專利名稱：分離的結合hla-c分子的肽及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可用于細胞免疫學領域的肽。本發(fā)明更具體涉及與細胞表面HLA分子結合的肽。這些肽中至少有一些當與HLA分子形成復合物時，可以誘導細胞裂解性T細胞的激活。本發(fā)明還涉及這些肽在例如識別HLA-Cw3和HLA-Cw6陽性細胞刺激T細胞，鑒定特殊T細胞的存在，以及鑒定細胞裂解性T細胞本身的存在等方面的用途。
背景技術：
宿主生物對癌細胞的識別或喪失識別，對這一問題的研究已經朝很多不同方向進行。對這一領域的了解需要基礎免疫學和癌病學的相關知識。
對小鼠腫瘤進行的早期研究顯示，這些展示在表面的分子導致了腫瘤細胞在被移植入同系動物體內后受到排斥。這些分子被受體動物的T細胞所識別，激發(fā)細胞裂解性T細胞應答，并伴有對移植細胞的裂解。這一證據最初是通過由化學致癌劑，如甲基膽蒽，體外誘導的腫瘤而獲得的。由腫瘤表達的激發(fā)T細胞應答的抗原對每種腫瘤而言不同。見Prehn，et al.，J.Natl.Canc.Inst.18769-778(1957)；Klein et al.，Cancer Res.201561-1572(1960)；Gross，Cancer Res.3326-333(1943)；Basombrio，Cancer Res.302458-2462(1970)，其中教導了用化學致癌劑誘發(fā)腫瘤，以及細胞表面抗原的差別。這類抗原被稱作“腫瘤特異性移植抗原”或“TSTA”。在觀察到化學致癌劑刺激使這類抗原呈遞之后，體外通過紫外線照射誘導的腫瘤也觀察到類似的結果，見Kripke，J.Natl.Canc.Inst.53333-1336(1974)。
雖然在上面描述的腫瘤類型中觀察到T細胞介導的免疫應答，自發(fā)性腫瘤一般認為是非免疫原性的。這些腫瘤一般認為不呈遞能在攜帶腫瘤的個體中激發(fā)針對該腫瘤的應答的抗原。見Hewitt，et al.，Brit.J.Cancer33241-259(1976)。呈遞tum抗原的細胞系是通過對小鼠腫瘤細胞或細胞系進行誘變而獲得的免疫原性變體，見Boon et al.，J.Exp.Med.1521184-1193(1980)，其引入本文作為參考。詳細地說，tum抗原是通過對腫瘤細胞進行突變得到的，這些腫瘤細胞在同系小鼠中不產生免疫應答，會形成腫瘤(即tum+細胞)。這些tum+細胞被誘變后，會被同系小鼠排斥，無法形成腫瘤(因此成為tum-)。見Boon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74272(1977)，其全文引入作為參考。許多腫瘤類型都有此現象。見Frost et al.，Cancer Res.43125(1983)。似乎Tum-變體無法形成進行性腫瘤，因為它們啟動免疫排斥應答。支持這一假說的證據包括腫瘤的tum-變體，即通常不形成腫瘤的那些，在用亞致死量放射線照射從而使免疫系統(tǒng)受到抑制的小鼠體內可以誘發(fā)腫瘤(Van Pel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 765282-5285(1979))；腹腔內注射的肥大細胞瘤p815的tum-細胞在12-15天內呈指數擴增，但在淋巴細胞和巨噬細胞中只需幾天就被清除了(Uyttenhove，et al.，J.Exp.Med.1521175-1183(1980))。進一步的證據包括小鼠獲得免疫記憶，使得它們能夠抵抗同一變體的進一步攻擊，即便當進一步攻擊后給予免疫抑制量的輻射時也是如此(Boon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74272-275，1977；Van Pel et al.，同上；Uyttenhove，et al.同上)。進一步研究發(fā)現，當對自發(fā)腫瘤進行誘變時，可產生能夠引發(fā)應答的免疫原性變體。的確，這些變體能夠引發(fā)針對初始腫瘤的免疫保護性應答。見VanPel et al.，J.Exp.Med.1571992-2001，1983。因此，在作為同系排斥應答的目標的腫瘤中誘發(fā)所謂“腫瘤排斥抗原”的呈遞是可能的。用外源基因轉染自發(fā)腫瘤也得到類似的結果。見Fearon et al.，Cancer Res.482975-1980(1988)。
