專利名稱：能生產(chǎn)果聚糖的乳桿菌屬菌株及其在人類或?qū)櫸锸称分械挠猛镜闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)的主要多糖為果聚糖的乳桿菌屬菌株，及其在各種人類或?qū)櫸锸称分械挠猛净蛴糜谥苽淙祟惢驅(qū)櫸锸称返挠猛?。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)果聚糖的方法。
背景技術(shù)：
由植物(纖維素、果膠或淀粉)、海藻(藻酸鹽和角叉菜膠)和細菌(藻酸鹽、吉蘭膠和呫噸膠)生產(chǎn)的多種高分子量多糖，可以在食品和非食品工業(yè)中用作增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、膠凝劑或水結(jié)合劑。所有這些多糖都是添加劑，因此，在食品工業(yè)中它們被認為不是很必要的。
果聚糖(又被稱為β-(2→6)-D-果糖或β-(2→6)-D-果聚糖或β-(2→6)-D-呋喃果聚糖或β-(2→6)-D-Fruf或植物中的phleins)是覆蓋寬的分子量范圍(大約2kDa至大約60MDa)的D-呋喃果糖的天然同多糖。低分子量果聚糖在植物中是作為碳水化合物儲存物質(zhì)生產(chǎn)的(Vandamme，B.J.，和Derycke，D.G.(1983)Adv.Appl.Microbiol.，29139-176)。在這種情況下的分子結(jié)構(gòu)是β-(2→6)-果糖的短的線性鏈。包括從與植物相關(guān)的細菌，到土壤桿菌、牙齒噬斑桿菌、酵母和真菌的若干種類型的微生物也能產(chǎn)生果聚糖(Han，Y.W.，(1990)Adv.Appl.Microbiol.，35，171-194)醋桿菌屬、放線菌屬、氣桿菌屬、曲霉屬、芽孢桿菌屬、棒桿菌屬、歐文氏菌屬、明串珠菌屬、假單胞菌屬和鏈球菌屬等。在微生物中，果聚糖具有較高的分子量，并且除了植物果聚糖中所存在的β-(2→6)鍵之外，還存在由β-(2→1)鍵形成的大量分支。
乳酸菌在美國是具有GRAS(一般被認為是安全的)資格的食品級生物，并且已知能產(chǎn)生多種外多糖(exopolysaccharide)分子(Cerning，J.(1990)FEMS Microbiol.Rev.87113-130；Dunican，L.K.和Seeley，H.W.(1965)J Gen.Microbiol.40297308)，這些分子決定了發(fā)酵乳制品的質(zhì)地。來自所述細菌的外多糖可以開發(fā)出新一代的食品級多糖。
實際上，目前正在深入研究包括乳桿菌屬在內(nèi)的乳酸菌的雜多糖合成(Cerning，J.(1990)FEMS Microbiol.Rev.87113-130；Grobben，G.J.，等，(1995)J.Appl.Bacteriol.79103-107；Stingele，F(xiàn).等，(1996)，R Bacteriol.1781680-1690和van denBerg，D.J.C.等，(1995)Appl.Environ.Microbiol.612840-2844)。
另外，主要在腸膜明串珠菌(NO 6055)和鏈球菌屬中研究了同多糖的合成(例如葡聚糖和果聚糖的合成)(Cerning，J.(1990)FEMSMicrobiol.Rev.87113-130)。可以獲得的有關(guān)乳桿菌屬中同多糖生物合成的信息有限(Dunican，L.K.和Seeley，H.W.(1965)JGen.Microbiol.40297-308；Pidoux，M.等，(1990)J；Appl.Bacteriol.69311-320)。
最近，G.van Geel-Schutten等業(yè)已鑒定了路氏乳桿菌LB 121的一個菌株，這種菌株能合成具有葡萄糖和果糖的水溶性外多糖材料，并且進一步表征了上述葡聚糖和果聚糖外多糖(van Geel-Schutten，G.H.，等，(1999)，Appl.Environ.Microbiol.653008-3014)。
因此，感興趣的提供能產(chǎn)生果聚糖(fructans)，特別是果聚糖(levan)的乳桿菌屬的其他菌株，特別是除了路氏乳桿菌以外的菌株，并且這種菌株對于食品工業(yè)來說具有很高的價值。
發(fā)明概述因此，在第一方面，本發(fā)明的目的是提供一種分離的和純化的乳桿菌屬菌株，特別是來自物種舊金山乳桿菌，它產(chǎn)生的主要多糖為果聚糖。
業(yè)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，最初被用于傳統(tǒng)面團發(fā)酵的舊金山乳桿菌能產(chǎn)生果聚糖和少量的葡萄糖聚合物。
