專利名稱：使用非標(biāo)準(zhǔn)堿基的固相支持體分析系統(tǒng)和方法
背景技術(shù)：
對(duì)于寡聚核苷酸，包括DNA和RNA片段，已經(jīng)發(fā)展了多種各式各樣不同的分析方法，這些方法通?？梢灾苯訖z測(cè)出樣品中是否包括具有特定靶寡聚核苷酸序列的寡聚核苷酸。在某些情況下，許多等位基因序列，寡聚核苷酸序列的不同僅僅是幾個(gè)核苷酸的不同。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)指的是等位基因單個(gè)核苷酸的不同。至少在某種情況下，即使單個(gè)核苷酸的不同也引起相應(yīng)的遺傳響應(yīng)或性狀的改變。相應(yīng)的，為了檢測(cè)樣品中存在何種等位基因，該檢測(cè)技術(shù)必須有足夠的靈敏度以區(qū)分密切相關(guān)的序列。
許多分析技術(shù)包括多個(gè)成分，在分析測(cè)試中每種成分將和其他成分相雜交。分析測(cè)試中成分之間的非特異雜交(即兩條非互補(bǔ)序列的雜交)產(chǎn)生高的雜交背景。比如，非常相似但并不完全一致的兩條序列不能形成完全互補(bǔ)的雙鏈，其中在兩條單鏈的堿基不互補(bǔ)的位置堿基配對(duì)間斷。當(dāng)兩條相似序列的成分互相雜交，正如上面的情況所述，很多的等位基因序列，特別是含有SNP的等位基因序列，會(huì)使非特異性雜交增加。因此，從方法上減少非特異的雜交，或者在分析中減少非特異雜交的影響，對(duì)例如測(cè)定樣品中存在哪種等位基因的雜交分析是很有裨益的。
發(fā)明概述總的來說，本發(fā)明涉及分析寡聚核苷酸的方法，試劑盒以及組合物。另外，本發(fā)明還涉及使用非標(biāo)準(zhǔn)堿基分析寡聚核苷酸的方法、試劑盒以及組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于分析被分析物特異性序列的方法。一個(gè)捕獲寡聚核苷酸包括一個(gè)分子識(shí)別序列，該分子識(shí)別序列含有至少一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基并偶聯(lián)在支持體上(例如單一的固相支持體，如芯片、晶片或顆粒支持體)，它與樣品接觸并在適當(dāng)?shù)碾s交條件下與靶寡聚核苷酸序列雜交，如果該樣品含有靶寡聚核苷酸的話。靶寡聚核苷酸包括一個(gè)標(biāo)記序列，它互補(bǔ)于捕獲寡聚核苷酸分子識(shí)別序列和分析物特異序列或分析物特異序列的互補(bǔ)序列。檢測(cè)靶寡聚核苷酸和捕獲的雜交。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了另一檢測(cè)被分析物特異序列的方法。捕獲寡聚核苷酸與支持體相偶聯(lián)，該捕獲寡聚核苷酸包含一個(gè)分子識(shí)別序列，該分子識(shí)別序列與被分析物特異序列至少部分相同或互補(bǔ)，捕獲寡核苷酸在雜交條件下與樣品接觸與靶寡核苷酸雜交。靶寡聚核苷酸包括含有至少一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基的標(biāo)記序列，和被分析物的特異序列或分析物特異序列的互補(bǔ)序列。捕獲寡聚核苷酸以靶寡聚核苷酸為模板進(jìn)行酶促延伸，在與標(biāo)記序列的非標(biāo)準(zhǔn)堿基相對(duì)位置上摻入互補(bǔ)的非標(biāo)準(zhǔn)堿基。報(bào)道基團(tuán)也會(huì)摻入到捕獲寡核苷酸的延伸部分。檢測(cè)靶寡聚核苷酸和捕獲寡聚核苷酸的雜交。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供了另一檢測(cè)被分析物特異序列的方法。含有被分析物特異序列的被分析物與第一引物和第二引物接觸。第一引物包括標(biāo)記序列和被分析物第一序列的互補(bǔ)序列。第二引物包括被分析物第二序列的互補(bǔ)序列和一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基。第一和第二引物酶促延伸分別形成靶寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸。靶寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸之一含有被分析物特異序列，另一個(gè)含有被分析物特異序列的互補(bǔ)序列。第一引物的延伸基本上停止于與第二引物的非標(biāo)準(zhǔn)堿基相遇時(shí)?；パa(bǔ)于第二引物非標(biāo)準(zhǔn)堿基被摻入到延伸的第一引物并與第二引物的非標(biāo)準(zhǔn)堿基相對(duì)。捕獲寡聚核苷酸分子識(shí)別序列與被分析物特異序列至少部分相同或互補(bǔ)，分析物特異序列與支持體相偶聯(lián)，在雜交條件下捕獲寡聚核苷酸分子識(shí)別序列與靶寡聚核苷酸接觸并與與包含標(biāo)記序列和被分析物特異序列、或被分析物特異序列互補(bǔ)序列的靶寡聚核苷酸相雜交。檢測(cè)靶寡聚核苷酸和捕獲寡聚核苷酸的雜交。
本發(fā)明的又一實(shí)施方案是一應(yīng)用于上述方法的試劑盒。該試劑盒包括支持體和捕獲寡聚核苷酸。該試劑盒還包括靶寡聚核苷酸或從被分析物中制造靶寡聚核苷酸的試劑。這些試劑包括，例如，聚合酶、互補(bǔ)于被分析物序列的第一、第二引物，或者第一、或者第二引物包括標(biāo)記序列。在一些方法中，本試劑盒還包括非標(biāo)準(zhǔn)的堿基或摻入非標(biāo)準(zhǔn)堿基的三磷酸核苷酸。
以上有關(guān)本發(fā)明的概述并非是對(duì)本發(fā)明所有公開的實(shí)施方案或應(yīng)用的描述。附圖和下面的發(fā)明詳述將會(huì)對(duì)這些實(shí)施方案更詳細(xì)描述。
附圖簡述參照本發(fā)明各種實(shí)施方案的詳細(xì)描述和圖解，本發(fā)明會(huì)被很好地理解，其中
圖1中展出了各種非標(biāo)準(zhǔn)堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中A是與聚合物主鏈相連的點(diǎn)，X是N或C-Z，Y是N或C-H，Z是H或是取代的或非取代的烷基；圖2A和2B是本發(fā)明寡聚核苷酸在固相支持體上雜交的兩個(gè)例子；圖3說明了本發(fā)明第一次分析被分析物特異序列的步驟；圖4說明了本發(fā)明第二次分析被分析物特異序列的步驟；圖5說明了本發(fā)明第三次分析被分析物特異序列的步驟；圖6說明了本發(fā)明第四次分析被分析物特異序列的步驟；圖7說明了本發(fā)明第五次分析被分析物特異序列的步驟；圖8說明了本發(fā)明第六次分析被分析物特異序列的步驟；圖9說明了本發(fā)明第七次分析被分析物特異序列的步驟；圖10說明了本發(fā)明第八次分析被分析物特異序列的步驟；圖11說明了本發(fā)明第九次分析被分析物特異序列的步驟；圖12是3D表面圖詳解，說明了98個(gè)分子識(shí)別序列(y軸)，與100個(gè)分子識(shí)別序列中每一個(gè)的互補(bǔ)標(biāo)記序列(x軸)的雜交；圖13是3D表面圖詳解，說明了50個(gè)分子的識(shí)別序列(y軸)，與50個(gè)分子識(shí)別序列中每一個(gè)的互補(bǔ)標(biāo)記序列(x軸)的雜交；圖14顯示本發(fā)明一次等位基因分析得到的圖示詳解；圖15顯示本發(fā)明另一次等位基因分析得到的圖示詳解；圖16說明了本發(fā)明第十次分析被分析物特異序列的步驟；圖17顯示本發(fā)明一次等位基因分析得到的圖解。
雖然本發(fā)明在附圖中以舉例的方式已經(jīng)給出的各種修飾，選擇形式以及特例一一列出并加以詳細(xì)描述。但必須理解，本發(fā)明并不局限于本發(fā)明描述的具體實(shí)施方案。相反，本發(fā)明覆蓋了一切不違背本發(fā)明精神和范圍的修改、等價(jià)替換和形式變更，它們都屬于本發(fā)明的范疇。
最佳實(shí)施方案的詳細(xì)描述本申請(qǐng)的相關(guān)申請(qǐng)為，申請(qǐng)?zhí)枮?0/240,397的美國臨時(shí)申請(qǐng)，申請(qǐng)日期為2000年10月14日；申請(qǐng)?zhí)枮?0/282,831的美國臨時(shí)申請(qǐng)，申請(qǐng)日期為2001年4月10日；申請(qǐng)?zhí)枮?9/861,292的美國臨時(shí)申請(qǐng)，申請(qǐng)日期為2001年5月18日；申請(qǐng)?zhí)枮?0/293,259的美國臨時(shí)申請(qǐng)，申請(qǐng)日期為2001年5月22日，這些專利在此引作參考。
本發(fā)明涉及的是一種寡聚核苷酸分析及其分析方法。更具體些，本發(fā)明涉及的是一種使用一個(gè)或多個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基來測(cè)試寡聚核苷酸的測(cè)試和分析方法。雖然本發(fā)明并不局限于此，有關(guān)本發(fā)明的各個(gè)方面的好處將通過以下討論來得到。另一些使用非標(biāo)準(zhǔn)堿基的分析方法已在申請(qǐng)?zhí)枮?0/240,397的美國專利臨時(shí)申請(qǐng)書中描述，該申請(qǐng)的申請(qǐng)日期為2000年10月14日。
正如我們所使用的，“核酸”包括聚合分子，象脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，肽核酸(PNA)，或其他任何序列，其他任何序列通常指由化學(xué)主鏈連接堿基，其中該序列的堿基能形成堿基對(duì)或與互補(bǔ)的化學(xué)結(jié)構(gòu)雜交。合適的非核酸化學(xué)主鏈包括，比如聚酰胺和多聚嗎啉主鏈。術(shù)語“核酸”包括寡聚核苷酸、核苷酸、或多聚核苷酸序列、和片段及其部分序列。核苷酸能以任何適當(dāng)?shù)男问降玫剑鐝奶烊粊碓粗蟹蛛x，重組制備、人工合成，可以是單鏈或雙鏈，也可以是有義鏈或反義鏈。
術(shù)語“寡聚核苷酸”通常指的是短的核酸序列(例如，長度少于100個(gè)核苷酸，通常長度是6至50個(gè)核苷酸)，該序列通?？梢允褂迷擃I(lǐng)域的以下技術(shù)得到，如核酸的固相支持體合成技術(shù)，DNA復(fù)制，逆轉(zhuǎn)錄，限制性內(nèi)切酶消化，第二輪轉(zhuǎn)錄等。寡聚核苷酸確切大小由各種因素所決定，寡聚核苷酸的大小反過來又由寡聚核苷酸的根本功能或用途所決定。
“序列”指的是核苷酸的順序。
術(shù)語“樣本”包括樣品或培養(yǎng)基(例如，微生物培養(yǎng)基)，或者是生物樣本、來源于生物體液的生物樣本和非生物源的樣本。
術(shù)語“被分析物”指的是樣本中的待檢測(cè)核酸。被分析物是分析測(cè)試的靶(例如，分析是檢測(cè)樣本中被分析物是否存在，濃度或量)。被分析物可直接或間接地被測(cè)試分析。至少在一些實(shí)施方案中間接測(cè)試被分析物，如果被分析物在樣本中出現(xiàn)，以該被分析物為模板合成靶寡聚核苷酸，例如使用PCR技術(shù)。然后靶寡聚核苷酸被用來進(jìn)行分析，來說明樣品中被分析物是否存在，濃度或量。
術(shù)語“靶寡聚核苷酸”指的是在分析測(cè)試方法中實(shí)際被測(cè)試的寡聚核苷酸。靶寡聚核苷酸可以是，例如被分析物或者含有被分析物特異性序列的寡聚核苷酸，該特異性序列與被分析物序列相同或互補(bǔ)。比如，靶寡聚核苷酸可以是被分析物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或被分析物的一部分。
術(shù)語“捕獲寡聚核苷酸”指的是擁有識(shí)別分子序列并與固相支持體表面相偶聯(lián)的寡聚核苷酸序列，該序列可與含有標(biāo)記序列或互補(bǔ)于分子識(shí)別序列的被分析物特異序列雜交，從而在固相支持體表面捕獲靶寡聚核苷酸。
本申請(qǐng)所提到的“分子識(shí)別序列”指的是互補(bǔ)于靶寡聚核苷酸被分析物特異序列或標(biāo)記序列的寡聚核苷酸序列。
這里，術(shù)語“互補(bǔ)”或“互補(bǔ)性”用于核酸時(shí)，(即，如寡聚核苷酸核酸或靶核酸的核苷酸序列)，指的是序列的堿基配對(duì)原則。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)堿基來說，堿基配對(duì)原則是沃森Watson和克里克Crick提出的。對(duì)于非標(biāo)準(zhǔn)堿基來說，下面將有所描述，非標(biāo)準(zhǔn)堿基配對(duì)原則指的是以與沃森和克里克堿基配對(duì)原則相似的方式形成氫鍵或通過疏水性、熵值、或范德華力從而形成特殊的堿基配對(duì)。例如，序列“T-G-A”的互補(bǔ)序列是“A-C-T”。互補(bǔ)可以是“部分”互補(bǔ)，其中只有部分核酸序列的堿基符合堿基配原則而匹配。另一種方式是核酸之間完全或全部互補(bǔ)。兩條核酸鏈間的互補(bǔ)程度影響著兩條核酸鏈間雜交的效率和強(qiáng)度。
術(shù)語“雜交”指的是兩條互補(bǔ)核酸鏈的配對(duì)。雜交和雜交強(qiáng)度(即，核酸間締合的強(qiáng)度)被多種因素所影響，比如，核酸分子間互補(bǔ)的程度，雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)度，包括形成雜交的熔解溫度(Tm)，核酸分子內(nèi)的G∶C的比值。
進(jìn)行分析測(cè)試來檢測(cè)樣品中是否含有擁有特定核酸序列(或它的互補(bǔ)序列)的被分析物。該核酸序列指的是“被分析物特異序列”。至少在一些例子中，原始樣本不能夠被直接分析測(cè)試。而是，如果該被分析物存在，將被分析物克隆或擴(kuò)增(例如，使用PCR技術(shù))以提供分析樣品，直到樣品中含有可檢測(cè)量的擁有被分析物特異序列的靶寡聚核苷酸。其它的擴(kuò)增技術(shù)包括，例如，核酸序列堿基擴(kuò)增(NASBA，例如Guatelil等，《美國科學(xué)院進(jìn)展》(Pro.Natl.Acad.Sci.)87，1874(1990)，這里引作參考)，鏈替換擴(kuò)增(SDA，例如Wakler等《美國科學(xué)院進(jìn)展》(Pro.Natl.Acad.Sci.)89，392-96(1992)，這里引作參考)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR，例如Kalin等，《突變研究》(mutat.Res.)，283，119-23(1992)，這里引作參考)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA，例如LaRocco等，歐洲微生物感染疾病臨床(Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis)13，726-31(1994)，這里引作參考)，滾環(huán)擴(kuò)增(RCA，例如Lizardi等，《自然遺傳學(xué)》(Nat.Genet)，19，225-32(1998)，這里引作參考)。至少，靶寡聚核苷酸的一部分一般相應(yīng)于以下其中的一種，a)被分析物，b)被分析物的一部分，c)互補(bǔ)于被分析物的物質(zhì)，d)互補(bǔ)于被分析物的一部分。該分析測(cè)試所檢測(cè)出的靶寡聚核苷酸說明了原始樣品中被分析物的存在。
通常，用于檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)被分析物特異序列的分析檢測(cè)系統(tǒng)包括固相支持體(例如，芯片、晶片或許多固體顆粒)。捕獲寡聚核苷酸以一種只允許鑒定寡聚核苷酸的方式固定在固相支持體上(例如，利用在芯片或晶片上的位置或利用顆粒特性與特殊的捕獲寡聚核苷酸相連)。捕獲寡聚核苷酸包括分子識(shí)別序列。擁有不同的分子識(shí)別序列的不同捕獲寡聚核苷酸被用來檢測(cè)不同的被分析物特異序列。因此，在單次測(cè)試系統(tǒng)中，設(shè)計(jì)使用不同的捕獲寡聚核苷酸可以分析含有多個(gè)被分析物特異序列的單樣本。