目前已找到一類抗原，它們被呈遞在腫瘤細胞表面，被細胞裂解性T細胞所識別，導致細胞裂解。這類抗原在后文中被稱作“腫瘤排斥抗原”或“TRA”。TRA可以誘發(fā)或不誘發(fā)抗體應答。對這些抗原的研究進展目前僅達到通過體外細胞裂解性T細胞進行特征性研究的水平，即利用細胞裂解性T細胞的具體亞類(CTL)來鑒定抗原的水平。這一亞類在對呈遞的腫瘤排斥抗原進行識別后增殖，使呈遞腫瘤排斥抗原的細胞裂解。特征性研究鑒定了能特異性裂解表達腫瘤排斥抗原的細胞的CTL克隆。這類工作見Levy et al.，Adv.Cancer Res.241-59(1977)；Boon et al.，J.Exp.Med.1521184-1193(1980)；Brunner et al.，J.Immunol.1241627-1634(1980)；Maryanski et al.，Eur.J.Immunol.1241627-1634(1980)；Maryanski et al.，Eur.J.Immunol.12406-412(1982)；Palladino et al.，Cancer.Res.475074-5079(1987)。其他類型的被CTL識別的抗原也需要此類分析，包括次要組織相容性抗原，男性特異性H-Y抗原，稱為tum-的一類抗原，如本文所述。
上述主題的一個例子是腫瘤P815。見DePlaen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852274-2278(1988)；Szikora et al.，EMBO J.91041-1050(1990)；Sibille et al.，J.Exp.Med.17235-45(1990)，其引入本文作為參考。P185腫瘤是肥大細胞瘤，用甲基膽蒽在DBA/2小鼠中誘導，既作為體外腫瘤也作為細胞系加以培養(yǎng)。P815系在誘變后產生許多tum變體，包括P91A(DePlaen，同上)、35B(Szikora，同上)，P198(Sibille，同上)等變體。與腫瘤排斥抗原相反(這是一個關鍵區(qū)別)，tum抗原僅在腫瘤細胞誘變后出現。腫瘤排斥抗原出現在未經誘變的腫瘤的細胞表面。因此，根據文獻記載，一個細胞系可以是tum+，例如稱為P1的細胞系，而且可被刺激產生tum-變體。由于tum-表型與親本細胞系的不同，我們會看到tum細胞系的DNA與tum+親本細胞系的DNA有所不同，我們可以利用這一差別以定位tum-細胞中的目的基因。結果發(fā)現，tum變體例如P91A，35B和P198的基因在其編碼區(qū)域與正常等位基因相比具有點突變。見Szikora和Sibille，同上；以及Lurquin et al.，Cell 58293-303(1989)。本發(fā)明的TRA沒有這種情況。這些文章還證實，來源于tum-抗原的肽由H-2dI類分子呈遞，被CTL識別。P91A由Ld呈遞，P35由DL呈遞，P198由Kd呈遞。
PCT申請PCT/US92/04354(1992年5月22日提交)已轉讓給本申請的同一受讓人，其中教導了一類人腫瘤排斥抗原前體編碼基因，稱為MAGE家族。Van der Burggen et al.Science 2541643(1991)也探討了這些基因中的某些基因。現在知道，MAGE家族中的各種基因都可在腫瘤細胞中表達，它們可以作為診斷此種腫瘤的標記物，以及用于本發(fā)明的其它用途。見Traversari et al.，Immunogenetics 35145(1992)；van der Bruggen et al.，Science2541643(1991)，以及De Plaen，et al.，Immunogenetics 40360(1994)。對蛋白的加工和呈遞于細胞表面的機制現在已有相當多的文獻記載。對這一領域的發(fā)展的粗略回顧請參見Barinaga，“Getting Some‘Backbone’How MHCBinds Peptides，”Science 257880(1992)；Fremont et al.，Science 257919(1992)；Matsumura et al.，Science 257927(1992)；Engelhard，Ann.Rev.Immunol.12181-207(1994)；Madden，et al.，Cell 75693-708(1993)；Ramensee，et al.，Ann.Rev.Immunol.11213-244(1993)；Germain，Cell 76287-299(1994)。這些文章都指出，與MHC/HLA分子結合的肽一般需9個氨基酸長(九肽)，同時也指出了第二和第九殘基在九肽中的重要性。對H-2Kb來說，錨定殘基為八聚體的第5位和第8位，對H-2Db來說，它們是九肽的位置5和9，而HLA-A1的錨定殘基是九肽的位置3和9。一般而言，對HLA分子來說，位置2和9是錨定殘基。
對MAGE家族的基因的研究顯示，一種特殊的九肽確實呈現在某些腫瘤細胞的表面，而該九肽的呈遞要求呈遞分子是HLA-A1。MAGE-1腫瘤排斥抗原(TRA或九肽)復合物導致了由細胞裂解性T細胞(CTL)對呈遞該抗源的細胞進行裂解。
