專利名稱：由真菌制備異源蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由真菌制備異源蛋白或肽的方法。
背景技術(shù)：
在宿主如真菌中制備異源蛋白是公知的。EP-A-481,008公開了在葡萄糖中生長的酵母中制備異源蛋白。
由宿主生物體以補(bǔ)料分批發(fā)酵法工業(yè)大規(guī)模制備異源蛋白通常顯示三個(gè)期。
第一期是分批期，定義是其中細(xì)胞生長到所需濃度的期。在這個(gè)期，細(xì)胞以指數(shù)生長。描述分批期的模型假定細(xì)胞不死亡，氧氣過量存在，以及所有其它條件使得可無限生長。這意味著在分批期，以充足的量提供所有營養(yǎng)需要?？傊?，分批期是(異源)蛋白產(chǎn)量仍低的同時(shí)，細(xì)胞擴(kuò)增的期。
第二期是補(bǔ)料期，定義是碳源和其它需要以相對濃縮的液體流以預(yù)先計(jì)算的速度“補(bǔ)料速度”補(bǔ)充到發(fā)酵罐。在這個(gè)期重點(diǎn)是由生長細(xì)胞制備蛋白和導(dǎo)致生物量增加的細(xì)胞生長。補(bǔ)充到發(fā)酵罐的底物在這個(gè)期通常用于細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成。細(xì)胞生長由補(bǔ)料速度控制，以獲得最佳的細(xì)胞生長和異源蛋白制備。
最后到達(dá)第三期，定義是衰亡期，其中出現(xiàn)限制條件。在這個(gè)期，例如發(fā)酵罐中的氧氣濃度降低到零，有些情況下導(dǎo)致乙醇形成。在這個(gè)期，多數(shù)細(xì)胞將集中于維持且通常產(chǎn)物合成減少。盡管在這個(gè)期仍可以觀察到細(xì)胞生長，但是生長通常有限至零。在這個(gè)期細(xì)胞可能逐漸失去活力。
在包含普通碳源如基于葡萄糖或其它糖基的碳源的培養(yǎng)基上制備異源蛋白是令人滿意的，直到補(bǔ)料期末開始存在限制條件。限制條件的實(shí)例包括生長培養(yǎng)基中氧氣濃度降低，營養(yǎng)物如維生素、碳、氮減少，和有毒化合物的蓄積。
如果真菌，特別是酵母，在包含葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基中生長，限制條件一出現(xiàn)，異源蛋白產(chǎn)量就大大降低。
對于在包括糖作為碳源的普通培養(yǎng)基上生長的酵母，補(bǔ)料分批發(fā)酵中存在上述期。因此一旦衰亡期開始，比產(chǎn)量(其定義是每克生物量所產(chǎn)生的異源蛋白或肽量)維持或降低。盡管細(xì)胞密度很高，在衰亡期產(chǎn)物合成因此降低。通常含葡萄糖作為碳源的普通培養(yǎng)基的另一個(gè)缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)變?yōu)樯锪慷皇寝D(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的底物量高，該產(chǎn)物通常是本發(fā)明上下文中的異源蛋白。因此在這個(gè)系統(tǒng)中，生物量相對高不可避免地伴隨高水平異源蛋白的產(chǎn)生。這個(gè)高生物量導(dǎo)致粘性發(fā)酵培養(yǎng)基，例如容易產(chǎn)生氧氣限制。
因此，期望在宿主如真菌中制備異源蛋白的方法，如甚至在限制條件下可得到高異源的蛋白產(chǎn)量，其中會(huì)存在正常衰亡和比產(chǎn)量降低，然而同時(shí)生長系統(tǒng)的比產(chǎn)量維持或與已知生長系統(tǒng)相比增加。
本發(fā)明的方法克服了至少一個(gè)指出的問題。
發(fā)明概述已經(jīng)驚奇地發(fā)現(xiàn)在含乙醇作為主要碳源和誘導(dǎo)劑如半乳糖控制異源蛋白產(chǎn)生的培養(yǎng)基上生長的真菌顯示出異源蛋白比產(chǎn)量高，甚至在限制條件下異源蛋白的比產(chǎn)量也驚人地高。
令人驚奇地，根據(jù)這個(gè)方法生長的真菌不顯示傳統(tǒng)葡萄糖基培養(yǎng)基上生長的真菌所遭遇的熟知衰減特性。連續(xù)補(bǔ)充含這個(gè)特殊碳源的培養(yǎng)基下，真菌維持或甚至增加異源蛋白的絕對和比產(chǎn)量水平。
