專利名稱：雙倍和三倍讀出測定系統(tǒng)的制作方法
相關申請本申請要求2000年10月27日提交在審的臨時申請USSN60/243,689的優(yōu)先權，將其在此引作參考。
背景技術：
數(shù)十年來，藥物篩選和生物測定一直用于藥物和生物技術產(chǎn)業(yè)中，以甄別研究中的前導化合物成為新的藥劑。在過去十年，通過諸如組合化學的技術，化學家在短的時間內合成大量化學化合物的能力已大大提高(對于組合化學領域的最新綜述，請參見Geysen等Molec.Immunol.23709-715，1986；Houghton等Nature 35484-86，1991；FrankTetrahedron 489217-9232，1992；Bunin等Proc.Natl.Acad.Sci.USA914708-4712，1994；Thompson等Chem.Rev.96555-600，1996；Keating等Chem.Rev.97449-472，1997；Gennari等Liebigs Ann./Recueil 637-647，1997；Reddington等Science 2801735-1737，1998；分別在此引作參考)，并且這已擴充超出了傳統(tǒng)篩選方法的容量。通常，需要篩選成千上萬的化合物以鑒定那些具有所需的藥物特性的化合物(如抗瘤活性、免疫抑制活性等)。許多目前通用的篩選為生化測定系統(tǒng)，其中將化合物加入到純化或部分純化的細胞抽提物中，以確定其是否具有所需的活性。與生化測定系統(tǒng)形成對照，目前通用的基于細胞的測定系統(tǒng)鑒定可透過細胞并在生理環(huán)境中起作用的生物活性分子。然而，基于細胞的測定篩選的主要缺陷之一是高的假陽性率，這是由細胞內的化合物的非特異效果產(chǎn)生的(例如，請參見Sarver等AIDS Res.Hum.Retroviruses 8659-666，1992；Witvrouw等Antimicrob.AgentsChemother.362628-2633，1992；分別在此引作參考)。假設基因調節(jié)在許多病態(tài)中具有根本的重要性，一種典型的基于細胞的測定在特異報道基因的控制下測量報道基因的活性。然而，抑制報道基因表達并不必然地顯現(xiàn)特異性干擾啟動子活性，而能反映細胞功能的非特異性抑制，例如由于細胞毒性。
在癌癥研究中一種特別重要的蛋白是核磷蛋白p53。據(jù)認為p53在超過50％的人類癌癥中是突變的。p53基因中的突變已在結腸、肺、乳房、卵巢、膀胱及其他若干器官的腫瘤中找到。如果將p53基因的突變型導入到初級成纖維細胞中，這些細胞就變?yōu)闊o限增殖化細胞。野生型p53基因已顯示抑制轉化人細胞的生長，但是p53的致癌形式失去這種抑制功能。因此，p53基因已被稱為“腫瘤抑制”基因。假設p53在腫瘤發(fā)生中起作用，它在新抗瘤劑研究中已變?yōu)橹匾臐撛诎凶印?br> 野生型p53的功能可被干擾。例如，轉化病毒性感染細胞能干擾p53蛋白產(chǎn)物。例如，轉化某些株的人乳頭瘤病毒(HPV)，并且已知干擾感染細胞中的p53蛋白的水平，這是因為所述病毒生產(chǎn)蛋白E6，其促進p53蛋白的降解。
對p53還有興趣，因為p53蛋白能夠誘導某些細胞調亡。在凋亡或“編程性細胞死亡”中，一系列細胞的致死事件顯示直接作為細胞DNA轉錄的結果發(fā)生。例如，與糖皮質激素接觸的淋巴細胞通過編程性細胞死亡而死亡。當促激素去除時，激素敏感組織如乳房和前列腺就通過編程性細胞死亡而發(fā)生退化。
特別地，最新的研究已顯示，野生型(非突變)p53導入攜帶p53突變型的轉化的細胞系，誘導細胞進行編程性細胞死亡，同時伴隨著核DNA的分解。相信通過誘導編程性細胞死亡，p53可以抑制腫瘤發(fā)展，由此調節(jié)細胞生長。
假設p53在各種各樣的生理狀態(tài)和病態(tài)中的重要性，有需要具有低背景的基于細胞的測定，所述測定可用于篩選化合物以鑒定p53的抑制劑和激活劑。此外，通過基因組研究快速增加新藥物靶子以及化學化合物巨大文庫的可利用度對提高篩選方法的新技術創(chuàng)造極大需求。
發(fā)明概述本發(fā)明提供篩選化學化合物以甄別目的蛋白的激活劑和抑制劑(如轉錄因子、酶和腫瘤抑制物)的測定系統(tǒng)。
一方面，本發(fā)明提供基于細胞的三倍讀出測定系統(tǒng)用于鑒定影響轉錄活性的化合物。使用三種單獨的細胞系，各細胞系含有不同改造的構建體。其中兩種已轉化有包含報道基因和已知與選擇的轉錄因子結合的可調節(jié)的轉錄調節(jié)序列的構建體。兩個細胞系各有不同的報道基因，以及將構建體整合進基因組的不同位置以控制側翼序列對報道基因轉錄的影響。第三細胞系已轉染有包含與組成型啟動子可操作連接的第三報道基因的構建體。第三細胞系用來評估測試化合物的總的細胞毒性。將源自三種細胞系中的各系的至少一個細胞與測試化合物接觸，測定報道基因的水平，并用來測試化合物對轉錄因子或轉錄因子途徑的特異性。在特別優(yōu)選的實施方案中，目的轉錄因子為p53。