美國專利5,405,940(1992年8月31日提交)和5,571,711中的研究發(fā)現，當將各種MAGE基因的同源區(qū)域與MAGE-1基因編碼相關九肽的區(qū)域進行比較時，發(fā)現有很大的同源性。這導致了在本文公開并要求權利的本發(fā)明的一個方面，即一個九肽家庭，其中每種九肽都具有相同的N末端和C末端氨基酸。這些九肽可用于各種用途，包括單獨或與載體肽聯(lián)合用作免疫原。九肽的長度足以形成一個抗原性表位，由它激發(fā)出的抗體可用來鑒定此九肽，無論該九肽單獨存在，還是作為一個長肽的一部分時均是如此。
此前對相關文獻的調查顯示，各種肽(通常為八、九或十個氨基酸長)與MHC分子形成復合物，并呈遞由細胞裂解性T細胞識別的標靶。針對黑素瘤進行了很多研究，被細胞裂解性T細胞所識別的黑素瘤抗原現在被分成三大類。第一類包括前面所討論的很多抗原(如MAGE)，它們在部分黑素瘤及其它腫瘤類型中表達，還在正常睪丸及胎盤中表達。這些抗原是通常在正常組織中呈靜息狀態(tài)的正?；虻谋磉_產物。
第二類黑素瘤抗原包括源自正常蛋白質的突變形式的抗原。這一類的例子包括MUM-1(Coulier，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927976-7980(1955))，CDK4(Wolfel，et al.Science 2691281-1284(1955))，和HLA-A2(Brandel，et al.J.Exp.Med.1832501-2508(1996))。第三類也可見于上述文獻，包括在黑素瘤和黑素細胞中都有表達的分化抗原。例如酪氨酸酶，gp100，gp75和MelanA/Mart-1。Melan-A參見美國專利5,620,886，其引入作參考。酪氨酸酶參見Wolfel，et al.，Eur.J.Immunol.24759(1994)和Richard，et al.，Eur.J.Immunol.26224(1996)。gp100參見Kang，et al.，J.Immunol.1551343(1995)；Cox，et al.，Science 264716(1994)；Kawakami，et al.，J.Immunol.1543961(1995)。gp75參見Wang，et al.，J.Exp.Med.1831131(1996)。
有幾種方法可用來鑒定受HLA限制的肽。例如，Boon，et al.J.Exp.Med.183725-729(1996)描述了如何利用對自體黑素瘤細胞的應答性鑒定CD8+T細胞的靶肽。該方法需要通過粘?；騝DNA載體將抗原表達轉移至非表達細胞。分別參見Van der Bruggen，et al.Science 2541643-1650(1991)，Kawakami，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 916458-6492(1994)，它門都引入本文作參考。在每一種情況下，轉染分子必須編碼相關抗原。如需要，也可使用HLA-I類限制元件。見De Plaen，et al.，Methods，12125-142(1997)。
被T細胞所識別的腫瘤抗原的編碼序列被鑒定以后，HLA結合基序分析(如Falk et al，Nature，357290-296(1991)所述)對于鑒定相關肽很有用。
Hunt et al，Science 2551261-1263(1992)描述了鑒定肽的方法將這些肽從HLA分子上洗脫下來，通過HPLC分級，然后再使用結構鑒定技術。應用這一方法的例子見Cox，et al，Science 264716-719(1994)，Skipper et al，J.Exp.Med.183527-534(1996)，Castelli et al，J.Exp.Med.181363-368(1995)。這一方法存在技術挑戰(zhàn)，尚未廣泛使用。
已知一種使用病毒載體來鑒定已知腫瘤抗原的靶肽的方法。這一技術包括誘導幼稚T細胞的從頭(de vovo)特異性應答(Chaux et al，J.Immunol.1632928-2936(1999)，Butterfield，et al，J.Immunol.1615607-5613，1998))；以及刺激和擴增體內致敏的T細胞。參見Toso，et al，Canc.Res.5616-20(1996)，Yee，et al，J.Immunol.1574079-4086(1996)；Kim，et al，J.Immunoother.20276-286(1997)；Ferrari et al，Blood 902406-2416(1997)。然后用T細胞鑒定引發(fā)T細胞應答的經天然加工的腫瘤肽。
