專利名稱：轉(zhuǎn)基因植物中1,2－二苯乙烯系產(chǎn)品及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物和植物材料。特別是，本發(fā)明涉及白藜蘆醇和其他1，2-二苯乙烯系(stilbenes)在植物中的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
癌癥是男性和女性最大的單獨死亡原因，癌癥的化學預防是減少發(fā)病率和死亡率最直接的途徑之一。預防癌癥的藥物包括非類固醇抗炎藥物，例如，消炎痛，阿司匹林，吡氯噻嗪和舒林酸，所有的這些藥物都抑制COX。過去30年來，在尋找新的癌癥預防藥物過程中，對數(shù)千種植物的樣品和提取物進行了研究，并評估了數(shù)百種提取物潛在的抑制COX的能力。1974年，一種秘魯肉桂(Cassia quinquangulata)的提取物被確認為有效的抑制劑，其活性成分被確認為白藜蘆醇(3，5，4`-三羥基-反-二苯乙烯)。1997年，據(jù)科學雜志報道，白藜蘆醇，一種在葡萄和其他食物中發(fā)現(xiàn)的植物抗毒素被提純，并在三個主要的癌癥發(fā)病階段的試驗中表現(xiàn)為具有化學預防癌癥的活性。白藜蘆醇作為一種抗氧化劑和抗誘變劑作用并導致第II階段的藥-代酶(抗起始活性)；它具有抗發(fā)炎的作用和抑制環(huán)氧酶和氫過氧化物酶的作用(抗啟動活性)，并且它誘導抗癌癥發(fā)展的活性。另外，在經(jīng)致癌處理的小鼠乳腺的培養(yǎng)中白藜蘆醇能抑制腫瘤發(fā)生前(preneoplastic)的損傷的發(fā)展，并抑制小鼠皮膚癌模型中腫瘤的發(fā)生(Jang M.S.，Science，275218-220，1997)。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，全世界多數(shù)其他科學家強烈建議，對白藜蘆醇，一種在我們?nèi)粘Ｊ澄镏械钠胀ǔ煞肿鳛槿祟愐环N潛在的癌癥抑制劑進行研究。
過去20年，酒精、心血管疾病和法蘭西軍團病(the French paradox)已經(jīng)進行過研究并且全世界醫(yī)學科學團體都進行了深入調(diào)查。多年來大量的研究表明酒精的攝入和心臟局部缺血疾病具有反比關(guān)系或U型曲線關(guān)系，這是指與沒有喝酒的人相比，每天喝兩次任何酒的人的冠心病的發(fā)病率下降，而更高劑量則導致心肌梗塞和發(fā)病的危險的增加。大多數(shù)酒精飲料的保護心臟的作用或許是由于增加了高密度脂蛋白和酒精防止血小板凝聚以及增加纖維蛋白溶解的能力；然而，紅酒增加了這種有益的作用。紅酒獨特的保護心臟的性能在于其中的類黃酮和stilbenoids的作用，而在白酒中它們的含量非常小(香檳酒除外)。研究得最多的類黃酮是白藜蘆醇和槲皮黃酮，它們比α-維生素E具有更好的抗氧化性能。葡萄汁含有紅酒一半的類黃酮的含量。然而，白藜蘆醇是一種植物抗毒素，在正常情況下葡萄并不會產(chǎn)生白藜蘆醇，只有在葡萄受到微生物病原體襲擊的時候才會產(chǎn)生。
至少超過12個科31個屬的72種植物產(chǎn)生植物抗毒素白藜蘆醇。產(chǎn)生白藜蘆醇的植物研究得最好的是葡萄和花生。美國和特別是德國的大學已經(jīng)積極的觀察了所描述的兩種植物的植物-病原體交互作用。拜爾AG(Bayer AG)是一個大型化學和制藥公司，積極的贊助和開展這種植物抗毒素的工作。他們已經(jīng)分離了涉及白藜蘆醇(植物抗毒素)產(chǎn)物的基因(1，2-二苯乙烯合酶)并表明在轉(zhuǎn)基因植物中被表達時能夠增加植物抗病原體攻擊的能力。拜爾(Bayer)也申報了他們分離的葡萄1，2-二苯乙烯合酶基因方面的專利。費舍爾R.(FischerR.)在植物雜志(Plant J.11(3)489-498，1997)發(fā)表了一篇論文，在轉(zhuǎn)基因煙草中，1，2-二苯乙烯合酶基因過度表達能導致花粉不育(由于查爾酮合酶和1，2-二苯乙烯合酶具有共同的酶底物前體，而存在競爭)。
不久前，也有一個加拿大公司PharmaScience銷售粉狀的白藜蘆醇，并聲稱是化學合成的產(chǎn)物。商標名稱是“Resverin”。他們只能以非常高的價格少量供應。過去的這些年里，還有許多報告表明白藜蘆醇是植物雌激素。因此，白藜蘆醇也包含模擬的雌激素作用，可能具有作為非固醇類雌激素補充物的潛力，也可能防止骨質(zhì)疏松癥。
試圖開發(fā)這類1，2-二苯乙烯系的抗氧化劑和抗誘變劑的一個困難是它們通常是植物抗毒素，只有在受感染或受傷的植物中才能發(fā)現(xiàn)，在健康的植物中沒有發(fā)現(xiàn)，即使這種基因在植物中自然存在。例如，雖然葡萄有1，2-二苯乙烯合酶(STS)基因并且是活潑的STS酶，消費者并不能從攝取葡萄得益，因為在健康的新鮮的葡萄中并沒有發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇。因此，需要生產(chǎn)所期望的含有高濃度和組成型水平(high and constitutive level)的一種或更多的1，2-二苯乙烯系的植物。

發(fā)明內(nèi)容
據(jù)此，本發(fā)明的一方面是至少含有一個轉(zhuǎn)化的1，2-二苯乙烯合酶(STS)基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物，并通過轉(zhuǎn)基因STS酶合成對應的1，2-二苯乙烯構(gòu)成的產(chǎn)品。另一方面，轉(zhuǎn)基因植物的生育能力和生理發(fā)育能夠通過在特定的范圍內(nèi)對1，2-二苯乙烯的表達選擇性克隆而得到控制。這種植物優(yōu)選一種普通的蔬菜，它在可食用的部分天然產(chǎn)生高含量的用于轉(zhuǎn)基因STS的前體。更優(yōu)選的是一種通?？梢陨缘亩嗳~蔬菜，但是也能夠在需要時煮熟。優(yōu)選的STS基因是白藜蘆醇合酶(RS)。適合接受白藜蘆醇合酶轉(zhuǎn)基因的植物的一個例子是紅葉萵苣(Lactuca Sativa)。紅葉萵苣也稱作紅色萵苣(red lettuce)。本發(fā)明其他的接受性強的植物的例子包括彩色蔬菜和水果，包括但不局限于西瓜、草莓、菠菜，紅甘藍、紅甘蔗。
因此，根據(jù)另一方面，本發(fā)明是一種轉(zhuǎn)基因植物，至少含有一個被轉(zhuǎn)化的白藜蘆醇合酶(RS)基因結(jié)構(gòu)并且通過轉(zhuǎn)基因RS酶合成白藜蘆醇的構(gòu)成產(chǎn)品。植物優(yōu)選紅葉萵苣。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及到轉(zhuǎn)基因植物的可食用的組成部分，一種實施方式是用這樣的轉(zhuǎn)基因植物的汁開發(fā)的飲料。因此，優(yōu)選的這樣的產(chǎn)品的植物產(chǎn)生足夠大量的含有轉(zhuǎn)基因白藜蘆醇的汁可通過加工制成飲料。更進一步，本發(fā)明也能提供含有轉(zhuǎn)基因白藜蘆醇的干的蔬菜和水果。在這種實施方式中，植物的可食用部分包括任何數(shù)量的流體。再進一步的實施方式中，可以從轉(zhuǎn)基因植物中生產(chǎn)含有白藜蘆醇的植物提取物。提取物可以是濃縮形式或不濃縮形式，例如粉末形式。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明是一種生產(chǎn)含有特定的轉(zhuǎn)基因STS酶的健康的轉(zhuǎn)基因植物的方法。優(yōu)選的實施方式，根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物含有高的和組成型水平的轉(zhuǎn)基因白藜蘆醇同時維持正常的生理生長。這種方法包括(1)選擇含有高含量轉(zhuǎn)基因STS酶前體的受體植物；(2)提供一種含有STS基因或編碼STS酶的部分STS基因的基因載體，為STS基因或部分STS基因提供適合于在受體植物中STS酶組成型表達的啟動子；(3)將基因載體轉(zhuǎn)入受體植物，并(4)選擇和培育含有高濃度和組成型水平的1，2-二苯乙烯的轉(zhuǎn)化的植物。