所述舊金山乳桿菌菌株優(yōu)選是保藏號為CNCM I-2588的舊金山乳桿菌NCC 2729或保藏號為CNCM I-2589的舊金山乳桿菌NCC 2731或保藏號為CNCM I-2613的舊金山乳桿菌NCC 2733。
本發(fā)明還涉及一種由舊金山乳桿菌生產(chǎn)果聚糖的方法，其中-用所述菌株的預培養(yǎng)物接種含有蔗糖的培養(yǎng)基，
-使其在25-35℃下發(fā)酵12-48小時，和-使所得到的培養(yǎng)物的pH值降低到低于4.5，然后添加冷的乙醇，并且在0-10℃下保存6-48小時。
所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有至少0.2％的蔗糖。
本發(fā)明還涉及所述多糖和/或所述菌株在各種人類或?qū)櫸锸称分械挠猛净蛴糜谥苽涓鞣N人類或?qū)櫸锸称坊蚧瘖y組合物的用途。
在一種最優(yōu)選的實施方案中，來自舊金山乳桿菌的果聚糖可以用作人類或?qū)櫸锸称分械囊嫔毓厶堑脑粊碓础?br> 還可將其用作免疫刺激多糖的來源(P.Z.Allen和W.H.Bowen，(1990)Arch.Oral.Biol.，35，55-62)。
在最后一個方面，本發(fā)明涉及至少包括上文所述的高度可溶的果聚糖和/或上文所述的舊金山乳桿菌菌株的人類或?qū)櫸锸称坊蚧瘖y組合物。
發(fā)明詳述在以下說明書中，使用了以下縮略語GRAS，一般認為是安全的；HMBC，異核多鍵相關(guān)；PEP-HSQC，保留異核單量子相干中的等同途徑；NMR，核磁共振；NOESY，核歐沃豪斯效應(yīng)譜測量；RAPD-PCR，隨機擴增的多態(tài)DNA聚合酶鏈式反應(yīng)；TOCSY，全相關(guān)譜測量；TPPI，與時間成正比的相增量。
最后，“NCC”表示雀巢培養(yǎng)物保藏中心(雀巢研究中心，Vers-chez-les-Blanc，Lausanne，瑞士)。
根據(jù)第一方面，涉及能產(chǎn)生果聚糖的舊金山乳桿菌的分離的和純化的菌株。
實際上，業(yè)已驚奇地發(fā)現(xiàn)，最初被用于傳統(tǒng)面團發(fā)酵的舊金山乳桿菌能產(chǎn)生高度可溶的含有果糖的碳水化合物，特別是果聚糖，和少量的葡萄糖聚合物。
例如，所述舊金山乳桿菌菌株是保藏號為CNCMI-2588的舊金山乳桿菌NCC 2729或保藏號為CNCM I-2589的舊金山乳桿菌NCC 2731或保藏號為CNCM I-2613的舊金山乳桿菌NCC 2733。
盡管果聚糖比菊糖的溶解度更高，其溶解度在低溫下是可變的，但是傾向于更低(Han，Y.W.，(1990)Adv.Appl.Microbiol.，35，171-194)。相反，由舊金山乳桿菌產(chǎn)生的果聚糖，即使是在低溫下也是高度可溶的。
通過NMR分析由舊金山乳桿菌NCC 2729發(fā)酵所生產(chǎn)的果聚糖。主要產(chǎn)物(＞95％)是果聚糖，而次要產(chǎn)物(＜5％)可能是葡聚糖。用源于粘放線菌的特殊果聚糖酶進行的酶促消化證實，由所述菌株所生產(chǎn)的果聚糖具有β-(2→6)鍵。由來自黑曲霉的菊糖酶的酶促消化所增強的降解作用表明，可能還存在β-(2→1)鍵。
舉例來說，在一種最優(yōu)選的實施方案中，業(yè)已于2000年12月1日將舊金山乳桿菌菌株NCC 2729，NCC 2731和NCC 2733交由國立微生物保藏中心(Institut Pasteur，28 rue du Docteur Roux，F(xiàn)-75024Paris cedex 15，法國)，保藏號分別為CNCM I-2588，CNCM I-2589和CNCM I-2613。
下面提供了有關(guān)所述菌株的細節(jié)，特別是有關(guān)其形態(tài)學、糖類發(fā)酵和其他方面的細節(jié)。
確定成分培養(yǎng)基為了生長舊金山乳桿菌的菌落，使用了以下培養(yǎng)基成分 用量 優(yōu)選用量蔗糖 0.2-50g/l 20g/l胰化蛋白胨 0.2-20g/l 10g/l酵母提取物 0.2-20g/l 7g/l檸檬酸二銨 0.1-20g/l 5g/l乙酸鈉(×3，溶于水)0.1-20g/l 5g/l磷酸二氫鉀×3H2O(×3，溶于水) 0.1-20g/l 2.5g/l牛肉膏(Lab Lemco powder，粉末) 0.1-20g/l 2g/l葡糖酸鉀 0.1-20g/l 2g/l半胱氨酸-HCl 0.01-10g/l 0.5g/l硫酸鎂(×7，溶于水)0.01-10g/l 0.2g/l硫酸錳(×4，溶于水)0.01-10g/l 0.1g/l硫酸鐵(×7，溶于水)0.001-2g/l 0.05g/lTween800.01-10ml 1ml最后，通過添加3N KOH將pH值調(diào)整到5-6之間，優(yōu)選5.4。