含有被分析物特異序列的靶寡聚核苷酸與捕獲寡聚核苷酸序列反應(yīng)，靶寡聚核苷酸序列除了被分析物特異序列，還包括標(biāo)記序列。特異的標(biāo)記序列與每一個(gè)被分析物特異序列相連接。標(biāo)記序列通常互補(bǔ)于其中一個(gè)分子識(shí)別序列。因此，在雜交條件下，靶寡聚核苷酸序列與適當(dāng)?shù)牟东@序列相雜交。另外，在本發(fā)明的一些特定方法中，被分析物特異序列可以互補(bǔ)于分子識(shí)別序列之一。
靶寡聚核苷酸或它的互補(bǔ)鏈典型地含有一個(gè)報(bào)道基因或用于連接報(bào)道基因的偶聯(lián)劑。通過觀察固相支持體上是否存在與特定的捕獲寡聚核苷酸相締合的報(bào)道基因，確定樣品中特殊的被分析物特異分析序列是否存在。合適的報(bào)道基因包括，但不限于，生物素，熒光素，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，地高辛，自旋標(biāo)記物，放射標(biāo)記物，DNA切割部分，發(fā)色基團(tuán)，或熒光發(fā)色基團(tuán)。一些合適的偶聯(lián)劑包括，但不僅限于胺，硫醇類，低亞硫酸鈉(hydrosines)醇或烷基。
恰當(dāng)?shù)姆治鰷y(cè)試系統(tǒng)的例子正如示意圖2A和2B中所示。在該分析測(cè)試中，捕獲寡聚核苷酸100a，100b偶聯(lián)一固相支持體120上，比如，單一固體基質(zhì)120a(如，芯片或晶片)，或固體顆粒120b的成員之一。通常，至少有一個(gè)捕獲寡聚核苷酸(如，捕獲寡聚核苷酸100a)含有一分子識(shí)別序列102，它互補(bǔ)于靶寡聚核苷酸110的標(biāo)記序列112，因此，在雜交條件下，靶寡聚核苷酸110和捕獲寡聚核苷酸100a相雜交。
盡管本分析測(cè)試法可以將所有的捕獲寡聚核苷酸用同一個(gè)球形分子識(shí)別序列進(jìn)行反應(yīng)，但典型的，使用兩組或更多不同的組的捕獲寡聚核苷酸100a，100b。每一組捕獲寡聚核苷酸都帶有一個(gè)不同的分子識(shí)別序列。在一個(gè)固相基質(zhì)上，每組捕獲寡聚核苷酸典型的排列在基質(zhì)的一個(gè)或幾個(gè)特定的區(qū)域內(nèi)，這些區(qū)域與特定的分子識(shí)別序列締合。當(dāng)使用微粒支持體時(shí)，捕獲寡聚核苷酸100a，100b的每一組被排列在有著特定性質(zhì)的微粒120b，120c至少一組之一上，這樣，特定微粒上的寡聚核苷酸可以從它所連接的顆粒的性質(zhì)而確定?？梢允褂萌缦碌臏y(cè)試，例如，a)通過使不同的寡聚核苷酸(和基質(zhì)中不同的區(qū)域，不同的微粒)與每一個(gè)等位基因相締合，檢測(cè)樣品中有何種等位基因存在，b)分析多種相關(guān)的或不相關(guān)的寡聚核苷酸序列或者c)實(shí)施這兩項(xiàng)。正如圖2A和2B所示，靶寡聚核苷酸優(yōu)先與相應(yīng)的捕獲寡聚核苷酸雜交，通過觀察靶寡聚核苷酸在單一支持體上的特定空間(圖2A)或連接的特定微粒上(圖2B)存在與否，來確定被分析物特異序列的存在與否。
如下所述，本分析測(cè)試系統(tǒng)的一個(gè)附加成分是報(bào)道基因130，它與靶寡聚核苷酸分子110(或它的互補(bǔ)序列120)相偶聯(lián)。報(bào)道基因130是分析測(cè)試的組成成分，該組成成分可以被檢測(cè)技術(shù)(如，比色法，熒光測(cè)定法，電泳，電化學(xué)法，光譜分析法，色譜分析法，光密度法或放射技術(shù))檢測(cè)出來，以顯示靶寡聚核苷酸的存在或濃度。報(bào)道基因通常由檢測(cè)技術(shù)確定(例如，熒光技術(shù)使用熒光報(bào)道基因，放射技術(shù)使用放射標(biāo)記。)在一些測(cè)試分析中，捕獲寡聚核苷酸和靶寡聚核苷酸它們中的一種或全部包括至少一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基。非標(biāo)準(zhǔn)堿基的使用可以提高包括雜交在內(nèi)的分析測(cè)試過程的分析特異性，因?yàn)榉菢?biāo)準(zhǔn)堿基優(yōu)先和其它互補(bǔ)的非標(biāo)準(zhǔn)堿基相雜交。使用更長的寡聚核苷酸也會(huì)增加雜交的特異性的比率。核酸的雜交通常取大約三到四個(gè)堿基完全互補(bǔ)的樣本。這就形成了成核位點(diǎn)。如果成核位點(diǎn)形成，雜交將會(huì)延伸到整個(gè)鏈。如果鏈上的堿基延伸后不能互補(bǔ)，兩條鏈將會(huì)釋放。因?yàn)槌珊诉^程要花費(fèi)時(shí)間，非標(biāo)準(zhǔn)堿基的使用會(huì)減少成核位點(diǎn)形成的可能性，從而減少了為了形成完全匹配而需要的采樣步驟數(shù)目。
另外，非標(biāo)準(zhǔn)堿基的使用會(huì)直接把另一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基摻入序列(例如使用PCR技術(shù))。被摻入的非標(biāo)準(zhǔn)堿基包括報(bào)道基因以及和報(bào)道基因偶聯(lián)的試劑，該試劑可以高選擇性的摻入報(bào)道基因以用于檢測(cè)靶寡聚核苷酸。
寡聚核苷酸和堿基DNA和RNA都是寡聚核苷酸，它們分別是脫氧核苷或核苷被磷酸二脂鍵相連的多聚物。每一個(gè)脫氧核苷或核苷包括一個(gè)與糖基偶連的堿基。自然存在的DNA和RNA中摻入的堿基有腺嘌呤(A)，鳥嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。這五種堿基稱為“天然堿基”。根據(jù)沃森和克里克所描述的堿基配對(duì)原則，天然堿基可以雜交形成嘌呤——嘧啶堿基對(duì)，G和C配對(duì)，A和T或U配對(duì)。這種配對(duì)原則就是寡聚核苷酸和它的互補(bǔ)寡聚核苷酸特異性雜交。
天然堿基的這些堿基配對(duì)的形式是由兩個(gè)堿基之間形成兩個(gè)或三個(gè)氫鍵產(chǎn)生的。每個(gè)堿基都有兩個(gè)或三個(gè)氫鍵供體和氫鍵受體。堿基對(duì)間的每個(gè)氫鍵是一個(gè)堿基的至少一個(gè)氫鍵供體和另一個(gè)堿基的氫鍵受體相互作用而產(chǎn)生的。氫鍵供體包括例如雜原子(例如，氧原子、氮原子)，它至少有一個(gè)相連的氫原子。氫鍵受體包括例如雜原子(例如，氧原子或氮原子)，它至少有一對(duì)孤對(duì)電子。
天然堿基，A，G，C，T和U，在非氫鍵的位點(diǎn)被取代，衍生成被修飾過的天然堿基。例如，天然堿基可被衍生化與支持體相連是通過反應(yīng)官能團(tuán)(如，硫醇，肼，醇或胺)與堿基上的非氫鍵原子偶聯(lián)而形成的。其它可能的取代基包括生物素，地高辛，英光素基團(tuán)，烷基(比如，甲基或乙基)。
非標(biāo)準(zhǔn)堿基也可以通過氫鍵形成堿基對(duì)，可以參考以下信息的描述，例如，美國專利5,432,272，5,965,364，6,001,983和6,037,120，和美國專利申請(qǐng)?zhí)?8/775,401所有這些專利文獻(xiàn)在此引作參考。“非標(biāo)準(zhǔn)堿基”指的是一種堿基，它不是A，G，C，T，或U，卻能摻入到寡聚核苷酸鏈中，能通過氫鍵，或疏水作用，熵，范德華力相互作用而互補(bǔ)于與之互補(bǔ)的堿基，形成堿基配對(duì)。圖1是幾個(gè)合適的堿基和與它們互補(bǔ)的幾個(gè)堿基配對(duì)的例子。這些堿基的具體例子包括在下面的堿基對(duì)復(fù)合體(iso-C/iso-G，K/X，H/J，和M/N)中的堿基。
其中A是將與糖基或聚合物主鏈的其它部分相連的點(diǎn)，R是H或是取代的以及非取代的烷基。認(rèn)識(shí)到其它的非標(biāo)準(zhǔn)堿基可以通過氫鍵結(jié)合而制備，或者在堿基非氫鍵原子結(jié)合的位置摻入官能團(tuán)修飾以上的非標(biāo)準(zhǔn)堿基而制備。在圖3至圖9中，非標(biāo)準(zhǔn)堿基被以下的符號(hào)指明X代表iso-C，Y代表iso-G。
非標(biāo)準(zhǔn)堿基配對(duì)的氫鍵與天然堿基配對(duì)的氫鍵相似，其中非標(biāo)準(zhǔn)堿基對(duì)的氫鍵供體和氫鍵受體之間形成了兩個(gè)或三個(gè)氫鍵。天然堿基和非標(biāo)準(zhǔn)堿基間的一個(gè)區(qū)別是氫鍵供體和受體數(shù)量和位置。例如，胞嘧啶被認(rèn)為是一供體/受體/受體堿基，鳥嘌呤是互補(bǔ)受體/供體/供體堿基。正如參考美國專利6,037,120所述，Iso-C是一受體/受體/供體堿基，iso-G是互補(bǔ)的供體/供體/受體堿基，該專利在這里一并被引作參考。
寡聚核苷酸中使用的其它非標(biāo)準(zhǔn)堿基包括有，例如，萘，菲，芘衍生物。有關(guān)信息可以參閱，例如，Ren等，發(fā)表在《美國化學(xué)會(huì)》(J.Am.Chem.Soc.)，118，1671(1996)的文章，和McMinn等，在《美國化學(xué)會(huì)》(J.Am.Chem.Soc.)121，11585(1999)的文章，這兩篇文獻(xiàn)在此引作參考。這些堿基并不是通過氫鍵形成穩(wěn)定的堿基對(duì)，而是依靠疏水作用，熵，范德華力相互作用形成堿基對(duì)。
固相支持體本分析測(cè)試的實(shí)施至少在部分使用了固相支持體。通常，捕獲寡聚核苷酸偶聯(lián)于或附著于支持體表面?？梢允褂枚喾N不同的支持體。在一些實(shí)施方案中，固相支持體是單一的固相支撐體，例如芯片、晶片、試管，錐形瓶或其它物品的內(nèi)表面或外表面。固相支持體可以由任何合適的材料制作，只要該材料可提供諸如穩(wěn)定性，大小，形狀，表面光滑度等最佳屬性組合。優(yōu)選的材料將不影響核酸雜交，也不會(huì)和核酸大量非特異性結(jié)合。適合的材料有生物的，非生物的，有機(jī)的或無機(jī)材料。例如，微陣列可以由任何合適的塑料，聚合物，硅，玻璃，陶瓷或金屬材料制成，同時(shí)也可被做成固體，或聚合物，膠體，硬膠片，彈性薄膜等各種形式。合適的聚合物材料包括，例如，聚苯乙烯，聚(烷基)甲基丙烯酸酯，聚(乙烯二苯甲酮)，聚碳酸脂，聚乙烯，聚丙烯，聚酰胺，聚偏二氟乙烯以及其它類似物。優(yōu)選的材料包括聚苯乙烯，玻璃和硅。
如圖3所示，在一些實(shí)施方案中，單一的固相支持體300被分成了一個(gè)個(gè)獨(dú)立的小區(qū)域310，捕獲寡聚核苷酸排列在每個(gè)區(qū)的支持體上。在每一個(gè)單獨(dú)區(qū)域或每個(gè)微粒支持體上，捕獲寡聚核苷酸顯著的(例如，至少75％)含有相同的分子識(shí)別序列。優(yōu)選地，各個(gè)區(qū)中或各顆粒支持體上基本上所有的(比如，至少90％，更好些，至少99％)捕獲寡聚核苷酸分子都含有相同的分子識(shí)別序列。通常狀況下，不同區(qū)域的捕獲寡聚核苷酸有著不同的序列，即使在一些實(shí)施例中，相同的捕獲寡聚核苷酸可以被用在兩個(gè)或更多的區(qū)域，例如，作為對(duì)照或用于確認(rèn)結(jié)果。
有著不同區(qū)域的固相支持體可以做成規(guī)則或不規(guī)則的陣列，用于測(cè)試樣品并測(cè)定是否存在著多種不同的被分析物特異序列。例如，一個(gè)微陣列可以檢測(cè)10，100，1000或更多的不同的被分析物特異序列。
固相支持體的尺寸大小由所期望點(diǎn)樣區(qū)域的數(shù)量和要分析的被分析物特異序列的數(shù)目等因素決定。例如，固相支持體可以是長從0.5cm左右到7.5cm左右，寬從0.5cm左右到7.5cm左右的二維平面。固相支持體還可以一層或多層放置在其它支持體上，比如顯微鏡載玻片(例如，長為7.5cm左右，寬為2.5cm左右)。固相支持體的大小可以在一些具體實(shí)施中根據(jù)需要方便地調(diào)整。
也可以使用其它一些類型的固相支持體。在一些實(shí)施方案中，固相支持體是一些微粒支持體。在這些實(shí)施方案中，捕獲寡聚核苷酸偶聯(lián)在微粒上。通常，微粒分成組，同一組內(nèi)的微粒具有特定特性，比如，顏色，熒光，頻率，密度，大小，或形狀，用這些性質(zhì)可以區(qū)別或分離不同組的微粒。優(yōu)選地，這些微?？梢杂眉夹g(shù)分離，例如，流式細(xì)胞光度計(jì)。
按照本發(fā)明所預(yù)期的，微?？梢允怯扇魏尾蝗艿幕蚬腆w材料制成。比如，微?？梢杂晒枘z，玻璃，尼龍，樹脂，交聯(lián)葡聚糖TM，瓊脂糖TM，纖維素，磁性材料，金屬(如，鋼，金，銀，鋁，銅或合金)，鍍金屬材料，塑料(如，聚乙烯，聚丙烯，聚酰胺，聚酯，聚偏二氟乙烯(PVDF))等，以及它們的組合物制成。恰當(dāng)?shù)睦邮俏⒅?，它在美國專?,736,330，6,046,807和6,057,107中描述，在此一并引為參考。適當(dāng)?shù)奈⒘５睦邮强梢缘玫降?，例如從Luminex公司，奧斯汀，德州。
在一個(gè)實(shí)施方案中，與捕獲寡聚核苷酸相連的微粒支持體放在一容器內(nèi)，容器可以是例如小瓶子，試管，孔板。靶寡聚核苷酸加入到容器內(nèi)，在雜交條件下進(jìn)行分析測(cè)試。再基于每組支持體所有的特性將微粒支持體進(jìn)行分離。然后再分別研究測(cè)試每組支持體上所連接的靶寡聚核苷酸。任選的，還可以洗脫支持體來減低相互雜交的影響。正如下面的描述，一次或多次的洗脫可以在相同或不同的嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行，如下文所述。另可選的，與捕獲寡聚核苷酸和支持體接觸以前，含有靶寡聚核苷酸的溶液，可以用例如，大小排除色譜法，差異沉降法，旋轉(zhuǎn)柱，過濾柱等方法除去沒被擴(kuò)增的引物或與靶寡聚核苷酸大小不一樣的其它物質(zhì)。
在一些實(shí)施方案中，使用多個(gè)容器(如，小瓶，試管等)，分析每個(gè)容器中多個(gè)分析樣品或不同捕獲寡聚核苷酸的結(jié)合物(含締合的支持體)。另一些情況下，每個(gè)容器僅包含一種類型的捕獲寡聚核苷酸(和締合的支持體)。
在另一個(gè)實(shí)施例中，支持體可以是一些獨(dú)立的支持體表面，他們可任選地偶連在一起。比如，這種支持體可以包括個(gè)體的光學(xué)纖維或一些其它支持體成員，它們分別偶聯(lián)不同的捕獲寡聚核苷酸，再相互連接在一起，形成一個(gè)單獨(dú)的支持體，比如基質(zhì)。
通常，支持體(無論是單個(gè)的支持體還是微粒支持體)能夠以一種足夠穩(wěn)定的方式使捕獲寡核苷酸結(jié)合或保持在其表面，以實(shí)現(xiàn)這里描述的目的。上面所提到的結(jié)合可以包括，例如，在支持體和捕獲寡聚核苷酸之間形成共價(jià)鍵，離子鍵，配位鍵，氫鍵或范德華鍵或者被帶正電荷或負(fù)電荷支持體吸引。捕獲寡聚核苷酸直接或通過連接頭連接在固相支持體表面。在一些實(shí)施方案中，捕獲寡聚核苷酸直接連接在支持體表面，提供支持體表面，或寡聚核苷酸，或它們兩者，或者用一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)將表面，寡核苷酸衍生化。例如，LuminexTM微粒表面可以用，例如，羧酸酯，順丁烯二酰亞胺，酰肼等官能團(tuán)或抗生物素蛋白來修飾。玻璃表面可以用硅烷，乙醛處理(形成希夫氏堿基DNA醛-胺偶聯(lián)物)。在一些實(shí)施方案中，支持體或支持體上的物質(zhì)(例如，支持體表面的包被層)帶有反應(yīng)功能團(tuán)，它可以偶聯(lián)于捕獲寡聚核苷酸上的反應(yīng)功能團(tuán)。例如，支持體可以被官能化(即，金屬或有反應(yīng)功能的多聚物表面)或含有官能化的基團(tuán)(即，含有未決定的功能團(tuán)的聚合物)，以提供方案位點(diǎn)與寡聚核苷酸相偶聯(lián)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，捕獲寡聚核苷酸在表面與捕獲寡聚核苷酸相互交聯(lián)。優(yōu)選地，交聯(lián)的捕獲寡聚核苷酸包括了一個(gè)交聯(lián)部分和一個(gè)捕獲部分，其中捕獲部分包括分子識(shí)別序列，它可以和靶寡聚核苷酸的標(biāo)記序列相雜交。