上述工作的缺陷之一在于對HLA-A等位基因、尤其是HLA-A2呈遞的強調。關于其它MHC/HLA分子的MHC/HLA限制，目前所知甚少。在非HLA-A亞型的MHC/HLA分子中，對HLA-B27分子的研究最多。參見Parker，et al，J.Immunol.152163(1994)，其引入本文作為參考。這提示，在被加工為MHC/HLA配體和/或表位的給定分子中，應可預見到HLA-B27結合子(binder)。但本發(fā)明的情況卻不是這樣。
與HLA-A2和HLA-B27相反，對HLA-C分子和其結合肽的了解很少。其結合基序不很清楚，幾乎沒有幾種肽接受了檢測。HLA-C的出現率遠低于HLA-A和B分子，在一個群體庫中，HLA-C分子遠非研究者的首選。本發(fā)明的一個意想不到的發(fā)現是鑒定了兩種HLA-C表位，這在文獻中鮮有提示，而在本發(fā)明的實驗設計中將加以詳細描述。
美國專利5,804,381(在此作為參考文獻)中所述NY-ESO-1分子被認為是腫瘤抗原中免疫原性最強的分子之一。晚期癌癥病人中有近一半表達該抗原(Stockert，et al，J.Exp.Med.1871349-1354(1998))，其表達伴有較強的CD4+和CD8+T細胞應答。參見Jger，et al，J.Exp.Med.191625-630(2000)；Jger et al.，J.Exp.Med.167265-270(1998)；Jger，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 974760-4765(2000)；Chen，et al，J.Immunol.(赴印)。來源于作為HLA-A2表位的分子的肽是已知的(Jger et al.，J.Exp.Med.187265-270(1998))。Wang et al，J.Immunol.1613598-3600(1998)則描述了HLA-A31結合表位。
已經發(fā)現，NY-ESO-1也呈遞與HLA-C分子，例如HLA-Cw3和HLA-Cw6結合的表位。見第7頁第13行“…HLA-Cw3和HLA-Cw6”之后。NY-ESO-1與另一腫瘤排斥抗原LAGE-1(Lethe et al，美國專利5,811,519)有同源序列。在了解MAGE-A1/HLA-A1和MAGE-A3/HLA-A1肽之后，LAGE-1上編碼相關九肽的等效區(qū)也呈遞與HLA-C分子，例如HLA-Cw3和HLA-Cw6結合的表位。這樣的肽，以及與其相關的發(fā)現，也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的另一部分則是鑒定這些肽的方法。本發(fā)明的所有方面均在下文中加以詳述。
優(yōu)選實施方案的詳述實施例1以下實驗描述了如何制備細胞樣品，以用于后面的實驗。
使用標準方法，從癌癥病人收集外周血淋巴細胞(下文中稱作PBL)。使用包被有CD8特異性抗體的磁珠和本領域已知技術處理細胞，以除去CD8+T細胞。一旦分離，便將CD8+細胞接種在圓底的96孔板上，密度為5×105細胞/孔，加入RPMI培養(yǎng)基1640，培養(yǎng)基中含有10％人AB血清，L-谷氨酰胺(2mM)，青霉素(100U/ml)，鏈霉素(100μg/ml)，和1％的非必需氨基酸。
去除了CD8+細胞的PBL被用作抗原呈遞細胞(后文稱為APC)。正如此后要詳細描述的，這些細胞或者用10μM肽進行脈沖處理，或者用腺病毒構建體以1000IU/細胞、在37℃、300μl無血清培養(yǎng)基中轉染過夜。
實施例2測定NY-ESO-1蛋白在無CD8的PBL中的表達。無CD8的PBL通過上述方法獲得。這些細胞然后用含有編碼NY-ESO-1蛋白的cDNA的腺病毒載體進行轉染，或者用“空”腺病毒載體進行轉染。PBL既有來自健康供體的，也有來自癌癥病人的。
為了制備載體，我們使用了Chen，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA941914-1918(1997)以及美國專利5,804,381中所描述的方法，這兩篇文獻在此均作為參考文獻。簡言之，用EcoRI和XbaI消化載體pBK-CMVNY-ESO-1(后者在這兩篇文獻中均有描述)，產生包含NY-ESO-1的cDNA的0.8kb片段。分離該片段，將其克隆入市售的穿梭載體pSV2-ICEU-1 pAd的EcoRI和XbaI位點。所得到的穿梭質粒pSV2-ICEU-1 NY-ESO-1隨后用ICEU消化，產生一種表達盒，該盒包含CMV啟動子/增強子，NY-ESO-1 cDNA，以及BGH polyA序列。分離該片段，并將其克隆入“pAd-Quick”質粒的單一ICEU-1位點。這一質粒隨后用SmaBI消化，用消化產物轉化293細胞，產生編碼NY-ESO-1的重組腺病毒載體。