形態(tài)學舊金山乳桿菌是形狀如直棒的革蘭氏陽性微生物。它們能在確定成分培養(yǎng)基瓊脂平板上形成規(guī)則的白色菌落。
在添加＞2％的蔗糖時，所述菌落的大小增加，并出現(xiàn)粘液質(zhì)的外觀。
舊金山乳桿菌是過氧化氫酶陰性的，并且是兼性厭氧菌。
糖的發(fā)酵為了進行糖發(fā)酵，舊金山乳桿菌是必須異型發(fā)酵。它們能由麥芽糖產(chǎn)生D/L-乳酸(D/L＝40/60)。舊金山乳桿菌對小麥蛋白具有蛋白水解活性，并且能夠使若干種復合碳水化合物發(fā)酵，包括麥芽糖、葡萄糖和蔗糖。
其他方面所述舊金山乳桿菌菌株能合成果聚糖多糖?？梢酝ㄟ^RAPD PCR鑒定所述菌株，這是一種從各物種生產(chǎn)基因組指紋的方法，對所述物種的待擴增靶序列所知甚少，所述擴增是通過PCR擴增方法擴增DNA片段的菌株特異性陣列(指紋)，使用隨機寡核苷酸啟動從基因組位點開始的DNA合成，寡核苷酸在所述位點偶然匹配的或者幾乎匹配。用這種方法擴增的DNA可用于通過匹配特征性模式，確定物種的相關(guān)性。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)果聚糖的方法，其中，用本發(fā)明的舊金山乳桿菌菌株的預培養(yǎng)物接種含有蔗糖的培養(yǎng)基，使其在25-35℃下發(fā)酵12-48小時，優(yōu)選24小時，補充蔗糖。所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有至少0.2％的蔗糖。
在pH值降低到小于4.5之后，收獲培養(yǎng)物。為了獲得果聚糖，可以將2倍體積的冰冷乙醇添加到上清液中，并且在0-10℃，優(yōu)選4℃下保存6-48小時，優(yōu)選15小時，然后可以通過將沉淀物溶解在蒸餾水中，再通過乙醇沉淀來進一步純化沉淀物中的果聚糖。
為了生長舊金山乳桿菌細菌，并且獲得果聚糖，生長可以在上文所述的特定的確定成分培養(yǎng)基(20g/l蔗糖，胰化蛋白胨10g/l，酵母提取物7g/l，檸檬酸二銨5g/l，乙酸鈉(×3，溶于水)5g/l，KH2PO4×3H2O(×3，溶于水)2.5g/l，牛肉膏(Lab Lemco，粉末)2g/l，葡糖酸鉀2g/l，半胱氨酸-HCl 0.5g/l，MgSO4(×7，溶于水)0.2g/l，MnSO4(×4，溶于水)0.1g/l，F(xiàn)eSO4(×7，溶于水)0.05g/l，tween 80 1ml，用3N KOH將pH調(diào)整到5.4)中進行。
例如，可以干燥含有果聚糖的舊金山乳桿菌培養(yǎng)物上清液，以便提供果聚糖粉末。例如，優(yōu)選通過凍干、噴霧干燥、冷凍干燥、流化床干燥方法干燥所述培養(yǎng)物。
通過GRAS舊金山乳桿菌菌株所生產(chǎn)的高度可溶的果聚糖可應(yīng)用于各種領(lǐng)域。
因此，根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及將所述多糖和/或所述舊金山乳桿菌用于各種人或?qū)櫸锸称坊蚧瘖y組合物的用途或用于制備各種人或?qū)櫸锸称坊蚧瘖y組合物的用途。
例如，可優(yōu)選將本發(fā)明的多糖用于制備嬰兒配方、基于乳的制品、基于谷物的制品、沙拉調(diào)料、調(diào)味汁、番茄醬、芥末，化妝品，如護膚霜。
在另一種實施方案中，來自舊金山乳桿菌的果聚糖可用作人類或?qū)櫸锸称分幸嫔毓厶堑膩碓?。果?寡-和多糖(FOS)的主要生物學特征是，當它們到達人類(或哺乳動物)的大腸時，具有選擇性地養(yǎng)育雙歧桿菌屬生長的能力。到目前為止，僅僅披露了β-(2→1)-D-果糖寡-和多聚物，如菊糖是雙歧桿菌屬產(chǎn)生的，并因此被確定為益生素碳水化合物。為了使果聚糖發(fā)酵，來自普通微生物區(qū)系的雙歧桿菌屬必須使用特異的酶，即果糖苷酶。所述微生物酶還能水解β-(2→6)-果糖，使果聚糖作為益生多糖而具有營養(yǎng)價值。最近業(yè)已證實，雙歧桿菌屬能水解β-(2→6)-果糖(Marx等(2000)，F(xiàn)EMS Microbiol.Letters 182，163-169)。