因此，本發(fā)明涉及由真菌制備異源蛋白的方法，該所述真菌在包含在含碳源的培養(yǎng)基上生長，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇，其中培養(yǎng)基另外包含誘導(dǎo)劑。
發(fā)明詳述在本發(fā)明上下文中，術(shù)語真菌包括酵母和霉菌。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語異源蛋白是指包括蛋白和肽。
異源蛋白是不是真菌天然產(chǎn)生，但是僅在真菌修飾到這個(gè)程度而產(chǎn)生的蛋白。
除非另有說明，指出的重量百分比是基于總產(chǎn)物或總培養(yǎng)基重量的重量百分比。
使用術(shù)語氧氣濃度的地方，實(shí)施例中闡明的方法測定的溶解氧氣濃度作為參照。
分批期末定義是提供給細(xì)胞的所有碳底物已經(jīng)耗盡的時(shí)刻。
誘導(dǎo)期定義是在分批期后開始的期，從異源蛋白誘導(dǎo)開始的時(shí)刻，直到所用特定誘導(dǎo)劑濃度獲得最大誘導(dǎo)的時(shí)刻。
碳源定義是給細(xì)胞提供碳和能量供應(yīng)的底物。真菌主要從有機(jī)化合物得到它們的細(xì)胞碳源。這些通常用作碳源和能源它們部分被同化為細(xì)胞材料，部分被氧化提供能量。在本文中，H.Schlegel在General microbiology，劍橋大學(xué)出版社，1992，第7版，194頁作為參考。
本發(fā)明涉及由真菌制備異源蛋白的方法。為了制備蛋白，真菌被遺傳學(xué)修飾，使得可能進(jìn)行這種異源蛋白或肽的控制生產(chǎn)。
任何合適的構(gòu)建體或轉(zhuǎn)化方法可用于這個(gè)遺傳修飾。EP-A-481,008給出了合適的構(gòu)建體和轉(zhuǎn)化方法實(shí)例，該專利引入作為參考。
通常，被修飾的真菌將在修飾后含有啟動(dòng)子控制下的包括編碼異源蛋白的基因的(整合)載體。啟動(dòng)子的活性由所謂的誘導(dǎo)劑調(diào)節(jié)。啟動(dòng)子的實(shí)例包括半乳糖啟動(dòng)子，如半乳糖誘導(dǎo)的GAL4，GAL7；甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子，由甲醇誘導(dǎo)；乙醇啟動(dòng)子，由乙醇誘導(dǎo)；溫度調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，由溫度改變誘導(dǎo)；磷酸鹽調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，由磷酸鹽的存在誘導(dǎo)；和葡萄糖可抑制啟動(dòng)子，由葡萄糖的存在誘導(dǎo)。
真菌在含碳源(50至100wt％是乙醇)的培養(yǎng)基中生長，同時(shí)培養(yǎng)基中存在誘導(dǎo)劑。
在本領(lǐng)域中，乙醇用作碳源通常認(rèn)為是不好的，下面引用的公開物可以例證。總之，據(jù)報(bào)道乙醇代替葡萄糖用作碳源可降低生物量產(chǎn)量，需要更高氧氣消耗并因此在氧氣有限條件下不提供或提供有限生長。而且，菌株的乙醇毒性可導(dǎo)致活力受損和細(xì)胞死亡。這在如Theyeasts，第3卷，第2版，第6章的表1中公開。這個(gè)公開物的附錄1作為具體的參考，它公開了乙醇和葡萄糖上酵母的生長速度是0.1h-1∶0.35h-1。這個(gè)附錄還公開了在乙醇作為碳底物的培養(yǎng)基上，酵母顯示出比在含葡萄糖作為碳底物的培養(yǎng)基上更高的氧氣消耗。
Shiba等(J.of bioscience and bioengineering，89卷，426-430頁，2000)進(jìn)一步描述了乙醇作為碳源的細(xì)胞的生長。Shiba公開了用GAL10啟動(dòng)子在啤酒糖酵母ga180突變體中進(jìn)行羧肽酶Y(CPY)的表達(dá)。生長培養(yǎng)基包含乙醇作為唯一碳源。在乙醇補(bǔ)料開始時(shí)，報(bào)道生長速度和CPY產(chǎn)量都降低。這個(gè)系統(tǒng)不在誘導(dǎo)劑的控制下。