另一方面，本發(fā)明提供基于細胞雙倍讀數(shù)測定系統(tǒng)用于鑒定影響細胞中的蛋白穩(wěn)定性/水平的化合物。在目的蛋白和第一報道蛋白之間創(chuàng)建融合蛋白。融合蛋白和第二報道蛋白在測試化合物加入的細胞系中表達。第二報道蛋白用來控制非特異效應如細胞毒性。測量所述兩種蛋白(即融合蛋白和第二報道蛋白)的水平以評估測試化合物對目的蛋白的特異性。在特別優(yōu)選的實施方案中，這兩種蛋白翻譯自被改造DNA構建體的相同mRNA轉錄物。
在本發(fā)明這方面的特別優(yōu)選的實施方案中，目的蛋白為p53。調節(jié)p53的一個關鍵點發(fā)生在蛋白水平。部分通過抑制由遍在蛋白—蛋白酶體途徑的降解，影響其構型的腫瘤突變通常增加它的半衰期。與其腫瘤抑制中的關鍵作用相一致，包括人乳頭瘤病毒E6癌蛋白的許多癌蛋白靶擊p53蛋白并且改變其穩(wěn)定性。
另一方面，本發(fā)明提供p53的化學抑制劑和激活劑。利用本發(fā)明的三倍和雙倍讀出測定系統(tǒng)中的一種或兩種系統(tǒng)，這種抑制劑和激活劑優(yōu)選被鑒定和/或表征。在某些臨床情形中，理想的是抑制p53的細胞效果。例如，p53依賴的編程性細胞死亡據(jù)信有助于用化療抗癌治療的毒性副作用。在本發(fā)明的某些優(yōu)選的實施方案中，將p53抑制劑或激活劑提供在藥物組合物的情形中。在優(yōu)選的實施方案中，抑制劑和激活劑是小分子。
另一方面，本發(fā)明提供試劑盒用于進行雙倍和三倍讀出測定。優(yōu)選地，本發(fā)明試劑盒含有所有測定測試化合物對轉錄和/或蛋白穩(wěn)定性/水平的影響所需的試劑。在特別優(yōu)選的實施方案中，三倍讀出測定中所用的試劑盒含有上述三種細胞系。雙倍讀出測定的試劑盒優(yōu)選含有穩(wěn)定轉染有融合蛋白和第二報道蛋白的細胞系。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含用于轉染細胞系的DNA構建體。本發(fā)明優(yōu)選的試劑盒也可含有其他試劑，如生長細胞的介質、酶底物(如熒光酶的底物)、DNA損傷化合物(如阿霉素)、人乳頭瘤病毒E6癌蛋白、生長因子等。
定義除非另外指明，下文所定義的術語具有下列含義“化合物”如本文所用的術語“化合物”或“化學化合物”可包括有機金屬化合物、多核苷酸、寡核苷酸、肽、蛋白質、有機化合物、金屬、過渡金屬復合物以及小分子。在一特別優(yōu)選的實施方案中，術語化合物是指小分子(例如，優(yōu)選非肽和非寡聚的分子)并且排除肽、多核苷酸、過渡金屬復合物、金屬以及有機金屬化合物。
“組成型啟動子”術語“組成型啟動子”是指總處于“開啟”狀態(tài)下的啟動子。換句話說，與組成型啟動子可操作連接的基因總能被轉錄成mRNA。
“構建體”術語構建體是指任何已經(jīng)人工操作的多核苷酸。具體而言，構建體分離自其他在天然狀態(tài)發(fā)現(xiàn)的序列。構建體可以由本領域公知的重組技術如聚合酶鏈式反應來產(chǎn)生。所述多核苷酸優(yōu)選含有各種各樣的可操作連接的元件，并將構建體導入細胞。例如，構建體可含有與編碼序列可操作連接的啟動子，以及所述構建體可導入細胞以誘導細胞生產(chǎn)編碼蛋白。在一優(yōu)選的實施方案中，構建體已經(jīng)人工創(chuàng)建或改造，不是自然發(fā)生的。
“融合蛋白”術語“融合蛋白”是指含有兩個或更多個多肽的蛋白，所述多肽盡管在其天然態(tài)通常是非連接的，但是通過它們各自的氨基和羧基末端以肽鍵合連接成單個連續(xù)多肽。兩個或更多個多肽組分可通過肽接頭/間隔臂直接連接或間接連接。融合蛋白可由核糖體從mRNA翻譯成單個多肽，或者利用合成或酶化學可將多肽連接。
“可調節(jié)的轉錄調節(jié)序列”術語“可調節(jié)的轉錄調節(jié)序列”是指通過蛋白與序列結合能夠調節(jié)報道基因的啟動子進行轉錄起始的DNA序列。蛋白優(yōu)選結合構建體的調節(jié)序列，在所述構建體中啟動子、可調節(jié)的轉錄調節(jié)序列以及報道基因是可操作連接的，由此所述蛋白上調或下調啟動子的轉錄。
“可操作連接”術語可操作連接是指可相互影響的多核苷酸序列的兩個區(qū)段。在一特別優(yōu)選的實施方案中，兩個區(qū)段中的一個是結合蛋白(如聚合酶、增強子和轉錄因子)的序列，以及蛋白與序列的結合導致位于第二區(qū)段的基因序列的轉錄。在另一特別優(yōu)選的實施方案中，分子(如核酸、小分子、蛋白和肽)與一個區(qū)段的結合可抑制或增強另一分子(如核酸、小分子、蛋白和肽)與第二區(qū)段的結合。兩個可操作連接的區(qū)段優(yōu)選是共價連接的，但是在本發(fā)明的情況下，足以取得所需結果的任何類型的結合都被視為可操作連接。
“p53”如本發(fā)明所用的術語“p53”是指p53的基因和蛋白形式或p53的任何同系物或p53基因家族的成員。所述同系物應該至少50％同源于小鼠p53 DNA或蛋白序列；優(yōu)選至少60％的同源性，以及最優(yōu)選大于75％的同源性。p53同系物的鑒定也可通過其活性如抑制轉化細胞生長的能力進行。在另一優(yōu)選的實施方案中，p53同系物由其在基因組中的位置(如染色體上的位置)來鑒定。在另一優(yōu)選的實施方案中，p53同系物能在標準雜交條件下與p53基因雜交。p53還可以指p53基因的片段。在某些優(yōu)選的實施方案中，p63、p73及其同系物被視為p53家族成員。在其他優(yōu)選的實施方案中，同系物在中央序列特異的DNA結合域、N-端反式激活域和/或C-端寡聚結構域內有至少50％的同源性，更優(yōu)選大于60％的同源性。