還可將果聚糖用作免疫刺激多糖的來源(P.Z.Allen和W.H.Bowen，(1990)Arch.Oral.Biol.，35，55-62)。
因此，能夠以大約0.01％-大約25％，更優(yōu)選0.1％-20％的用量將本發(fā)明的果聚糖用于人類或?qū)櫸锸称分?。在用于化妝品領(lǐng)域時，本發(fā)明的果聚糖的用量為大約0.01％-大約5％，更優(yōu)選0.1％-2％。
可以將本發(fā)明的菌株用于人類或?qū)櫸锸称芬约盎瘖y品中，其用量至少為1.105cfu/g，更優(yōu)選107cfu/g至≥108cfu/g。
最后，本發(fā)明涉及至少含有上述多糖和/或上述細菌菌株的人類或?qū)櫸锸称坊蚪M合物。
為了制備所述食品或組合物，可以將按上述方法獲得的果聚糖添加到食品或化妝品中，如添加到嬰兒配方、骨粉、奶粉、酸奶、番茄醬、蛋黃醬中，例如，在生產(chǎn)期間添加。
寵物食品可以含有來自舊金山乳桿菌的果聚糖和/或舊金山果聚糖菌株作為益生素的來源。然后可以將它用作營養(yǎng)全面的寵物食品或添加劑或治療劑或餅干。優(yōu)選在營養(yǎng)全面的寵物食品中含有果聚糖和/或所述菌株。
所述營養(yǎng)全面的寵物食品可以是任何合適形式的；例如干燥形式、半濕潤形式和濕潤形式。所述寵物食品可以按常規(guī)方法生產(chǎn)。除了營養(yǎng)成分之外，所述寵物食品可以含有淀粉來源、蛋白來源或脂質(zhì)來源的任意一種或多種。例如，合適的淀粉來源為谷類和豆類，如玉米、稻米、小麥、大麥、燕麥、大豆及其混合物。合適的蛋白來源可選自任何合適的動物或植物蛋白來源；例如肉類和骨粉、禽肉粉、魚肉粉、大豆蛋白濃縮物、乳蛋白和谷蛋白等。合適的脂質(zhì)來源包括肉類、動物脂肪和植物脂肪。淀粉、蛋白和脂質(zhì)來源的選擇主要是由動物的營養(yǎng)需要、可口性因素和所生產(chǎn)的產(chǎn)品類型決定的。另外，根據(jù)需要還可以將各種其他成分添加到干燥食品中，例如糖、鹽、調(diào)料、佐料、維生素、礦物質(zhì)、香味劑、和脂肪等。
對于干燥的寵物食品來說，合適的方法是擠出蒸煮。盡管可以使用烘烤和其他合適的方法。在進行擠出蒸煮時，干燥的寵物食品通常是以粗粒形式提供的。如果使用益生素的話，可以在加工之前將所述益生素與干燥的寵物食品的其他成分混合。
在歐洲專利申請?zhí)?850569中披露了一種合適的方法。如果使用細菌菌株的話，優(yōu)選將所述生物包覆在所述干燥寵物食品上或填充在所述干燥寵物食品內(nèi)。在歐洲專利申請?zhí)?862863中披露了一種合適的方法。
對于濕潤的食品來說，可以使用披露于美國專利4,781,939和5,132,137中的方法生產(chǎn)模仿的肉制品。還可以使用用于生產(chǎn)厚面包類型產(chǎn)品的其他方法；例如，在蒸汽烤箱中烹制。另外，可以生產(chǎn)長面包形產(chǎn)品，包括乳化合適的肉類材料，以便生產(chǎn)肉乳液，添加合適的膠凝劑，并且在填充到罐或其他容器中之前，對所述肉類乳液進行加熱。
作為益生素的果聚糖在所述寵物食品中的最高含量優(yōu)選為占重量大約的20％；特別是占重量的大約10％。例如，所述益生素可以占寵物食品重量的大約0.1％-大約20％。
提供下面的實施例僅僅是為了說明目的，而不應(yīng)當被理解成是對本申請主題的限定。所有百分比都是以重量百分比形式提供的，除非另有說明。在實施例前面是附圖簡述。


圖1由舊金山乳桿菌CNCM I-2588生產(chǎn)的果聚糖的結(jié)構(gòu)，具有通過其殘基字母代碼(A-C)表示的單糖單元。
圖2(上)在2H2O中，在600MHz和67℃下記錄的由舊金山乳桿菌CNCM I-2588生產(chǎn)的果聚糖的1D1H NMR譜。所有的β-D-Fruf共振都是通過相應(yīng)的殘基字母代碼和編號識別的；(下)舊金山乳桿菌CNCM I-2588生產(chǎn)的果聚糖的PEP-HSQC譜。
實施例實施例1測試能產(chǎn)生果聚糖的舊金山乳桿菌菌株在上文所述的確定成分培養(yǎng)基-瓊脂平板上生長菌株(20g/l蔗糖，胰化蛋白胨10g/l，酵母提取物7g/l，檸檬酸二銨5g/l，乙酸鈉(×3，溶于水)5g/l，KH2PO4×3H2O(×3，溶于水)2.5g/l，牛肉膏(Lab Lemco，粉末)2g/l，葡糖酸鉀2g/l，半胱氨酸-HCl0.5g/l，MgSO4(×7，溶于水)0.2g/l，MnSO4(×4，溶于水)0.1g/l，F(xiàn)eSO4(×7，溶于水)0.05g/l，tween 80 1ml，用3N KOH將pH調(diào)整到5.4)。