為了檢查內(nèi)生的1，2-二苯乙烯合酶，按照已知的STS基因的保留區(qū)域構(gòu)成的寡核苷酸可以作為探針，然后通過Southern印跡分析候選受體植物的基因組。
生物化學檢測，例如HPLC，可以用于分析前體的水平。4-香豆?；?輔酶A(4-Coumaroyl-CoA)和丙二酰-輔酶A是RS和其他1，2-二苯乙烯合酶共同的兩個前體。作為選擇，從具有相同的生物化學途徑的其它中間體的水平可推斷其高前體水平，例如自然狀態(tài)下植物的“紅色”的外表。“紅色”是由于花青素的累積，它是RS的已知前體的中間體。
基因載體中的STS基因可以是從含有適當?shù)腟TS基因的植物中分離的mRNA或基因組DNA而獲得的cDNA。任何能夠合成1，2-二苯乙烯系的植物都可以作為候選的原料植物。采用已知STS基因保留區(qū)域的同源低聚引物可以獲得STS基因或STS基因中重要的cDNA。分離的STS DNA可以克隆到常規(guī)的基因載體中，這個載體帶有一個常規(guī)的可選擇標記物(例如抗生素阻抗基因)和一個常規(guī)啟動子該啟動子能引起嵌入的STS DNA的結(jié)構(gòu)表達。
這種方法的特定的優(yōu)選實施方式是，基因載體載著RS基因或編碼RS酶的部分RS基因?qū)е略谵D(zhuǎn)基因植物中以高濃度和組成型水平表達轉(zhuǎn)基因白藜蘆醇。采用自然產(chǎn)生花青素的非轉(zhuǎn)基因植物適合作為轉(zhuǎn)基因RS酶的前體。受體植物是一種紅色的，顯示出高含量的自然產(chǎn)生的花青素和它的前體的植物。
在另一優(yōu)選的實施方式中，受體植物可以是通過組織培養(yǎng)方法再生并分析愈合組織的前體含量。愈合組織和植物幼苗中發(fā)現(xiàn)表達有高濃度和組成型水平的轉(zhuǎn)基因白藜蘆醇合酶(resveratrol synthase enzyme)的前體，這樣的愈合組織和幼苗將被選擇。要考慮到轉(zhuǎn)化的植物(開始表達轉(zhuǎn)基因RS酶并開始耗盡用于生物合成轉(zhuǎn)基因1，2-二苯乙烯的前體)在組織培養(yǎng)過程中，甚至成長到成熟植物都能維持良好的健康。
這里所使用的STS基因指的是編碼各種STS酶的基因族。STS酶催化1，2-二苯乙烯系的不同成員的合成。白藜蘆醇合酶(RS)基因指的是編碼白藜蘆醇合酶(RS enzyme)的STS基因組的特定的成員。RS酶催化4-香豆?；?輔酶A和丙二酰-輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)?，4`，5-三羥基-反-1，2二苯乙烯(白藜蘆醇)紅色用普通的方法就可以確定，可以通過眼睛觀察到，并在本領(lǐng)域被廣泛接受這是眾所共知的。可以作為“紅色”植物的例子包括紅葉萵苣(Lactucasativa)、red bayam(Amaranthus species)、紅甘藍(Brassica oleracea)、紅甜菜(Beta vulgaris)、紫甘藍、紅甜菜根、紅莧屬(red amaranthus)、紅糖甘蔗、紅菠菜、紅西瓜(Citrullus lanatus)、紅草莓(Fragaria species)、黑莓(raspberry)。
這里所使用的“健康”指的是健康的一般狀態(tài)，包括植物的通常范圍，如觀察到的相關(guān)外觀、例如大小和顏色。
這里所使用的“生育能力”指的是植物具有形成能萌芽的種子的能力。


圖1表示白藜蘆醇和柚配基查爾酮的生物合成途徑的最后步驟。
圖2A-D是基因圖質(zhì)粒pBI 121含有RS基因的遺傳圖(圖2A)、R65RS基因的遺傳圖(圖2B)，R14RS基因的遺傳圖(圖2C)和R17RS基因的遺傳圖(圖2D)。
圖3是親水曲線(a)Vitis vinifera cv.Optima RS(pSV21)，(b)Arachishypogaea RS(arqresol)，(c)Pinus sylvestris STS(PSTS1)和(d)Phalenopsissp.BS(pBibsy811)。
圖4A-D表示使用ClustraIW排列的4個存在的葡萄RS cDNA，pSV21，pSV25，pSV368和VVLSTS。用于分離全長Vitis vinifera cv的引物。Red FlameRS基因以框內(nèi)部分標明。
圖5是限制性酶切圖(a)葡萄RS(pSV21，pSV25，pSV368和VVLSTS)(b)葡萄RS基因內(nèi)區(qū)(Vst1-1和Vst2-1)(c)Vitis vinifera cv.Red Flame cDNA(R1，R5和R8)(d)Vitis vinifera cv.Red Flame gDNA(G13，G14和G17)。框內(nèi)區(qū)域是基因內(nèi)區(qū)。
圖6是在推定的葡萄RS cDNA R6，gDNA G14和葡萄RS VVLSTS之間的DNA排列。
圖7是在推定的RS cDNA R12，gDNA G13和葡萄RS pSV21之間的DNA排列。
圖8A-E是HPLC洗提圖RV分析對照(圖8A)，含有質(zhì)粒G14的轉(zhuǎn)基因線(the transgenic lines)(圖.8B)，G17(圖.8C)，R1(圖.8D)和R15(圖.8E)。箭頭表示RV峰。
具體實施例方式
下列例子用于舉例說明本發(fā)明的各方面的情況。
紅葉萵苣中白藜蘆醇的生產(chǎn)Vitis vinifera cv.Red Flame的白藜蘆醇合酶基因是用于這個例子中的1，2-二苯乙烯合酶基因，作為STS基因組中的一員用于克隆和轉(zhuǎn)化。為了易于描述和理解，由轉(zhuǎn)基因RS酶生成的RV和由轉(zhuǎn)基因STS酶生成的1，2-二苯乙烯，分別稱作轉(zhuǎn)基因RV和轉(zhuǎn)基因1，2-二苯乙烯。由于紅葉萵苣含有高含量的花青素色素，而4-香豆?；?輔酶A & 丙二酰-輔酶A是其前體，因而它被選為本例的RS基因受體植物。例如，柚配基查爾酮是花青素生物合成途徑的中間體，4-香豆?；?輔酶A和丙二酰-輔酶A是前體。如圖1所示，4-香豆酰基-輔酶A和丙二酰-輔酶A也是已知的白藜蘆醇(RV)的前體。因此，在轉(zhuǎn)化萵苣中有大量的從RS轉(zhuǎn)化為RV的前體。而且，將萵苣的各種品種自然存在的基因組與為各種已知的RV基因提供同源區(qū)的寡聚核苷酸雜交，檢測RV相關(guān)基因的存在。Southern印跡分析表明沒有雜交發(fā)生，說明在萵苣中沒有內(nèi)源的RS基因，按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方式它適合于作為受體植物。因此，在轉(zhuǎn)基因紅葉萵苣中可以獲得高濃度和組成型水平的RV。