又一實(shí)施方案中，支持體可以部分或全部被結(jié)合試劑所包被，比如，抗生蛋白鏈菌素，抗體，抗原，酶，酶的輔助因子或抑制因子，激素，或激素受體。結(jié)合試劑通常是生物分子或合成分子，它們通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵對(duì)其它分子或大分子具有高的親和力。捕獲寡聚核苷酸偶聯(lián)于結(jié)合試劑互補(bǔ)體(如，生物素，抗原，抗體，酶的輔助因子或抑制因子，酶，激素受體，或激素)。當(dāng)捕獲寡聚核苷酸在與結(jié)合試劑接觸時(shí)，捕獲寡聚核苷酸將被保留在支持體上。其它的一些已知的偶聯(lián)技術(shù)也可以被方便的調(diào)整采用而在本系統(tǒng)和方法中實(shí)施。
捕獲寡聚核苷酸和靶寡聚核苷酸捕獲寡聚核苷酸包括分子識(shí)別序列，該序列通過雜交能捕獲具有互補(bǔ)標(biāo)記序列的靶寡聚核苷酸。捕獲寡聚核苷酸的分子識(shí)別序列與靶寡聚核苷酸的標(biāo)記序列相雜交，導(dǎo)致靶寡聚核苷酸連接到固相支持體上。分子識(shí)別序列和標(biāo)記序列與特定的被分析物特異序列(也是靶寡聚核苷酸的一部分)相締合，如果有雜交發(fā)生，它將顯示分析樣品中，具有被分析物特異序列(或它的互補(bǔ)序列)的被分析物的存在或濃度。
典型的，編碼和標(biāo)記序列包括至少六個(gè)核苷酸，在一些實(shí)施例中，包括至少8，10，15，20，或更多的核苷酸。在一些分析測(cè)試中，正如以下的描述，分子識(shí)別序列和標(biāo)記序列包含一個(gè)或多個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基。在另一些分析測(cè)試中，分子識(shí)別序列和標(biāo)記序列不包含任何非標(biāo)準(zhǔn)堿基。
捕獲寡聚核苷酸一般也包含一個(gè)官基團(tuán)，該基團(tuán)使捕獲寡聚核苷酸與固相支持體表面，或者固相支持體上排列的、或延伸的官能團(tuán)相連接。該官能團(tuán)可直接連接聚合物主鏈上或核酸序列的一個(gè)堿基上。可選的，正如上描述，捕獲寡聚核苷酸分子可以包括一個(gè)用于交聯(lián)的交聯(lián)區(qū)，它可以通過靜電力結(jié)合在表面。捕獲寡聚核苷酸可以用各種技術(shù)產(chǎn)生，如，包括固相合成，DNA復(fù)制，逆轉(zhuǎn)錄，限制性酶切，第二輪轉(zhuǎn)錄等。
除了標(biāo)記序列外，靶寡聚核苷酸包括一被分析物特異序列，它與被分析物中感興趣的序列一致或互補(bǔ)。被分析物特異序列可以是與標(biāo)記序列完全不同的序列，或者一些或全部標(biāo)記序列可以是被分析物特異序列的一部分。
捕獲寡聚核苷酸的長度可以通過期望雜交的強(qiáng)度和動(dòng)力學(xué)來優(yōu)化。通常，分子識(shí)別序列的長度在范圍為6至20(優(yōu)選為8至12個(gè))個(gè)核苷酸范圍內(nèi)。在最佳實(shí)施方案中，捕獲寡聚核苷酸的不同分子識(shí)別序列相互之間并不互補(bǔ)，更優(yōu)選的情況是，和任何已知的天然基因序列或待測(cè)樣品中最有可能出現(xiàn)的大量的基因片段不互補(bǔ)。結(jié)果是，捕獲寡聚核苷酸的捕獲分子識(shí)別序列主要與相應(yīng)的靶寡聚核苷酸互補(bǔ)標(biāo)記序列相雜交。
靶寡聚核苷酸(或互補(bǔ)于靶寡聚核苷酸的至少一部分的寡聚核苷酸)包含有一報(bào)道基因或用于連接報(bào)道基因的偶聯(lián)試劑。報(bào)道基因或偶聯(lián)試劑可以與聚合物主鏈結(jié)合，或與靶寡聚核苷酸或其互補(bǔ)寡聚核苷酸的任何堿基結(jié)合，將報(bào)道基因與核苷酸堿基(包括天然和非標(biāo)準(zhǔn)堿基)連接的技術(shù)是已知的。一些報(bào)道基因基團(tuán)的例子包括，生物素，地高辛，自旋標(biāo)記基團(tuán)，放射標(biāo)記，DNA分裂片段，發(fā)色基團(tuán)，和熒光發(fā)色基團(tuán)例如熒光素。偶聯(lián)試劑的例子包括，生物素或含有反應(yīng)官能團(tuán)的取代物。報(bào)道基因基團(tuán)然后連接鏈霉抗生物素蛋白或包含與偶聯(lián)劑相互作用的反應(yīng)官能團(tuán)，從而將報(bào)告基團(tuán)結(jié)合到靶寡聚核苷酸或其互補(bǔ)的寡聚核苷酸分子上。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)正如以下描述，多種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)是已知的并且可以用于本分析測(cè)試中。通常PCR技術(shù)用于擴(kuò)增寡聚核苷酸的至少一部分。存在被分析物特異序列的待測(cè)樣品與以下試劑接觸寡聚核苷酸第一和第二引物；核酸聚合酶；PCR過程中加入的核苷酸相應(yīng)的三磷酸核苷。天然堿基的三磷酸核苷包括dATP，dCTP，dGTP，dTTP，和dUTP。如果需要的話，非標(biāo)準(zhǔn)堿基的三磷酸核苷也可以加入。已知合適的PCR聚合酶，并且包括例如熱穩(wěn)定聚合酶，例如，無論是原酶還是改造過的Thermus棲熱菌屬種聚合酶，這些屬種包括但不僅限于Thermus aquaticus水生棲熱菌(Taq)，Thermus flavus黃棲熱菌(Tfl)，Thermus thermophilus嗜熱棲熱菌(Tth)，以及DNA聚合酶I和HIV-1聚合酶的Klenow片斷。
第一和第二引物互補(bǔ)于待擴(kuò)增寡聚核苷酸雙鏈的不同模板鏈的不同位置。擴(kuò)增出的寡聚核苷酸序列包括與分析物雜交的兩條引物序列和兩條引物之間的序列。引物可以通過多種方法合成，包括固相合成技術(shù)，DNA復(fù)制，逆轉(zhuǎn)錄，限制性內(nèi)切酶消化，第二輪轉(zhuǎn)錄等。
PCR技術(shù)包含的循環(huán)步驟有(i)將要擴(kuò)增的雙鏈寡核苷酸的或者前面循環(huán)中形成的延伸產(chǎn)物的第一寡聚核苷酸引物和第二寡聚核苷酸引物退火；(ii)通過核酸聚合酶延伸退火后第一和第二寡聚核苷酸引物，合成引物延伸產(chǎn)物；和(iii)使產(chǎn)物變性，得到單鏈的核酸。通過修改反應(yīng)步驟和各種條件(如，時(shí)間和溫度)，發(fā)展了多種PCR技術(shù)。一般情況下雖然在一些特殊的檢測(cè)中，一些PCR技術(shù)也許比另一些更加好用，但以下所描述中，多種PCR方法都適用于本分析測(cè)試。
以下描述的“fast-shot PCR”是適用的一些分析改進(jìn)PCR方法之一，該方法的引物延伸時(shí)間縮短或消除。正如我們所使用的，術(shù)語“fast-shot聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”或“fast-shot PCR”指的是在PCR延伸終止時(shí)，也同時(shí)停止了退火和解鏈步驟，使用的時(shí)間非常短或說沒有耗時(shí)的PCR。通常，使用該方法，兩引物的3’端與模板核酸分離不會(huì)超過10個(gè)堿基。
使用fast-shot PCR循環(huán)會(huì)增強(qiáng)反應(yīng)的特異性，該技術(shù)在PCR延伸終止時(shí)，也同時(shí)停止了退火和解鏈步驟，使用的時(shí)間非常短或說沒有耗時(shí)。在一些實(shí)施方案中，PCR混合液快速循環(huán)在大約90至100℃和大約55至65℃之間，在每一個(gè)溫度最多只停留大約一秒鐘的時(shí)間，從而使聚合酶沒有時(shí)間來延伸錯(cuò)配引物。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)循環(huán)的溫度大約在95℃到58℃間，每個(gè)溫度大約要停留一秒鐘。
這種快速循環(huán)容易產(chǎn)生短的PCR產(chǎn)物，通常，在模板核酸和第一和第二引物的3’端間留下大約0至10個(gè)堿基的空位。優(yōu)選地，引物被設(shè)計(jì)成Tm值在大約55至60℃。在一些實(shí)施方案中，大約總共37個(gè)循環(huán)就一般適合檢測(cè)出大小為30個(gè)核苷酸的靶寡聚核苷酸分子。
等位基因特異性PCR引物能用于分辨SNP(單核苷酸多態(tài)性)和其它等位基因。對(duì)于SNP檢測(cè)，引物應(yīng)該設(shè)計(jì)為互補(bǔ)于每一個(gè)等位基因，使感興趣的多態(tài)性堿基位于或接近于第一或第二引物的3’端(典型的，在3到5個(gè)堿基內(nèi))。高水平的等位基因分辨，部分的由于Taq聚合酶引物延伸時(shí)，3’端核苷酸與靶DNA的錯(cuò)配而受到局限，即，引物結(jié)合的等位基因并不是特異的。其它的聚合酶也可以被使用。
此外，通過置換等位基因特異性引物中其它位置處的錯(cuò)配能實(shí)現(xiàn)等位基因分辨。引物核苷酸錯(cuò)配的其他位置可以用以下兩種主要方式進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，1)簡單地通過降低引物的Tm值(解鏈溫度)，使引物在熱循環(huán)時(shí)不能在DNA模板上雜交，最終導(dǎo)致聚合酶不能延伸引物。2)建立一個(gè)不利的引物/模板結(jié)構(gòu)，使聚合酶不能延伸。
分析測(cè)定的實(shí)施例使用非標(biāo)準(zhǔn)堿基分析測(cè)試編碼區(qū)序列和標(biāo)記序列如圖4所示的分析中，兩組或更多組捕獲寡聚核苷酸分子202被制備。每組捕獲寡聚核苷酸分子202包括特定的分子識(shí)別序列204。每組分子識(shí)別序列至少含有一個(gè)(典型的是兩個(gè)或更多)非標(biāo)準(zhǔn)堿基(在圖中用虛線表示)。非標(biāo)準(zhǔn)堿基的使用大大減少了捕獲寡聚核苷酸與僅由天然堿基組成的序列雜交的可能性。與使用僅有天然堿基的寡聚核苷酸的相似分析測(cè)試相比，一般導(dǎo)致非特異雜交遠(yuǎn)遠(yuǎn)減少。捕獲寡聚核苷酸一般還包括一個(gè)反應(yīng)官能團(tuán)，用以連接固相支持體206，當(dāng)然，根據(jù)以上所描述，還有其它的方法用以連接。
測(cè)試所使用的支持體，可以是，例如，一種單一固相支持體，如，玻璃，金屬，塑料或無機(jī)芯片。捕獲寡聚核苷酸被排列在支持體上，并且一般用以上所描述的方法之一固定在支持體上(例如，通過反應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)捕獲寡聚核苷酸和支持體，使用結(jié)合試劑處理支持體，或者交聯(lián)捕獲寡聚核苷酸)。每種基團(tuán)排列在固相支持體一個(gè)或多個(gè)的獨(dú)特的區(qū)域，以至于該區(qū)域能和特定的寡聚核苷酸相締合。
在另一個(gè)實(shí)施方案中(沒有圖示)，分析測(cè)試的支持體是微粒支持體(例如，珠子)。這里所描述的任何分析測(cè)試可以在單一固相支持體上，微粒支持體上，或其它任何支持體上進(jìn)行，這是可以被理解的。微粒支持體可以分為幾組，每一組都有著區(qū)別于其它各組微粒的特性(如，顏色，形狀，大小，密度或其它化學(xué)和物理性質(zhì))。每種寡聚核苷酸可以和一組或更多組的微粒偶聯(lián)。一組特定的微粒和一組特異的寡聚核苷酸產(chǎn)生締合作用，可以利用微粒支持體獨(dú)特性質(zhì)來鑒定相應(yīng)的捕獲寡聚核苷酸。
回到圖4，靶寡聚核苷酸208，如果它在待測(cè)樣品中存在，它包含一被分析物特異序列210和一標(biāo)記序列212，該標(biāo)記序列互補(bǔ)于一種捕獲寡聚核苷酸202的分子識(shí)別序例204。標(biāo)記序列212至少有一種非標(biāo)準(zhǔn)堿基，否則該標(biāo)記序列將不能互補(bǔ)于捕獲寡聚核苷酸的分子識(shí)別序列?；パa(bǔ)于靶寡聚核苷酸208部分的寡聚核苷酸序列214包含一報(bào)道基因216或與報(bào)道基因連接的結(jié)合試劑(沒有圖示)。
靶寡聚核苷酸208或它的互補(bǔ)寡聚核苷酸214可以，例如，用PCR從含有被分析物特異序列或它的互補(bǔ)序列的被分析物中擴(kuò)增出來。在PCR擴(kuò)增中，使用了兩種不同的引物(如圖4B所示)，第一引物218包含被分析物220第一條鏈第一序列的互補(bǔ)序列。第二引物222包含被分析物220的第二條鏈第二序列的互補(bǔ)序列，第二條鏈第二序列是第一序列的上游或下游。被分析物特異序列典型地包括，被分析物的延伸序列，該延伸序列包括引物雜交的序列(或其互補(bǔ)序列)。第一引物218包括標(biāo)記序列212，第二引物212包括報(bào)道基因216(或連接報(bào)道基因的偶聯(lián)劑)。使用公知的PCR擴(kuò)增技術(shù)或上面所描述的fast-shot PCR技術(shù)延伸第一引物和第二引物并擴(kuò)增，產(chǎn)物是靶寡聚核苷酸208和它的互補(bǔ)寡聚核苷酸214(如圖4C所示)。其它已知的合成方法，如，固相合成，DNA復(fù)制，逆轉(zhuǎn)錄等都可用于合成靶寡聚核苷酸及它的互補(bǔ)鏈。
回到分析測(cè)試中，靶寡聚核苷酸208一般與締合有捕獲寡聚核苷酸202的支持體206(或一固定微粒支持體的容器)相接觸。如果適當(dāng)?shù)牟东@寡聚核苷酸分子在支持體上存在(如圖4D所示)，通過條件的控制來促進(jìn)靶寡聚核苷酸的標(biāo)記序列和捕獲寡聚核苷酸互被分子識(shí)別序列選擇性雜交。還加入報(bào)道基因(除非互補(bǔ)的寡聚核苷酸214已經(jīng)有了報(bào)道基因)，用于偶聯(lián)互補(bǔ)的寡聚核苷酸214上。可選擇的是，在雜交之前使用如下技術(shù)除去沒有摻入的引物，比如，尺寸排除色譜法，差異沉降法，旋轉(zhuǎn)柱，過濾柱或者雜交后洗脫。
對(duì)于一些平面支持體，分析測(cè)試可以通過讀取支持體各個(gè)獨(dú)立區(qū)域是否有報(bào)道基因的存在而得到檢測(cè)。報(bào)道基因的存在說明該原始樣品中含有擁有被分析物特異序列的被分析物，該被分析物特異序列與支持體區(qū)域上特異性標(biāo)記序列和分子識(shí)別序列相締合。報(bào)道基因的不存在表明樣品中不含有擁有特定被分析物特異序列的被分析物。
對(duì)于顆粒支持體的分析檢測(cè)，微?？梢愿鶕?jù)它們的特性而被分離，然后確定哪種顆粒含帶有通過捕獲寡聚核苷酸和靶寡聚核苷酸偶聯(lián)于微粒上的報(bào)道基因。完成分離的技術(shù)包括，例如，流式細(xì)胞光度儀。報(bào)道基因基團(tuán)的存在表明了樣品含有靶寡聚核苷酸，該靶寡聚核苷酸含有被分析物特異序列，該序列和特定的標(biāo)記序列和特定的捕獲寡聚核苷酸的分子識(shí)別序列相締合。
圖4種所采用的方法可以被調(diào)整用于檢測(cè)樣品中等位基因的存在。比如，該分析包括相應(yīng)于兩個(gè)或多個(gè)等位基因的等位基因特異性引物(包括第一引物218或第二引物222，以及它們兩者)。每一個(gè)等位基因特異性引物包括一個(gè)僅僅和一個(gè)等位基因特異性雜交的序列。連接于等位基因特異性引物的標(biāo)記序列或報(bào)道基因(或偶聯(lián)劑)對(duì)每一個(gè)等位基因來說也是特異的。如果樣品中存在等位基因，與等位基因締合的等位基因特異性引物能被延伸，并被通過與互補(bǔ)的，支持體上等位基因特異性捕獲寡聚核苷酸雜交，或者觀察等位基因特異性報(bào)道基因基團(tuán)的存在而檢測(cè)出來。同樣認(rèn)識(shí)別到，這項(xiàng)測(cè)試也可以用于測(cè)試被分析物中的非等位基因的被分析物特異序列是否存在。