本發(fā)明提供了一種方法，其中在含50至100wt％是乙醇的碳源的培養(yǎng)基存在下，特別是當(dāng)限制生長條件出現(xiàn)時(shí)，蛋白產(chǎn)量維持或甚至增加。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法適用于任何類型的真菌，生長不需要特殊的ga180突變體。通過誘導(dǎo)可以很好控制本發(fā)明的方法。
Saliola，M等(applied and environmental microbiology，1999年1月，53-60頁)公開了使用乙醇誘導(dǎo)型KIADH4啟動(dòng)子在Kluyveromyces lactis中表達(dá)異源基因。這個(gè)文件教導(dǎo)了在補(bǔ)料分批系統(tǒng)中，當(dāng)乙醇用作啟動(dòng)子且同時(shí)作為唯一碳源時(shí)，表達(dá)最佳。這個(gè)生產(chǎn)系統(tǒng)不能夠控制補(bǔ)料期的基因表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的方法的另外益處是控制熱產(chǎn)量，它對于熱不穩(wěn)定蛋白的制備很重要。
優(yōu)選含碳源的50至100wt％是乙醇的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中同時(shí)存在誘導(dǎo)劑，貫穿所有相中，但是發(fā)現(xiàn)在分批期使用不滿足這些需要的培養(yǎng)基是可能的，只要補(bǔ)料期培養(yǎng)基滿足需要。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由真菌制備異源蛋白的方法，該方法包括分批期和補(bǔ)料期，且其中補(bǔ)料期培養(yǎng)基包含50至100wt％是乙醇的碳源，和其中補(bǔ)料期培養(yǎng)基另外含有誘導(dǎo)劑。
與通常含有葡萄糖或其它糖作為主要碳源的已知生長系統(tǒng)相比，根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基能夠得到高水平比產(chǎn)量，甚至在限制條件下；即，優(yōu)選沒有衰亡期。
甚至發(fā)現(xiàn)限制氧氣條件下，比產(chǎn)量在補(bǔ)料期最高，而對于基于葡萄糖的生長系統(tǒng)來說，發(fā)現(xiàn)最高的比產(chǎn)量通常在補(bǔ)料期，生物量的量仍相對較低。
不期望受任何理論的限制，申請人相信在本發(fā)明的方法中，由于使用含50至100wt％是乙醇的碳源的培養(yǎng)基，衰亡期延遲或甚至不存在。
在制備異源蛋白的方法中，優(yōu)選優(yōu)化補(bǔ)料條件，使得細(xì)胞生長速度和異源蛋白產(chǎn)量最佳。如上指出，如果真菌以工業(yè)規(guī)模生長，非常優(yōu)選使用發(fā)酵罐的補(bǔ)料分批系統(tǒng)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由真菌制備異源蛋白的方法，該方法包括分批期、誘導(dǎo)期和補(bǔ)料期，其中在所述補(bǔ)料期a)真菌細(xì)胞在含任何碳源的培養(yǎng)基上生長到至少5g/l的細(xì)胞密度，沒有特殊優(yōu)選，隨后真菌細(xì)胞生長到5g/l以上的細(xì)胞密度，優(yōu)選10至90g/l，更優(yōu)選40至60g/l，使用含誘導(dǎo)劑和碳源的培養(yǎng)基，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇，b)已經(jīng)達(dá)到步驟a)的細(xì)胞密度后，產(chǎn)生限制生長條件，c)這些限制條件到來后，細(xì)胞進(jìn)一步在含碳源的培養(yǎng)基上生長，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇。