開始，從當?shù)厥袌霁@得一些紅葡萄(培育的Red Flame)。紫外照射這些葡萄10分鐘以誘導白藜蘆醇合酶的轉(zhuǎn)錄并等待12小時后提取紫外輻射的葡萄中的mRNA。我們制備RS基因的5`和3`低聚引物并通過反轉(zhuǎn)錄PCR，引出這個基因的cDNA序列。我們也提取red flame葡萄的基因組DNA并再通過PCR分離基因組RS基因(1基因內(nèi)區(qū))。RS是一種多重基因族。因此，我們對所有的基因繪制基因圖，測定序列并表征。
我們選擇2個全長的cDNA克隆(稱為R1和R65)和2個基因組克隆(稱為G14和G17)并通過花椰菜Mosiac病毒(CaMv)35S啟動子連接它們到表達載體(pBI 121)中。通過BamH1和Sacl限制性酶切點將克隆R65、G14和G17連接到pBI 121中。通過BamH1和EcoR1限制性酶切點將克隆RI連接到pBI 121中。這些質(zhì)粒表達載體隨后轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌(Agrobacterium)中(菌株LBA4404)。采用卡那霉素抗性選擇的方法，選出了載有攜帶RS基因的pBI121的農(nóng)桿菌。因此，我們獲得了如圖2A-D所示的包括4個不同結(jié)構(gòu)的4個不同的農(nóng)桿菌克隆。
同時，我們也篩選了5個不同種類的紅萵苣并評定它們子葉外植體組織培養(yǎng)的再生能力。在組培萵苣中，由于Red Salad Bowl紅葉萵苣品種具有最高和最快的再生能力，從而選擇了它。
試驗重復進行，子葉被切成2平方毫米面積的方塊并在農(nóng)桿菌中孵育30分鐘。然后清洗，我們?yōu)镽ed Salad Bowl所做的組織培養(yǎng)記錄如下。用150mg/L濃度的卡那霉素注射導入介質(zhì)中來選擇可再生殖的幼苗。促使這些幼苗生根并移植到外面生長30到35天，收集葉子用于RNA，DNA，并用HPLC提取白藜蘆醇。
Northern和Southern分析表明RS基因(R1，R65，G14和G17)被表達了。按照白藜蘆醇分析報告對葉子樣品進行了有機溶劑萃取，并采用HPLC進行了分析，從西格瑪化學(Sigma chemicals)買的純白藜蘆醇樣品作為標準樣。
對煙草植物的進行了類似的轉(zhuǎn)化、選擇的實驗，并用普通綠色植物做陽性對照。
HPLC定量分析數(shù)據(jù)表明與煙草對照(最佳是大約0.36微克/克鮮葉)，轉(zhuǎn)基因紅萵苣能夠產(chǎn)生高濃度和構(gòu)成水平的白藜蘆醇(超過4微克/克鮮葉)。轉(zhuǎn)基因紅萵苣能夠產(chǎn)生10倍于轉(zhuǎn)基因煙草的白藜蘆醇，比較時都使用干重。未轉(zhuǎn)基因的植物沒有檢測到白藜蘆醇。從轉(zhuǎn)基因紅萵苣的花青素的定量分析獲得了關(guān)鍵的觀察資料和數(shù)據(jù)，與沒有轉(zhuǎn)化的對照相比，轉(zhuǎn)基因紅萵苣的花青素的含量下降一半。這些數(shù)據(jù)表明一些前體4-香豆酰基-輔酶A和丙二酰-輔酶A通過RS轉(zhuǎn)向產(chǎn)生白藜蘆醇，并且如果我們在這蔬菜中進一步地過量表達白藜蘆醇合酶基因，紅萵苣的白藜蘆醇含量還有逐步增加到一個相當高的水平的潛能。過量表達的方法包括使用更強的結(jié)構(gòu)啟動子或雙倍啟動子，更有效的轉(zhuǎn)化可使用濾過性病毒的最后序列，使用象肌動蛋白啟動子那樣的其他啟動子。這個體系用于其他的有顏色的植物和水果中也顯示出可獲得高含量白藜蘆醇產(chǎn)率的能力。設想我們每天吃100克蔬菜將為我們的身體每天提供大于400微克的白藜蘆醇。因此，我們預見這種新發(fā)明能夠為新的具有抗癌癥、心血管疾病和其他潛在疾病的新的營養(yǎng)蔬菜的開發(fā)開辟新的道路。
下面是詳細的獲得轉(zhuǎn)基因紅葉萵苣的過程選擇和建立受體植物材料4種不同的紅萵苣，Lactuca sativa cv.Canasta，Lollo Rossa，Red Salad Bowl(Novartis種子公司，荷蘭)和Red Rapid(Known-you種子公司，臺灣)檢測它們的紅色和在組織培養(yǎng)中的再生能力。
按照克提斯(Curtis)等1995年，《分子生物學方法》(Methods in MolecularBiology)，44卷，美國修瑪那出版社(Humana Press Inc.USA)，59-70頁的描述進行整個再生過程，有一些修改。每種取10粒種子采用10％次氯酸鈉表面滅菌10分鐘然后用滅菌R.O.水洗三次。然后，將這些種子播種在裝有50ml MS+B5培養(yǎng)基(西格瑪索引號(Sigma Catalogue No.)M-5519)的250ml錐形瓶中并在23±2℃生長，16個小時的光周期，用光強為18umol/s/m2(日光熒光管)照射7天。
播種7天后的秧苗子葉被切開，留下葉柄，除掉子葉的頂端。用針沿著子葉的紋理扎進背軸面(abaxial surface)。子葉漂浮在UM液體培養(yǎng)基中(4.71g/LMS鹽和維生素，30g/l蔗糖，2g/l酪蛋白水解物，2mg/l 2，4二氯苯氧基乙酸(2，4-D，Sigma)，0.25mg/l激動素，9.9mg/l維生素B1HCL，9.5mg/l維生素B6-HCL，4.5mg/l煙酸，5.5g/l植物凝膠(phytagel)，pH 5.8)10分鐘，使它們的傷口表面與培養(yǎng)基接觸。取出子葉并浸泡在UM瓊脂培養(yǎng)基中。外植體在與發(fā)芽種子相同條件下培養(yǎng)兩天。
在UM固體培養(yǎng)基中2天后，子葉轉(zhuǎn)移到SI瓊脂培養(yǎng)基上(4.71g/L MS鹽和維生素，30g/l蔗糖，0.04mg/l NAA(萘乙酸)0.5mg/l芐基氨基嘌呤(BAP)，500mg/l羧芐青霉素，100mg/l氨中噻肟頭孢菌素，150mg/l卡那霉素硫酸鹽，5.5g/l植物凝膠，pH5.8)用背軸面與SI瓊脂培養(yǎng)基接觸。如培養(yǎng)發(fā)芽的種子一樣培養(yǎng)子葉并每21天接種到新鮮的SI瓊脂培養(yǎng)基上。
在49天后，產(chǎn)生愈合組織的外植體和幼苗被轉(zhuǎn)移到50ml的SI瓊脂培養(yǎng)基0.11％(w/v)2[N-嗎啉]乙基磺酸(MES)。
幼苗長到接近1cm高時轉(zhuǎn)移到250ml錐型瓶中，每瓶有50ml的生根瓊脂培養(yǎng)基(4.71g/L MS鹽和維生素，30g/l蔗糖，0.04mg/l NAA(萘乙酸)，150mg/l卡那霉素硫酸鹽，5.5g/l植物凝膠，pH5.8)。這些幼苗在與發(fā)芽的種子相同的條件下培養(yǎng)。
葡萄STS基因的分離和基因載體的結(jié)構(gòu)植物材料商業(yè)上方便的成熟的水果葡萄樹Vitis cv.Red Flame用作分離葡萄樹RS基因的植物材料。