本分析方法可以用于檢測(cè)等位基因中的SNP(單核苷酸多態(tài)性)。無論是第一還是第二引物都是SNP特異性的。通常，兩個(gè)(或多個(gè))不同的SNP特異性引物被用于分析測(cè)試。優(yōu)選地，SNP特異性引物中的SNP位點(diǎn)位于或接近(例如在三至五個(gè)堿基內(nèi))引物的延伸端?！錐ast-shot PCR″技術(shù)可以用于本SNP分析檢測(cè)，因?yàn)槎痰难由鞎r(shí)間基本上減少了非互補(bǔ)引物延伸的可能性。
捕獲寡聚核苷酸和靶寡聚核苷酸之間的雜交是這里描述的分析測(cè)試的特征。象許多傳統(tǒng)的雜交方法一樣，本雜交發(fā)生在雜交混合物內(nèi)，該混合物包括鹽(如，鈉鹽或鎂鹽)，緩沖液(如，TRIS，TAPS，BICINE或MOPS)，非特異性封閉試劑(如，SDS，BSA或剪切的基因組DNA)，和保護(hù)試劑(如，EDTA或疊氮化物)。典型的，雜交發(fā)生在鈉離子(或其它陽離子)濃度至少0.01至1.0M和pH在7.0至8.3時(shí)。一般情況，雜交和洗脫步驟在能滿足保持雜交所需要嚴(yán)謹(jǐn)度的溫度和鹽濃度下進(jìn)行。嚴(yán)謹(jǐn)條件取決于序列。如果愿意的話，在嚴(yán)謹(jǐn)條件的基礎(chǔ)上可以增加洗脫次數(shù)。
選擇的“低嚴(yán)謹(jǐn)條件”是指，比特異性序列在雜交溶液的pH和離子強(qiáng)度下的熱解鏈溫度(Tm)低大約10至15℃。Tm值是指有50％的標(biāo)記序列和互補(bǔ)的分子識(shí)別序列雜交，并處于平衡時(shí)的溫度(固定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度)。
選擇的“中嚴(yán)謹(jǐn)條件”是，比特異性序列在雜交溶液的pH和離子強(qiáng)度下的熱解鏈溫度(Tm)低大約5至10℃。
選擇的“高嚴(yán)謹(jǐn)條件”是比特異性序列在雜交溶液的pH和離子強(qiáng)度下的熱解鏈溫度(Tm)低不到大約5℃。
另一種檢測(cè)分析方案如圖5所示，在圖5A中，兩組或更多組的捕獲寡聚核苷酸252被制備，它們與支持體256相連。捕獲寡聚核苷酸252的每一組都包括一個(gè)特定的分子識(shí)別序列254。每組的分子識(shí)別序列包括至少一個(gè)(一般兩個(gè)或更多)非標(biāo)準(zhǔn)堿基。靶寡聚核苷酸258和互補(bǔ)的寡聚核苷酸264可以，通過例如，PCR擴(kuò)增含有被分析物特異序列或它的互補(bǔ)序列的被分析物而形成。在PCR擴(kuò)增中，使用兩種不同的引物(正如圖5B、5C所示)。第一引物268包含互補(bǔ)于被分析物270第一鏈第一序列的序列，第二引物272包含互補(bǔ)于被分析物270第二鏈第二序列的序列，第二鏈第二序列位于第一序列的上游或下游。典型的，被分析物特異序列包括被分析物的延伸序列和引物所雜交的序列(或其互補(bǔ)序列)。第一引物268包括標(biāo)記序列262，第二引物272包括報(bào)道基因266(或報(bào)道基因的偶聯(lián)劑)。
靶寡聚核苷酸258一般與支持體256接觸(或是一盛有微粒支持體的容器)，該支持體與捕獲寡聚核苷酸252相締合。如果支持體上有適當(dāng)?shù)牟东@寡聚核苷酸分子(如圖5D所示)，控制條件來促進(jìn)靶寡聚核苷酸標(biāo)記序列和捕獲寡聚核苷酸互補(bǔ)的分子識(shí)別序列進(jìn)行選擇性雜交。也加入報(bào)道基因(除非互補(bǔ)的寡聚核苷酸分子264已經(jīng)包含了報(bào)道基因)用于偶聯(lián)互補(bǔ)的寡聚核苷酸264?？蛇x擇的，在雜交之前使用如下技術(shù)除去沒有摻入的引物，比如，尺寸排除色譜法，或者雜交后洗脫。
使用酶280，可將互補(bǔ)寡聚核苷酸264和捕獲寡聚核苷酸252共價(jià)相連。適用的酶有連接酶?？蛇x擇的，如圖5E所示，將靶寡聚核苷酸258從互補(bǔ)的寡聚核苷酸264變性，靶寡聚核苷酸和分析測(cè)試中的其它成分可被洗脫除去，從而留下固定在支持體256上的互補(bǔ)寡聚核苷酸分子264。然后檢測(cè)報(bào)道基因266。
如圖6所示的另一項(xiàng)分析測(cè)試中，靶寡聚核苷酸314形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)或頸環(huán)結(jié)構(gòu)321，323(或典型的雙螺旋結(jié)構(gòu)以外的結(jié)構(gòu))。在這種方法中，第一和第二引物318，322的每一個(gè)分別包括部分標(biāo)記序列312b或部分標(biāo)記序列312a的互補(bǔ)序列。此外，其中的一個(gè)引物322有一報(bào)道基因316(或用于報(bào)道基因的偶聯(lián)劑)結(jié)合于部分標(biāo)記序列312b上。利用，例如PCR技術(shù)，用第一和第二引物318，322擴(kuò)增被分析物320，制備靶寡聚核苷酸314和它的互補(bǔ)序列308。靶寡聚核苷酸314的標(biāo)記序列312b，313a位于靶寡聚核苷酸的兩端。
靶寡聚核苷酸314從它的互補(bǔ)序列308變性分離下來，與固相支持體306相接觸，該支持體帶有擁有分子識(shí)別序列304的捕獲寡聚核苷酸302。如果捕獲寡聚核苷酸其中之一的分子識(shí)別標(biāo)記304與靶寡聚核苷酸314的標(biāo)記序列312b，313a互補(bǔ)，靶寡聚核苷酸314將與捕獲寡聚核苷酸相雜交。在一些實(shí)施方案中，捕獲寡聚核苷酸分為兩部分，每一部分互補(bǔ)于標(biāo)記序列312b，313a的一部分。這兩部分可以用接頭連接。連接頭可以是附加核苷酸或任何其他化學(xué)連接部分。靶寡聚核苷酸314的靶序列構(gòu)成頸環(huán)結(jié)構(gòu)321，323(或其他不是雙螺旋結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu))的至少一部分?？梢园匆陨蠈?shí)施例討論的實(shí)行檢測(cè)。
另一種檢測(cè)分析方案如圖7所示，在圖7A中，被分析物420與起始引物440，442接觸，每一個(gè)引物都具有互補(bǔ)于被分析物420的序列。其中一個(gè)起始引物440還包含一偶聯(lián)基團(tuán)444(例如，生物素，或包含反應(yīng)官能團(tuán)的取代基)，用于底物450相連接。如圖7B所示，起始引物440，442例如利用PCR技術(shù)進(jìn)行延伸。延伸的起始引物446，448分別包括被分析物特異序列或它的互補(bǔ)序列。
然后，延伸的起始引物446，448與底物450相接觸，該底物與延伸的起始引物446的偶聯(lián)基團(tuán)444相互作用，進(jìn)而將延伸了的起始引物446連接到底物450上，如圖7C所示。例如，底物可以被鏈霉抗生物素蛋白包被，延伸的起始引物包包生物素。
接著，第一和第二引物418，422與延伸的起始引物446，448相接觸，如圖7C所示。第一引物418有一個(gè)標(biāo)記序列412，第二引物422有一個(gè)報(bào)告基因416(或用于報(bào)告基因的偶聯(lián)劑)。兩條引物也都包括與延伸的起始引物446，448一部分互補(bǔ)的序列。圖7所示的檢測(cè)同時(shí)表明其它的引物422a也可以被添加。這不是檢測(cè)的一個(gè)必需的特性，但是被用來詳細(xì)說明檢測(cè)等位基因的分析測(cè)試的一個(gè)實(shí)施方案。等位基因特異引物的應(yīng)用可以被用于這里所說明的其它任何檢測(cè)。
在詳細(xì)說明的分析檢測(cè)中，引物422，422a是具有等位基因特異報(bào)道基因416，416a的等位基因特異引物。在詳細(xì)說明的例子中，等位基因只是一個(gè)核苷酸的差異，但這可以理解為應(yīng)用這些技術(shù)對(duì)其他的有一個(gè)以上核苷酸差異的等位基因特異也可檢測(cè)。引物422被延伸是因?yàn)樗c延伸的起始引物446的一段序列是互補(bǔ)的。引物422a因?yàn)樗慌c延伸的起始引物446互補(bǔ)而不能延伸。認(rèn)識(shí)到另一頂檢測(cè)包括有幾個(gè)不同等位基因特異引物，它們帶有等位基因特異標(biāo)記序列(與等位基因特異性報(bào)道基因相對(duì))。還認(rèn)識(shí)到另一種分析測(cè)試包括非等位基因引物，它們用于檢測(cè)被分析樣品中非等位基因被分析物特異性序列的存在與否。
引物418，422被延伸，形成帶有標(biāo)記序列412的靶寡聚核苷酸408和帶有報(bào)道基因416(或一個(gè)報(bào)道基因的偶聯(lián)劑)的互補(bǔ)寡聚核苷酸414。靶寡聚核苷酸408和互補(bǔ)寡聚核苷酸414從延伸的起始引物446，448變性，并和在固相支持體406(如芯片，晶片或粒子)上的捕獲寡聚核苷酸402接觸。靶寡聚核苷酸414和捕獲寡聚核苷酸402雜交，捕獲寡聚核苷酸402含有與標(biāo)記序列412互補(bǔ)的分子識(shí)別序列404。通過觀察與特定捕獲寡聚核苷酸相連的報(bào)道基因是否存在，來確定樣品中被分析物特異序列的存在與否。
在本分析測(cè)試的又一個(gè)實(shí)施例中，第一引物468和第二引物472與被分析物470接觸并且延伸形成靶寡聚核苷酸458和其互補(bǔ)寡聚核苷酸464。在詳述的例子中，第一和第二引物468，472都是等位基因特異性的，但是對(duì)不同的等位基因有特異性。除第一和第二引物，468，372外，其它的第一和第二引物，469，473，如果在樣品中存在的話將可以擴(kuò)增其它等位基因。
第一引物468包含標(biāo)記序列的第一部分462a，第二引物472包含標(biāo)記序列的第二部分462b。462a和462b部分之一包含一報(bào)道基因466(或報(bào)道基因的偶聯(lián)劑)。通常，標(biāo)記序列的462a和462b部分將具有一定的形式而使引物468，472不通過標(biāo)記序列進(jìn)行延伸。例如，462a和462b部分可以包含一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基，它作為一個(gè)堿基連接引物468，472可延伸部分和標(biāo)記序列部分。在這個(gè)實(shí)施方案中，非標(biāo)準(zhǔn)堿基的互補(bǔ)堿基三磷酸核苷不包括在PCR擴(kuò)增反應(yīng)之中。作為選擇，化學(xué)接頭可被用來把標(biāo)記序列部分偶聯(lián)到引物的可延伸部分。合適的接頭的例子包括，但不僅限于n-丙烷基，三亞乙基二醇，六亞乙基二醇，1’，2’雙脫氧核糖，2’-O-甲基核糖核苷酸，脫氧異胞啶，或任何能夠停止聚合酶的鏈。
在支持體456上提供了一個(gè)偶聯(lián)的寡聚核苷酸452。偶聯(lián)的寡聚核苷酸452包括453a，453b部分，他們與標(biāo)記序列的462a和462b部分互補(bǔ)。這些453a，453b部分通過化學(xué)的或核苷酸的接頭454偶聯(lián)，454它可以與兩個(gè)核酸序列的5’(或3’)端偶聯(lián)。
靶寡聚核苷酸458和其互補(bǔ)寡聚核苷酸464與支持體456和捕獲寡聚核苷酸452反應(yīng)，標(biāo)記序列的特異部分462a，462b與捕獲寡聚核苷酸的相應(yīng)部分453a，453b雜交。靶寡聚核苷酸458的剩余部分和互補(bǔ)寡聚核苷酸464典型地形成一個(gè)如圖8所示的結(jié)構(gòu)。
通過PCR技術(shù)加入非標(biāo)準(zhǔn)堿基的分析測(cè)定盡管標(biāo)記的天然核苷酸堿基具有許多用途，但與標(biāo)記的天然核苷酸相關(guān)也有缺點(diǎn)。例如，很難作到一個(gè)標(biāo)記的天然核苷酸堿基的定點(diǎn)摻入。通常，為了在一個(gè)含有腺嘌呤的寡核苷酸上標(biāo)記一個(gè)位點(diǎn)，標(biāo)記的腺苷三磷酸[(dATP*)]被作為一個(gè)底物加入反應(yīng)混合物中，反應(yīng)混合物中包含寡核苷酸模板[dGTP]，[dCTP]和[dTTP]，和聚合酶。如果反應(yīng)混合物中所有的dATP被標(biāo)記，在寡核苷酸序列上的所有腺嘌呤殘基將被標(biāo)記。如果反應(yīng)混合物中dATP只有部分被標(biāo)記，那么，在序列中隨機(jī)位置的腺嘌呤殘基被標(biāo)記。從而標(biāo)記寡核苷酸中一個(gè)單獨(dú)的核苷酸殘基是非常困難的。
可用標(biāo)記的雙脫氧核糖核酸來克服摻入多個(gè)標(biāo)記的核苷酸殘基相關(guān)的問題。因?yàn)殡p脫氧核糖核酸缺少3’羥基，這樣寡核苷酸只能在末端部分引入標(biāo)記了的雙脫氧核糖核酸?？捎门苄蛄刑輥頊y(cè)寡核苷酸序列以確定標(biāo)記核苷酸的位置。因?yàn)楣押塑账嵩谝腚p脫氧核糖核酸的位置終止，雙脫氧核糖核酸通常不能和寡核苷酸鏈擴(kuò)增結(jié)合使用。
圖9顯示了本發(fā)明的一類檢測(cè)，包括通過PCR把非標(biāo)準(zhǔn)堿基摻入。第一和第二引物518，522與被分析物520雜交并且延伸。引物522之一包括一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基550，當(dāng)延伸時(shí)，變成靶寡核苷酸508?？蛇x擇的，非標(biāo)準(zhǔn)堿基550后還可以附加額外的堿基。靶寡核苷酸508帶有非標(biāo)準(zhǔn)堿基550，其然后與固相支持體506a，506b接觸，固相支持體506a，506b包含有捕獲寡核苷酸502a，502b。在圖9中顯示的固相支持體是上面討論過的微粒支持體，然而，認(rèn)識(shí)到也能使用一個(gè)單獨(dú)的固相支持體(如，一個(gè)芯片或晶片)。
捕獲寡核苷酸502a，502b是不同的，并分別與不同的支持體506a，506b連接。因此捕獲寡核苷酸能通過檢測(cè)所相連的支持體獨(dú)有特征而被識(shí)別。一個(gè)捕獲寡核苷酸502a與靶寡核苷酸508雜交。此實(shí)施方案中，捕獲寡核苷酸502a具有一個(gè)與靶寡核苷酸508的被分析物特異序列至少一部分互補(bǔ)的序列。
靶寡核苷酸508雜交之后，捕獲寡核苷酸502a在包含有dATP，dUTP，dGTP，dCTP的PCR反應(yīng)液中延伸，第二個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基核苷三磷酸(如，diso-GTP)552互補(bǔ)于靶寡核苷酸508上的非標(biāo)準(zhǔn)堿基550。第二個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基552被報(bào)告基因516(或報(bào)告基因的偶聯(lián)劑)標(biāo)記。隨著捕獲寡核苷酸被延伸，被報(bào)告基因516標(biāo)記的第二個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基552被摻入到延伸的捕獲寡核苷酸中，并與非標(biāo)準(zhǔn)堿基550的位置相對(duì)。這樣，在特定支持顆粒上報(bào)道基因存在與否，表明了與捕獲寡核苷酸偶聯(lián)的特定靶寡核苷酸的存在與否。
圖10所示為另一個(gè)分析。在此分析中，第一引物618包含一個(gè)標(biāo)記序列612，第二引物622在它的5’端有一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基(或一個(gè)包含非標(biāo)準(zhǔn)堿基的序列)621。引物618，622在dATP，dCTP，dGTP，dTTP存在條件下擴(kuò)增被分析物620，非標(biāo)準(zhǔn)堿基核苷三磷酸互補(bǔ)于非標(biāo)準(zhǔn)堿基621。這種非標(biāo)準(zhǔn)堿基核苷三磷酸被一個(gè)報(bào)道基因616(或報(bào)道基因的偶聯(lián)基團(tuán))標(biāo)記，并被摻入到對(duì)應(yīng)于非標(biāo)準(zhǔn)堿基621的位置，形成靶寡核苷酸608。