PBL用1000 IU/細胞的腺病毒構建物感染，37℃溫育過夜。對細胞進行透化，用1μg/ml特異于NY-ESD-1的單克隆抗體染色，該抗體在Stockert，et al.，J.Exp.Med.1871340-1354(1998)和WO99/53938中有所描述，在此一并列為參考文獻。
高達85％的被感染PBL可表達重組NY-ESO-1細胞，顯示這一方法可用于其它的實驗。
實施例3這些實驗測定用NY-ESO-1重組腺病毒感染的APC進行的刺激與用肽脈沖處理所得APC進行的刺激，兩者是否相當。這些實驗還提供了分析NY-ESO-1應答性T細胞在癌癥病人中的出現和頻率的方法。更為重要的是，通過使用重組病毒載體轉導APC中NY-ESO-1而非外源肽例如SEQ ID No.1的表達，這一分析方法可以用于天然加工和呈遞的肽表位。
在這些實驗中，細胞樣品取自兩個病人，這兩個病人在此前被確診為具有對HLA-A2限制性肽SLLMWITQC(SEQ ID No.1)的自發(fā)性T細胞應答，如Jger，et al.，J.Exp.Med.167265-270(1998)和Jger，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 974760-4765(2000)中所述，這兩篇文獻在此都作為參考文獻。取自這兩個病人的PBL如上述加以處理，以從中分離CD8+細胞。去除了CD8的PBL如上述用10μM SEQ IDNo.1樣品進行脈沖處理，用編碼NY-ESO-1的腺病毒進行轉染，或用編碼綠色熒光蛋白的腺病毒進行轉染。隨后將自體CD8+細胞用PBL刺激8天。如上所述，每孔CD8+細胞加1×106APC予以刺激(即，將PBL加入含5×105CD8+細胞/孔的孔中)。刺激8小時后，加入IL-2(10U/ml)，以及IL-7(20ng/ml)。該過程重復3天，直到收獲細胞用于測試。
細胞用四聚體實驗進行檢測，即將CD8+T細胞在含1％FCS的50μlPBS中，用藻紅素(PE)標記的四聚體進行染色。四聚體合成參見Altman，et al.，Science，27494-96(1996)，在此作為參考文獻。使用SEQ ID.No.1作為肽來裝配四聚體。細胞在37℃染色15分鐘，然后加入特異于CD8的市售單克隆抗體，即“三色(Tricolor)-CD8 mAb”，在冰上放置15分鐘。洗滌細胞，用流式細胞儀分析。
刺激8天后，四聚體陽性細胞率是相同的，即，使用肽和使用腺病毒轉化細胞，其應答是相同的。這一應答特異于NY-ESO-1，因為當使用編碼綠色熒光蛋白的腺病毒時，四聚體染色是陰性的。
實施例4以下實驗被設計用來更充分地研究得自一個個體的CD8+T細胞。使用在此作為參考文獻的Jung，et al.，J.Immunol.Meth.159197-207所述細胞點(Cytospoet)方法。CD8+細胞如上述進行呈遞后，與自體EBV-B靶細胞在300μl無血清培養(yǎng)基中以1∶2混合30分鐘。樣品中加入10μg/ml布雷菲爾德菌素，再放置5小時。上述自體EBV-B細胞用SEQ ID No.1肽脈沖處理，或用痘苗載體構建物轉染。所用痘苗病毒構建物包含全長NY-ESO-1cDNA，其在痘苗病毒40k啟動子控制之下(Gritz，et al.，J.Virol.645948-5857(1990)，在此作為參考文獻)，所述構建物還包含大腸桿菌lacZ基因，其在禽痘病毒C1啟動子控制之下(Jenkins，et al.，AIDS Res.Hum.Retroviruses 7991-998(1991)，在此作為參考文獻)。將外源序列插入該構建體的胸苷激酶基因中，位于痘苗病毒Wyeth株基因組的Hind III區(qū)域(見Mazzara，et al.，Meth.Enzymol.217557-581(1993)，在此作為參考文獻)。
將細胞固定，透化，用上述CD8特異性三色單克隆抗體、FITC標記的IFN-γ單抗，PE標記的TNF-α特異性單抗室溫染色15分鐘。結果通過在流式細胞儀中對CD8+淋巴細胞進行選通來分析。
結果顯示，受腺病毒構建體刺激的效應細胞，應對用編碼NY-ESO-1的痘苗病毒構建物轉染的自體EBV-B細胞，而產生大量IFN-γ和TNF-α；但它們卻不對野生型痘苗轉染體產生應答。沒有觀察到用來致敏的腺病毒載體和用來讀取結果的痘苗病毒之間的交叉反應。致敏效應細胞具有激活的記憶T細胞的典型特征，包括CD45RO的高表達，以及CD62L的低表達，而且它們在沒有再次刺激的條件下可在培養(yǎng)中維持一個月以上。
用上述方法、經流式細胞述分揀出任何對上述四聚體產生陽性應答的CD8+T細胞。發(fā)現兩類細胞群體，一類對四聚體呈陽性應答，另一類呈陰性應答。