“p53結合元件”術語“p53結合元件”是指結合p53蛋白的多核苷酸的序列。在一優(yōu)選的實施方案中，p53結合元件是p21、bax或14-3-3基因中發(fā)現(xiàn)的p53結合元件。p53結合元件可包含多結合元件(即多聚化)。
“多核苷酸”或“寡核苷酸”多核苷酸或寡核苷酸是指核苷酸的聚合物。多核苷酸優(yōu)選包含至少三個核苷酸，更優(yōu)選包含至少10個核苷酸，以及最優(yōu)選包含至少100個核苷酸。所述聚合物可包括天然核苷(即腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷、脫氧胞苷)、核苷同系物(如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧腺苷、8-氧鳥苷、O(6)-甲基鳥嘌呤以及2-硫代胞苷)、化學修飾的堿基、生物修飾的堿基(如甲基化堿基)、插入堿基、修飾糖(如2’-氟核糖、核糖、2’-脫氧核糖、阿拉伯糖以及己糖)或修飾磷酸基團(如硫代磷酸和5’-N-亞磷酰胺鍵合)。
“蛋白”根據(jù)本發(fā)明，“蛋白”包含通過肽鍵連接在一起的氨基酸殘基的聚合物。如本文所用的術語是指任何大小、結構或功能的蛋白、多肽和肽。通常，蛋白的長度至少為3個氨基酸。肽可以涉及單獨的肽或肽的集合。盡管本領域公知的非天然氨基酸(即不會自然發(fā)生但可摻入多肽鏈的化合物；參見，例如http//www.cco.caltech.edu/～dadgrp/Unnatstruct.gif，其展示已成功摻入功能離子通道的非天然氨基酸的結構)和/或氨基酸同系物可以選擇使用，但是本發(fā)明肽優(yōu)選只含有天然氨基酸。同樣，例如通過加入化學基團如碳水化合物基團，磷酸基團，羥基，法尼基，異法尼基，脂肪酸基團，共軛、官能作用或其他修飾的接頭等，本發(fā)明肽中的一個或多個氨基酸可被修飾。蛋白也可以是單個分子或多分子復合體。蛋白可以是天然存在的蛋白或肽的片段。蛋白可以是天然存在、重組或合成的或其組合。
“報道基因”如本文所用的術語“報道基因”是指其轉錄物或任何其他基因產(chǎn)物(如蛋白質)為可檢測的基因?；虍a(chǎn)物優(yōu)選也是可定量測定的?；虍a(chǎn)物更優(yōu)選是利用標準分析可檢測的?；虍a(chǎn)物最優(yōu)選是利用標準分析可檢測的，在此分析中所用的試劑可以試劑盒的形式獲得。在某些優(yōu)選的實施方案中，報道基因編碼熒光蛋白或其活性是可檢測的及優(yōu)選是可定量測定的酶。
“小分子”如本文所用的術語“小分子”是指實驗室中合成的或自然界中發(fā)現(xiàn)的非肽、非寡聚的有機化合物。如本文所用的小分子可涉及“類似天然產(chǎn)物”的化合物，然而，術語“小分子”不限于“類似天然產(chǎn)物”的化合物。反之，小分子的特征通常在于其含有幾個碳—碳鍵，并且其分子量小于1500，盡管此特征不旨在限制本發(fā)明的目的。自然界中出現(xiàn)的“小分子”的實例包括，但不限于紫杉醇、dynemicin和雷帕霉素。實驗室中合成的“小分子”的實例包括，但不限于下列文獻所述的化合物Tan等(“超過兩百萬個具有下列結構特征的化合物的立體選擇性合成既起源于天然產(chǎn)物又與小型化的基于細胞的測定法相容”J.Am.Chem.Soc.1208565，1998)以及在審的專利申請?zhí)枮?8/951,930的“起源于天然產(chǎn)物的組合文庫化合物的合成”，其全部內容在此引作參考。
附圖描述

圖1示出p53結合位點的轉錄活化。將(A)6拷貝的p21、bax和14-3-3基因的p53結合位點和(B)多拷貝(3、6和12)的14-3-3基因的p53位點克隆到FL(螢火蟲熒光素酶)報道基因的上游。RKO細胞用這些質粒轉化，并用阿霉素處理后對報道活性進行分析。與未用阿霉素處理的細胞的熒光素酶活性比較，結果以倍比誘導表示。
圖2示出用于p53轉錄活性的報道質粒。將12拷貝的14-3-3基因的p53位點克隆到FL(螢火蟲熒光素酶)或SEAP(分泌的堿性磷酸酶)報道基因的上游。該報道質粒用來監(jiān)控細胞中p53的轉錄活性。
圖3示出由DNA損傷劑導致p53在選擇的穩(wěn)定細胞系中的轉錄活化。在用各種各樣的DNA損傷劑(阿霉素、UV輻射、絲裂霉素C和鬼臼亞乙苷)處理前后，確定穩(wěn)定轉染RKO細胞的選擇的克隆中的(A)FL(螢火蟲熒光素酶)和(B)SEAP(分泌的堿性磷酸酶)報道活性。與未處理細胞的報道活性比較，結果以倍比誘導表示。
