuò)增反應(yīng)是在抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)存在下進(jìn)行的。
29.權(quán)利要求28中的方法，其中抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)為乙膦甲酸。
30.權(quán)利要求1-29中任意一項(xiàng)的方法，其中作為模板的核酸是單鏈DNA或雙鏈DNA。
31.權(quán)利要求30中的方法，其是在將作為模板的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化為單鏈DNA后進(jìn)行的。
32.權(quán)利要求30或31中的方法，其中的作為模板的核酸是以RNA為模板通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到的cDNA。
33.權(quán)利要求32中的方法，其是在以RNA為模板通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA后進(jìn)行的。
34.權(quán)利要求32或33中的方法，其中具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的DNA聚合酶被用作逆轉(zhuǎn)錄酶。
35.權(quán)利要求31-34中任意一項(xiàng)的方法，其中利用具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性和鏈置換活性的一種DNA聚合酶來(lái)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)并合成與模板互補(bǔ)的延伸鏈。
36.權(quán)利要求35中的方法，其中的DNA聚合酶是來(lái)自于嗜熱脂肪芽胞桿菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶或來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶。
37.權(quán)利要求1-36中任意一項(xiàng)的方法，其中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)是在等溫條件下進(jìn)行的。
38.權(quán)利要求1-37中任意一項(xiàng)的方法，其是在脫氧核糖核苷三磷酸類(lèi)似物存在下進(jìn)行的。
39.權(quán)利要求38中的方法，其中的脫氧核糖核苷三磷酸類(lèi)似物為脫氧尿苷三磷酸或其衍生物。
40.用于擴(kuò)增核酸的組合物，包含(d)至少一種與作為模板的核酸的核苷酸序列基本互補(bǔ)的引物，其中此引物是嵌合寡核苷酸引物，此引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸及核苷酸類(lèi)似物、定位于引物的3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(e)內(nèi)切核酸酶；及(f)具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
41.用于擴(kuò)增核酸的組合物，包含(d)至少兩種基本上與作為模板的雙鏈核酸的各條鏈的核苷酸序列分別互補(bǔ)的引物，其中此引物是嵌合寡核苷酸引物，此引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸及核苷酸類(lèi)似物、定位于引物的3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)；(e)內(nèi)切核酸酶；及(f)具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
42.用于擴(kuò)增核酸的組合物，其是通過(guò)將作為模板的核酸、脫氧核糖核苷三磷酸、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、至少一種引物和內(nèi)切核酸酶混合而獲得的，其中此引物是嵌合寡核苷酸引物，此引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸及核苷酸類(lèi)似物、定位于引物的3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)。
43.用于擴(kuò)增核酸的組合物，其是通過(guò)將作為模板的核酸、脫氧核糖核苷三磷酸、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、至少兩種引物和內(nèi)切核酸酶混合而制得的，其中每種引物都是嵌合寡核苷酸引物，此引物與作為模板的雙鏈核酸的每條鏈的核苷酸序列基本互補(bǔ)，并且此引物含有核糖核苷酸及選自脫氧核糖核苷酸及核苷酸類(lèi)似物、定位于引物的3′末端或3′末端側(cè)的核糖核苷酸中的至少一個(gè)。
44.權(quán)利要求40-43中任意一項(xiàng)的組合物，其中的引物為下面的通式表示的嵌合寡核苷酸引物通式5′-dNa-Nb-dNc-3′(a等于或大于11的整數(shù)；b等于或大于1的整數(shù)；c0或等于或大于1的整數(shù)；dN脫氧核糖核苷酸和/或核苷酸類(lèi)似物；N未修飾的核糖核苷酸和/或修飾的核糖核苷酸，其中dNa中的一些dNs可為Ns所替換，并且可對(duì)3′末端的核苷酸進(jìn)行修飾，這樣不會(huì)發(fā)生通過(guò)DNA聚合酶的作用而進(jìn)行的從3′末端開(kāi)始的延伸)。
45.權(quán)利要求44中的組合物，其中c為0。
46.權(quán)利要求44或45中的組合物，其中的核苷酸類(lèi)似物是脫氧肌苷核糖核苷酸或脫氧尿嘧啶核糖核苷酸，并且修飾的核糖核苷酸為(α-S)核糖核苷酸。
47.權(quán)利要求40-46中任意一項(xiàng)的組合物，其包含適于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的緩沖成分。