然后在液體特殊培養(yǎng)基中生長達到粘稠外觀的菌株，然后在25-35℃下發(fā)酵12-48小時，優(yōu)選24小時。在pH值降低到小于4.5時，收獲培養(yǎng)物。為了獲得果聚糖，將2倍體積的冰冷乙醇添加到上清液中，并且在0-10℃，優(yōu)選4℃下保存6-48小時，優(yōu)選15小時，然后通過將沉淀物溶解在蒸餾水中并且用乙醇使果聚糖沉淀而進一步純化沉淀物。
舊金山乳桿菌是直棒形狀的，并且能在確定成分培養(yǎng)基瓊脂平板上形成規(guī)則的白色菌落。
在添加＞2％的蔗糖時，所述菌落的大小增加，并且出現(xiàn)粘液質(zhì)的外觀，可以對它進行肉眼鑒定。
為了進行糖類發(fā)酵，舊金山乳桿菌必須進行異型發(fā)酵。它們能由麥芽糖產(chǎn)生D/L-乳酸(D/L＝40/60)。舊金山乳桿菌對小麥蛋白具有蛋白水解活性，并且能夠發(fā)酵若干種復合碳水化合物，包括麥芽糖，葡萄糖和蔗糖。
所述舊金山乳桿菌菌株CNCM I-2588和CNCM I-2589能合成果聚糖多糖。可以通過RAPD PCR鑒定所述菌株，這是一種從各物種生產(chǎn)基因組指紋的方法，對所述物種的待擴增靶序列所知甚少，所述擴增是通過PCR擴增方法擴增DNA片段的菌株特異性陣列(指紋)，使用隨機寡核苷酸啟動從基因組位點開始的DNA合成，寡核苷酸在所述位點偶然匹配的或者幾乎匹配。用這種方法擴增的DNA可用于通過匹配特征性模式，確定物種的相關(guān)性。
實施例2由舊金山乳桿菌CNCM I-2588所生產(chǎn)的多糖的結(jié)構(gòu)分析所述鑒定是通過單糖分析、核磁共振譜測量(NMR)和酶促消化進行的。
單糖分析由舊金山乳桿菌CNCM I-2588生產(chǎn)的多糖的定量單糖分析是在軟酸水解(2N三氟乙酸，60℃，在30分鐘和1小時采集的樣品)之后通過高效陰離子交換(HPAE)層析借助于脈沖電流檢測(PAD)進行的。為了避免降解果糖單糖單元(降解成甘露糖和葡萄糖)，低溫水解條件是必需的。
以上分析發(fā)現(xiàn)了＞95％的果糖的存在和痕量葡萄糖的存在。
NMR譜測量將5mg由舊金山乳桿菌CNCM I-2588生產(chǎn)的多糖溶解在99.96原子％2H2O(Euriso-Top)中。所有實驗都是在裝有主動屏蔽的脈沖場z-梯度倒三角共振探頭的三通道Bruker DRX 600MHz波譜儀上記錄的?；瘜W位移是參考外部[13C-1]-葡萄糖的α-端基異構(gòu)信號，以ppm形式提供的(對于H-1來說是δ6H-15.15，而對于C-1來說是δC- 192.90)。
相敏感性二維實驗是用TPPI記錄的(Marion，D.等，(1983)Biochem.Biophys.Res.Commun.113，967-974)混合時間為15毫秒和90毫秒的TOCSY(Braunschweiler，L.等，(1983)J.Magn.Reson.53，521-528)，混合時間為50毫秒和200毫秒的NOESY(Jeener，J.等，(1979)J Chem。Phys.11，45464553；Anil Kumar，Ernst，R.R.等(1980)Biochem.Biophys.Res.Commun.95，1-6)，和梯度敏感性增強的1H-13C異核單量子相干(PEP-HSQC)(Kay，L.E.，等(1992)J.Am.Chem.Soc.114，10663-10665)。為了確定糖苷鍵，記錄了幅度模式梯度過濾的50毫秒1H-13C HMBC(Bax，A.等(1986)J.Am.Chem.Soc.108，2093-2094)。
獲得了以下復合點數(shù)目(F1，F(xiàn)2)256×1024(TOCSY和NOESY)，512×1024(HSQC)和256×4096(HMBC)，平均超過14次掃描(TOCSY，HSQC)或64次掃描(NOESY，HMBC)。使用1800Hz×1800Hz(TOCSY和NOESY)或3020Hz×1800Hz(HSQC和HMBC)的譜寬度(ω1，ω2)。在所有場合下都使用90度位移的方形正弦波，具有1次零填充。所有數(shù)據(jù)都是用Bruker XWINNMR 2.6軟件處理的。
由舊金山乳桿菌CNCM I-2588所產(chǎn)生的多糖的1D1H NMR譜(圖2)表現(xiàn)出一組優(yōu)勢質(zhì)子共振標記的A。大約5ppm的波幅小得多的其他組的共振(總體上比A小5％)是由于葡聚糖的端基異構(gòu)共振產(chǎn)生的，并且不再作進一步的鑒定。
在對所述二維波譜進行分析之后，獲得了1H和13C NMR的結(jié)果，并且將這些結(jié)果歸納在表1中。