靶寡核苷酸608與固相支持體606相接觸，固相支持體606帶有捕獲寡核苷酸602，而捕獲寡核苷酸602含有分子識(shí)別序列。如果分子識(shí)別序列其中之一與靶寡核苷酸608的標(biāo)記序列612互補(bǔ)，靶寡核苷酸608將與捕獲寡核苷酸602雜交。檢測(cè)將以前面實(shí)施例中討論過的方法進(jìn)行。
圖11所示仍是另一個(gè)分析。在此分析中，第一引物718包含一個(gè)標(biāo)記序列712，第二引物722在它的5’端有一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基721跟隨一個(gè)天然堿基(或是一天然堿基序列)723。引物18，722在dATP，dCTP，dGTP和dTTP存在的情況下擴(kuò)增被分析物720，僅形成部分延伸的靶寡核苷酸707和它的互補(bǔ)物714。此部分延伸的靶寡核苷酸的延伸被非標(biāo)準(zhǔn)堿基721所限。在擴(kuò)增啟始之后，要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物707，714進(jìn)行清洗以除去dATP，dCTP，dGTP和dTTP。
第二個(gè)延伸步驟接著在互補(bǔ)于非標(biāo)準(zhǔn)堿基721的非標(biāo)準(zhǔn)堿基三磷酸，和至少有互補(bǔ)于天然堿基723的天然堿基三磷酸存在的情況下進(jìn)行。這個(gè)天然堿基三磷酸被報(bào)告基因716(或報(bào)道基因的偶聯(lián)基團(tuán))所標(biāo)記，并且被摻入到與天然堿基723相對(duì)的位置，形成靶寡核苷酸708。
靶寡核苷酸708與固相支持體706相接觸，固相支持體706帶有擁有分子識(shí)別序列的捕獲寡核苷酸702。如果分子識(shí)別序列中的一個(gè)是與靶寡核苷酸708的標(biāo)記序列712互補(bǔ)的，則靶寡核苷酸708將與捕獲寡核苷酸702雜交。隨后的檢測(cè)根據(jù)上文實(shí)施例中討論過的進(jìn)行。
在一個(gè)具體的例子中，等位基因特異第二引物和相同的第一引物共同使用。等位基因特異第二引物不同于在從被分析物上退火的第二引物的部分。對(duì)每個(gè)等位基因而言選擇不同的天然堿基723。在延伸的第二個(gè)步驟中，在相對(duì)于非標(biāo)準(zhǔn)堿基721和天然堿基723處加上的堿基，兩個(gè)或更多的天然堿基核苷三磷酸被加入到延伸混合物中。不同的核苷三磷酸被不同的報(bào)道基因標(biāo)記。因此，如果天然堿基723可以是A或C，這依賴于等位基因，在延伸步驟中使用的[dTTP]和[dGTP]被用不同的報(bào)道基因標(biāo)記。報(bào)道基因的鑒定可以判斷一個(gè)特定相關(guān)的等位基因的存在。進(jìn)而，例如四種不同的等位基因可以用這種方法同時(shí)檢測(cè)出來，在適當(dāng)?shù)膱?bào)道基因的選擇下，可以利用四種不同顏色而顯示。
其他分析圖16所示的一個(gè)分析中，制備兩組或多組捕獲寡核苷酸902。每組捕獲寡核苷酸902包含一個(gè)獨(dú)特的分子識(shí)別序列904。每組的這一分子識(shí)別序列任選地包含有至少一個(gè)或多個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基。典型的，捕獲寡核苷酸也包含一個(gè)能附著于固相支持體906的反應(yīng)官能團(tuán)，像上面提到的，其他連接方式也可被利用。
在一個(gè)具體例子中，檢測(cè)的支持體是微粒支持體(如珠子)?？梢岳斫猓@里描述的任何檢測(cè)可以在一個(gè)單獨(dú)的固體支持體上，在一個(gè)顆粒支持體上，或者其他的任何支持體上進(jìn)行。顆粒支持體被分為若干組顆粒，每組顆粒具有一個(gè)特性(如顏色，形狀，大小，密度或其他的物理化學(xué)特性)，這特性使它們各自區(qū)分開來。每組捕獲寡核苷酸與一組或多組顆粒偶聯(lián)。這造成了一組特定顆粒與一組特定捕獲寡核苷酸的偶聯(lián)，允許通過觀察獨(dú)特的顆粒支持體特性來鑒別捕獲寡核苷酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中(未給出)，分析的支持體可以是，例如，一個(gè)單獨(dú)固相支持體，如玻璃，金屬，塑料，或無機(jī)芯片。捕獲寡核苷酸被排列于支持體上，并用上述方法中的一種(如經(jīng)捕獲寡核苷酸和支持體上的反應(yīng)基團(tuán)偶聯(lián)并支持，用支持體上的結(jié)合劑，或捕獲寡核苷酸交聯(lián))來固定。每一組排列于一個(gè)或多個(gè)的固相支持體的特定區(qū)域，以使區(qū)域能與特定的捕獲寡核苷酸相締合。
回到圖16，靶寡核苷酸908，如果在檢測(cè)的樣品中存在，與第一引物909和第二引物911接觸。第一和第二引物909，911可以是等位基因特異性的，或優(yōu)選的是，是不與靶寡核苷酸等位基因特異性部分互補(bǔ)的(如，感興趣的等位基因特異性部分定位在靶寡核苷酸中與兩個(gè)引物雜交之間的區(qū)域)。第二引物911也包括了非互補(bǔ)連接區(qū)905，這個(gè)非互補(bǔ)報(bào)道基因連接區(qū)905可選擇的包括一個(gè)或多個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基。使用第一和第二引物909，911和PCR技術(shù)使靶寡核苷酸908被擴(kuò)增，獲得一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物907，它含有報(bào)道基因連接區(qū)905。
擴(kuò)增產(chǎn)物907然后與等位基因特異性引物920a，920b接觸后延伸，如果存在特定的等位基因，則用與PCR相近的反應(yīng)條件和反應(yīng)成分來產(chǎn)生等位基因特異延伸產(chǎn)物922。每個(gè)等位基因特異性引物920a，920b帶有互補(bǔ)于不同的分子識(shí)別序列904和捕獲寡核苷酸902的等位基因特異性標(biāo)記序列。當(dāng)?shù)任换蛱禺愐?20a，920b延伸時(shí)，互補(bǔ)于連接區(qū)905一個(gè)或多個(gè)堿基的標(biāo)記了的核苷酸925(或寡核苷酸)就可以被產(chǎn)生。被標(biāo)記的核苷酸925或寡核苷酸可以包括一個(gè)報(bào)道基因或偶聯(lián)劑，如生物素，用于報(bào)道基因的附著。
延伸產(chǎn)物922形成以后，與捕獲寡核苷酸902和報(bào)告基因930相反應(yīng)(除非報(bào)道基因已經(jīng)連上)。捕獲寡核苷酸902和支持體906鑒別樣品中存在哪個(gè)等位基因，報(bào)道基因提供了延伸產(chǎn)物922的可檢測(cè)性。對(duì)于顆粒支持體的檢測(cè)，顆?？梢愿鶕?jù)獨(dú)特特性而被分開，然后確定哪些微粒906上有報(bào)道基因通過捕獲寡核苷酸902和延伸產(chǎn)物922連接到微粒上。實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)包括，例如，流式細(xì)胞術(shù)。報(bào)告基因基團(tuán)的存在表明樣品中含有擁有特定等位基因特異性標(biāo)記序列的等位基因。
分子識(shí)別序列的選擇當(dāng)多個(gè)分子識(shí)別序列被使用時(shí)，就形成了能通過對(duì)單一樣品進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)多個(gè)被分析物特異性序列的分析系統(tǒng)。不同分子識(shí)別序列的集合是必要的。優(yōu)選地，分子識(shí)別序列有足夠的不同，以準(zhǔn)許在希望的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，對(duì)被分析物特異序列進(jìn)行可靠的檢測(cè)。各種不同的方法可以被用于選擇分子識(shí)別序列的集合。下面詳細(xì)描述一些能用的方法和標(biāo)準(zhǔn)。這些方法和標(biāo)準(zhǔn)可以單獨(dú)使用也可以聯(lián)合使用。
下面的例子是可以用于創(chuàng)造分子識(shí)別序列的集合的標(biāo)準(zhǔn)序列中的堿基數(shù)目，序列中的非標(biāo)準(zhǔn)堿基數(shù)目，序列中連貫的天然堿基的數(shù)目，在任何兩個(gè)序列中相同連續(xù)堿基(不是正向就是逆向)的數(shù)目，特殊需要的序列(例如，在3’端或’端或兩端的GC夾)、估計(jì)的或?qū)嶋H的解鏈溫度。一個(gè)測(cè)定Tm的方法的例子被Peyret等描述，Biochemistry，38，3468-77(1999)，在這里一并引作參考。非標(biāo)準(zhǔn)堿基可以經(jīng)過估計(jì)或計(jì)算而使用，例如，其他堿基的值(如，is-G/iso(可以通過用G/C來估計(jì))，或應(yīng)用如下面提到的實(shí)驗(yàn)資料。
以下是可以用于建立分子識(shí)別序列集合的一系列步驟1)用天然堿基和期望的非標(biāo)準(zhǔn)堿基(如或iso-C，或iso-G或兩者)建立一個(gè)寡核苷酸的系列，該寡核苷酸的系列包括具有長度n1(如8，9或10個(gè)核苷酸)的所有可能的寡核苷酸。
2)任選地要求使寡核苷酸有一個(gè)特異的亞序列(如，位于3’或5’或兩末端上的GC夾)。
3)除去不帶至少n2個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基(如，不帶至少兩個(gè)iso-C堿基)或帶有多于n3個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基(如，帶有多于兩個(gè)iso-C堿基)或綜合兩者(如，僅接受恰恰帶有兩個(gè)iso-C堿基)的寡核苷酸。
4)任選地在一組內(nèi)除去帶有n4(如，4或5)個(gè)天然堿基的寡核苷酸。
5)選擇一個(gè)剩余寡聚核苷酸，除去其他任何的、在寡聚核苷酸序列上有相同序列n5個(gè)堿基(如5或6個(gè)堿基)的剩余寡核苷酸。對(duì)每個(gè)未除去的寡聚核苷酸重復(fù)此操作。
6)任選地選擇一個(gè)剩余寡核苷酸并測(cè)它的反向互補(bǔ)序列(如，“ACT”的反向互補(bǔ)為“AGT”)，然后除去其他任何具有n6個(gè)與反向互補(bǔ)序列部分相同的連續(xù)堿基(如，4或5堿基)的寡核苷酸。對(duì)于每個(gè)未除去的寡核苷酸都進(jìn)行重復(fù)。
7)任選地只選擇估計(jì)或?qū)嶋H解鏈溫度(Tm)在期望溫度范圍內(nèi)的，在期望溫度下限以上，或在期望溫度上限以下的剩余寡核苷酸。例如，具有的解鏈溫度低于室溫(大約22℃)的寡核苷酸可被除去。
實(shí)施例實(shí)施例1編碼及標(biāo)記序列的交叉雜交檢測(cè)這項(xiàng)分析中使用的儀器包括Luminex100和Luminex微珠，DNA合成儀(Northern Engineering公司)，點(diǎn)測(cè)量合成領(lǐng)域的分光光度計(jì)、薄層層析柱(TLC)(SI250F TLC硅膠板，JTBaker)、用于寡聚核苷酸定性控制、離心機(jī)、超聲波儀(Ney Dental)、渦旋儀(Vortex)和各種移液器(2，20，200和1000μl)一組至少100條寡核苷酸鏈(分子識(shí)別序列)及其互補(bǔ)序列(標(biāo)記序列)被設(shè)計(jì)并合成。這兩組寡聚核苷酸包含非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(isoC和isoG)(EraGenBiosciences，Inc.，Madison，WI)和天然核苷酸(A，G，C和T)(Perkin-Elmer/ABI)，長9至10bp。第一組被設(shè)計(jì)為分子識(shí)別序列的寡核苷酸鏈的5’端用一個(gè)氨基修飾物(C6-TFA，Glen Reasch)標(biāo)記。另一組互補(bǔ)的寡聚核苷酸被設(shè)計(jì)為標(biāo)記序列，并在5’端則被Cy3(Glen Reasch))標(biāo)記。
將分子識(shí)別序列與特定的Luminex微珠相偶連使用下面的試劑0.1mM 2-[N-嗎啉子]乙磺酸(MES) (pH4.5)(Sigma)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸(EDC)(Pierce)，0.02％(v/v)Tween(Sigma)，0.1％(W/v)SDS(Sigma)雜交步驟包括雜交緩沖液Sourav 0.5，包含10mM Tris(Sigma)，1mM EDTA(Sigma)，200mM NaCl(Aldrich)，10mM MgCl2(Aldrich)，及1％(W/v)PEG8000(Sigma)。
98條分子識(shí)別序列用MES稀釋成1nmol/μl。制備98種特異性Luminex微珠用來偶聯(lián)。微珠在實(shí)驗(yàn)前要經(jīng)超聲波處理20秒再渦旋振蕩10秒。從1.25×107珠/ml的微珠溶液中取出5×107的微珠，放入一個(gè)1.5mL的微量離心管中。微珠用10,000rcf離心1分鐘。將微珠傾析，小心不要攪動(dòng)微珠，然后將微珠移入50μL MES中，進(jìn)行超聲波處理和渦旋振蕩。為了將分子識(shí)別序列偶聯(lián)到不同微珠上，每種獨(dú)特微珠中加入1nmol各種分子識(shí)別序列，再向混合物加入1.75μl新配制的EDC(20mgEDC/1mL ddH2O)，進(jìn)行超聲波處理和渦旋振蕩。接著將混合液在室溫、黑暗放置30分鐘，每10分鐘渦旋振蕩一次。三十分鐘后，再加入1.75μl新配制的EDC。溫育30分鐘，每10分鐘渦旋振蕩一次。
偶聯(lián)后，加入400μl Tween-20洗微珠，渦旋振蕩，10,000rct/分鐘離心，棄上清。再加入400μlSDS，離心，棄上清，最后加入100μl MES，然后計(jì)數(shù)。
互補(bǔ)的寡核苷酸(標(biāo)記序列)用TLC和聚丙烯酰胺凝膠來定量和定性，并用MOPS稀釋為終濃度為50fmol/μl的操作溶液。
計(jì)數(shù)之后，Luminex微珠/分子識(shí)別序列被結(jié)合在一個(gè)98微珠板上(98 beadset)(1000微珠/微珠區(qū)/孔)來進(jìn)行分析。在98微珠板的基礎(chǔ)上，有一種50微珠板(2500微珠/微珠區(qū)/孔)已經(jīng)問世。表1列舉了50微珠板的分子識(shí)別序列，表2列舉了98微珠板的分子識(shí)別序列。
在進(jìn)行交叉雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)，取50fmol的標(biāo)記序列(1->98)移入兩塊96孔板的孔中(第1和第2孔作為對(duì)照)?，F(xiàn)在Luminex100的局限性在于，布置的資料組為98個(gè)標(biāo)記序列，和2個(gè)作為對(duì)照(沒有標(biāo)記序列)以消除背景。
向每孔加入主混合液(98種混合)，10μl/孔，再向每孔加入31μL 2×Sourav 0.5雜交緩沖液，并用雙蒸水補(bǔ)足至62μl/孔總體積。混合好試劑并且在室溫保溫約10分鐘。樣品立即在Luminex100的流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。
50微珠主混合液也對(duì)其相應(yīng)的互補(bǔ)分子識(shí)別序列及標(biāo)記序列施加，只是標(biāo)記序列的用量為500fmol/孔。
下面的數(shù)據(jù)報(bào)告了兩塊微珠板上每微珠的熒光介質(zhì)強(qiáng)度(MedianFluorescence Intensity，MFI)。圖12顯示了用98微珠主混合實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)繪制的3D表面圖。Y軸表示分子識(shí)別序列，X軸表示標(biāo)記序列。圖13顯示了50微珠主混合實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)繪制的3D表面圖。