在這個(gè)優(yōu)選方法的第一步中，細(xì)胞在分批期生長直到碳底物已耗盡，在第二步中，細(xì)胞生長到足夠的細(xì)胞密度使得能夠高量制備異源蛋白。在這個(gè)第二期的第一個(gè)階段，向補(bǔ)料培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)異源蛋白的產(chǎn)生。從零誘導(dǎo)，和由此很低水平異源蛋白產(chǎn)生，直到最佳誘導(dǎo)所花費(fèi)的時(shí)間稱作誘導(dǎo)期。這個(gè)誘導(dǎo)期組成補(bǔ)料期的第一個(gè)階段。
發(fā)酵罐中的限制條件可以用幾種方法獲得。限制條件定義是不再可能進(jìn)行指數(shù)細(xì)胞生長和細(xì)胞生長降低的那些條件。
本發(fā)明的方法中，優(yōu)選培養(yǎng)基中的限制條件是由選自下組的方法產(chǎn)生的，包括a)發(fā)酵罐培養(yǎng)基中氧氣濃度降低，優(yōu)選低于30％，更優(yōu)選低于15％，b)給含乙醇的培養(yǎng)基過量補(bǔ)料，直到培養(yǎng)基中乙醇水平達(dá)到或超過培養(yǎng)基中生長的菌株細(xì)胞的生長限制濃度c)降低細(xì)胞生長的其它必要成分的水平，所述成分優(yōu)選選自氮、磷、硫和維生素優(yōu)選在分批期后，補(bǔ)料方案隨生物量產(chǎn)量呈指數(shù)增長。當(dāng)出現(xiàn)氧氣限制和進(jìn)入衰亡期，優(yōu)選補(bǔ)料速度設(shè)置為維持發(fā)酵罐培養(yǎng)基中乙醇濃度低于10vol％的速度。這可例如通過線性補(bǔ)料速度或脈沖補(bǔ)料速度或分步補(bǔ)料速度來達(dá)到。
在甚至更優(yōu)選的實(shí)施方案中，以重復(fù)補(bǔ)料分批方法來實(shí)施本發(fā)明的方法。
優(yōu)選誘導(dǎo)劑適合啟動(dòng)與用于轉(zhuǎn)化宿主真菌的基因構(gòu)建體中的異源基因可操作連接的啟動(dòng)子。優(yōu)選誘導(dǎo)劑是半乳糖、甲醇、溫度和磷酸鹽。
最優(yōu)選的誘導(dǎo)劑是半乳糖。
本發(fā)明不涉及乙醇用作誘導(dǎo)劑和(部分)碳源的表達(dá)方法。
當(dāng)半乳糖是誘導(dǎo)劑時(shí)，優(yōu)選培養(yǎng)基中半乳糖的量應(yīng)該使得在其量很低的時(shí)候，啟動(dòng)子啟動(dòng)到期望水平，和半乳糖不分解代謝。為了防止這點(diǎn)，可能使用不能分解代謝誘導(dǎo)劑的菌株。
優(yōu)選補(bǔ)料培養(yǎng)基的組合是使得發(fā)酵罐的培養(yǎng)基包含0.1-10wt％半乳糖，更優(yōu)選0.05-1wt％，甚至更優(yōu)選0.05-0.2wt％半乳糖。
根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)基中的碳源包含至少50wt％和至高100wt％乙醇。優(yōu)選碳源包含80至100wt％乙醇。剩余碳源可以是例如糖如葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、果糖或其它化合物如甘油、醋酸鹽，或復(fù)合碳底物如乳清和糖蜜。
真菌可以是酵母或霉菌。合適的酵母屬實(shí)例包括糖酵母屬、克魯維氏酵母屬、畢赤氏酵母屬、漢遜氏酵母屬。合適的霉菌實(shí)例包括曲霉屬、根霉屬、木霉屬。
特別優(yōu)選的生物體是啤酒糖酵母。
異源蛋白可以是期望制備的任何蛋白或肽。發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法特別適合抗凍肽、抗體或其片段，或酶如角質(zhì)酶(cutinase)和半乳糖苷酶的制備。抗凍肽是具有改善冰雪下生長能力的蛋白，例如biotechnology advances，13卷，3期，375-402頁，1995年，Griffith等所述，其引入本專利作為參考。
真菌生長的各個(gè)期的培養(yǎng)基通常包含碳源，含有或不含有誘導(dǎo)劑，分批期后需要其存在，和含有或不含有另外成分如維生素、酵母提取物、微量金屬離子、酸化劑使pH保持在期望水平、磷酸鹽、硫酸鹽水和止泡劑。