總RNA和基因組DNA的提取0.2g的Vitis cv.Red Flame外皮組織用研缽和槌在液氮中研碎。完整RNA和DNA均采用Knapp和Chandlee描述的相同的方法提取(從蘭花組織的單一樣品中少量制備RNA/DNA生物技術(shù)，(RNA/DNA Mini-Prep from a SingleSample of Orchid Tissue.Bio Techniques)2154-56)，方法有一些修正。2ml提取緩沖液含有3％CTAB；2％PVP；1.42M NaCl；20mM EDTA，pH 8.0；100mM Tris，pH 8.0和5mM維生素C用于提取Vitis cv Red Flame外皮組織的總RNA或gDNA。這些樣品在65℃加熱15分鐘，然后用氯仿萃取除去蛋白質(zhì)。1/5體積的5％CTAB(5％CTAB和0.7M NaCI)加入樣品的液相除去多糖并在65℃加熱15分鐘。用氯仿再萃取一次。加入2體積的冰冷的100％EtOH到樣品的液相中并在-20℃培養(yǎng)15分鐘。在室溫以11,000rpm使用EppendorfrM5410C冷凍離心分離機離心分離15分鐘獲得顆粒狀總RNA和gDNA。這些顆粒用70％EtOH清洗并在EppendorfrM濃縮器中干燥，然后溶解于50μl TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0和1mM EDTA，pH 8.0).中。分離的3μl的總RNA或gDNA和1μl的載入緩沖液(0.025％溴苯酚藍(bromophenol blue)，0.025％二甲苯苯胺(xylene cyanol)，30％甘油(glycerol)于1X TBE)與0.25μg的lambda DNA/HindIII和0.25μg phiX174 DNA/HaeIII標記物一起被載入到1％瓊脂糖上。在100V下進行1/2小時水平凝膠電泳運。使用EtBr染色和Stratagene′sEagle.Eye II Junior系統(tǒng)文件而顯現(xiàn)和計算出所提取的總RNA或gDNA的量和質(zhì)量。
引物的確定在生物技術(shù)信息國家中心(NCBI)網(wǎng)站基因銀行(GenBank)獲得了所有存在的Vitis cv Optima STS(pSV21，pSV25和pSV368)，Vitis cv.LambruscoaFoglia Frastagliata STS(VVLSTS)，Phalenopsis sp.BS(pBibsy811和pBibsy212)，Arachis hypogaea(peanut)STS(arqresol和a00769)和Pinussylvestris(Scots pine)STS(PSTS1和PSTS2)的基因序列。德克薩斯州休斯頓的Baylor醫(yī)學院人類基因組中心使用ClustalW BCM多樣序列檢索裝置，進行了所有同源性檢索。
通過多種現(xiàn)有序列確定了分離全長葡萄藤RS基因使用的引物，這些序列是如圖4A-D所示的pSV21，pSV25，pSV368(Melchior and Kindl，Optima.Arch.Biochem.and Biophy.288552-557，1991)和VVLSTS(Spavoli F.Plant Mol.Biol.24743-755，1994)。
在確定了引物的序列和引物的熔解溫度后，由Gibco BRL常規(guī)寡核苷酸合成部門，美國L.T.I.，進行常規(guī)的商業(yè)合成。
總RNA的逆轉(zhuǎn)錄1μg紫外誘導Vitis cv.Red Flame表皮總RNA、葉總RNA，作為模板允許3′引物-35GSTS2a在65℃熱處理10分鐘。在引物熱處理后，用200個單位/μl SuperscriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Gibco BRL，LTI，)，SuperscriptIITM1X反應緩沖劑，10mM DTT和200uM dNTP，最終體積為50μl，對總RNA逆轉(zhuǎn)錄。在普爾金埃納基因擴增(Perkin Ehner GeneAmp)PCR系統(tǒng)2400上在42℃進行1小時的逆轉(zhuǎn)錄，然后SuperscriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶在70℃15分鐘失活。
采用苯酚Tris-緩沖液和氯仿∶異戊醇(24∶1)萃取提純cDNA。采用1/10體積3M醋酸鈉和2.5體積冰冷100％EtOH沉淀水相。這些顆粒溶解到20μl的滅菌milli-Q水中。
cDNA和gDNA的聚合酶鏈式反應通過聚合酶鏈式反應(PCR)在普爾金埃默基因擴增(Perkin ElmerGeneAmp)PCR系統(tǒng)2400中放大Vitis cv.Red Flame表皮的20μl的cDNA和20ng gDNA。PCR反應在總體積50μl的溶液中進行，包括所提供的含有5個單位/μl Tlaermus flavus(Tfl)DNA聚合酶1X Tfl反應緩沖劑(美國Promega)、200ng/μl 5′引物35GSTS1和200ng/μl 3′引物35GSTS2a，200aM dNTP，1.5mM硫酸鎂并用滅菌millin-Q水加至總體積50μl。
葡萄樹RS基因的PCR放大在92℃進行持續(xù)5分鐘，然后進行40個如下循環(huán)92℃變性1分鐘，55℃退火2分鐘，在72℃擴展2分鐘。更進一步在72℃擴展6分鐘完成PCR。
在1％的瓊脂糖中進行水平凝膠電泳分離和定量分析5μl的PCR反應物。在確定所期望的MW片段存在后，采用1/10體積的10X STE(10mM Tris.Cl，pH8.0；100mM NaCl和1mM EDTA，pH 8.0)，1/10體積的4M NH4OAc和2.5體積的冰冷的100％EtOH對剩余的45ul的PCR反應物進行選擇沉淀。這些顆粒被溶解到TE中用于連接到pGEM-T(+)載體。
克隆到pGEM-T(+)中采用pGEM-T(+)TM載體系統(tǒng)試劑盒(美國Promega)將Vitis cv.Red Flame表皮的cDNA和gDNA PCR產(chǎn)物克隆到pGEM-T(+)載體。采用3個單位/ul的T4 DNA連接酶將這些cDNA和gDNA PCR產(chǎn)物以1∶3(載體插入物)的比率連接到pGEM-T(+)載體，T4 DNA連接酶1X緩沖劑的總體積為10μl，并在16℃培養(yǎng)過夜。
在連接后，10μl的連接反應混合物轉(zhuǎn)化到200μl的XL1-Blue充足的細胞中(美國Stratagene)。它們放進冰中10分鐘，接著在37℃保持5分鐘，然后在冰中1分鐘。加入1ml的普通肉湯，37℃培養(yǎng)1小時。在1小時恢復期后，細胞在11,000rpm 30秒離心分離收集細胞，然后重新懸浮在50μl的普通LB肉湯中。和100μg/ml氨比西林一起50μl的肉湯被涂在1.5％的LB瓊脂平皿上。這些平皿在37℃培養(yǎng)過夜。
在質(zhì)粒小型制備后，遵循制造商推薦的條件采用限制性酶SalI和ClaI(美國NEB Biolabs)進行消化，帶有正確嵌入尺寸的陽性克隆被選擇。
推定的Vitis cv.Red Flame STS基因的特征在推定的Vitis cv.Red Flame STS RS基因被分離后，采用限制性酶切圖(圖5)，序列分析(圖6和7)并測繪的親水曲線(圖3)來描述它們的特征。
限制性酶切圖現(xiàn)有的葡萄藤RS基因(pSV21，pSV25，pSV368和WLSTS)的限制酶圖采用網(wǎng)站W(wǎng)ebcutter 2.0識別。按照所獲得的限制性酶圖，按照制造商的推薦的條件使用Pstl，Kpnl，和HindlI1(NEB，U.S.A.)消化Vitis cv.Red Flame RS基因的推定的克隆。在消化后，在1％瓊脂凝膠上采用100V下水平凝膠電泳45分鐘分析反應產(chǎn)物。采用Eagle-Eye II Junior文件系統(tǒng)(美國Stratagene)觀察凝膠。