48.權(quán)利要求47中任意一項(xiàng)的組合物，其含有選自N-二[羥乙基]甘氨酸和HEPES的緩沖成分。
49.權(quán)利要求40-48中任意一項(xiàng)的組合物，其中選自大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段、來(lái)自于嗜熱脂肪芽胞桿菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶的DNA聚合酶被用作具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
50.權(quán)利要求40-49中任意一項(xiàng)的組合物，其中的內(nèi)切核酸酶是內(nèi)切核糖核酸酶。
51.權(quán)利要求50中的組合物，其中的內(nèi)切核糖核酸酶是RNA酶H。
52.權(quán)利要求51中的組合物，其中的RNA酶H選自來(lái)自于大腸桿菌的RNA酶H、來(lái)自于棲熱袍菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于棲熱菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于芽胞桿菌屬細(xì)菌的RNA酶H。
53.權(quán)利要求40-52中任意一項(xiàng)的組合物，其中具有鏈置換活性的DNA聚合酶是來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的BcaDNA聚合酶，并且內(nèi)切核酸酶是選自來(lái)自于大腸桿菌的RNA酶H、來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌的RNA酶H和來(lái)自于古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H的RNA酶H。
54.權(quán)利要求53中的組合物，其中RNA酶H是來(lái)自于大腸桿菌的I型RNA酶H或來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌或古生球菌屬細(xì)菌的II型RNA酶H。
55.權(quán)利要求40-54中任意一項(xiàng)的組合物，其中使用具有內(nèi)切核酸酶活性的DNA聚合酶。
56.權(quán)利要求55中的組合物，其中的DNA聚合酶是來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶，該組合物含有允許Bca DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)。
57.權(quán)利要求56中的組合物，其中允許Bca DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)是錳離子。
58.權(quán)利要求40-57中任意一項(xiàng)的組合物，其含有抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)。
59.權(quán)利要求58中的組合物，其中抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)為乙膦甲酸。
60.權(quán)利要求40-59中任意一項(xiàng)的組合物，其含有脫氧核糖核苷三磷酸類(lèi)似物。
61.權(quán)利要求60中的組合物，其中的脫氧核糖核苷三磷酸類(lèi)似物為脫氧尿嘧啶三磷酸或其衍生物。
62.用于權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所定義的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增組合物，此組合物包含(c)RNA酶H；及(d)具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
63.用于權(quán)利要求6-9中任意一項(xiàng)所定義的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增組合物，此組合物包含(a)內(nèi)切核酸酶，及(b)具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
64.權(quán)利要求63中的組合物，其中的內(nèi)切核酸酶是內(nèi)切核糖核酸酶。
65.權(quán)利要求64中的組合物，其中的內(nèi)切核糖核酸酶是RNA酶H。
66.權(quán)利要求62或65中的組合物，其中的RNA酶H選自來(lái)自于大腸桿菌的RNA酶H、來(lái)自于棲熱袍菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于棲熱菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于芽胞桿菌屬細(xì)菌的RNA酶H。
67.權(quán)利要求62-66中任意一項(xiàng)的組合物，其含有適于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的緩沖成分。
68.權(quán)利要求67中的組合物，其含有選自N-二[羥乙基]甘氨酸和HEPES的緩沖成分。
69.權(quán)利要求62-68中任意一項(xiàng)的組合物，其中選自大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段、來(lái)自于嗜熱脂肪芽胞桿菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶的DNA聚合酶被用作具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
70.權(quán)利要求62中的組合物，其中具有鏈置換活性的DNA聚合酶是來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶，并且RNA酶H是選自來(lái)自于大腸桿菌的RNA酶H、來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌的RNA酶H和來(lái)自于古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H的RNA酶H。