實施例5這些實驗進一步對上面描述的兩個細胞亞群進行分析。分揀以后，細胞在0.1μg/ml PHA，10U/ml IL-2和20ng/ml IL-7存在下，用同種異體的飼養(yǎng)細胞PBL進行刺激。每一亞群隨后進行ELISPOT分析，以決定其特異性。具體是，平底的、96孔硝酸纖維素板用2μg/ml IFN-γ進行包被，然后4℃孵育過夜。平板用PBS洗滌，然后用10％人AB血清37℃封閉1小時。加入上述已呈遞的CD8+T細胞(1×103～5×104細胞/孔)，還加入5×104靶細胞。靶細胞為用SEQ ID No.1肽脈沖處理的PBL，或用表達NY-ESO-1的痘苗病毒轉染的PBL或用EBV-B細胞轉染的PBL，如上述。細胞在無IL-2和人血清的RPMI培養(yǎng)基1640中孵育20小時。平板用PBS粗略沖洗以除去細胞，然后每孔加入0.2μg/ml IFN-γ單抗。37℃孵育2小時后，洗板，用1μg/ml鏈親和素堿性磷酸酶室溫顯色1小時。隨后沖洗，加入底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍四唑，孵育5分鐘。最后一次沖洗之后，板面上呈現暗紫色斑點，在顯微鏡下記數。
上述使用四聚體陽性亞群所進行的其他實驗顯示，呈現有NY-ESO-1重組腺病毒的CD8+T細胞可以喚醒特異性識別表達NY-ESO-1的HLA-A2腫瘤細胞的效應細胞。用表達NY-ESO-1的不同黑素瘤細胞系如上述進行的ELISPOT實驗證實了這一點。選出一個不表達NY-ESO-1的細胞系。所選的所有細胞系均表達HLA-A2，只有一個細胞系除外；但這個細胞系卻表達NY-ESO-1?？傊?，在所測試的五個黑素瘤細胞系中，3個既表達NY-ESO-1又表達HLA-A2分子，1個表達HLA-A2但不表達NY-ESO-1，1個表達NY-ESO-1但不表達HLA-A2。
結果顯示，對四聚體陽性CD8+T細胞來說，NY-ESO-1和HLA-A2表達對識別都是必需的。
實施例6如上文所述，分揀出四聚體陰性CD8+T細胞亞群；然而，令人驚訝的是，當進行檢測時，這一亞群卻可與用表達重組NY-ESO-1的痘苗病毒感染的自體EBV-B細胞進行反應。這表明，NY-ESO-1蛋白被加工成由MHC分子而非HLA-A2呈遞的表位。如“背景技術”部分所言，HLA-B27分子以一定頻率被表達，并已知一結合基序(Parker et al.，J.Immunol.152163(1994)，引入為參考)。這是一個九或十聚體，位置2為精氨酸，C末端有一疏水殘基。由于提供T細胞的病人可表達HLA-B27，有理由相信肽分子可能是由這一HLA分子呈遞的。
用Parker所述基序對NY-ESO-1氨基酸序列進行圖像分解，得到11個預計可與HLA-B27分子結合并可作為T細胞表位的肽序列。合成每個肽序列，用上文描述的ELISPOT方法進行檢測。沒有一個呈陽性反應。我們沿整個NY-ESO-1序列發(fā)現了所有目標肽，即，氨基酸42-50，51-60，76-85，80-88，85-94，105-113，124-133，135-143，157-165，159-167和163-171。參見，例如，引入作參考的WO99/53938提供了上述氨基酸序列。如所述，沒有一個呈陽性反應。
四聚體陰性亞群隨后用來自健康供體的EBV-B細胞進行測試，所述EBV-B細胞用重組病毒轉導以表達NY-ESO-1，但在HLA特異性上卻有差別，即細胞系名稱HLA類型9-EBV A*0101；A*0301；B*15；B*4406；Cw*0303；Cw*070410-EBVA*3001；A*3301；B*4501；B*5301；Cw*060219-EBVA*0201；A*2402；B*2705；B*37.01；Cw*0202；Cw*060220-EBVA*0301；A*2301；B*0702；B*4403；Cw*0401；Cw*070221-EBVA*2402；A*3101；B*15；B*2705；Cw*0202；Cw*030326-EBVA*0201；B*0801；B*5701；Cw*0602；Cw*070132-EBVA*0101；A*0201；B*0801；B*15；Cw*0303；Cw*0701對上述每一種EBV細胞取樣，用編碼NY-ESO-1的痘苗病毒或野生型痘苗病毒進行轉染。樣品如上述進行檢測。HLA-Cw3陽性細胞系能向四聚體陰性細胞亞群呈遞NY-ESO-1。隨后鑒定其中所涉及的肽。為此，使用現有技術合成長的、重疊的肽，以跨越整個NY-ESO-1序列。用這些肽對自體EBV-B細胞進行脈沖處理，并使用ELISPOT進行檢測，如上述。相應于氨基酸85-102和91-108的肽被CD8+T細胞識別。