表1在67℃下，在2H2O中測定的由舊金山乳桿菌CNCM I-2588生產(chǎn)的多糖的1H和13C NMR化學位移。表中的值是以相對外部[13C-1]葡萄糖的ppm形式提供的(δH-1(α)5.15和δC-1(α)92.90)。

由舊金山乳桿菌CNCM I-2588生產(chǎn)的多糖的1H結(jié)果是通過追蹤所記錄的TOCSY和NOESY譜中的所有跡線獲得的。13C共振是從PEP-HSQC譜獲得的，C-2共振除外，C-2是季碳原子，預計在PEP-HSQC中它不能產(chǎn)生信號，該結(jié)果是通過其與H-1和H-3的長范圍的標量偶聯(lián)從HMBC光譜獲得的。
含量最豐富的殘基A的身份相當于β-D-Fruf單糖單元的化學位移(van Geel-Schutten，G.H.等，(1999)，Appl.Environ.MicrobioL653008-3014)。含量較少的殘基B和C相當于強度較小的NMR峰，還相當于具有不同取代的β-D-Fruf單糖單元(表1，J.W.Timmermans等，(1993)，Carbohydr.Res.243379-384)。PEP-HSQC峰的綜合提供了對不同種的比例的相當精確的描述。從(C-6，H-6)亞甲基交叉峰可以看出，A+BC為5.52，而從(C-1，H-1)亞甲基交叉峰可以看出，A+B+C＝6.7。另一方面，(C-i，H-i)交叉峰的i＝3，4，5，表明A+B+C＝4.1。由以上結(jié)果可以得出這樣的結(jié)論，所述重復單元具有兩個無分支的Fruf，一個分支點Fruf和一個末端Fruf。其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
不過，其取代形式是難以確定的，因為在對1或2號位置進行糖苷取代之后，質(zhì)子或碳化學位移沒有發(fā)生顯著變化(J.W.Timmermans等，(1993)，Carbohydr.Res.243379-384)。對于6號位置上的取代來說，碳化學位移大于64ppm，而對于未取代過的C-6來說，碳化學位移在大約63ppm左右。NOESY和HMBC數(shù)據(jù)的作用很小，因為在同多糖上常見的情況是殘基內(nèi)轉(zhuǎn)移與可能的殘基間轉(zhuǎn)移重疊。在缺乏甲基化分析數(shù)據(jù)的情況下，可以推斷所述取代位于1、2和6號位置上。
酶促消化用來自粘放線菌的特異性果聚糖酶進行的酶促消化表明，由所述菌株生產(chǎn)的果聚糖具有β-(2→6)鍵。由來自黑曲霉的菊糖酶的酶促降解增強降解作用，表明可能還存在β-(2→1)鍵。
總之，根據(jù)化學單糖分析和NMR譜，可以將由舊金山乳桿菌CNCMI-2588分泌的多糖的重復單元的結(jié)構(gòu)確定為→6)-β-D-Fruf-(2→6)-[β-D-Fruf(2→1)-]-β-D-Fruf-(2→6)-β-D-Fruf-(2→，并且如圖1所示。
實施例3本發(fā)明果聚糖的制備在25-35℃下，在確定成分培養(yǎng)基(20g/l蔗糖，胰化蛋白胨10g/l，酵母提取物7g/l，檸檬酸二銨5g/l，乙酸鈉(×3，溶于水)5g/l，KH2PO4×3H2O(×3，溶于水)2.5g/l，牛肉膏(Lab Lemco，粉末)2g/l，葡糖酸鉀2g/l，半胱氨酸-HCl 0.5g/l，MgSO4(×7，溶于水)0.2g/l，MnSO4(×4，溶于水)0.1g/l，F(xiàn)eSO4(×7，溶于水)0.05g/l，tween 80 1ml，用3N KOH將pH調(diào)整到5.4)上生長24小時之后，收獲培養(yǎng)上清液(在消耗蔗糖之后)，并離心(10分鐘，1000g，4℃)，以便除去細胞。
然后，添加1倍體積的冰冷乙醇。攪拌并且在4℃下冷卻15小時，然后通過離心(30分鐘，15000g，4℃)回收沉淀的細胞外多糖。
將沉淀物溶解在蒸餾水中，再次收獲，并且向上清液中添加1倍體積的乙醇(在4℃下保存15小時)。在離心之后(27000xg，25分鐘)，將沉淀物溶解在蒸餾水中，并且用脫礦質(zhì)水透析2天(截斷分子量12000-14000Da)并且冷凍干燥。
實施例4本發(fā)明果聚糖的制備制備本發(fā)明果聚糖的另一種方法如下。通過果聚糖-蔗糖酶合成果聚糖。業(yè)已證實這種酶是一種細胞表面蛋白。發(fā)現(xiàn)果聚糖-蔗糖酶活性與細胞表面相關(guān)。在含有1％葡萄糖和1％蔗糖的培養(yǎng)基中生長之后，通過離心回收細胞，用鹽溶液洗滌，并且在25℃或37℃的溫度下在pH5.2的50mM乙酸鈉，200mM蔗糖和50mg/LCaCl2，2H2O，疊氮化物0.1％中培養(yǎng)。24小時之后，通過離心分離細胞。用所述方法在冰冷乙醇中沉淀上清液，并且將不溶性沉淀物溶解在蒸餾水中。用水充分透析，然后在50℃下用0.5N TFA水解含有所述多糖的溶液30分鐘。僅發(fā)現(xiàn)果糖是單糖。該實驗證實僅僅使用細胞沉淀可以在含有蔗糖的緩沖溶液中合成果聚糖。