71.權(quán)利要求63中的組合物，其中具有鏈置換活性的DNA聚合酶是來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶，并且內(nèi)切核酸酶是選自來(lái)自于大腸桿菌的RNA酶H、來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌的RNA酶H和來(lái)自于古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H的RNA酶H。
72.權(quán)利要求62-71中任意一項(xiàng)的組合物，其中使用具有內(nèi)切核酸酶活性的DNA聚合酶。
73.權(quán)利要求72中的組合物，其中的DNA聚合酶是來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶，該組合物含有允許Bca DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)。
74.權(quán)利要求73中的組合物，其中允許DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)是錳離子。
75.權(quán)利要求62-74中任意一項(xiàng)的組合物，其含有抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)。
76.權(quán)利要求75中的組合物，其中抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)為乙膦甲酸。
77.權(quán)利要求62-76中任意一項(xiàng)的組合物，其含有脫氧核糖核苷三磷酸類(lèi)似物。
78.權(quán)利要求77中的組合物，其中的脫氧核糖核苷三磷酸類(lèi)似物為脫氧尿嘧啶三磷酸或其衍生物。
79.用于權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所定義的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增試劑盒，此試劑盒含有(a)RNA酶H；及(b)具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
80.用于權(quán)利要求6-9中任意一項(xiàng)所定義的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增試劑盒，此試劑盒含有(a)內(nèi)切核酸酶；及(b)具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
81.權(quán)利要求80中的試劑盒，其中的內(nèi)切核酸酶是內(nèi)切核糖核酸酶。
82.權(quán)利要求81中的試劑盒，其中的內(nèi)切核糖核酸酶是RNA酶H。
83.權(quán)利要求79或82中的試劑盒，其中的RNA酶H選自來(lái)自于大腸桿菌的RNA酶H、來(lái)自于棲熱袍菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于棲熱菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H、來(lái)自于芽胞桿菌屬細(xì)菌的RNA酶H。
84.權(quán)利要求79-83中任意一項(xiàng)的試劑盒，其含有適于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的緩沖成分。
85.權(quán)利要求84中的試劑盒，其含有用于核酸擴(kuò)增的、含有選自N-二[羥乙基]甘氨酸和HEPES的緩沖成分的緩沖液。
86.權(quán)利要求79-85中任意一項(xiàng)的試劑盒，其含有退火溶液，此退火溶液含有增強(qiáng)作為模板的核酸退火到與所述核酸的核苷酸序列基本互補(bǔ)的引物上的物質(zhì)。
87.權(quán)利要求86中的試劑盒，其中的退火溶液含有亞精胺和/或丙二胺。
88.權(quán)利要求79-87中任意一項(xiàng)的試劑盒，其中選自大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段、來(lái)自于嗜熱脂肪芽胞桿菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶的DNA聚合酶被用作具有鏈置換活性的DNA聚合酶。
89.權(quán)利要求79中的試劑盒，其中具有鏈置換活性的DNA聚合酶是來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶，并且RNA酶H是選自來(lái)自于大腸桿菌的RNA酶H、來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌的RNA酶H和來(lái)自于古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H的RNA酶H。
90.權(quán)利要求80中的試劑盒，其中具有鏈置換活性的DNA聚合酶是來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶，并且內(nèi)切核酸酶是選自來(lái)自于大腸桿菌的RNA酶H、來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌的RNA酶H和來(lái)自于古生球菌屬細(xì)菌的RNA酶H的RNA酶H。
91.權(quán)利要求89或90中的試劑盒，其中RNA酶H是來(lái)自于大腸桿菌的I型RNA酶H或來(lái)自于火球菌屬細(xì)菌或古生球菌屬細(xì)菌的II型RNA酶H。
92.權(quán)利要求79或91中的試劑盒，其中使用具有內(nèi)切核酸酶活性的DNA聚合酶。