序列分析采用雙脫氧核苷酸鏈式終止法分析推定的Vitis cv Red Flame RS基因序列。與正向引物(ssDNA序列)和反向引物(dsDNA序列)一起使用SequenaseTMVersion 2測序試劑盒(瑞典阿默森-法瑪西亞(Amersham-Pharmacia))用于測序反應。反應產(chǎn)物用35S-dATP(美國NEN)標記。使用測序儀S2(SequencingApparatus S2)(美國L.T.I.，Inc.)在50W運行6％的聚丙烯酰胺凝膠。將其暴露在Kodax加強拍攝盒內(nèi)的MR Bio-Max膠卷進行近16小時自動射線照相。用Kodax顯影劑和Kodax定影劑沖洗膠卷。人工讀序列。克隆R65的5`序列的前300堿基表明它屬于葡萄RS基因的PSV21組。
親水曲線親水曲線是由賓夕法尼亞州大學的生物化學和分子生物學支持的親水作圖網(wǎng)站對Vitis cv.Optima RS(pSV21)，Phalenopsis sp.BS(pBibsy811)，Arachishypogaea RS(arqresol)和Pinus sylvestris STS(PSTS1)測畫的。按照Kyte和Dolittle方法作出親水法曲線。
將Vitis cv.Red Flame RS基因克隆到表達載體中4個克隆Vitis cv.Red Flame RS基因被克隆到表達載體pBI 121中。通過BamH1和Sacl限制性酶切，克隆R65、G14和G17被克隆到pBI 121載體中。通過BamH1和EcoR1限制性酶切，克隆R1被克隆到pBI 121中。由構(gòu)成的CaMV35S RNA啟動子驅(qū)動這些基因?？寺≥d體如圖2A-2D所示。
含RS基因結(jié)構(gòu)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中1.備足夠的YEP用于轉(zhuǎn)化時的液體培養(yǎng)基、接種和劃線(restreak)。每次轉(zhuǎn)化需要5ml的液體培養(yǎng)基、需要1ml用于外部生長、20-40ml用于平板接種。(YEP10g細菌蛋白胨，10g細菌酵母萃取液，5g NaCl；10g/l固體植物用瓊脂)2.在28℃2ml YEP中培養(yǎng)農(nóng)桿菌LBA4404菌落O/N。
3.將50ml YEP加入預先準備好的250ml的燒瓶中，在600nm的波長下，以250rpm震蕩OD值達到0.5到1。
4.在冰上冷卻孵育5分鐘，以5,000rpm旋轉(zhuǎn)5分鐘。
5.小心倒出上清液并輕柔的重新嚴格在0℃將離心管中的沉淀用0℃的1ml的20mM的CaCl2溶液中。
6.按0.1ml等分，并分別放入預先冷卻的微型管中。
7.加入1μg DNA到小槽內(nèi)，柔和的徹底的進行攪拌，然后在無水冰乙醇中浴進行冷凍。
8.將小槽放在37℃浴中5分鐘。
9.加入1ml YEP并用柔和方式振動2-4小時培養(yǎng)。
10.離心分離管中以4000rpm離心分離45秒。用移液管尖移走所有的培養(yǎng)基只留下100-200μl，采用吹吸和/或渦流將細胞重新懸浮在留下的介質(zhì)中并接種到25ug/ml卡那霉素。在28℃培養(yǎng)。菌落應該在2-3天出現(xiàn)。
由農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化紅萵苣1.用10％W/V次氯酸鈉將萵苣種子、VarRed Salad Bowl表面滅菌10分鐘，并用清潔的蒸餾水清洗3次。
2.在含有發(fā)芽培養(yǎng)基9cm直徑的陪氏培養(yǎng)皿中使種子發(fā)芽(30個種子/培養(yǎng)皿)。以18umol/s/m2的強度照射下，在24℃培養(yǎng)16小時。
3.含二元載體pBI121結(jié)構(gòu)子(R1，R65，G14和G17)的根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404在LB培養(yǎng)基中，pH 7和50mg/L濃度的卡那霉素硫酸鹽，2mg/L濃度的四環(huán)素-鹽酸的條件下以210rpm振蕩培養(yǎng)1天。
4.將20ml的UM瓊脂培養(yǎng)基倒入9cm直徑的陪氏培養(yǎng)皿中并固化。
5.將一張無菌的7cm直徑的沃特曼(Whatman)濾紙在液體UM中浸泡并放在UM瓊脂培養(yǎng)基表面上。
6.切除7天大的幼苗的子葉，留下完整的葉柄，但是去掉子葉的頂端。用一根細針刻離軸邊。用解剖刀，在子葉的橫向表面制作1mm間隔的淺的切口。在農(nóng)桿菌液體培養(yǎng)基中漂浮子葉10分鐘。除了不用農(nóng)桿菌外進行相同的條件的對照實驗。
7.取出子葉并用滅菌濾紙吸干，轉(zhuǎn)移到預備好的UM培養(yǎng)皿上(每培養(yǎng)皿10個子葉)。在與使種子發(fā)芽相同的條件下培養(yǎng)2天。
8.如下制備實驗平板9.A..沒有農(nóng)桿菌接種的對照移植體i.SI培養(yǎng)基ii.SI培養(yǎng)基+100mg/L卡那霉素硫酸鹽iii.SI培養(yǎng)基+150mg/L卡那霉素硫酸鹽B.用農(nóng)桿菌接種移植體i.SI培養(yǎng)基+100mg/L卡那霉素硫酸鹽ii.SI培養(yǎng)基+150mg/L卡那霉素硫酸鹽
10.將外植體轉(zhuǎn)移到SI培養(yǎng)基，將子葉的葉柄的末端插入培養(yǎng)基中大約2mm。象使種子萌芽那樣進行培養(yǎng)并每17天更換新鮮的SI瓊脂培養(yǎng)基做再培養(yǎng)。
11.40天以后，轉(zhuǎn)移這些已經(jīng)產(chǎn)生愈合組織和幼芽的外植體到250ml燒瓶中，每個燒瓶含有60ml SI瓊脂培養(yǎng)基和0.11％w/V的羧芐青霉素。每個燒瓶4個外植體，在80umol/s/m2的高光強下培養(yǎng)。
12.當外植體的幼芽長到1cm時轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，在80umol/s/m2的高光強下培養(yǎng)。
13.當生根后，小心的從這些容器中取出植物，清洗掉瓊脂并將這些植物移植到10英寸的裝滿蛭石的罐中。將這些植物裝進透明的聚乙烯袋中3天然后除去這些袋。植物在完全日光下生長并用Graviota施肥。在35天后將這些植株進行Northern，Southern化驗，再經(jīng)過有機溶劑提取后，用高壓液相色譜分析白藜蘆醇的產(chǎn)率。
轉(zhuǎn)基因植物的選擇帶有農(nóng)桿菌的子葉在刺破后攜帶這些結(jié)構(gòu)。然后子葉浸泡在UM瓊脂培養(yǎng)基中(15個子葉/培養(yǎng)皿)并在23±2℃，光周期為16小時，18μmol/s/m2的光強(日光熒光管)的條件下培養(yǎng)2天。
兩天后，這些子葉植入SI瓊脂培養(yǎng)基，使離軸面與培養(yǎng)基接觸。子葉在上述條件下生長。為了顏色選擇，子葉每21天在新鮮的SI瓊脂培養(yǎng)基中進行再次培養(yǎng)。約1mm的小幼芽并且顏色是紅色的需要棄去，而粉紅色和綠色的幼芽植入UM培養(yǎng)基2天。在這個階段粉紅或綠色的幼芽變?yōu)榧t色的也去掉，余留的粉紅色或綠色的在新鮮的SI瓊脂培養(yǎng)基中再培養(yǎng)。這些植物長到1cm高時移植到生根瓊脂培養(yǎng)基中。