圖4示出p53轉錄活性的三倍讀出。將等數(shù)量的三種不同RKO報道細胞系(含有在p53控制下的FL和SEAP以及在CMV啟動子控制下的RL)中的各種培養(yǎng)在384-孔板的各個孔中。利用針形陣列(pinarray)把化學物質轉移到孔中，并在加入阿霉素(0.5-1.0μM)之前與細胞預先溫育?！?4小時后，利用SEAP測定系統(tǒng)(Promega)確定培養(yǎng)基中的SEAP活性。利用雙重熒光素酶測定系統(tǒng)(Promega)確定細胞裂解液中的FL和RL活性。通過篩選，我們鑒定了特異性影響p53-依賴的FL和SEAP表達而不影響CMV啟動子—驅動的RL表達的化合物。
圖5示出由DNA損傷劑導致p53蛋白的穩(wěn)定以及由E6癌蛋白導致p53蛋白的去穩(wěn)定。(A)在用阿霉素處理前后，確定選擇的MCF7克隆中的p53-FL(螢火蟲熒光素酶)和RL(renilla熒光素酶)報道活性。與未處理細胞的熒光素酶活性比較，結果以倍比誘導表示(p53-FL/RL)。(B)在沒有或有E6癌蛋白表達下，確定選擇的MCF7克隆中的p53-FL和RL報道活性。與未處理細胞的熒光素酶活性比較，結果以倍比誘導表示(p53-FL/RL)。
圖6示出用于p53蛋白穩(wěn)定性和水平的報道質粒。將p53基因與FL(螢火蟲熒光素酶)報道基因融合。在CMV啟動子的控制下通過IRES(內部核糖體進入位點)使p53-FL融合蛋白與RL(renilla熒光素酶)報道蛋白一起表達。該報道質粒用來監(jiān)控p53蛋白在細胞中的穩(wěn)定性。
圖7示出p53蛋白穩(wěn)定性的雙倍讀出測定。384-孔板用來培養(yǎng)均在CMV啟動子的控制下表達p53-FL和RL蛋白的MCF7細胞。利用針形陣列把化學物質轉移到384-孔板中，并在加入阿霉素(1μM)之前與細胞預先溫育?！?4小時后，利用雙重熒光素酶測定系統(tǒng)(Promega)確定細胞裂解液中的p53-FL和RL活性。通過篩選，鑒定出特異性影響p53-FL蛋白的穩(wěn)定性/水平而不影響RL蛋白穩(wěn)定性/水平的化學物質。
圖8示出由多倍讀出鑒定的特異性化學物質。(A)三倍和雙倍讀出系統(tǒng)有效用來在分別影響p53的轉錄活性和蛋白活性的不同集合的16,320種合成化合物(Chembridge Corporation)中篩選特異化學物質。(B)示出影響p53-依賴的FL和SEAP表達而不影響CMV啟動子驅動的RL表達的挑選化合物的例子。
圖9示出用于信號途徑的雙倍和三倍讀出作為藥物發(fā)現(xiàn)平臺。利用多倍讀出，這些測定可用來有效篩選對p53特異的小分子。通過上調或下調p53蛋白水平一些化學物質可影響p53的轉錄活性。其活性由三倍讀出而非由雙倍讀出檢測的那些其他化學物質可能調節(jié)p53轉錄活性而不影響p53蛋白穩(wěn)定性。因此，這些讀出使我們能夠選擇和歸類對p53蛋白穩(wěn)定性和/或轉錄活性的有效和特異影響的化學物質。這些測定系統(tǒng)展示在許多其他信號途徑中系統(tǒng)篩選特異化學配體的基礎。
一些優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明提供利用具有內置對照以使非特異擊中(即背景)的數(shù)量最小化的基于細胞的測定以鑒定基因和基因產(chǎn)物的抑制劑和激活劑的系統(tǒng)。本發(fā)明測定系統(tǒng)消除昂貴和耗時的多篩選的需要。本發(fā)明測定確定測試化合物對目的蛋白的轉錄和水平/穩(wěn)定性的影響。
三倍讀出測定系統(tǒng)本發(fā)明提供基于細胞的三倍讀出測定系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括對報道基因產(chǎn)物在特異啟動子控制下的活性或水平進行測定。過去測定報道基因活性的努力錯綜復雜，其問題包括非特異性抑制報道基因表達，原因可能是細胞毒性導致細胞功能非特異性抑制。在本發(fā)明之前，為了區(qū)分“真的”抑制和其他非特異作用，需要進行眾多耗時和昂貴的試驗。同樣，另一與許多可用的報道基因測定有關的問題是在報道基因整合到基因組中后，報道基因的轉錄可受到周圍穩(wěn)定插入了報道基因的DNA序列的影響。
本發(fā)明三倍讀出測定克服這些限制，所以減少或消除多篩選的需要。本發(fā)明基于細胞的三倍讀出測定包括三株單獨的細胞系。其中兩株細胞系在同樣可調節(jié)的轉錄調節(jié)序列控制下表達報道基因。第三細胞系在組成型啟動子控制下表達報道基因。與報道基因穩(wěn)定插入位置相鄰的DNA序列的影響被頭兩株細胞系控制。利用含有組成型啟動子的第三細胞系可消除基因表達的細胞毒性或抑制的總效應。
在一特別優(yōu)選的實施方案中，研究中的轉錄因子是p53。在非應激細胞中，p53的含量較低，并以潛伏非活化的形式存在。p53的水平和/或活性增加對各種各樣刺激物包括基因毒性應激的反應?；钚詐53蛋白積累在細胞核中，與其DNA效應元件結合并且誘導其靶基因的轉錄。在不適宜的生長條件下，p53可整合多種信號至特異基因調節(jié)，用于保護細胞免于瘤的轉移。與其在腫瘤抑制中的關鍵作用一致，除了許多癌蛋白以外，與人腫瘤相關的絕大多數(shù)p53突變降低p53序列特異的DNA結合和轉錄活性。因此，調節(jié)p53轉錄活性的小分子對于治療目的是重要的。