表150個(gè)珠子的分子識(shí)別序列(Y＝iso，X＝iso-G)
表298個(gè)珠子的分子識(shí)別序列(Y＝iso-C，X＝iso-G)
實(shí)施例2初步確定非標(biāo)準(zhǔn)堿基在預(yù)測(cè)核酸雙螺旋穩(wěn)定性參數(shù)中的作用本實(shí)驗(yàn)使用帶有溫控系統(tǒng)和樣品架的beckman DU-7500分光儀。精確的控溫系統(tǒng)可以同時(shí)測(cè)量六個(gè)樣品的溫度。石英杯選用美國Hellma產(chǎn)品，為了覆蓋樣品濃度的一百倍的范圍，其光程長度分別為0.1cm，0.2cm，0.5cm，和1.0cm。DNA在Perkin-Elmer/ABI公司的392型DNA合成儀上合成。TLC層析用盛液槽(Fisher)，TLC平板(Si250F，JTBaker)。使用Sanvant SpeedVac制備DNA，還使用了Sep-pakC-18純化柱(Waters)，紫外燈，渦旋振蕩器，100cc針筒，及微量取液器若干(2，20，200，1000μl)。
寡核苷酸的合成使用了天然核苷酸(A，G，C和T)(Perkin-Elmer/ABI)和isoC和isoG(EraGen Biosciences，Inc.，Madison，WI)。表3和表4列舉了人工合成的自身互補(bǔ)序列和非自身互補(bǔ)的序列。
表3自身互補(bǔ)序列(isoG＝X，isoC＝Y(jié))
表4非自身互補(bǔ)的序列(isoG＝X，isoC＝Y(jié))
寡聚核苷酸純化和解鏈實(shí)驗(yàn)中使用以下試劑用n-丙醇/氨/水(體積比55∶35∶10)(參考以下文獻(xiàn)Chou，S.-H.，F(xiàn)lynn，P.，和Reid，B.(1989)《生物化學(xué)》(Biochemistry)28，2422-2435，)對(duì)TLC洗脫5-6小時(shí)，以純化TLC。雜交實(shí)驗(yàn)在1×SL脫氣緩沖液中進(jìn)行(1.0M NaCl(Fisher)，10mM二甲胂酸鈉(Fisher)，0.5mM Na2EDTA，pH7)(參考文獻(xiàn)SantaLucia，J.，Allawi，H.，和Seneviratne，P.A.，(1996)《生物化學(xué)》(Biochemistry)35，3555-3562，這里引作參考)。
使用MeltwinTMv3.0，熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)通過解鏈曲線的數(shù)據(jù)確定，如Petersheim，M.，和Turner，D.H.(1983)《生物化學(xué)》(Biochemistry)22，253-263所述，這里引作參考。
合成后，寡核苷酸鏈置于氨水中，50℃過夜，再經(jīng)凍干，將每個(gè)樣品用175μl雙蒸水溶解，經(jīng)TLC純化，洗脫5-6小時(shí)。洗脫越劇烈，移動(dòng)帶會(huì)越少，越不容易弄花平板。洗脫要用3ml雙蒸水進(jìn)行三次。使用Sep-pakTM柱對(duì)寡核苷酸進(jìn)行進(jìn)一步除鹽和純化，用30％乙腈，10mM碳酸氫銨，pH7(SantaLucia，J.，Allawi，H.，和Seneviratne，P A.，(1996)《生物化學(xué)》(Biochemistry)35，3555-3562)進(jìn)行洗脫，最后用SpeedVacTM干燥。
自身互補(bǔ)的寡核苷酸被定量，收集及OD260為2.0的，然后用SpeedVacTM再干燥。寡核苷酸用1×SL緩沖液進(jìn)行梯度稀釋以形成一百倍的稀釋濃度范圍。通過Beckman DU-7500分光光度計(jì)測(cè)量光吸收與溫度的分布圖，過程中還需要多種常規(guī)微比色杯，樣品架及溫控裝置。表5和表6列舉了一組樣品稀釋梯度，其稀釋梯度是根據(jù)表3和表4的各樣品制備的。
表5梯度A
測(cè)量完A1-A5樣品后，第二組稀釋溶液被設(shè)置。B組中，在上一次樣品中剩余的24.71μl被在A-3，A-4和A-5比色杯中與稀釋物加在一起(總共約172.5μl)合并，再加入345μl lx SL緩沖液。
表6梯度B
裝入液體后，每個(gè)比色杯(cuvette)容積上部分要留出約4％的空間以保證解鏈過程中樣品的散熱。
在每次操作中，樣品都要進(jìn)一步脫氣，然后提高溫度到85℃退火5分鐘，接著降溫到到10℃保溫5分鐘以上。在低溫條件下，取干燥氬作為空白對(duì)照以限制濃縮。A、B兩組同時(shí)測(cè)量OD260和OD280。當(dāng)溫度從10℃提升到90℃時(shí)，樣品以1.0℃/min的恒定速度升溫。
收集解鏈實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)并用MeltwinTM軟件做In(G)與Tm-1的最適曲線分析，其中G是總的鏈的濃度，Tm-1是解鏈溫度的倒數(shù)(Borer，P.N.，Dengler，B.，Tinoco，I.Jr，和Uhlenbeck，O.C.(1974)《分子生物學(xué)學(xué)報(bào)》(J.Mol.Biol)86，843-853，在此引入做為參考)。
非自身互補(bǔ)寡核苷酸以相同的摩爾量合并，OD260為2.0 260nm下的光密度，并以和表5和表6中自身互補(bǔ)寡核苷酸稀釋梯度相同的方式稀釋。同樣的，非自身互被寡核苷酸的解鏈數(shù)據(jù)由MeltwinTM收集并分析。
表7和表8總結(jié)了由MeltwinTM得到的自身互補(bǔ)寡核苷酸和非自身互補(bǔ)寡核苷酸的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
表7自身互補(bǔ)寡核苷酸序列的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)(isoC＝Y(jié)，isoG＝X)
表8非自身互補(bǔ)寡核苷酸序列的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)(isoC＝Y(jié)，isoG＝X)
所有的樣品都具有濃度依賴性TM并發(fā)生單相解鏈轉(zhuǎn)換。isoC和isoG使得雙螺旋形式比較穩(wěn)定，每個(gè)isoC/isoG對(duì)使解鏈溫度要比天然(A、T、G、C)的Watson-Crick寡核苷酸高5℃樣品3B和4C至10℃(樣品3C和4E)。
表7和8顯示了當(dāng)AEGIS堿基混入天然DNA時(shí)所發(fā)生的一些最臨近效應(yīng)的程度。
實(shí)施例3及其對(duì)比實(shí)施例位點(diǎn)控制性摻入第一引物5′AGAACCCTTTCCTCTTCC(SEQ ID NO104)靶序列5’AAGAACCCTTTCCTCTTCCGATGCAGGATACTTAACAATAAATATTT(SEQ ID NO105)第二引物CTACGTCCTATGAATTGTTATTTATAAAYAGGACAGACG5’(SEQ ID NO106)
Y＝isoCTP第一引物及其靶序列以及第二引物分別為SEQ ID NO104，SEQ ID NO105，和SEQ ID NO106所示。
用如下混合液進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)20μl反應(yīng)體積中加入0.2μM第一引物，0.2μM第二引物，50fM靶序列，dGTP，dATP，dTTP和dCTP，各50μM，10mM TrispH8，0.1％BSA，0.1％Triton X-100，0.1μg/μl降解的鮭魚精DNA，40mMKAc，2mM MgCl2，1U Amplitaq Stoffel(Perkin Elmer Biosciences，F(xiàn)oster City，CA)。混合液在95℃先保溫2分鐘，循環(huán)在95℃1秒和58℃10秒，設(shè)置30個(gè)PCR循環(huán)。最終在58℃保溫2分鐘。
制備兩種PCR反應(yīng)混合液。每種PCR混合液都要用AutoseqTMmicrospin column(Amersham Pharmacia Biotech Inc.，Piscataway，NJ)進(jìn)行脫鹽以除去未結(jié)合的dNTPs，在將樣品脫鹽之前用柱緩沖液與ddH2O交換。脫鹽后的樣品用下面的反應(yīng)組分來調(diào)節(jié)至終濃度在25μl反應(yīng)體積中加入10mM Tris pH8，0.1％BSA，0.1％TritonX100，0.1μg/μl降解的鮭魚精DNA，40mM KAc，2mM MgCl2，1U/反應(yīng)AmplitaqStoffel(Perkin Elmer Biosciences，F(xiàn)oster City，CA)，和10μM Cy3-dTTP(NEN lifescience Products，Inc.，Boston，MA)。此外，disoGTP按如下濃度添加0μM(對(duì)照例)或40μM(實(shí)施例3)。反應(yīng)混合液在68℃保溫15分鐘，取5μl產(chǎn)物用10％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。凝膠用595熒光成像儀(Molecu lar Dynamics，Sunnyvale，CA)檢測(cè)含有Cy3的延伸產(chǎn)物。
結(jié)果顯示(未給出資料)，當(dāng)沒有disoGTP時(shí)，第一引物在最終的PCR反應(yīng)中不會(huì)引發(fā)額外的延伸(即，相對(duì)于引物2的iso-C，沒有或很少有堿基錯(cuò)配)。
實(shí)施例4標(biāo)記的5’-三磷酸脫氧iso鳥嘌啉核苷酸的合成下面的化學(xué)反應(yīng)中，三丁銨焦磷酸從Sigma公司購買，生物素N-羥基丁二酰亞胺酯，從Pierce化學(xué)公司購買；所有其它化學(xué)藥品都購自Aldrich化學(xué)公司或者Fisher化學(xué)公司，并且沒有經(jīng)過進(jìn)一步的純化就進(jìn)行使用。溶劑通過4分子篩進(jìn)行干燥。反應(yīng)在烘箱干烤過的玻璃器皿中，在干燥的氬中進(jìn)行。用硅膠進(jìn)行柱層析(230-425目)。
縮寫Ac2O 醋酸酐DMF N，N-二甲基甲酰胺DMAP 4，4-二甲氨基吡啶DMT 4，4-二甲氧三苯甲基Et3N 三乙胺MeCN 乙腈MeOH 甲醇Tol 對(duì)-甲苯甲酰1-(p，p’ -二甲氧三苯甲基)-己二胺(2)己二胺(10當(dāng)量，375mmol，43.5g)從吡啶中被共蒸餾兩次，并溶解在100毫升的吡啶中。加進(jìn)DMAP(0.1當(dāng)量，3.75mmol，457mg)，將反應(yīng)燒瓶冰浴。溶解在100毫升吡啶中的4，4-二甲氧三苯甲基-氯(1當(dāng)量，37.5mmol，12.69g)被逐滴加進(jìn)去，耗時(shí)2個(gè)小時(shí)以上。室溫，攪動(dòng)4個(gè)小時(shí)，加進(jìn)MeOH(5ml)，反應(yīng)混合液進(jìn)行濃縮，剩余的殘余物用碳酸氫鈉水溶液/乙酸乙酯萃取。有機(jī)層用碳酸氫鈉水溶液洗2遍，干燥，溶劑被蒸發(fā)。得到的產(chǎn)物不進(jìn)一步純化，在下一步中使用。
產(chǎn)量14.895g(35.634mmol，95％)粘稠油狀物。
2-氯-6-(6-p，p’-二甲氧三苯甲基氨基己基)-氨基嘌呤-2’-脫氧-3’，5’-二甲苯甲酰核苷(3)化合物2(1.3當(dāng)量，31.916mmol，13.34g)與DMF共蒸發(fā)并溶于100ml DMF。加入溶于100ml DMF的二異丙基乙胺(3.9當(dāng)量，95.748mmol，16.65ml)和化合物1(1當(dāng)量，24.551mmol，13.282g)，室溫?cái)嚢?小時(shí)。之后進(jìn)行濃縮，剩余物用碳酸氫鈉水溶液/乙酸乙酯萃取，有機(jī)層干燥，蒸發(fā)溶劑。殘余物用乙醚研磨兩次，得到的固體物不經(jīng)進(jìn)一步純化，真空干燥后進(jìn)一步使用。
2-芐氧基-6-(6-p，p’-二甲氧三苯甲胺己基)-氨基嘌呤-2’-脫氧核糖核苷(4)化合物3(1當(dāng)量，19.23mmol，17.74g)溶于DMF(25ml)并加NaH(10當(dāng)量，192.3mmol，7.69g，在礦物油中60％的分散物)的一種苯甲醇溶液(128ml)。反應(yīng)混合物120℃加熱6小時(shí)，然后在濾過C礦之前于室溫?cái)嚢?5小時(shí)，蒸發(fā)濾出物，剩余物用乙酸乙酯/水萃取，有機(jī)層用NaHCO3溶液清洗，干燥，蒸發(fā)溶劑，剩余物用乙醚/正己烷(1∶10)研磨5次。
TLCCHCl3/10％MeOHRF＝0.26產(chǎn)量10.280g(13.562mmol，70.5％用于2步)泡沫。
2-芐氧基6-(6-p，p’-二甲氧三苯甲基氨基己基)-氨基嘌呤-2’-脫氧-5’-O-p，p’-二甲氧三苯甲基核苷(5)化合物4(14.7388mmol，11.172g)用吡啶共蒸發(fā)，溶于150ml吡啶，加DMAP(0.25當(dāng)量，3.6847mmol，450mg)。燒瓶放在冰浴上，在2小時(shí)中緩慢加DMTCl(1.5當(dāng)量，22.108mmol，7.484g)。室溫?cái)嚢?2小時(shí)，加MeOH(1ml)，濃縮反應(yīng)混合物，剩余物用氯仿/NaHCO3水溶液萃取。有機(jī)層進(jìn)行干燥，蒸發(fā)溶劑，剩余物用乙醚/正己烷1∶1研磨以去除多余的DMT，不溶性固狀物進(jìn)行干燥，不另外純化即可進(jìn)一步使用。
產(chǎn)量14.890g(14.047mmol，95％)淺棕色泡沫。
2-芐氧基-6-(6-p，p’-二甲氧三苯甲基氨基己基)-氨基嘌呤-3’-O-乙酰基2’-脫氧5’-O-p，p’-二甲氧三苯甲基核苷(6)化合物5(14.047mmol，14.89g)用吡啶共蒸發(fā)，溶于200ml吡啶，加DMAP(0.25當(dāng)量，3.5117mmol，428mg)，Et3N(5當(dāng)量，70.235mmol，9.7ml)和Ac2O(2.5當(dāng)量，35.1175mmol，3.582g)。室溫?cái)嚢?.5小時(shí)，加MeOH(2ml)，濃縮反應(yīng)混合物，剩余物用乙酸乙酯/NaHCO3水溶液萃取。有機(jī)層進(jìn)行干燥，蒸發(fā)溶劑，剩余物用層析柱純化，采用一步梯度，先乙酸乙酯/正己烷/Et3N 30∶60∶1，然后是65∶35∶3。產(chǎn)量5.93g(5.385mmol，38％)，黃色泡沫。
2-芐氧基-6-(6-氨基己基)-氨基嘌呤-3’-O-乙酰-2’-脫氧核苷-(7)化合物6(2.471mmol，2.723g)溶于50ml乙腈/2ml水，加Ce(NH4)2(NO3)3(0.3當(dāng)量，0.74mmol，406mg)?；亓骷訜?5分鐘，然后再加0.15當(dāng)量Ce(NH4)2(NO3)3(0.37mmol，205mg)，繼續(xù)回流加熱1小時(shí)。然后蒸發(fā)，剩余物用乙醚研磨去除DMT，不溶物進(jìn)行干燥，不另外純化備用。
2-芐氧基-6-(6-三氟乙酰氨基己基)-氨基嘌呤-3’-O-乙?；?2’-脫氧核苷-(8)上面所得化合物7(最多5.385mmol)溶于30ml MeOH/50ml三氟醋酸乙酯/5ml Et3N中，反應(yīng)混合物于室溫?cái)嚢?1.5小時(shí)。TLC(氯仿/17.5％MeOH):RF＝0.72)顯示完全轉(zhuǎn)化。然后進(jìn)行蒸發(fā)，剩余物用鹽水/乙酸乙酯萃取，有機(jī)層干燥，蒸發(fā)溶劑，剩余物通過硅膠層析柱純化，采用一步梯度，先是氯仿/1.5％MeOH，然后是17.5％MeOH。產(chǎn)量2.80g(4.714mmol，87％)泡沫。
2-芐氧基-6-(6-三氟乙酰氨基己基)-氨基嘌呤-3’-O-乙?；?5’-三磷?；?2’-脫氧核苷-(9).