研究了溫度對細胞生長的影響以及溫度對多糖在乙酸緩沖液中的合成的影響。下面的表格表明，在25℃下生長的細胞獲得了最佳果聚糖產(chǎn)量。
表溫度對細胞生長的影響和溫度對多糖在乙酸緩沖液中的合成的影響(在將樣品稀釋10倍之后通過苯酚/硫酸測定，測定在485nm波長下的吸收值)

實施例5舊金山乳桿菌菌株在乳制品中的應(yīng)用將本發(fā)明的菌株舊金山乳桿菌CNCM I-2588、CNCM I-2589或CNCMI2613用于生產(chǎn)發(fā)酵的酸奶樣乳制品。
為此，制備了1L含有2.8％的脂肪，并且添加了2％脫脂奶粉和6％蔗糖的乳制品，在96℃下對它進行巴氏滅菌30分鐘，并且將其溫度降低到42℃。在含有10％重構(gòu)奶粉和0.1％商用酵母提取物的無菌MSK培養(yǎng)基中重新激活嗜熱鏈球菌的非增稠菌株的預培養(yǎng)物和保加利亞乳桿菌非粘性菌株的預培養(yǎng)物。
同樣在上文所述的確定成分培養(yǎng)基中重新激活舊金山乳桿菌菌株的預培養(yǎng)物，然后在含有10％重構(gòu)奶粉和0.1％商用酵母提取物以及1％蔗糖的無菌MSK培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后用1％每一種上述重新激活的預培養(yǎng)物接種巴氏滅菌的乳制品，并且讓該乳制品在32℃下發(fā)酵，直到pH值達到4.5。
用這種方法生產(chǎn)出了酸奶樣乳制品，并且在4℃下保存。用舊金山乳桿菌菌株制備的發(fā)酵的酸奶樣乳制品具有柔軟的質(zhì)地和美妙的口感，特別是在4℃下保存10天之后更是如此。另外，果聚糖具有益生素潛力。
實施例6將來自舊金山乳桿菌菌株的果聚糖用作嬰兒配方中的益生素制備用于干燥嬰兒配方中的干混合物，對于100克的配方來說，含有5-20％，優(yōu)選10％的肽，2-40％，優(yōu)選20％的脂肪，10-60％，優(yōu)選40％的非果聚糖碳水化合物(包括乳糖65％，麥芽糖糊精20％，淀粉15％)，和1-10％，優(yōu)選3％的果聚糖(按實施例3方法制備)，滿足每日所需的痕量維生素和少量元素，和0.1-5％，優(yōu)選1.5％的礦物質(zhì)。
實施例7含有來自舊金山乳桿菌菌株的果聚糖的嬰兒配方為了獲得一種嬰兒配方，我們制備了100毫升配方所包含的以下混合物0.5-5％，優(yōu)選2％的肽，0.2-10％，優(yōu)選4％的脂肪，1-25％，優(yōu)選8％的非果聚糖碳水化合物(包括乳糖65％，麥芽糖糊精20％，淀粉15％)，和0.5-20％，優(yōu)選5％的果聚糖(按實施例3方法制備)，滿足每日所需的痕量維生素和少量元素，和0.01-2％，優(yōu)選3％的礦物質(zhì)，和50-90％，優(yōu)選75％的水。
實施例8基于發(fā)酵谷物的飲料在適合熱處理的容器中混合以下成分(份數(shù)以千克形式表示)19.8米粉，15.0小麥粉，13.9燕麥片，24.3蔗糖，1.5酵母提取物和850水。
向上述混合物中噴射蒸汽，將溫度提高到130℃，并且在該溫度下保持1分鐘，最后冷凍到大約32℃。然后將所得到的漿轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中，然后用舊金山乳桿菌菌株CNCM I-2588、CNCM I2589或CNCMI-2613中的一種菌株接種，使接種的細菌細胞在所述漿中的細胞濃度大約為1-5×106cfu/ml。
發(fā)酵在32℃下進行8小時，得到了一種酸化發(fā)酵谷物基料。在使用之前，可以在4℃下將所述發(fā)酵的谷物基料保存長達1周時間，或者進行巴氏滅菌/消毒以便保存更長時間。
實施例9含有舊金山乳桿菌菌株的寵物食品一種飼料混合物由玉米、玉米谷蛋白、雞和魚、鹽、維生素和礦物質(zhì)組成。將離開預調(diào)節(jié)器的潮濕的飼料輸送到擠出機-蒸煮器中，并且凝膠化。強制離開所述擠出機的凝膠化基質(zhì)通過一個模具，并且擠出。將離開所述模具頭的擠出物切割成適合喂養(yǎng)狗的片，在大約110℃下干燥大約20分鐘，并且冷凍以便成團，所得到的所述團塊的水活性大約為0.6。