任何細胞系可用于開發(fā)本發(fā)明三倍讀出測定中所用的細胞系。所述細胞可以是動物、植物、細菌或真菌細胞。在一優(yōu)選的實施方案中，所述細胞系是哺乳動物細胞系。在一特別優(yōu)選的實施方案中，所述細胞系是人細胞系。所選的細胞系可滿足針對目的蛋白和本領域技術人員已知的其他要求；例如，如果人們對調節(jié)p53-依賴的轉錄感興趣，細胞系應該優(yōu)選(1)表達野生型p53；(2)顯示在用DNA損傷劑處理后高水平誘導p53；和/或(3)具有功能完整的p53-介導的生長停滯途徑。一種在研究p53中所用的特別優(yōu)選的細胞系是一種結腸癌細胞系RKO細胞系。本領域中那些普通技術人員會輕易意識到眾多的細胞系，它們能用于測定系統(tǒng)中并能根據(jù)影響本發(fā)明測定中在研的基因或蛋白的多種因素來選擇細胞系。
可調節(jié)的轉錄調節(jié)序列由目的蛋白或被目的蛋白次級或間接調節(jié)的蛋白來調節(jié)。在一些實施方案中，目的蛋白通過與調節(jié)序列直接或間接結合直接調節(jié)轉錄。在其他實施方案中，目的蛋白間接起到調節(jié)轉錄的作用。通過一步或多步生物途徑，目的蛋白可間接起作用。調節(jié)序列的反應性取決于有或沒有目的蛋白或其活性水平。
僅為了給出一個實例，其中p53是目的蛋白，可調節(jié)的轉錄調節(jié)序列包含至少一個p53結合元件。任何p53結合元件可與報道基因可操作連接。在一優(yōu)選的實施方案中，所述p53結合元件對DNA損傷的反應顯示出高水平地誘導可操作連接的報道基因。p53結合元件的實例可在下列3個靶基因中發(fā)現(xiàn)p21、bax和14-3-3。在一特別優(yōu)選的實施方案中，所述p53結合元件是多聚化的。例如，6或12拷貝的元件可導致近乎飽和的p53誘導水平。在其他實施方案中，所述p53可充當阻遏物，并且測定報道基因的下調節(jié)。
報道基因可編碼由任何已知方法(如Northern分析、Western分析、放射免疫測定、酶法測定、熒光變化、吸光度變化等)可檢測的任何基因產(chǎn)物(即轉錄物和蛋白)，以及基因產(chǎn)物水平優(yōu)選是由任何公知方法可定量測定的(請參見分子克隆實驗室手冊(MolecularCloningA Laboratory Manual)，第二版，Sambrook、Fritsch和Maniatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press1989)；Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins編1984)；論文，Methods inEnzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Immunochemical Methods inCell and Molecular Biology(Mayer和Walker編，Academic Press，London，1987)；Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley& Sons，Inc.，New York，1999)；Transcription and Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins編1984)；Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編，1986)；各篇文獻在此引作參考)。在一優(yōu)選的實施方案中，所述報道基因是酶(如激酶、磷酸酶、熒光素酶、β-半乳糖苷酶、還原酶、合酶、辣根過氧化物酶、合成酶等)。酶本身可以是可檢測的或者酶活性可以用來間接測量酶的水平。
在本發(fā)明一特別優(yōu)選的實施方案中，測定系統(tǒng)的至少一種報道基因編碼熒光素酶蛋白。熒光素酶可來自任何生物，包括北美螢火蟲Photinus pyralis、海洋海腎(pansy Renilla reniformis)和海熒光菌(Vibriofischeri)。熒光素酶和其作為轉錄報道分子的更完全描述可在De Wet等(“螢火蟲熒光素酶cDNA的克隆以及活性熒光素酶在大腸桿菌中的表達”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 827870，1985；在此引作參考)和Engebrecht等(“用光測量基因表達”Science 2271345，1985；在此引作參考)中找到。
在本發(fā)明另一特別優(yōu)選的實施方案中，測定系統(tǒng)的至少一種報道基因編碼堿性磷酸酶。磷酸酶基因可來自任何物種。一特別優(yōu)選的堿性磷酸酶為分泌的堿性磷酸酶(SEAP)。
在另一特別優(yōu)選的實施方案中，報道基因編碼增強的綠色熒光蛋白(EGFP)。對于使用增強的綠色熒光蛋白作為報道分子的更多細節(jié)，請參見Cinelli等(Photochem.Photobiol.71(6)771-776，2000；在此引作參考)；Kiss-Toth等(J.Immunol.Methods 239(1-2)125-135，2000；在此引作參考)以及Millet等(Toxicol.Sci.55(1)69-77，2000；在此引作參考)。