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及制備異源蛋白或肽的方法，其中分批培養(yǎng)基含有1-40wt％葡萄糖、水、微量金屬、根據(jù)需要存在的止泡劑、酵母提取物、維生素、磷酸鹽和硫酸鹽和其中培養(yǎng)基中含有5-35體積％乙醇、0.1-10wt％半乳糖、水、微量金屬、和根據(jù)需要存在的止泡劑、酵母提取物、維生素、磷酸鹽和硫酸鹽和其中10升規(guī)模中，“補(bǔ)料速度”“”是0.25-4g/分，或較大規(guī)模發(fā)酵的相應(yīng)值。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明方法獲得的異源蛋白分離物，特別是抗凍肽分離物。
現(xiàn)在將以下列非限制性實(shí)施例闡明本發(fā)明。實(shí)施例培養(yǎng)基和培養(yǎng)所有培養(yǎng)基和培養(yǎng)數(shù)據(jù)基于10升規(guī)模乙醇發(fā)酵。
對于10m3規(guī)模，根據(jù)比例因子1000粗略相同調(diào)整。培養(yǎng)基預(yù)先培養(yǎng)培養(yǎng)基
分批和補(bǔ)料培養(yǎng)基在表1中列出，對于10升規(guī)模表1
*乙醇純度，96.2％v/v含量，不飽和所有培養(yǎng)基在121℃/1.2巴(Linden高壓鍋)滅菌25分鐘，糖單獨(dú)滅菌。自來水量在下面描述，總量是使得總重量如表1底行指出。Egli維生素和微量金屬組成表2
維生素用0.22μm濾器滅菌菌株使用的菌株是啤酒糖酵母CEN.PK102-3A?；A(chǔ)CRN.PK2啤酒糖酵母菌株是從EUROSCARF，Institute for Microbiology，JohannWolfgang Goethe-University Frankfurt，Marie-Curie-Strasse 9；Building N250，D-60439 Frankfurt，德國商購得到的。
這個(gè)啤酒糖酵母菌株不能分解代謝半乳糖，因?yàn)閬碜云【铺墙湍窾RA3基因的序列的插入已經(jīng)打斷GAL1基因。用含下列元件的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌株啟動(dòng)子GAL7啟動(dòng)子，引導(dǎo)GAPDH。GAL7啟動(dòng)子總是存在兩個(gè)上游活化序列。它們是作為連接的序列的一部分的2個(gè)天然元件。
選擇性標(biāo)記Leu2d信號(hào)序列轉(zhuǎn)化酶(SUC2)整合靶具有為酵母染色體XII特定區(qū)域靶向整合的獨(dú)特的限制性酶切位點(diǎn)的rDNA重復(fù)片段。
異源基因?qū)嵤├?編碼海洋鱈(ocean pout)HPLC12抗凍蛋白的抗凍蛋白基因(WO-A-9702343)實(shí)施例2K 609B，小豬中抗毒力因子的抗體。
實(shí)施例3蛋白VHH G，它是HGL11，是重鏈免疫球蛋白；EP-A-1,134,231公開的抗人胃脂肪酶的脂肪酶抑制劑。
實(shí)施例4蛋白VHHP，它是HPL18，是重鏈免疫球蛋白；EP-A-1,134,231公開的抗人胰腺脂肪酶的脂肪酶抑制劑。
實(shí)施例2-4的蛋白是根據(jù)EP-A-1,134,231公開的美洲駝免疫步驟得到的抗體。培養(yǎng)菌株保存菌株保存在-80℃，用脫脂牛奶和20％甘油的混合物1∶1稀釋的YNB生長培養(yǎng)物的單批中。接種50ml YNB接種1ml保存的菌株，在30℃，以150rpm培養(yǎng)48小時(shí)+2小時(shí)。
隨后接種物轉(zhuǎn)移到500ml 2％YPD，隨后在30℃，以150rpm培養(yǎng)24小時(shí)+2小時(shí)。發(fā)酵罐在標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，所述發(fā)酵罐具有十升的工作體積。對于溫度控制，發(fā)酵罐裝配冷卻線圈和加熱指針。擋板是標(biāo)準(zhǔn)尺寸。帶有六個(gè)葉片的Rushton型葉輪用于攪拌。用Inglod DO2-電極(Mettler-Toledo)測定溶解的氧氣(DO2)，Inglod Impro 3000凝膠電極(Mettler-Toledo)測定pH。質(zhì)譜分光光度計(jì)Prima 600(VG氣體分析系統(tǒng))用于測定廢氣。整個(gè)發(fā)酵過程是自動(dòng)的和軟件控制的，但是也可以在下面提供的指導(dǎo)基礎(chǔ)上手工操作。