用含有牛脂的物質(zhì)對所述飼料團進行噴霧包衣。除了所述標準包衣之外，以0.1-20％，優(yōu)選0.5-5％的比例，用含有由舊金山乳桿菌菌株CNCM I-2588、CNCM I-2613或CNCM I-2589生產(chǎn)的果聚糖(按實施例3方法制備)的干燥的和濃縮的粉末對所述飼料團進行包衣。
因此，由此獲得的干燥的狗飼料，特別適合為寵物提供果聚糖的益生素來源，例如，這種飼料能改善腸道微生物區(qū)系的組成或皮膚和皮毛狀況。
實施例10含有來自舊金山乳桿菌的果聚糖的濕潤的寵物食品用73％的禽成分、豬肺和牛肝(研磨物)，16％的小麥粉，7％的水，2％的染料、香味劑、維生素和無機鹽制備混合物。在12℃下對該混合物進行乳化，并且以布丁形式擠出，然后在90℃的溫度下蒸煮。將其冷卻到30℃，并且切成厚塊。將45％的厚塊與55％的調(diào)味汁混合，該調(diào)味汁是用98％的水、1％的染料和1％的由舊金山乳桿菌菌株CNCM I-2588、CNCM I-2589或CNCM I-2613生產(chǎn)的多糖果聚糖制備的，該果聚糖是按照實施例3的方法作為具有益生素特性的增稠劑而制備的。將所述寵物食物填充在鍍錫鐵皮罐中，并且在125℃下消毒40分鐘。
實施例11基于發(fā)酵谷物的嬰兒配方用舊金山乳桿菌菌株CNCM I-2588、CNCM I-2589或CNCM I-2613中的一種菌株接種小麥、稻米或玉米粉或其混合物和水，其干物質(zhì)含量為20-60％，優(yōu)選30-50％，更優(yōu)選35-45％，以便使?jié){中的細胞濃度為大約1-5×10E+06cfu/ml。發(fā)酵在32℃下進行10小時。在菌株生長期間，果聚糖是原位生產(chǎn)的。然后通過蒸汽噴射(120-140℃)對發(fā)酵的和酸化的面粉進行消毒，并且通過滾動于燥(120-140℃)或通過擠出蒸煮(140-180℃)進行干燥，得到了富含益生素外多糖果聚糖的嬰兒配方。
權(quán)利要求
1.舊金山乳桿菌的一種分離的和純化的菌株，它能產(chǎn)生果聚糖。
2.如權(quán)利要求1的菌株，其保藏號為CNCM I-2588，CNCM I-2589或CNCM 1-2613。
3.一種由權(quán)利要求1或2之一的菌株獲得的可溶性果聚糖。
4.一種生產(chǎn)果聚糖的方法，其中-用權(quán)利要求1或2的菌株的預培養(yǎng)物接種含有蔗糖的培養(yǎng)基，-使其在25-35℃下發(fā)酵48小時，和-然后使所得到的培養(yǎng)物的pH降低到低于4.5，再添加冷乙醇，并且在0-10℃下保存6-48小時。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中，所述培養(yǎng)基至少含有0.2％的蔗糖。
6.如權(quán)利要求4的方法，其中，在保存之后純化沉淀物中的果聚糖。
7.如權(quán)利要求4的方法，其中，干燥含有果聚糖的培養(yǎng)物，以便生產(chǎn)果聚糖粉。
8.將權(quán)利要求3的果聚糖和/或權(quán)利要求1或2的舊金山乳桿菌菌株用于制備人類或?qū)櫸锸称坊蚧瘖y組合物的用途。
9.如權(quán)利要求8的用途，其中，果聚糖的用量為大約0.01-25％。
10.如權(quán)利要求8或9的用途，其中，果聚糖被用作益生素果聚糖的原位來源。
11.如權(quán)利要求8或9的用途，其中，果聚糖是免疫刺激多糖。
12.如權(quán)利要求7的用途，其中，所述舊金山乳桿菌菌株的用量為至少1.105cfu/g。
13.人或?qū)櫸锸称罚辽俸袡?quán)利要求3的果聚糖和/或權(quán)利要求1或2的舊金山乳桿菌菌株。
14.如權(quán)利要求13的人類或?qū)櫸锸称?，其中，果聚糖的用量為大約0.01-25％。
15.如權(quán)利要求13的人類或?qū)櫸锸称?，其中，舊金山乳桿菌菌株的用量為至少1.105cfu/g。
全文摘要
本發(fā)明涉及能產(chǎn)生果聚糖的舊金山乳桿菌的分離的和純化的菌株，涉及制備所述果聚糖的方法，并且涉及將所述果聚糖和/或能生產(chǎn)所述果聚糖的菌株用于各種人類或?qū)櫸锸称坊蚧瘖y品中的用途。
文檔編號C12N1/20GK1533430SQ01820986
公開日2004年9月29日 申請日期2001年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月21日
發(fā)明者S·溫森特, M·布蘭德特, C·卡瓦迪尼, W·P·哈梅斯, Ｊ·Ｒ·尼澤, S·瓦爾德比澤, S 溫森特, 鹵仍, 叩夏, 哈梅斯, 嫉綠, 尼澤 申請人:雀巢制品公司