卡那霉素選擇，在植入SI瓊脂培養(yǎng)基中1周后，子葉轉(zhuǎn)移到SI+150μg/ml卡那霉素硫酸鹽瓊脂培養(yǎng)基中。每4周再培養(yǎng)到SI+150μg/ml卡那霉素硫酸鹽瓊脂培養(yǎng)基中。
采用上述步驟，Red Flame RS基因被成功的克隆到紅萵苣中并在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的白藜蘆醇.采用上述方法獲得的結(jié)果如下所示。
受體植物材料檢驗4種變種的Lactuca sativa的花青素含量和在體外的再生能力。白藜蘆醇的前體(也就是4-香豆?；?輔酶A和丙二酰-輔酶A)的含量能夠從花青素的含量推導出來，因為4-香豆?；?輔酶A和丙二酰-輔酶A是這兩種生物合成途徑的共同前體。4-香豆?；?輔酶A和丙二酰-輔酶A可以被本領(lǐng)域有經(jīng)驗的人員直接測量出來，也可以考慮本發(fā)明的范圍。
表1顯示子葉在UM培養(yǎng)基中2天后的紅色分析，在SI培養(yǎng)基中14天后愈傷組織的顏色和Lactuca sativa cv.Canasta，Lollo Rossa，Red Rapid和RedSalad Bowl在SI培養(yǎng)基中37天后的再生能力。
如下表1所示，在UM培養(yǎng)基中2天后，Lactuca sativa cv.Red Salad Bowl的子葉顯示出最濃的紅色，Lactuca sativa cv.Lollo Rossa的子葉顯示最淡的紅色。SI培養(yǎng)基中2星期后形成的愈傷組織表明Lactuca sativa cv.Canasta，Lollo Rossa和Red Rapid有較多淺綠色的愈傷組織，而其它顏色的較少。至于Lactuca sativa cv.Red Salad Bowl的愈傷組織，紅色的比其他顏色的比例更高。只有Lactuca sativa cv.Red Rapid和Red Salad Bowl有粉紅、深紅(dirty-red)和白色的愈傷組織。
表1

圖例±表示＜30％；+表示30％-50％；++表示50％-70％；+++表示70％-90％；++++表示＞90％2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)，一種植物激素引起花青素的形成。高的花青素產(chǎn)率是選擇用于轉(zhuǎn)化的變種植物的標準之一。更高的花青素含量意味著更多的可用的基礎原料(4-香豆酰基-輔酶A和丙二酰-輔酶A)。因此，當STS基因被轉(zhuǎn)化到紅萵苣時，基因產(chǎn)物有充足的基礎原料供使用。這使轉(zhuǎn)基因植物的顏色選擇更方便，因為如果子葉沒有轉(zhuǎn)化部分是紅的，那么顏色變成淺粉紅色或深粉紅色將更突出。而且，Lactuca sativa cv.Red Salad Bowl的子葉全身顏色均勻(圖3a)再生能力方面，大于90％的Lactuca sativa cv.Red Salad Bowl愈傷組織再生為幼苗。與Lactuca sativa cv.Canasta，Lollo Rossa和Red Rapid相比，Lactucasativa cv.Red Salad Bowl有最高的再生能力。Red Rapid有接近70％到90％的愈傷組織再生成幼苗。這縮短了需要選擇轉(zhuǎn)基因植物的時間。因此，Lactuca sativacv.Red Salad Bowl被選擇為Vitis vinifera cv.Red Flame RS基因的轉(zhuǎn)化植物材料。
Red Flame葡萄的RS基因引物的確定從Vitis vinifera cv.Optima(pSV21，pSV25和pSV368)和Vitis vinifera cv.Lambruscoa Foglia Frastagliata(VVLSTS)分離的現(xiàn)有的葡萄RS cDNA的ClustalW序列表明它們非常相似，有87.5％的高度同源性(圖4)。在5`和3`末端序列的共有區(qū)被確定以從Vitis vinifera cv.Red Flame中分離完整的基因。確定的5`引物是5′GTC GACCTT CCT CAA CTT AAT CTT 3′(標注為35GSTS1)3′引物是5′ATC GATTTC CTT CAC TTA ATT TGT 3′(標注為35GSTS2a)。它們在圖4中35GSTS1含有一個SalI連接，而35GSTS2a含有ClaI連接，它們均為加重的紅色兩者都在5′末端。
Vitis vinifera cv.Red Flame RS基因的cDNA和gDNA推定克隆在RT和PCR后獲得了MW1.3kb的Vitis vinifera cv.Red Flame cDNA。在用SalI和ClaI.While消化后，在pGEM-T(+)的18個克隆中，有12個克隆含有范圍從0.9kb到1.6kb的嵌入尺寸。gDNA獲得了1.6kb的片段。用Sall和Clal消化的所有的18克隆含有1.5kb到1.6kb的嵌入尺寸。
限制酶切圖Vitis vinifera cv.Red Flame的12個cDNA克隆和18個gDNA克隆用Pstl，KpnI和HindIII消化。Vitis vinifera cv.Red Flame的cDNA的3個克隆與現(xiàn)有的葡萄RS基因有相同的限制酶圖(圖5a)。3個cDNA克隆的限制酶切圖，如圖5C所示RI、R5和R8。RI的尺寸是1.3kb，它擁有1Kpnl位點、并沒有Pstl和Hindlll位點。R5有1.2kb的尺寸和對應于Pstl，Kpnl和Hindlll位點各一個(表2)。這3克隆和3個其他的克隆(R3，46，R12)的限制酶圖沒有顯示任何與現(xiàn)有的葡萄RS的類似處，并進行序列分析。
Vitis vinifera cv.Red Flame的gDNA克隆的嵌入的MW列表于表2。18個克隆中，4個克隆的尺寸是1.5kb，5個克隆的尺寸是1.6kb。所有的克隆有Pstl和Kpnl位點，只有1個克隆(G13)有Hindlll位點。G13、G14和G17的限制酶切圖示于圖5d而且它們彼此類似。所有這9個克隆進行序列分析。
表2

MW(kb)和存在于Vitis vinifera cv.Red Flame cDNA和gDNA中的Pstl，Kpnl和HindIII的限制酶切圖。圖例√--位點存在，×--位點不存在序列分析前300bp序列分析和使用BLAST程序(網(wǎng)址http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，表明cDNA克隆，RI和R5與pSV25有94.5％的同源性如表3所示。但是R5缺失85bp。R3，R65和R12有同樣的序列并與pSV21分享97.5％的同源性。R6與VVLSTS有99％的同源性，但是缺失82bp如圖6所示。
Vitis vinifera cv.Red Flame的gDNA克隆G13與PSV21有93％的同源性(表3)。4gDNA克隆(G5，G9，G14和G17)如表3所示，與VVLSTS的同源性為99％。在前300bp序列分析后，這些4gDNA克隆發(fā)現(xiàn)是相同的序列。
表3