雙倍讀出測定系統(tǒng)細胞中某些蛋白的水平調節(jié)許多細胞過程。所以，蛋白的降解、穩(wěn)定和積累在細胞中受到高度控制。例如，調節(jié)蛋白降解的一種途徑是遍在蛋白—蛋白體途徑。調節(jié)特異蛋白間接途徑或影響特異蛋白的穩(wěn)定性的能力將考慮用于治療諸如癌癥、自身免疫疾病和神經(jīng)病等的新方法。
用于鑒定實現(xiàn)蛋白穩(wěn)定性的化合物的傳統(tǒng)測定已被大量的非特異效果所阻礙。例如，蛋白穩(wěn)定性增加可以反映通過化合物的細胞毒性效應對細胞功能的非特異性抑制，而非對蛋白穩(wěn)定性的特異性作用。
僅為了給出蛋白的一個實例，其水平在細胞過程中是關鍵的，p53是腫瘤阻遏物蛋白，已發(fā)現(xiàn)其水平在腫瘤發(fā)生中是重要的。部分通過抑制由遍在蛋白—蛋白酶體途徑的降解，影響其構型的腫瘤突變通常增加它的半衰期。在非應激細胞中，p53的含量較低，并以潛伏非活化的形式存在。如果細胞是應激的(如基因毒性應激)，p53的水平和/或活性增加。然后活性p53蛋白積累在細胞核中，與其DNA效應元件結合并且誘導其靶基因的表達。在不適宜的生長條件下，p53可整合多種信號用于保護細胞免于瘤的轉移。與p53在腫瘤抑制中的關鍵作用一致，許多癌蛋白靶擊p53及其蛋白穩(wěn)定性，包括人乳頭瘤病毒E6癌蛋白。因此，可調節(jié)p53蛋白穩(wěn)定性的化合物對于治療目的是重要的。
在本發(fā)明雙倍讀出測定系統(tǒng)中，例如使用標準重組DNA技術(Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons，Inc.，New York，1999)；Sambrook、Fritsch和Maniatis編，MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)；各篇文獻在此引作參考)，將目的蛋白與第一報道蛋白融合(如p53)。融合蛋白和對照報道蛋白在細胞中表達。將所述一種或多種細胞與各種測試化合物接觸，并測量融合蛋白和對照報道蛋白的水平。融合蛋白的水平當與對照報道蛋白的水平比較時，將考慮到化合物的鑒定，由于所述化合物對融合蛋白與對照的比例的作用，其特異性影響目的蛋白的穩(wěn)定性。在一優(yōu)選的實施方案中，當與對照報道蛋白比較時，融合蛋白的水平變化至少50％才視為擊中，更優(yōu)選有至少150％的變化，以及最優(yōu)選有至少500％的變化。
報道蛋白可以是任何如上三倍讀出測定系統(tǒng)中所述的蛋白或肽。蛋白或肽的測定優(yōu)選可采用標準技術(如方式免疫測定、放射標記、免疫測定、酶活性測定、吸光度、熒光、發(fā)光以及Western印跡)。更優(yōu)選地，各報道蛋白的水平即使在低水平利用標準技術也是易于定量測定的。在一優(yōu)選的實施方案中，報道蛋白是相關的，因此它們的水平是易于比較的。
在特別優(yōu)選的實施方案中，報道蛋白是如上三倍讀出測定系統(tǒng)中所述的熒光素酶。如果兩種熒光素酶用作報道蛋白，則熒光素酶優(yōu)選是相互可區(qū)分的。在特別優(yōu)選的實施方案中，一種報道蛋白是Photinuspyralis的螢火蟲熒光素酶(FL)，而另一種為海洋海腎(Renillareniformis)的海腎(Renilla)熒光素酶(RL)。蛋白水平的測定可使用Dual-Luciferase測定系統(tǒng)(Promega)(Dual-LuciferaseReporter1000 Assay System，Technical Manual No.046，Promega Corp.，Madison，WI，1999；在此引作參考)。
編碼融合蛋白和對照報道蛋白的基因優(yōu)選以基本相同的水平轉錄。在特別優(yōu)選的實施方案中，兩個蛋白基因被一起轉錄成一個轉錄物。內部核糖體進入位點(IRES)可插入兩個基因之間以確保兩種編碼蛋白翻譯。在另一特別優(yōu)選的實施方案中，所述兩個基因是在相同啟動子序列和調節(jié)元件的控制之下。
正如本發(fā)明三倍讀出測定系統(tǒng)，其中蛋白被表達的任何細胞系可用于本發(fā)明雙倍讀出系統(tǒng)中。優(yōu)選地，在p53的實例中，細胞系含有活性p53翻轉途徑，p53蛋白的穩(wěn)態(tài)水平是相對低的，但在應激刺激(如用化療DNA損傷劑處理)之后，p53蛋白的水平顯著提高。在一特別優(yōu)選的實施方案中，細胞系是MCF7。
在另一特別優(yōu)選的實施方案中，細胞系用融合蛋白基因和對照報道基因轉染，并將所得細胞用阿霉素處理之后對p53蛋白的穩(wěn)定性進行測試?？寺?yōu)選顯示融合蛋白的水平增加5倍。克隆更優(yōu)選顯示增加10倍；以及克隆最優(yōu)選顯示增加20倍。
細胞系可用其他影響p53降解的基因轉染。在特別優(yōu)選的實施方案中，細胞系用人乳頭瘤病毒癌蛋白E6轉染。許多其他癌蛋白可用于本發(fā)明的該實施方案中。正如本領域中的一名技術人員會懂得，任何可影響在研蛋白的穩(wěn)定性/水平的基因能被轉染到細胞系中。