93.權(quán)利要求92中的試劑盒，其中的DNA聚合酶是來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶，該試劑盒含有允許Bca DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)。
94.權(quán)利要求93中的試劑盒，其中允許DNA聚合酶的內(nèi)切核酸酶活性表達(dá)的物質(zhì)是錳離子。
95.權(quán)利要求79-94中任意一項(xiàng)的試劑盒，其含有抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)。
96.權(quán)利要求95中的試劑盒，其中抑制DNA聚合酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的物質(zhì)為乙膦甲酸。
97.權(quán)利要求79-96中任意一項(xiàng)的試劑盒，其含有脫氧核糖核苷三磷酸類(lèi)似物。
98.權(quán)利要求97中的試劑盒，其中的脫氧核糖核苷三磷酸類(lèi)似物為脫氧尿嘧啶三磷酸或其衍生物。
99.用于權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所定義的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增試劑盒，此試劑盒以包裝形式存在，并且含有指導(dǎo)具有鏈置換活性的DNA聚合酶及RNA酶H的使用的說(shuō)明書(shū)。
100.用于權(quán)利要求6-9中任意一項(xiàng)所定義的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增試劑盒，此試劑盒以包裝形式存在，并且含有指導(dǎo)具有鏈置換活性的DNA聚合酶及RNA酶H的使用的說(shuō)明書(shū)。
101.用于擴(kuò)增核酸的試劑產(chǎn)品，由包裝材料和用于對(duì)包裹在包裝材料中的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的試劑組成，其中用于擴(kuò)增核酸的試劑包括具有鏈置換活性的DNA聚合酶和/或RNA酶H，并且在粘貼到包裝材料的標(biāo)簽中或粘貼到包裝材料的說(shuō)明書(shū)中說(shuō)明了所述用于擴(kuò)增核酸的試劑可以用于在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
102.用于擴(kuò)增核酸的試劑產(chǎn)品，由包裝材料和用于對(duì)包裹在包裝材料中的核酸進(jìn)行擴(kuò)增的試劑組成，其中用于擴(kuò)增核酸的試劑包括具有鏈置換活性的DNA聚合酶和/或內(nèi)切核酸酶，并且在粘貼到包裝材料的標(biāo)簽中或粘貼到包裝材料的說(shuō)明書(shū)中說(shuō)明了所述用于擴(kuò)增核酸的試劑可以用于在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
103.樣品中靶核酸的檢測(cè)方法，此方法包括(a)利用權(quán)利要求1-39中任意一項(xiàng)所定義的核酸擴(kuò)增方法進(jìn)行擴(kuò)增核酸；及(b)對(duì)步驟(a)中擴(kuò)增的核酸進(jìn)行檢測(cè)。
104.權(quán)利要求103中的方法，其包括利用探針對(duì)擴(kuò)增后的核酸進(jìn)行檢測(cè)。
105.權(quán)利要求104中的方法，其中用于檢測(cè)的探針是用標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記的探針。
106.權(quán)利要求105中的方法，其中的探針是用間隔了導(dǎo)致淬滅狀態(tài)的距離的兩種或多種熒光物質(zhì)標(biāo)記的RNA探針。
107.用于權(quán)利要求103-106中的任意一項(xiàng)所定義的靶核酸檢測(cè)方法的嵌合寡核苷酸引物。
108.權(quán)利要求107中的嵌合寡核苷酸引物，其由下列通式來(lái)表示通式5′-dNa-Nb-dNc-3′(a等于或大于11的整數(shù)；b等于或大于1的整數(shù)；c0或等于或大于1的整數(shù)；dN脫氧核糖核苷酸和/或核苷酸類(lèi)似物；N未修飾的核糖核苷酸和/或修飾的核糖核苷酸，其中dNa中的一些dNs可為Ns所替換，并且可對(duì)3′末端的核苷酸進(jìn)行修飾，這樣不會(huì)發(fā)生通過(guò)DNA聚合酶的作用而進(jìn)行的從3′末端開(kāi)始的延伸)。
109.權(quán)利要求108中的嵌合寡核苷酸引物，其中c為0。
110.權(quán)利要求108或109中的嵌合寡核苷酸引物，其中的核苷酸類(lèi)似物是脫氧肌苷核糖核苷酸或脫氧尿嘧啶核糖核苷酸，并且修飾的核糖核苷酸為(α-S)核糖核苷酸。
111.權(quán)利要求107-110中任意一項(xiàng)的嵌合寡核苷酸引物，它是可用于檢測(cè)病原微生物或與疾病相關(guān)的基因的嵌合寡核苷酸引物。
112.權(quán)利要求111中的嵌合寡核苷酸引物，其中的病原微生物為腸出血性大腸桿菌、肉毒梭菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核分支桿菌、衣原體、乳頭狀瘤病毒、丙型肝炎病毒或類(lèi)病毒。
113.用于檢測(cè)腸出血性大腸桿菌的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有選自SEQ ID NO31-34、47、48、51-53、64-72、84、85、113、114、130和131的核苷酸序列。
114.用于檢測(cè)類(lèi)病毒的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有選自SEQID NO59、60、119、120、122和123的核苷酸序列。
115.用于檢測(cè)肉毒梭菌的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有SEQ IDNO116或117所表示的核苷酸序列。