Vitis vinifera cv.Red Flame推定的STS克隆cDNA和gDNA與現(xiàn)存的葡萄RS基因(pSV21，pSV25，pSV368和VVLSTS)同源性水平由于與Psv21和VVLSTS具有同源性的克隆從cDNA和gDNA分離出來，在這些克隆進行了排列。圖7中，R12和G13是類似的，但相互并不相同。R6和G14也獲得了同樣的結(jié)果(圖6)。
親水性曲線圖6的Vitis vinifera cv.Optima RS(pSV21)，Phalenopsis sp.BS(pBibsy811)，Arachis hypogaea RS(arqresol)和Pinus sylvestris STS(PSTS1)的親水性曲線彼此相似。它們被分為3個主要的區(qū)域。憎水N-末端(氨基酸1至127)，親水的中間部分(氨基酸128 to 313)和親水、增水混合部分的C-末端(氨基酸314至392)。氨基酸的位置是建立在pSV21的基礎上的。
從Vitis vinifera cv.Red Flame的克隆pUCSTS-R1，R3和R12是全長cDNASTS基因。根據(jù)序列分析，它們與pSV25(R1)和pSV21(R3，和R12)同源。這些cDNA克隆MW并不對應于所期望的MW，當使用5′(35GSTS1)和3′(35GSTS2a)引物時這個區(qū)域是1.179kb到1.237kb。但是，它們對應于pSV21，pSV25，pSV368和VVLSTS的MW，分別為1.323kb，1.3kb，1.251kb和1.547kb(Melchio和Kindl，Optima..Arch.Biochem.and Biophy.288552-557，1991 andSpavoli F.，Plant Mol.Biol.24743-755，1994)。
此外，R1，R3和R12的限制酶切圖與現(xiàn)存的葡萄RS基因不同(圖5a和圖5c)。這種差別可解釋為采用了不同變種植物。
pUCSTS-R5和R6的序列分析說明分別有85bp和82bp的缺失。雖然R5與PSV25同源，R6與VVLSTS同源，這些缺失引起了開放讀框的移動。使用3密碼子翻譯氨基酸，在開放讀框的移動，將影響功能性蛋白的產(chǎn)生。因此，這2個克隆被認為是假性克隆。
分離的gDNA克隆pUCSTS-G5，G9，G13，G14和G17是全長的Vitisvinifera cv.Red Flame STS基因。這些克隆的尺寸在1.5kb到1.6kb的范圍內(nèi)，對應于從Vitis vinifera cv.Optima(Wiese W.，Plant Mol.Biol.26667-677，1994)分離的gDNA STS基因Vst1和Vst2。
由于除了基因內(nèi)區(qū)的序列，Vst1和Vst2的序列并不可利用，gDNA STS克隆的序列分析不可能與Vst1和Vst2進行比較。但是Vst1與pSV25有98％同源(Wiese W.，Plant Mol.Biol.26667-677，1994)。因此，gDNA STS克隆也能夠與pSV25進行比較。根據(jù)序列分析，獲得的gDNA克隆與pSV21(G13)或VVLSTS(G5，G9，G14和G17)同源。這再一次能夠解釋為使用了不同的變種植物。另一個原因可能是類似于Psv25的基因沒有在這個實驗中分離。
Vitis vinifera cv.Red Flame的gDNA RS克隆的限制酶切圖與現(xiàn)存的RS基因(圖5a，5b和5d)沒有任何相似之處。使用不同的變種植物可能是這種結(jié)果的原因。
由于Vitis vinifera cv.Red Flame的cDNA和gDNA的全長序列還沒有測序，不可能畫出這些克隆的RS基因水療法曲線。然而，如圖3所示，Vitis vinifera cv.Optima STS(pSV21)，Phalenopsis sp.BS(pBibsySll)，Arachis hypogaea STS(arqresol)和Pinus sylvestris STS(PSTS1)的親水曲線，均相似地具有3個主要的區(qū)域。Preisig-Muller R.Biochem.368349-8358，1997，說明STS和BS的N-末端是用來進行底物的識別或特異性，而C-末端是決定產(chǎn)物的形成。不同植物的STS(s)被完全保存下來。而且盡管Vitis vinifera cv.Optima(pSv21)和Arachis hypogaea RS(arqresol)產(chǎn)生白藜蘆醇，而Pinus sylvestris STS(PSTS1)產(chǎn)生二羥苯乙烯(Schanz S.，F(xiàn)EBS.313(1)71-74，1992)，這3個植物的STS(s)是一樣的。
STS和BS也保存下來。盡管它們的親水曲線是一樣的，但是STS利用4-香豆?；?輔酶A和丙二酰-輔酶A而BS利用m-羥基苯丙酰-輔酶A和丙二酰-輔酶A。根據(jù)Fliegmann J.(Plant Mol.Biol.18489-503，1992)，STS能夠利用不同于它們的原先優(yōu)選的底物，但是在較低的速率下(Km值更低)。這也許可以為相似的親水曲線提供解釋。
轉(zhuǎn)化植物的分析分析帶有各種基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化植物的RV濃度。結(jié)果如表4所示。
表4

花青素的含量也被分析了。表5表明花青素含量以A530/g表達作為和轉(zhuǎn)基因L.sativa cv Red Salad Bowl的對照。
表5

分析表明當植物種植在充滿陽光和視覺可見的情況下，花青素含量降低了。因此，轉(zhuǎn)基因萵苣中的花青素含量與白藜蘆醇的產(chǎn)率成反比。
含高含量(＞3ug/g.f.w.)白藜蘆醇的紅萵苣的種子不能成活。更低的RV含量(＜1.5ug/g.f.w.)，的種子能夠成活。這些轉(zhuǎn)化紅萵苣植物能生產(chǎn)含有濃度接近1ug/ml(用轉(zhuǎn)化植物表達接近1.2ugRV/g.f.w.得到未沖稀的汁液)到接近4ug/ml的液汁(用轉(zhuǎn)化植物表達接近4.8ugRV/g.f.w.得到未沖稀的汁液)的RV。這些液汁可以直接飲用，消費者可以吸收RV，已知由于在植物中自然表達是被糖基化的RV并易于被身體吸收。另外，轉(zhuǎn)基因植物也可以作為干的水果或蔬菜消費，這樣每次有更多的RV能夠被攝入。
基因的穩(wěn)定性由RV的表達量為＜1.5ug/g.f.w.的轉(zhuǎn)基因植物的種子進行再繁殖顯示出轉(zhuǎn)基因至少2代是穩(wěn)定的。
用RV的表達量＞3ug/g.f.w.的轉(zhuǎn)基因植物進行組培再繁殖表明體外繁殖10代后仍舊是穩(wěn)定的。圖8A-E表示不同轉(zhuǎn)基因植物的HPLC的RV分析。HPLC分析方法如下從推定L.sativa cv Red Salad Bowl和N.tabacum cv Xanthi取白藜蘆醇按照海恩R.(Hain R.)(植物分子生物學(Plant.Mol.Biol.)15325335，1990)和塞羅提E.(Celotti E.)(光譜雜志(J.Chromatogr.)A.730；47-52，1996)的描述并作某些修改，從推定的轉(zhuǎn)基因L.sativa cv Red Salad Bowl和N.tabacum cvXanthi萃取白藜蘆醇。