測試化合物本發(fā)明雙倍和三倍讀出測定中待篩選的化合物可由本領域任何公知的方法來提供。測試化合物可以是多核苷酸、肽、蛋白、小分子、有機分子、無機分子、肽類似物(peptidomimetics)、抗體或其他化學化合物?；衔锏闹苽淇赏ㄟ^從來源(如植物、真菌、動物、細菌、土樣等)中純化或分離，或通過合成。合成化合物的產(chǎn)生可采用更多常規(guī)的一個接一個的合成方法或采用組合化學方法通過快速平行和/或自動合成來進行。化合物可以粗或純的形式來提供?；衔锟梢允翘烊划a(chǎn)物或其衍生物。在另一優(yōu)選的實施方案中，化合物的提供來自大的制藥和化學公司的化合物歷史檔案。化合物優(yōu)選提供為化學化合物的文庫。
通過上述方法篩選化合物以鑒定目的蛋白/基因的激活劑和抑制劑。僅為了給出一個實例，所述方法可用來鑒定p53的激活劑和抑制劑。p53的化學抑制劑在防止或最小化源自p53-依賴的編程性細胞死亡的毒副作用(如那些經(jīng)受化療和放療的個體中所見的副作用)方面是有用的。p53的化合物激活劑在開發(fā)新的抗瘤劑方面將是有用的。在一特別優(yōu)選的實施方案中，所述化合物可激活或抑制目的蛋白/基因2倍，更優(yōu)選5倍以及最優(yōu)選10倍。
試劑盒本發(fā)明還提供用于進行雙倍和三倍讀出測定的試劑盒。這些試劑盒優(yōu)選包括所有對分析測試化合物或測試化合物的文庫所必須的試劑。所述試劑盒可包括細胞系、如上所述穩(wěn)定轉染的細胞系、培養(yǎng)基、生長因子、DNA損傷劑(如博來霉素、阿霉素)、人乳頭瘤病毒E6癌蛋白、DNA構建體、酶底物(如在測熒光素酶的底物)等。
本發(fā)明的這些和其他方面在考慮下列實施例之后會進一步懂得，它們旨在闡述本發(fā)明某些特別的實施方案，而非限制如權利要求所限定的范圍。
實施例實施例1-p53轉錄活性的三倍讀出在用報道質粒轉染RKO細胞之后，通過潮霉素(400μg/ml)選擇，建立了3株不同的報道細胞系(第一株含有p53控制下的FL，第二株含有p53控制下的SEAP以及第三株含有CMV啟動子控制下的RL)(參見圖2)。在此篩選中，將源自3株細胞系的細胞混合，并與如下所述的化學物質溫育后在單個孔中測定3種不同報道蛋白的活性。
使細胞系維持在補充有抗生素和10％熱滅活牛血清(FBS)的McCoy培養(yǎng)基中以排除血清中的SEAP活性。在報道細胞與胰蛋白酶單聚之后，將3株細胞系中各株的等數(shù)量細胞混合在瓶中，并利用全自動分液器(Multidrop 384，Labsystems)將30μl所得的細胞混合物分配到384-孔板各個孔中(5×103細胞/孔)。12-16小時后，利用針形陣列把測試化學化合物導入孔中，導致測試化合物的終濃度為～5μg/ml，并與細胞預溫育2小時，接著加入阿霉素(0.5-1.0uM)。24小時后，利用相應的測定系統(tǒng)根據(jù)廠商說明對報道蛋白的活性進行測定。
對于SEAP測定，將5μl的各培養(yǎng)基轉移至另一384-孔板中，并在室溫下與55μl的SEAP測定混合物(EscAPe SEAP化學發(fā)光測定系統(tǒng)，Clontech Laboratories)溫育20分鐘。利用發(fā)光讀數(shù)儀(WallacVICTOR2，PerkinElmer Life Sciences)測定SEAP活性。
雙重熒光素酶報道測定系統(tǒng)(Promega)用于FL和RL測定。在最初的384-孔培養(yǎng)板中，移出剩余的培養(yǎng)基，并用40μl的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞一次。將洗滌細胞用Passive裂解緩沖液(PLB，5μl/孔)室溫下輕輕振蕩溫育20分鐘。接著，把熒光素酶測定試劑II(LARII，25μl/孔)直接加入到細胞裂解液中，并利用發(fā)光讀數(shù)儀(WallacVICTOR2，PerkinElmer Life Sciences)測定FL活性。在測量FL活性后，加入Stop & Glo試劑(25μl/孔)，并測定RL活性。在此篩選中，特異性影響p53-依賴的FL和SEAP表達而不影響CMV啟動子—驅動的RL表達的化合物得到了鑒定。
實施例2-p53蛋白穩(wěn)定性的雙倍讀出測定創(chuàng)建在單個CMV啟動子控制下表達p53/FL融合基因和EL基因、帶有內部核糖體進入位點(IRES)的質粒(參見圖6)。通過利用內部核糖體進入位點共表達p53/FL和RL蛋白使得在各種各樣的測定條件下規(guī)格化p53/FL與RL的水平成為可能。利用含有遺傳霉素(G418)(700μg/ml)的培養(yǎng)基通過選擇轉染有IRES表達質粒的MCF7細胞建立報道細胞系。在此篩選中，對兩種不同報道蛋白p53/FL和RL的活性進行測量以確定測試化學化合物的效果。