116.用于檢測(cè)乳頭狀瘤病毒的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有SEQ ID NO96或97所表示的核苷酸序列。
117.用于檢測(cè)丙型肝炎病毒的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有選自SEQ ID NO101、102、138、139、200和201的核苷酸序列。
118.用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有SEQ ID NO136或137所表示的核苷酸序列。
119.用于檢測(cè)結(jié)核分支桿菌的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有選自SEQ ID NO155、156、159-162、194和195的核苷酸序列。
120.用于檢測(cè)衣原體的嵌合寡核苷酸引物，此引物具有選自SEQID NO157或158所表示的核苷酸序列。
121.用于權(quán)利要求1-39中任意一項(xiàng)所定義的核酸擴(kuò)增方法的核酸擴(kuò)增試劑盒，此試劑盒含有權(quán)利要求107-120中的任意一項(xiàng)所定義的嵌合寡核苷酸引物。
122.用于權(quán)利要求103-106中任意一項(xiàng)所定義的靶核酸檢測(cè)方法的靶核酸檢測(cè)試劑盒，此試劑盒含有權(quán)利要求107-120中的任意一項(xiàng)所定義的嵌合寡核苷酸引物。
123.權(quán)利要求103-106中的任意一項(xiàng)所定義的方法中所使用的探針。
124.與通過(guò)權(quán)利要求1-39中的任意一項(xiàng)所定義的方法擴(kuò)增得到的核酸雜交的探針。
125.與使用權(quán)利要求113-120中的任意一項(xiàng)所定義的嵌合寡核苷酸引物擴(kuò)增得到的區(qū)域進(jìn)行雜交的探針。
126.權(quán)利要求123-125中任意一項(xiàng)的探針，其已用標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行了標(biāo)記。
127.權(quán)利要求126中的探針，其是用間隔了導(dǎo)致淬滅狀態(tài)的距離的兩種或多種熒光物質(zhì)標(biāo)記的RNA探針。
128.權(quán)利要求103-106中的任意一項(xiàng)所定義的方法中使用的試劑盒，其含有權(quán)利要求123-127中的任意一項(xiàng)所定義的探針。
129.核酸擴(kuò)增方法，其包括利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶來(lái)實(shí)現(xiàn)模板交換反應(yīng)。
130.權(quán)利要求129中的方法，其中具有鏈置換活性的DNA聚合酶選自大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段、來(lái)自于自嗜熱脂肪芽胞桿菌的缺乏5′→3′外切核酸酶的Bst DNA聚合酶及來(lái)自于熱堅(jiān)芽孢桿菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶。
131.含有固定化核酸的物質(zhì)的制備方法，此物質(zhì)中的核酸是排列在預(yù)定的區(qū)域中，此方法包括(a)利用權(quán)利要求1-39中任意一項(xiàng)所定義的核酸擴(kuò)增方法來(lái)擴(kuò)增待固定化的核酸；及(c)將步驟(a)中擴(kuò)增得到的核酸排列并固定化在預(yù)定的區(qū)域中。
132.含有固定化核酸的物質(zhì)，此物質(zhì)中的核酸是利用權(quán)利要求131定義的方法制備并排列在預(yù)定的區(qū)域中的。
133.大量制備核酸的方法，此方法包括(a)利用權(quán)利要求1-39中任意一項(xiàng)所定義的核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增核酸；及(b)收集步驟(a)中擴(kuò)增得到的核酸。
134.核酸擴(kuò)增方法，此方法包括(a)復(fù)制含有待擴(kuò)增序列的DNA或RNA以制備作為模板的核酸；及(b)利用權(quán)利要求1-39中的任意一項(xiàng)所定義的核酸擴(kuò)增方法對(duì)步驟(a)中獲得的作為模板的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。
135.對(duì)核酸的核苷酸序列進(jìn)行確定的方法，該方法包括按照權(quán)利要求1-39、133和134中的任意一項(xiàng)所定義的方法擴(kuò)增核酸。
136.制備單鏈核酸的方法，包括利用權(quán)利要求1-39中的任意一項(xiàng)所定義的方法來(lái)制備單鏈核酸。
137.權(quán)利要求136中的方法，其中使用至少兩種不同濃度的引物。
全文摘要
在樣品中，利用在3′末端或3′末端側(cè)具有核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物、內(nèi)切核糖核酸酶及具有鏈置換活性的DNA聚合酶擴(kuò)增靶核酸的高靈敏度和高特異性方法，也即等溫的和嵌合引物起始的核酸擴(kuò)增(ICAN)方法；通過(guò)上述方法獲得的擴(kuò)增片段的檢測(cè)方法；利用上述擴(kuò)增方法制備靶核酸的方法；以及用于這些方法中的嵌合寡核苷酸引物。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1471588SQ01817776
公開(kāi)日2004年1月28日 申請(qǐng)日期2001年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月23日
發(fā)明者佐川裕章, 上森隆司, 向井博之, 山本純子, 友野潤(rùn), 小林英二, 榎龍嗣, 淺田起代蔵, 加藤郁之進(jìn), 之, 之進(jìn), 二, 代, 司, 子 申請(qǐng)人:寶生物工程株式會(huì)社