從推定的轉(zhuǎn)基因L.sativa cv Red Salad Bowl和N.tabacum cv Xanthi上取5g新鮮的葉子在液氮中用研缽和杵搗碎成粉末。在粉末融化之前，室溫下以每克鮮重加入1ml甲醇(MeOH)萃取24小時。在甲醇萃取后，漿液以7000rpm離心分離15分鐘，去除細胞殘渣。2體積的milli-Q水加入到上清夜中。這溶液和9ml的乙酸乙酯混合15秒。試管在4℃冷卻3分鐘，然后放置在-20℃中5分鐘。試管的冷卻促進了有機相和水相的分離。有機相被回收了，而水相用6ml的乙酸乙酯進一步萃取兩次。有機相被回收，并加入無水硫酸鈉以除去痕量的水份。水相用于測定花青素，有機相在EppendorfrM真空濃縮器中濃縮。加入50μg的甲醇以干燥樣品。
HPLC分析采用Shimadzu model CBM-10A反相HPLC系統(tǒng)(日本)分析推定的轉(zhuǎn)基因樣品。6ng/μl的化學合成的反-白藜蘆醇(美國西格瑪公司(Sigma，U.S.A.))作為標準。50μl的提取樣品用水∶冰醋酸∶乙腈(75∶5∶20)作為流動相通過C18柱(125mm×5mm)。流速設定為0.5ml/min而且二極管排列UV探測器(SPD-M10AVP)設定為306nm。白藜蘆醇的保留時間大約為17分鐘。
使用可見光分光光度計測量花青素按照Mancinelli(1990)描述的方法作了一些修正，測量推定的轉(zhuǎn)基因L.sativa cv Red Salad Bowl和N.tabacum cv Xanthi中的花青素。由于花青素溶解在水相中，其提取方法可仿照溶解在有機相中的白藜蘆醇來確定。1ml的水相采用Du650分光光度計(美國貝克曼公司(Beckman，U.S.A.))在光程為10mm透明容器中讀數(shù)。確定吸收峰在530nm和657nm并采用公式(A530-0.25A657)/(以克計算鮮重)計算花青素的含量?；ㄇ嗨貪舛扔肁530/g表示?；ㄇ嗨卦?30nm測量吸收峰。而657nm的吸收峰測量酸性甲醇中葉綠素的降解產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種紅色轉(zhuǎn)化植物，其中包括一個轉(zhuǎn)化的基因載體，所述的載體包含分離或合成的DNA編碼的1，2-二苯乙烯合酶基因。
2.按照權(quán)利要求1所述的紅色轉(zhuǎn)化植物，其中所述的1，2-二苯乙烯合酶基因編碼白藜蘆醇合酶基因。
3.按照權(quán)利要求1所述的紅色轉(zhuǎn)化植物，其中所述的基因載體是一種質(zhì)粒，所述的1，2-二苯乙烯合酶基因是白藜蘆醇合酶基因。
4.按照權(quán)利要求1所述的紅色轉(zhuǎn)化植物，其中所述的紅色轉(zhuǎn)化植物是紅葉萵苣。
5.按照權(quán)利要求1所述的紅色轉(zhuǎn)化植物，其中所述的轉(zhuǎn)化植物是能夠產(chǎn)生可繁育的種子。
6.一種由1，2-二苯乙烯合酶基因或部分1，2-二苯乙烯合酶基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化植物，所述的1，2-二苯乙烯合酶基因編碼特定的1，2-二苯乙烯合酶，所述的特定的1，2-二苯乙烯合酶在所述的轉(zhuǎn)化植物中合成組成型水平的特定的1，2-二苯乙烯，所述的轉(zhuǎn)化植物在自然未轉(zhuǎn)化狀態(tài)時含有高水平的所述的1，2-二苯乙烯合酶基因的前體。
7.按照權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化植物，其中所述的1，2-二苯乙烯合酶基因是白藜蘆醇合酶基因，所述的特定的1，2-二苯乙烯合酶是白藜蘆醇合酶，所述的特定的1，2二苯乙烯是白藜蘆醇。
8.按照權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化植物，其中所述的轉(zhuǎn)化植物是紅葉萵苣。
9.一種生產(chǎn)含有由特定的轉(zhuǎn)基因1，2-二苯乙烯合酶(STS)轉(zhuǎn)化于其中的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述的轉(zhuǎn)基因植物從受體植物獲得包括a)選擇含有高水平的轉(zhuǎn)基因STS酶前體的受體植物；b)提供一個基因載體含有STS基因或編碼所述特定的STS酶的部分STS基因，為STS基因或部分STS基因提供一個適于在受體植物中STS酶組成型表達的啟動子；c)轉(zhuǎn)化基因載體到受體植物中，并d)選擇并培育對含有高濃度和組成型水平的轉(zhuǎn)基因1，2-二苯乙烯的轉(zhuǎn)基因植物。
10.按照權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的選擇步驟進一步包括培育所述的受體植物在組織培養(yǎng)系統(tǒng)作為愈合組織培養(yǎng)，并分析所述的愈合組織培養(yǎng)的所述STS酶的前體含量。
11.一種含有轉(zhuǎn)基因白藜蘆醇合酶(RS)酶的轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法，所述的轉(zhuǎn)基因植物從受體植物獲得包括a)選擇含有高水平的4-香豆?；?coumaroyl)-輔酶A和丙二酰-輔酶A的受體植物；b)提供一個基因載體其包含有RS基因或編碼RS酶的一部分RS基因，為RS基因或部分RS基因提供一個適于在受體植物中RS酶組成型表達的啟動子；c)轉(zhuǎn)化基因載體到受體植物中，并d)選擇并培育含有高濃度和組成型水平的轉(zhuǎn)基因白藜蘆醇的轉(zhuǎn)化植物。
12.一種含有轉(zhuǎn)基因白藜蘆醇合酶(RS)酶的轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法，所說的轉(zhuǎn)基因植物從受體植物獲得包括a)選擇可食用部分含有高濃度和組成型水平花青素的受體植物；b)提供一個基因載體含有RS基因或編碼RS酶的部分RS基因，為RS基因或部分RS基因提供一個適于在受體植物中RS酶組成型表達的啟動子；c)轉(zhuǎn)化基因載體到受體植物，并d)選擇并培育轉(zhuǎn)化植物在可食用部分含有高濃度和組成型水平的白藜蘆醇。
13.按照權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的受體植物是紅葉萵苣。
14.一種含有植物可食用部分產(chǎn)生的未發(fā)酵汁的飲料，所述的汁含有至少1μg/ml的白藜蘆醇。
15.干的水果和蔬菜每克干重中含有至少1μg的白藜蘆醇。
16.粉末植物提取物每克干重中含有至少1μg白藜蘆醇。
全文摘要
一種至少轉(zhuǎn)化了一種1，2－二苯乙烯合酶(STS)基因結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物，和由轉(zhuǎn)基因STS酶構(gòu)成的相應的1，2－二苯乙烯合酶的產(chǎn)品，同時保持正常的生理生長。優(yōu)選的實施例包含將轉(zhuǎn)基因白藜蘆醇合酶(RS)轉(zhuǎn)化到紅色的植物中。這種生產(chǎn)方法包括選擇含有高含量的轉(zhuǎn)基因RS酶的前體的受體植物。
文檔編號C12N15/09GK1606623SQ01819232
公開日2005年4月13日 申請日期2001年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月21日
發(fā)明者謝德發(fā), 黃愛玲 申請人:南洋理工大學