咪唑(61當(dāng)量，306mg，4.5mmol，重結(jié)晶)溶于乙腈(3.6ml)并冷卻至0℃。加入POCl3(19當(dāng)量，0.128ml)和三乙胺(61當(dāng)量，0.633ml)，于0℃攪拌0.5小時(shí)，然后加一部分(0.309ml)給化合物8(1當(dāng)量，0.074mmol，44mg)。此混合物室溫下攪拌0.5小時(shí)，然后加含有三丁基銨焦磷酸鹽(2當(dāng)量，0.16mmol，73mg)的DMF(1.5ml)。24小時(shí)后用2ml 10％NH4COO終止反應(yīng)并低壓凍干。產(chǎn)物通過陰離子交換層析(Dionex ProPac SAX-10)，使用20％MeCN和一個(gè)(NH4)2CO3/20％MeCN梯度而純化。收集到的產(chǎn)物反復(fù)低壓凍干以除去多余鹽分。產(chǎn)量0.007mmol(10％)，白色固體。
6-(6-氨基己基)-氨基嘌呤-5′-三磷?；?2′-脫氧核苷(10).
化合物9(0.007mmol)溶于甲醇(2.5ml)然后加Pd/C(10％，5mg)和NH4COO(0.05mmol，31mg)。懸浮液回流加熱1小時(shí)，然后濾掉催化劑并蒸發(fā)溶劑。剩余物用28％氫氧化銨(1.5ml，3小時(shí)，室溫)處理，然后干燥反應(yīng)物，產(chǎn)物通過陰離子交換層析(Dionex ProPac SAX-10)，使用20％MeCN和一個(gè)(NH4)2CO3/20％MeCN梯度純化。收集到的產(chǎn)物反復(fù)低壓凍干以除去多余鹽分。產(chǎn)量0.0063mmol(90％)，白色固體。
6-(6-生物素基酰氨基己基)-氨基嘌呤-5′-三磷酰基-2′-脫氧核苷(11).
硼酸鈉(10.5μl，1M，pH8.5)加入溶于40μl水的化合物10(0.88μmol，三乙銨鹽)，然后加入含有生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(2.6μmol，3當(dāng)量)的DMF(216μl)。反應(yīng)55℃進(jìn)行3小時(shí)，然后用20％MeCN稀釋，產(chǎn)物使用水和一個(gè)NH4HCO3溶液梯度，通過陰離子交換層析(Dionex ProPac SAX-10)純化。產(chǎn)率約70％。
實(shí)施例5摻入標(biāo)記堿基和在固相支持微球上進(jìn)行捕獲在基因組DNA多元化基因型測(cè)定中的應(yīng)用9個(gè)多態(tài)性座位上的基因型通過以下步驟確定擴(kuò)增，查詢和捕獲來自基因組DNA樣品中的靶核酸序列。第一步是一個(gè)多重PCR反應(yīng)，包括一組多樣化的PCR引物對(duì)。每對(duì)PCR引物包括一個(gè)第一引物A和一個(gè)第二引物B，他們被設(shè)計(jì)成能與小鼠基因組DNA中包含一個(gè)已知多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域雜交，并能擴(kuò)增這段區(qū)域。第二步是一個(gè)多重的等位基因特異引物延伸(ASPE)反應(yīng)，包括多組已標(biāo)記的等位基因特異引物。每個(gè)標(biāo)記的等位基因特異引物包括一個(gè)含有非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-G)的5’標(biāo)記序列，后面是一C3間隔區(qū)(n-丙二醇)，再后面是一段3’序列，3’序列被設(shè)計(jì)成能與來自前面多重PCR步驟擴(kuò)增的DNA鏈中的其中一條鏈雜交。通過每條標(biāo)記等位基因特異引物的3’核苷酸來確定等位基因特異性。多組標(biāo)記等位基因特異引物被設(shè)計(jì)，以用于查詢已知的包含在多重PCR擴(kuò)增序列中的多態(tài)性位點(diǎn)。標(biāo)記的三磷酸(dATP-生物素)被加入ASPE反應(yīng)物中，從而標(biāo)記等位基因特異性引物的等位基因特異性延伸導(dǎo)致了dATP-生物素的摻入。未摻入的dATP-生物素在隨后的捕獲步驟之前被去除。
第三步，即多重ASPE反應(yīng)產(chǎn)物的捕獲，使用了包含有與特定LuminexTM微珠共價(jià)結(jié)合的非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-C)的捕獲序列。捕獲序列與前面ASPE反應(yīng)使用的標(biāo)記等位基因特異性引物上的標(biāo)記序列互補(bǔ)。加入藻紅素(Phycoerythrin)是為了在標(biāo)記等位基因特異引物鏈的延伸物上結(jié)合生物素標(biāo)記，從而提供一種熒光信號(hào)。在捕獲序列和標(biāo)記序列雜交后，微珠被注入Luminex100TM裝置，以檢測(cè)與每組特定微珠身份相關(guān)的信號(hào)。
小鼠基因組的9個(gè)多態(tài)性區(qū)域在本實(shí)施例中被作為靶
在這個(gè)例子中，下面的核酸用于多重PCR步驟
PCR引物被合成并稀釋于1mM MOPS pH7.5，0.1mMEDTA溶液中。某些PCR引物加入6FAM或者Cy3熒光標(biāo)記，使得在聚丙烯酰胺凝膠上的多重PCR反應(yīng)的檢測(cè)具有可能。
小鼠基因組DNA樣品購自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)。所有基因組DNA樣品均用1mM MOPS pH7.5，0.1mM EDTA溶液稀釋為5ng/μl。PCR反應(yīng)成分如下
所有列出組分的母混合液制備為25μl終反應(yīng)體積的1.09X濃度。23μl母混合液與2μl基因組DNA模板(5ng/μl)混合于單個(gè)的PCR管中。負(fù)對(duì)照用水代替基因組DNA模板。PCR反應(yīng)循環(huán)如下
PCR循環(huán)過后，各取2μl PCR反應(yīng)物作為模板轉(zhuǎn)移到多重ASPE反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)。下面合成的核酸被用作多重ASPE反應(yīng)中的標(biāo)記等位基因特異(TAS)引物
ASPE反應(yīng)的成分是
一種包含以上除TAS引物以外所有組分的母混合液被配成1.36X。每個(gè)ASPE反應(yīng)包括11μl母混合液，2μl多重TAS引物混合物(各0.5μM)，2μl PCR反應(yīng)物(來自前面步驟)。ASPE反應(yīng)循環(huán)如下
ASPE循環(huán)后，10μl反應(yīng)物體積與5μl包含40mM Tris，40mM EDTA的溶液混合以終止聚合酶的活性。反應(yīng)物用G-50柱純化去除未結(jié)合的dATP-生物素。然后純化的多重ASPE反應(yīng)液通過偶聯(lián)LuminexTM微珠(Luminex公司，休斯敦，德克薩斯州)的捕獲序列解旋。偶聯(lián)的微珠是
偶聯(lián)的微珠與混合物混合，該混合物在存儲(chǔ)緩沖液(10mM MOPSpH7.5，200mM NaCl，1mM EDTA，1％PEG8000，0.05％SDS)中含有等量的每一種特定微珠。捕獲雜交反應(yīng)液的成分是
以上列出的組分是在反應(yīng)溶液終體積為60μL的反應(yīng)體系中，母混合液的濃度為1.2倍。50μL的母溶液與10μl純化的多重ASPE反應(yīng)溶液混合，在室溫條件下雜交十分鐘。10μl含有0.01mg/ml的鏈霉抗生物素蛋白藻紅素(Phycoerethrin)(Molecular Probes，Eugene，OR)的雜交緩沖液(10mM MOPS pH7.5，200mM NACI，50mM MgCl2，1mM EDTA，1％PEGg000，0.05％SDS)被加入到每一種捕獲雜交反應(yīng)液中，然后注射到Luminex100TM儀中。
對(duì)于每一個(gè)捕獲雜交反應(yīng)，55μL反應(yīng)物被以60μL/分的速度加入到Luminex100TM中，然后持續(xù)讀數(shù)，直到可以分辨每50個(gè)微球的時(shí)候。熒光介質(zhì)強(qiáng)度被用做連接于微球上熒光信號(hào)的測(cè)量。結(jié)果顯示在圖14上。
實(shí)施例6標(biāo)記非標(biāo)準(zhǔn)堿基的位點(diǎn)特異性摻入和在固相支持微球上進(jìn)行捕獲在基因組DNA多元化基因型測(cè)定中的應(yīng)用通過基因組DNA樣品上的靶核酸序列的擴(kuò)增、檢驗(yàn)、捕獲，確定了基因組上這九個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。第一步，多元PCR反應(yīng)，包括多對(duì)成對(duì)PCR引物。每對(duì)引物包括第一引物A和第二引物B，而在第二引物B的近5’端包含著一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-C)。每個(gè)引物對(duì)被設(shè)計(jì)成能與小鼠基因組DNA的包含一段已知多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域雜交，并能擴(kuò)增這段區(qū)域。第二步是一個(gè)多重的等位基因特異引物延伸(ASPE)反應(yīng)，包括多組標(biāo)記等位基因特異引物。每個(gè)標(biāo)記等位基因特異引物包括一個(gè)含有非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-G)的5’標(biāo)記序列，后面是一C3間隔區(qū)(n-丙二醇)，再后面是一段3’序列，3’序列被設(shè)計(jì)成能與來自前面多重PCR步驟擴(kuò)增的DNA鏈中的其中一條鏈雜交。通過每條標(biāo)記等位基因特異引物的3’核苷酸來確定等位基因的特異性。多組已標(biāo)記等位基因特異引物被設(shè)計(jì)，以用于查詢已知的包含在多重PCR擴(kuò)增序列中的多態(tài)性位點(diǎn)。標(biāo)記的非標(biāo)準(zhǔn)三磷酸酯(iso-GTP-生物素)被加入ASPE反應(yīng)物中，從而標(biāo)記等位基因特異性引物的等位基因特異性延伸導(dǎo)致了在相對(duì)于模板鏈上的非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-C)位置摻入標(biāo)記的非標(biāo)準(zhǔn)三磷酸(iso-GTP-生物素)，該模板鏈?zhǔn)怯汕懊娑嘀豍CR反應(yīng)產(chǎn)生的。未摻入的iso-GTP-生物素在隨后的捕獲步驟之前去除。
第三步，捕獲多重ASPE反應(yīng)的產(chǎn)物，這一步驟利用了各自共價(jià)結(jié)合在特定的LuminexTM微球上的，含有非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-C)的捕獲序列。捕獲序列與前面ASPE反應(yīng)使用的標(biāo)記等位基因特異性引物上的標(biāo)記序列互補(bǔ)。加入藻紅素(Phycoerythrin)是為了在標(biāo)記等位基因特異引物鏈的延伸物上結(jié)合生物素標(biāo)記，從而提供一種熒光信號(hào)。在捕獲序列和標(biāo)記序列雜交后，微珠被注入Luminex100TM裝置，以檢測(cè)與每組特定微珠相結(jié)合的信號(hào)。
小鼠基因組的9個(gè)多態(tài)性區(qū)域在該實(shí)施例中被作為靶
在這個(gè)例子中，以下的核酸序列被用于多元PCR反應(yīng)步驟。
合成PCR反應(yīng)的引物并且在pH7.5的1mM的MOPS、0.1mMEDTA中進(jìn)行稀釋。小鼠基因組DNA樣品是從Jackson Laboratory in(Bar Harbor，ME)購買的。所有的基因組DNA樣品都在pH7.5的1mM的MOPS、0.1mM EDTA中被稀釋到5ng/μl。PCR反應(yīng)的組分是
所有列出組分的母混合液制備為25μl終反應(yīng)體積的1.09X濃度。23μl母混合液與2μl基因組DNA模板(5ng/μl)混合于單個(gè)的PCR管中。負(fù)對(duì)照用水代替基因組DNA模板。PCR反應(yīng)循環(huán)如下
PCR循環(huán)過后，各取2μl PCR反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到多重ASPE反應(yīng)中作為模板。下面合成的核酸被用作多重ASPE反應(yīng)的標(biāo)記等位基因特異(TAS)引物
ASPE反應(yīng)中的組分為
一種包含以上所有組分的母混合液被配成1.15X。每個(gè)ASPE反應(yīng)包含13μ1母混合液2μl PCR反應(yīng)物(來自前面步驟)。ASPE反應(yīng)循環(huán)如下
ASPE循環(huán)后，5μl包含40mM Tris，40mM EDTA的溶液被加入到多重ASPE反應(yīng)物中，以終止聚合酶的活性。反應(yīng)物用G-50柱純化去除未結(jié)合的d-isoGTP-生物素。然后純化的多重ASPE反應(yīng)液通過結(jié)合在LuminexTM微珠(Luminex公司，休斯敦，德克薩斯州)上的捕獲序列解旋。偶聯(lián)的微珠是
偶聯(lián)的微珠與混合物混合，該混合物在存儲(chǔ)緩沖液(10mM MOPS pH7.5，200mM NaCl，1mM EDTA，1％PEG8000，0.05％SDS)中含有等量的每一種特定微珠。捕獲雜交反應(yīng)液的成分是
制備以上列出的組分的母混合物，反應(yīng)溶液終體積為60μL，1.2倍濃度。50μl的母溶液與10μL純化的多重ASPE反應(yīng)溶液混合，在室溫條件下雜交十分鐘。10μL含有0.01mg/ml的鏈霉抗生物素蛋白藻紅素(Phycoerethrin)(MolecularProbes，Eugene，OR)的雜交緩沖液(10mM MOPS pH7.5，200mM NaCl，50mMMgCL2，1mM EDTTA，1％PEG8000，0.05％SDS)被加入到每一種捕獲雜交反應(yīng)液中，然后注射到Luminex100TM儀中。
對(duì)于每一個(gè)捕獲雜交反應(yīng)，55μL反應(yīng)物被以60μL/分的速度加入到Luminex100TM中，然后持續(xù)讀數(shù)，直到可以分辨每50個(gè)微球的時(shí)候。熒光介質(zhì)強(qiáng)度被用做連接于微球上熒光信號(hào)的測(cè)量。結(jié)果顯示在圖15上。
本發(fā)明并不局限于上面描述的特例，而進(jìn)一步可以理解為覆蓋本發(fā)明權(quán)利要求書提出的權(quán)利要求的各個(gè)方面。各種不同的修飾、等同替換以及其他多種應(yīng)用方式，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講參照本發(fā)明說明書是非常容易的。
實(shí)施例7報(bào)道基因寡聚核苷酸與等位基因特異性延伸產(chǎn)物的位點(diǎn)特異性連接和在固相支持微球上進(jìn)行捕獲在基因組DNA基因型測(cè)定中的應(yīng)用通過基因組DNA樣品上的靶核酸序列的擴(kuò)增、檢驗(yàn)、捕獲，我們確定了基因組上多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。第一步，PCR反應(yīng)，包括一系列PCR引物第一引物A和第二引物B，第二引物B的5’端包含著一個(gè)非互補(bǔ)于靶的序列，該靶序列是指在其被分析物特異性序列和非互補(bǔ)部分的連接處含有iso-C的靶序列。引物被設(shè)計(jì)成能與小鼠基因組DNA的包含一段已知多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域雜交，并能擴(kuò)增這段區(qū)域。第二步是一個(gè)等位基因特異引物延伸(ASPE)反應(yīng)，包括一系列標(biāo)記等位基因特異引物。每個(gè)標(biāo)記等位基因特異引物包括一個(gè)含有非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-G)的5’標(biāo)記序列，后面是一C3間隔區(qū)，再后面是一段3’序列，3’序列被設(shè)計(jì)成能與來自前面PCR步驟擴(kuò)增的DNA鏈中的其中一條鏈雜交。通過每條標(biāo)記的等位基因特異引物的3’核苷酸來確定等位基因的特異性。一系列標(biāo)記等位基因特異引物被設(shè)計(jì)，以用于查詢已知的包含在擴(kuò)增序列中的多態(tài)性位點(diǎn)。在ASPE反應(yīng)中，包括了DAN連接酶，和一個(gè)含有一5’磷酸和一3’生物素修飾的報(bào)道基因寡核苷酸。此報(bào)道基因寡核苷酸互補(bǔ)于引物B的5’區(qū)域，引物B被用來產(chǎn)生查詢的擴(kuò)增子。含有此非標(biāo)準(zhǔn)堿基的擴(kuò)增產(chǎn)物鏈具有作為ASPE反應(yīng)模板的區(qū)域。在等位基因特異引物延伸期間，DNA聚合酶在模板鏈iso-C的前一個(gè)堿基處終止，這樣留下一個(gè)單鏈區(qū)域用于報(bào)道基因寡核苷酸的雜交。延伸ASPE引物，模板和報(bào)告基因寡核苷酸之間的復(fù)合體導(dǎo)致一個(gè)適合于DNA連接酶連接的缺口結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。
第三步，應(yīng)用含非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-C)序列捕獲多元ASPE反應(yīng)產(chǎn)物，每一個(gè)含非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸(iso-C)序列均各自共價(jià)偶聯(lián)于特定的luminex微球。捕獲序列與在前面ASPE反應(yīng)中用于建立標(biāo)簽等位基因特異引物的標(biāo)記序列互補(bǔ)。加入鏈霉抗生物素蛋白-藻紅素是與延伸的和連接的等位基因特異性引物鏈上生物素標(biāo)記連接，以提供熒光信號(hào)。在捕獲序列和標(biāo)記序列之間雜交之后，微球體被注射入一個(gè)Luminex100裝置來檢測(cè)與每種獨(dú)特微球體相連的特有信號(hào)。