利用補(bǔ)料分布控制發(fā)酵。用3M磷酸(Baker)和12.5％v/v氨(Merck)控制pH。用葉輪速度的自動(dòng)調(diào)節(jié)將DO2控制在30％，直到產(chǎn)生最大攪拌速度(1000rpm)。
發(fā)酵過程中，用自動(dòng)取樣器取出5ml樣品并冷卻在4℃，進(jìn)行干重測定和產(chǎn)物濃度分析。分批期為啟動(dòng)分批期，500ml YPD接種物加入到5.5L分批培養(yǎng)基中。發(fā)酵參數(shù)根據(jù)表3.1，當(dāng)廢氣中乙醇含量降低到300ppm時(shí)，開始指數(shù)補(bǔ)料。補(bǔ)料期補(bǔ)料培養(yǎng)基分裝到同一泵連接的兩個(gè)補(bǔ)料瓶中。
一個(gè)補(bǔ)料瓶含乙醇和自來水至2升，通過底板補(bǔ)料到發(fā)酵罐中。第二個(gè)補(bǔ)料瓶含所有其它補(bǔ)料成分和水至2升，通過頂板補(bǔ)料。根據(jù)等式1給與一個(gè)泵連接的兩個(gè)瓶施加相同指數(shù)補(bǔ)料速度。對于兩個(gè)瓶，所得補(bǔ)料速度是泵速度的兩倍。Φv,t=μ*X0*eμ*tρfeed*Yx,s*60]]>[g/分](等式1)Φv，t＝補(bǔ)料速度g/分μ＝生長速度 h-1X0＝補(bǔ)料開始時(shí)的生物量g(Mw＝24.6g/mol)t＝從補(bǔ)料開始起的時(shí)間 分ρfeed＝補(bǔ)料密度 g乙醇/g補(bǔ)料Yx，s＝生物量的估計(jì)產(chǎn)量 g×/g底物60＝時(shí)間因子 分/小時(shí)補(bǔ)料參數(shù)根據(jù)表3。
表310升乙醇發(fā)酵的發(fā)酵補(bǔ)料參數(shù)
當(dāng)氧氣濃度是0％時(shí)，限制條件到來，泵速度設(shè)置到線性補(bǔ)料速度。這個(gè)補(bǔ)料連續(xù)直到所有補(bǔ)料耗盡。結(jié)果
基于這些結(jié)果，結(jié)論是補(bǔ)料期限制條件出現(xiàn)后AFP的產(chǎn)量，繼續(xù)用含100wt％是乙醇的碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料，導(dǎo)致AFP的比產(chǎn)量驚人地高。
觀察到生物量產(chǎn)量是恒定的，沒有絕對AFP生產(chǎn)率的損失。對比實(shí)施例補(bǔ)料期的生長培養(yǎng)基不含有乙醇而是100wt％葡萄糖作為碳源。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基在上面描述。發(fā)酵罐補(bǔ)料條件也在上面說明，除了下列例外補(bǔ)料培養(yǎng)基從一個(gè)補(bǔ)料瓶應(yīng)用于發(fā)酵罐，該補(bǔ)料瓶含有所有成分并通過底板補(bǔ)料到發(fā)酵罐。根據(jù)等式1實(shí)施指數(shù)補(bǔ)料速度。
補(bǔ)料參數(shù)根據(jù)表3，除了X0值設(shè)置為2.11mol，使得一個(gè)補(bǔ)料瓶的補(bǔ)料速度與一個(gè)泵上兩個(gè)補(bǔ)料瓶的乙醇發(fā)酵相同。結(jié)果如下
結(jié)論是當(dāng)生長培養(yǎng)基僅含葡萄糖作為碳底物時(shí)，AFP產(chǎn)量從限制條件到來的時(shí)刻降低。AFP產(chǎn)量不再增加且產(chǎn)量下降。結(jié)果-實(shí)施例2
*比產(chǎn)量mg異源蛋白/g干燥物質(zhì)結(jié)論是使用乙醇作為碳源的異源蛋白的比產(chǎn)量大大高于葡萄糖作為碳源的產(chǎn)量。結(jié)果-實(shí)施例3
*比產(chǎn)量mg異源蛋白/g干燥物質(zhì)結(jié)論是使用乙醇作為碳源的異源蛋白比產(chǎn)量大大高于葡萄糖作為碳源的產(chǎn)量。
結(jié)果-實(shí)施例4
*比產(chǎn)量mg異源蛋白/g干燥物質(zhì)結(jié)論是使用乙醇作為碳源的異源蛋白比產(chǎn)量大大高于葡萄糖作為碳源的產(chǎn)量。
權(quán)利要求