Falk et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9012005-12009(1993)描述了用于結合HLA-Cw3的一種基序。使用該基序合成由NY-ESO-1的氨基酸92-100組成的肽，并進行測試。為此，HLA-1類陰性細胞系721.221用編碼HLA-Cw3的cDNA進行轉染，然后用肽進行脈沖處理。在比較試驗中，用HLA-Cw4轉染后，結果為陰性。HLA-Cw*0303和HLA-Cw*0304亞型均可很好地呈遞所述肽。事實上，在濃度低于1nM時即可識別。此肽序列為LAMPFATPM(SEQ ID No.2)實施例7經過上面的實驗，設計了以下實驗來研究并非HLA-A2陽性的個體體內對NY-ESO-1的自發(fā)性T細胞應答。
選擇一名對NY-ESO-1呈血清陽性的病人。從病人身上取PBL，隨后用上面描述的方法分離CD8+T細胞，效應細胞在體外用感染了編碼NY-ESO-1的腺病毒構建物的CD8耗竭型PBL進行刺激。使用上文的方法培養(yǎng)9天后，接近40％的致敏CD8+T應對痘苗病毒感染的組織相容性EBV-B細胞所表達的NY-ESO-1而特異性產生IFN-γ。如上文所述，用跨NY-ESO-1的重疊肽進行測試，以確定由氨基酸73-90和79-96組成的肽被受試者的預致敏T效應細胞識別。使用上述EBV-B細胞將HLA-Cw6鑒定為這一應答中的限制性成分。HLA-Cw6的錨定基序在Falk，et al.文章中已描述。由氨基酸80-88(ARGPESRLL；SEQ ID No.3)組成的肽被推定為相關的九肽。合成該肽，如上述進行測試，證實其可被效應細胞以HLA-Cw*0602限制性方式識別。
實施例8此前，Jger等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 974760-4765(2000)證實，CD8+細胞對NY-ESO-1的應答性只存在于帶有對該蛋白質的抗體的病人中。我們研究了當使用本文所述腺病毒/痘苗病毒交叉致敏方法時是否也是這樣。為此，我們研究了三例NY-ESO-1陽性腫瘤病人。一例病人是血清陽性，其他兩例是血清陰性。來自血清陽性病人的CD8+T細胞用去除了CD8的PBL進行刺激，該PBL已被上述編碼NY-ESO-1的腺病毒載體感染。結果觀察到，針對借由痘苗病毒載體來表達NY-ESO-1的組織相容性EBV-B細胞，產生NY-ESO-1特異性應答。HLA-A2限制性肽(SEQ ID No.1)和HLA-Cw3限制性肽(SEQ ID No.2)都是該應答的標靶。血清陰性個體中未見應答。
前述實施例描述了本發(fā)明的特征，包括鑒別T細胞，例如特異于肽/MHC復合體的CD8+T細胞的方法，其中的肽來源于目的蛋白。在該方法中，使1例被認為包含相關CD8+細胞的樣品與已被第一種編碼目的蛋白的病毒載體感染的抗原呈遞細胞，例如樹突細胞接觸。之后，使CD8+細胞再與已被第二種編碼目的蛋白的病毒載體感染的第二群抗原呈遞細胞接觸，其中所述第二種病毒載體與第一種病毒載體不同。該方法的好處在于，可以更精確確定免疫應答針對的是抗原而非針對病毒的任何方面。在一個優(yōu)選實施方案中，第一種病毒載體是腺病毒載體，更優(yōu)選它不能復制，而第二種載體是痘苗載體。這個順序也可以顛倒過來，這兩種選擇只能擇一使用，并使得第二種病毒與這兩種選擇中的一種不同。
如上所述，這一方法需要一種抗原呈遞細胞，例如樹突細胞，或能夠在其表面呈遞MHC或HLA分子和一種肽的復合體的其他類型的細胞。在實踐中，優(yōu)選該方法涉及使用自體細胞，即來自同一病人的抗原呈遞細胞和CD8+T細胞，但這一方法也可用同種異體細胞進行。通過使用這一方法，如實施例所示，可使技術人員鑒定那些因呈遞MHC/HLA分子而被限制的表位。如這里所描述的，這一方法允許鑒別與HLA分子，例如HLA-Cw3和HLACw6分子結合的肽，包括，但不限于，SEQ ID No.2和3所定義的肽。這些肽可用來，例如，刺激特異于HLA分子和肽的復合物的細胞裂解性T細胞的產生，以鑒定能呈遞HLA分子的細胞，等等。所述肽也可以用于治療，例如，作為在增強免疫應答的配制劑中的單一肽成分來用，或作為多種肽中的一種。這類組合物還可以包含其他成分，例如佐劑。這類佐劑的一個例子是GM-CSF，如Jger et al.在引入本文作參考的美國專利中所教導的。
NY-ESO-1基因和其編碼的蛋白與稱作“LAGE”或“LL-1”的分子具有同源性。參見，例如，Lethe et al.，美國專利5,811,519，在此全文引用。與SEQ ID No.2和3同源的LAGE肽，即ITMPFSSPM(SEQ ID NO.4)ARRPDSRLL(SEQ ID NO.5)也是本發(fā)明的一部分，可作為HLA-Cw3、亞型HLA-Cw*0303和HLA-Cw*0304、尤其HL-C26的表位。