此例中，小鼠基因組單一多態(tài)性區(qū)作為靶位
小鼠基因組DNA樣品購自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)。所有的基因組DNA樣品用1mM MOPS pH7.5，0.1mM EDTA稀釋至10ng/μl。PCR反應(yīng)組成是
所有所列組分的母混合物制備成1.07×濃度，以使反應(yīng)終體積為30μl。23μl的母混合物與2μl的基因組DNA模板(5ng/μl)在單獨(dú)的PCR小管中混合。陰性對(duì)照是由水代替基因組DNA模板。PCR反應(yīng)的熱循環(huán)如下
PCR循環(huán)后，每個(gè)反應(yīng)體系加入5U/μl的λ核酸外切酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)3μl以除去PCR引物A引入的擴(kuò)增子非模板鏈。加入λ核酸外切酶后，將反應(yīng)小管加熱至37℃，5分鐘，再加熱至95℃，2分鐘。這樣消化之后，每個(gè)PCR反應(yīng)取1μl作為ASPE反應(yīng)的模板。下面的核酸序列被用為ASPE反應(yīng)中的標(biāo)記等位基因特異性(TAS)引物
ASPE反應(yīng)的組分為
包括所有上述組分的母混合物制備為1.11×。每一ASPE反應(yīng)由9μl母混合物和1μlPCR反應(yīng)物(來自前一步)組成。ASPE反應(yīng)循環(huán)如下
ASPE循環(huán)之后，反應(yīng)物被偶聯(lián)于Luminex微球(Luminex Corp，Austin，TX)上的捕獲序列解旋。偶聯(lián)微球體為
偶聯(lián)的微珠與混合物混合，該混合物在存儲(chǔ)緩沖液(10mM MOPS pH7.5，200mM NaCl，1mM EDTA，1％PEG8000，0.05％SDS)中等量的每一種特定微珠。捕獲雜交反應(yīng)液的成分是
上述所有組分的母混合物制備成1.2×濃度，以使反應(yīng)終體積為60μl。50μl此母混合物加入每一個(gè)ASPE反應(yīng)體系中，并在室溫雜交10分鐘。在注入Luminex100裝置之前向每一個(gè)捕獲雜交系加入10μl鏈霉抗生物素蛋白-藻紅素溶液(0.075mg/ml于10mM MOPS pH7.5中，NaCl 200mM，MgCl250mM，EDTA1mM，PEG 8000 1％，SDS 0.05)(Molecular Probes，Eugene，OR)。
對(duì)于每個(gè)捕獲雜交反應(yīng)，取45μl反應(yīng)混合物以60μl/min的速度注入Luminex100，然后持續(xù)讀數(shù)，直到可以分辨每100個(gè)微球的時(shí)候。熒光介質(zhì)強(qiáng)度(MFI)被用做連接于微球上熒光信號(hào)的測(cè)量。結(jié)果顯示在圖17上。
在上述例子中，引物B的非標(biāo)準(zhǔn)堿基，位于5’端非互補(bǔ)序列和分析物特異序列連接區(qū)，被設(shè)計(jì)為用來阻止酶促在標(biāo)簽和分析物特異序列連接處的延伸。可以明確地預(yù)想，其他合適的接頭也可以用于停止聚合酶反應(yīng)，包括，例如，2-O-甲基堿基，像2’-O-甲基核糖核苷酸。
權(quán)利要求
1，一種分析樣品中靶寡聚核苷酸的方法，該方法包括如下步驟(a)在靶寡聚核苷酸與捕獲寡聚核苷酸的適當(dāng)雜交條件下，至少一種捕獲寡聚核苷酸與樣品相接觸，捕獲寡聚核苷酸包含一種分子識(shí)別序列，該分子識(shí)別序列至少含有一種非標(biāo)準(zhǔn)堿基，捕獲寡聚核苷酸與支持體偶聯(lián)，靶寡聚核苷酸包含一個(gè)互補(bǔ)于捕獲寡聚核苷酸的分子識(shí)別序列的標(biāo)記序列和被分析物特異序列或被分析物特異序列的互補(bǔ)序列；和(b)檢測(cè)靶寡聚核苷酸和捕獲寡聚核苷酸的雜交。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的支持體包括單一固相支持體。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的支持體包括固相微粒。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的支持體包含至少兩種不同類型的捕獲寡聚核苷酸，每種類型的捕獲寡聚核苷酸序列在分子識(shí)別序列上不同于另一種捕獲寡聚核苷酸，與之至少有一個(gè)堿基不同；并且其中靶寡聚核苷酸的標(biāo)記序列互補(bǔ)于其中一種類型的捕獲寡聚核苷酸的分子識(shí)別序列。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中至少有兩種不同類型的捕獲寡聚核苷酸偶聯(lián)于多種支持體，每種不同類型的捕獲寡聚核苷酸的分子識(shí)別序列之間至少有一個(gè)堿基不同，并且其中所述的每種靶寡聚核苷酸包含一種標(biāo)記序列，該標(biāo)記序列互補(bǔ)于捕獲寡聚核苷酸中一種的分子識(shí)別序列。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的多種支持體至少可以分為兩類，每類擁有各自的特性，以用于區(qū)別其它種類的成員。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中在每類支持體上的捕獲寡聚核苷酸有著不同的序列，以區(qū)別其它類支持體上的捕獲寡聚核苷酸。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中靶寡聚核苷酸進(jìn)一步包括報(bào)道基因或偶聯(lián)部分，其中檢測(cè)步驟包括檢測(cè)報(bào)道基因的存在或與支持體相連的偶聯(lián)部分的存在。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中報(bào)道基因或偶聯(lián)部分都帶有非標(biāo)準(zhǔn)堿基。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中反應(yīng)步驟是在中嚴(yán)謹(jǐn)條件或高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下進(jìn)行的。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中其中的反應(yīng)步驟是在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行的。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中至少一種靶寡聚核苷酸是通過以下方法制備的，至少一引物對(duì)與被分析物接觸，被分析物至少包含一個(gè)被分析物特異序列，各引物對(duì)包含第一引物和第二引物，第一引物包含靶寡聚核苷酸的標(biāo)記序列和互補(bǔ)于被分析物第一序列的序列，第二引物包括互補(bǔ)于被分析物第二序列的序列；和酶促延伸第一和第二引物形成靶寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸，其中靶寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸的其中一個(gè)包括被分析物特異序列，而另一個(gè)包含被分析物特異序列的互補(bǔ)序列。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中第二寡聚核苷酸包含一報(bào)道基因或連接部分。
14.權(quán)利要求1所述的方法，其中靶寡聚核苷酸的標(biāo)記序列包括第一序列和第二序列，第一序列位于靶寡聚核苷酸的5’端，第二序列位于靶寡聚核苷酸的3’端。
15.權(quán)利要求12所述的方法，其中至少第一和第二引物中的一種是第一等位基因特異性引物，進(jìn)一步包括用至少一種不同于第一等位基因特異性引物的附加等位基因特異性引物與分析物接觸。
16.權(quán)利要求12所述的方法，其中無論靶寡聚核苷酸還是第二寡聚核苷酸都包含一標(biāo)記序列，捕獲寡聚核苷酸分子包括第一分子識(shí)別序列和通過接頭與第一分子識(shí)別序列連接的第二分子識(shí)別序列，第一和第二分子識(shí)別序列分別互補(bǔ)于靶寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸序列的標(biāo)記序列。
17.權(quán)利要求12所述的方法，進(jìn)一步包括將第二寡聚核苷酸共價(jià)偶聯(lián)于捕獲寡聚核苷酸，并除掉靶寡聚核苷酸。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中共價(jià)偶聯(lián)的步驟包括把第二寡聚核苷酸連接到捕獲寡聚核苷酸上。
19.一種分析樣品中靶寡聚核苷酸的方法，該方法包括以下步驟(a)在和靶寡聚核苷酸的適當(dāng)雜交條件下，將樣品與偶聯(lián)于支持體的捕獲寡聚核苷酸接觸，靶寡聚核苷酸包含含有至少一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基的標(biāo)記序列和一個(gè)被分析物特異序列或它的互補(bǔ)序列，捕獲寡聚核苷酸包括一分子識(shí)別序列，該分子識(shí)別序列包含一與被分析物特異序列相同或互補(bǔ)的序列；(b)酶促延伸的捕獲寡聚核苷酸以靶寡聚核苷酸為模板，在與標(biāo)記序列中非標(biāo)準(zhǔn)堿基相對(duì)的位置上摻入互補(bǔ)的非標(biāo)準(zhǔn)堿基；和(c)摻入報(bào)道基因或與捕獲寡聚核苷酸延伸部分相連的偶聯(lián)部分；和(d)通過檢測(cè)摻入的報(bào)道基因或偶聯(lián)部分來確定樣品中靶寡聚核苷酸的存在。
20.一種分析靶寡聚核苷酸的方法，包括步驟如下(a)包含被分析物特異序列的被分析物與第一和第二引物接觸，第一引物包括一標(biāo)記序列和被分析物第一序列的互補(bǔ)序列，第二引物包括被分析物第二序列的互補(bǔ)序列和非標(biāo)準(zhǔn)堿基；(b)酶促延伸第一和第二引物形成靶寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸，其中靶寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸之一含有被分析物特異序列，而另一個(gè)含有互補(bǔ)于被分析物特異序列的序列，其中第一引物的延伸基本停止于第二引物非標(biāo)準(zhǔn)堿基相對(duì)的位置；(c)在延伸的第一引物上，相對(duì)于第二引物非標(biāo)準(zhǔn)堿基的位置摻入一個(gè)互補(bǔ)的非標(biāo)準(zhǔn)堿基；(d)在和靶寡聚核苷酸的適當(dāng)雜交條件下，使偶聯(lián)于支持體的捕獲寡聚核苷酸與靶寡聚核苷酸接觸，靶寡聚核苷酸包括一標(biāo)記序列和被分析物特異序列或被分析物序列的互補(bǔ)序列，捕獲寡聚核苷酸包括一分子識(shí)別序列，該分子識(shí)別序列與被分析物特異序列的至少一部分相同或互補(bǔ)；和(e)檢測(cè)靶寡聚核苷酸與捕獲寡聚核苷酸的雜交。
21.一種同時(shí)檢測(cè)包含基因組DNA的樣品中至少兩個(gè)等位基因的方法，該方法包括如下步驟(a)在以使每一個(gè)第一和第二引物的引物對(duì)都能和基因組DNA相雜交的條件下將包含第一引物和第二引物的至少兩個(gè)引物對(duì)與樣品接觸；(b)通過每個(gè)引物對(duì)的第一和第二引物擴(kuò)增DNA序列兩側(cè)；(c)用至少兩個(gè)標(biāo)記的等位基因特異性引物與步驟(b)所擴(kuò)增的DNA序列雜交；每一個(gè)標(biāo)記的等位基因特異性引物都是，在以5’到3’的順序，包含有包含至少一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的5’標(biāo)記的序列，連接頭，和一個(gè)能與步驟(b)擴(kuò)增的序列相互雜交3’端序列；(d)步驟(c)中的等位基因特異引物在標(biāo)記的三磷酸堿基存在的情況下，酶促延伸從而形成標(biāo)記延伸產(chǎn)物；(e)在與延伸產(chǎn)物雜交的適當(dāng)雜交條件下，步驟(d)中的延伸產(chǎn)物和與支持體相偶聯(lián)的至少兩種捕獲寡聚核苷酸相接觸，雜交延伸產(chǎn)物，延伸產(chǎn)物包含至少含有一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基的標(biāo)記序列和等位基因特異性序列，捕獲寡聚核苷酸包括含有互補(bǔ)于標(biāo)記序列的分子識(shí)別序列，分子識(shí)別序列包含互補(bǔ)與非標(biāo)準(zhǔn)堿基的非標(biāo)準(zhǔn)堿基；和(f)檢測(cè)至少兩個(gè)延伸產(chǎn)物與至少兩個(gè)捕獲寡聚核苷酸的雜交。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中步驟(a)中，每引物對(duì)中的一個(gè)引物包含第一非標(biāo)準(zhǔn)堿基，該引物的延伸產(chǎn)物互補(bǔ)于步驟(c)中的等位基因特異引物，步驟(d)中標(biāo)記的非標(biāo)準(zhǔn)三磷酸堿基互補(bǔ)于步驟(a)中引物的第一非標(biāo)準(zhǔn)堿基，步驟(d)中的延伸產(chǎn)物包括標(biāo)記的第二非標(biāo)準(zhǔn)堿基，該第二非標(biāo)準(zhǔn)堿基相對(duì)于包含有第一非標(biāo)準(zhǔn)堿基的引物的延伸產(chǎn)物的第一非標(biāo)準(zhǔn)堿基。
23.權(quán)利要求21所述的方法，其中步驟(a)中，每引物對(duì)中的一個(gè)引物包括，從3’到5’順序，與步驟(a)中基因組DNA雜交的3’區(qū)，不和基因組DNA雜交的非標(biāo)準(zhǔn)堿基，和非互補(bǔ)于基因組DNA的5’序列，其中引物延伸產(chǎn)物互補(bǔ)于步驟(c)中的等位基因特異性引物，步驟(d)的延伸產(chǎn)物不包括相對(duì)于引物非標(biāo)準(zhǔn)堿基的互補(bǔ)非標(biāo)準(zhǔn)堿基，第一非標(biāo)準(zhǔn)堿基區(qū)域。
24.一種分析靶寡聚核苷酸的方法，其包括步驟如下(a)包含被分析物特異序列的被分析物與第一引物和第二引物接觸，第二引物包括，從5’到3’的順序，非互補(bǔ)序列，非標(biāo)準(zhǔn)堿基和分析物特異序列；(b)酶促延伸引物，形成靶寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸，其中靶寡聚核苷酸和第二寡聚核苷酸之一含有被分析物特異序列，而另外一個(gè)含有互補(bǔ)于被分析物特異序列的序列；(c)標(biāo)記的等位基因特異性引物與步驟(b)中第二引物的延伸產(chǎn)物雜交，標(biāo)記的等位基因特異性引物包括，從5’到3’順序，包含了非標(biāo)準(zhǔn)堿基的5’標(biāo)記序列，連接頭，和互補(bǔ)于第二引物延伸產(chǎn)物的3’序列；(d)酶促延伸步驟(c)的等位基因特異性引物；(e)把互補(bǔ)于步驟(a)中第二引物5’非互補(bǔ)序列的報(bào)告寡聚核苷酸和步驟(d)中的延伸產(chǎn)物雜交，報(bào)告寡聚核苷酸包括5’磷酸根和報(bào)告基團(tuán)，從而形成適合用連接酶連接的切口結(jié)構(gòu)；(f)步驟(e)得到的切口結(jié)構(gòu)與連接酶接觸，從而連接報(bào)告寡聚核苷酸和等位基因特異性延伸產(chǎn)物；(g)與支持體偶聯(lián)的捕獲寡聚核苷酸和步驟(f)的連接產(chǎn)物接觸；和(h)檢測(cè)連接的寡聚核苷酸和捕獲寡聚核苷酸的雜交。
25.一種分析被分析物的試劑盒，該試劑盒包括支持體，偶聯(lián)于支持體的捕獲寡聚核苷酸，捕獲寡聚核苷酸包含擁有至少一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基的分子識(shí)別序列；第一引物，其包含標(biāo)記序列和被分析物第一序列的互補(bǔ)序列；和第二引物，其包含被分析物第二序列的互補(bǔ)序列。
全文摘要
描述了使用非標(biāo)準(zhǔn)堿基的固相支持體分析系統(tǒng)，捕獲寡聚核苷酸包括一分子識(shí)別標(biāo)記序列，捕獲寡聚核苷酸連接于固相支持體上，它與靶寡聚核苷酸固相支持體雜交。在一些例子中，分子識(shí)別序列包括一個(gè)或多個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)堿基，并雜交于互補(bǔ)的靶寡聚核苷酸的標(biāo)記序列。在一些例子中，在分析中使用一些非標(biāo)準(zhǔn)堿基(如，通過PCR或連接)摻入法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1697881SQ01820515
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2001年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月14日
發(fā)明者J·K·格雷尼爾, D·J·馬沙爾, J·R·普魯?shù)翘? C·S·里奇蒙, E·B·雷施, C·W·舍雷爾, C·B·舍里爾, J·L·普塔欽 申請(qǐng)人:伊拉根生物科學(xué)公司