1.由真菌制備異源蛋白的方法，包括所述真菌在含碳源的培養(yǎng)基上生長，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇，和其中培養(yǎng)基另外含有誘導(dǎo)劑。
2.權(quán)利要求1的方法，它包括分批期和補(bǔ)料期，其中補(bǔ)料期培養(yǎng)基包含50-100wt％是乙醇的碳源和其中補(bǔ)料期培養(yǎng)基另外含有誘導(dǎo)劑。
3.權(quán)利要求2的方法，其中補(bǔ)料期培養(yǎng)基包含50-100wt％是乙醇的碳源和另外含半乳糖作為誘導(dǎo)劑。
4.權(quán)利要求2或3的方法，其中該方法在發(fā)酵罐中實(shí)施，培養(yǎng)基以使得發(fā)酵罐中乙醇濃度維持在低于10vol％的補(bǔ)料速度進(jìn)行補(bǔ)料。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，該方法包括分批期，誘導(dǎo)期和補(bǔ)料期，其中在所述補(bǔ)料期a)真菌細(xì)胞在含任何碳源的培養(yǎng)基上生長到至少5g/l的細(xì)胞密度，沒有特殊優(yōu)選，隨后真菌細(xì)胞生長到5g/l以上的細(xì)胞密度，優(yōu)選10至90g/l，更優(yōu)選40至60g/l，使用含誘導(dǎo)劑和碳源的培養(yǎng)基，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇，b)已經(jīng)達(dá)到步驟a)的細(xì)胞密度后，產(chǎn)生限制生長條件，c)這些限制條件到來后，細(xì)胞進(jìn)一步在含碳源的培養(yǎng)基上生長，其中所述碳源的50-100wt％是乙醇。
6.前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中該方法以重復(fù)補(bǔ)料分批方法實(shí)施。
7.前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中誘導(dǎo)劑選自包括半乳糖、甲醇、溫度和磷酸鹽的組。
8.權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)的方法，其中補(bǔ)料培養(yǎng)基包含0.1-10wt％的半乳糖。
9.前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中碳源含80-100wt％的乙醇。
10.前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中真菌是酵母，優(yōu)選啤酒糖酵母。
11.前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中異源蛋白或肽選自抗凍肽、抗體或其片段，和酶。
12.權(quán)利要求5的方法，其中分批培養(yǎng)基含1-40wt％葡萄糖、水、微量金屬、止泡劑存在或不存在下、酵母提取物、維生素、磷酸鹽和硫酸鹽，和其中補(bǔ)料培養(yǎng)基含5-35vol％乙醇、0.1-10wt％葡萄糖、水、微量金屬、和止泡劑存在或不存在下、酵母提取物、維生素、磷酸鹽和硫酸鹽和其中10升規(guī)模中的“補(bǔ)料速度”“”是0.25-4g/分。
13.異源蛋白，可根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法獲得。
全文摘要
當(dāng)補(bǔ)料培養(yǎng)基含50－100wt％乙醇碳源和誘導(dǎo)劑時(shí)，由真菌細(xì)胞制備異源蛋白是好的。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1481439SQ01820537
公開日2004年3月10日 申請日期2001年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月13日
發(fā)明者A·M·J·范德拉爾, N·M·林德納, P·紐夫波爾特, A M J 范德拉爾, 林德納, 蠆ǘ 申請人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司