必須記住，本領域普遍認為，MHC配體和MHC表位之間存在區(qū)別。對前者來說，它們只是與MHC分子結合的肽，但結合后并不引起T細胞應答。而對后者來說，MHC表位是與MHC分子結合的肽，當它與特異于肽/MHC復合物的T細胞接觸時可刺激T細胞。Falk等人在上文引用的文獻中推出針對HLA-Cw*3、HLA-Cw*0301、HLA-Cw*0304、HLA-Cw*0601、HLA-Cw*0602的結合基序。Falk等也在其文章中對配體和表位進行了區(qū)分。將會看到，沒有找到針對這些等位基因中的任何一個的T細胞表位。
本發(fā)明的一部分是所謂“微型基因”，即由編碼目的肽的核苷酸序列組成的核酸分子。肽的長度使得能簡單構建編碼目的表位的所有簡并序列。使用本領域已知方法可將這些編碼序列制備成一個擴展的“多表位(polytopic)”序列的一部分，并可將其摻入已將微型基因或目的基因與啟動子可操作連接的編碼載體中，以便在宿主細胞中表達。
微型基因也可以與編碼目的MHC分子的基因，例如HLA-Cw3或HLA-Cw6編碼序列協(xié)同使用。這兩種序列可以組成單一載體的一部分，隨后用于試劑盒中的一對載體，或允許技術人員用其刺激T細胞應答的其他組合，等等。
本發(fā)明的其他特征對本領域技術人員是清楚的，在此無需贅述。
雖然本發(fā)明用特定實施方案進行了描述，但應該明了，本領域技術人員可以在不偏離本發(fā)明精神的條件下對其進行多種修飾和改動。此類修飾、改動或等效體都包含在本發(fā)明權利要求的范圍內。
序列表<110>薩夏.格恩杰蒂克(Gnjatic，Sacha)勞埃德.J.奧爾德(Old，Lloyd J.)<120>分離的結合HLA-C分子的肽及其用途<130>LUD 5668 PCT<140><141>2001-09-26<160>5<210>1<211>9<212>氨基酸<213>人(Homo sapiens)<220><400>1Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys5<210>2<211>9<212>氨基酸<213>人(Homo sapiens)<220><400>2Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met5<210>3<211>9<212>氨基酸<213>人(Homo sapiens)<220><400>3Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu5<210>4<211>9<212>氨基酸<213>人(Homo sapiens)<220><400>4Ile Thr Met Pro Phe Ser Ser Pro Met5<210>5<211>9<212>氨基酸<213>人(Homo sapiens)<220><400>5Ala Arg Arg Pro Asp Ser Arg Leu Leu權利要求
1.一種分離的肽，該肽與HLA-Cw3分子結合，并可刺激特異于所述肽與HLA-Cw3分子的復合物的T細胞增殖，其氨基酸序列由SEQ ID NO.2組成。
2.一種分離的肽，該肽與HLA-Cw6分子結合，并可刺激特異于所述肽與HLA-Cw6分子的復合物的T細胞增殖，其氨基酸序列由SEQ ID NO.3組成。
3.分離的細胞裂解性T細胞，其特異于HLA-Cw3分子與權利要求1的肽的復合物。
4.分離的細胞裂解性T細胞，其特異于HLA-Cw6分子與權利要求2的肽的復合物。
5.一種刺激細胞裂解性T細胞增殖應答的方法，包括將含有T細胞的樣品與在表面呈遞HLA-Cw3與權利要求1所述肽的復合物的細胞接觸，從而刺激特異于所述復合物的細胞裂解性T細胞的增殖。
6.一種刺激細胞裂解性T細胞增殖應答的方法，包括將含有T細胞的樣品與在表面呈遞有HLA-Cw6與權利要求2所述肽的復合物的細胞接觸，從而刺激特異于所述復合物的T細胞的增殖。
全文摘要
本發(fā)明教導了與細胞表面的HLA－Cw3和HLA－Cw6分子結合的肽表位。這些肽可用于診斷和治療，編碼它們的DNA分子、特異于HLA/肽復合物的細胞裂解性T淋巴細胞也可用于診斷和治療。本發(fā)明另一特征是，在用不同病毒載體進行刺激和再刺激的系統(tǒng)中，鑒定諸如本文所述的那些相關分子的方法。
文檔編號C12N5/08GK1476480SQ01819481
公開日2004年2月18日 申請日期2001年9月24日 優(yōu)先權日2000年9月26日
發(fā)明者薩夏·格恩杰蒂克, 勞埃德·J·奧爾德, 永田康浩, 埃爾克·賈格爾, 陳耀楨, 亞歷山大·克努思, J 奧爾德, 賈格爾, 大 克努思, 浩, 薩夏 格恩杰蒂克 申請人:路德維格癌癥研究院