將源自報道細胞系的細胞維持在補充有抗生素和10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中。在報道細胞與胰蛋白酶單聚之后，利用全自動分液器(Multidrop 384，Labsystems)將體積為30μl的等數(shù)量細胞分配到384-孔板的各個孔中(5×103細胞/孔)。12-16小時后，利用針形陣列把測試化學化合物導入孔中，測試化合物的終濃度為～5μg/ml，并與細胞預溫育2小時，接著加入阿霉素(1.0μM)。
24小時后，利用雙重熒光素酶報道測定系統(tǒng)(Promega)在相同的孔中確定p53/FL和RL的活性。在384-孔培養(yǎng)板中，移出剩余的培養(yǎng)基，并用40μl的PBS洗滌細胞一次。然后將洗滌過的細胞與Passive裂解緩沖液(PLB，5μl/孔)在室溫下輕輕振蕩溫育20分鐘。把熒光素酶測定試劑II(LAR II，25μl/孔)直接加入到細胞裂解液中，利用發(fā)光讀數(shù)儀(Wallac VICTOR2，PerkinElmer Life Sciences)測定FL活性。接著加入Stop & Glo試劑(25μl/孔)，測定RL活性。在此篩選中，特異性影響p53-FL穩(wěn)定性而不影響RL穩(wěn)定性的測試化學化合物得到了鑒定。這些化學化合物所觀察到的作用被內源性p53蛋白和其他內源性對照蛋白如肌動蛋白的免疫印跡分析證實。
其他實施方案本領域的那些普通技術人員會容易懂得，上述僅代表本發(fā)明某些優(yōu)選的實施方案。在不背離如下列權利要求所闡述的本發(fā)明實質或范圍的情況下，可對上述程序和組成進行各種變化和修正。
權利要求
1.一種鑒定影響受p53調節(jié)的基因轉錄的化合物的方法，所述方法包含下列步驟提供第一株含有構建體的細胞系，該構建體包含與第一報道基因可操作連接的p53結合元件；提供第二株含有構建體的細胞系，該構建體包含與第二報道基因可操作連接的p53結合元件；提供第三株含有構建體的細胞系，該構建體包含與第三報道基因可操作連接的啟動子；將測試化合物與三株細胞系中的各株的細胞接觸；以及確定測試化合物對三種報道基因表達的影響。
2.一種鑒定影響受p53調節(jié)的基因轉錄的化合物的方法，所述方法包含下列步驟提供第一株含有構建體的細胞系，該構建體包含與第一報道基因可操作連接的p53結合元件；提供第二株含有構建體的細胞系，該構建體包含與第二報道基因可操作連接的p53結合元件；將測試化合物與兩株細胞系中的各株的細胞接觸；以及確定測試化合物對報道基因表達的影響。
3.權利要求1或2所述的方法，其中細胞系源自在用DNA損傷劑處理后高水平誘導p53的細胞系。
4.權利要求1或2所述的方法，其中細胞系源自表達野生型p53的細胞系。
5.權利要求1或2所述的方法，其中細胞系源自在對DNA損傷反應中具有完整的p53-介導的生長停滯途徑的細胞系。
6.權利要求1或2所述的方法，其中細胞系源自動物細胞系。
7.權利要求1或2所述的方法，其中細胞系源自哺乳動物細胞系。
8.權利要求1或2所述的方法，其中細胞系源自人細胞系。
9.權利要求1或2所述的方法，其中細胞系源自RKO細胞系。
10.權利要求1或2所述的方法，其中p53結合元件源自p21基因。
11.權利要求1或2所述的方法，其中p53結合元件源自bax基因。
12.權利要求1或2所述的方法，其中p53結合元件源自14-3-3基因。
13.權利要求1或2所述的方法，其中p53結合元件包含多個p53結合位點。
14.權利要求1所述的方法，其中啟動子是組成型啟動子。
15.權利要求1所述的方法，其中啟動子是CMV啟動子。
16.權利要求1所述的方法，其中報道基因選自螢火蟲熒光素酶、分泌的堿性磷酸酶、增強的綠色熒光蛋白、辣根過氧化物酶和海腎熒光素酶。
17.權利要求1所述的方法，其中報道基因選自螢火蟲熒光素酶、分泌的堿性磷酸酶、海腎熒光素酶和β-半乳糖苷酶。
18.權利要求1所述的方法，其中報道基因編碼可由抗體檢測的蛋白。
19.權利要求1所述的方法，其中報道基因編碼通過吸光度的變化、熒光的變化或放射免疫測定可檢測的基因產(chǎn)物。
20.一種鑒定影響p53穩(wěn)定性的化合物的方法，所述方法包含下列步驟提供轉染有構建體的細胞系，其表達與p53-融合的報道蛋白和對照報道蛋白；將測試化合物與細胞系的細胞接觸；將細胞與DNA損傷劑接觸；以及比較p53融合蛋白與對照報道蛋白的水平。
21.一種鑒定影響p53穩(wěn)定性的化合物的方法，所述方法包含下列步驟提供轉染有構建體的細胞系，其表達與p53-融合的報道蛋白和對照報道蛋白，以及受轉染后表達E6；將測試化合物與細胞系的細胞接觸；將細胞與DNA損傷劑接觸；以及比較p53融合蛋白與對照報道蛋白的水平。
22.權利要求20或21所述的方法，其中細胞系源自已知含有活性p53翻轉途徑的細胞系。
23.權利要求20或21所述的方法，其中細胞系源自具有相對低的p53蛋白穩(wěn)態(tài)水平并且顯示在用DNA損傷劑處理后顯著積累p53蛋白的細胞系。
24.權利要求20或21所述的方法，其中DNA損傷劑是化療劑。
25.權利要求20或21所述的方法，其中DNA損傷劑是阿霉素。
26.由權利要求1或20所述的方法鑒定的p53的抑制劑。
27.由權利要求1或20所述的方法鑒定的p53的激活劑。
28.一種試劑盒，其用于鑒定影響受p53調節(jié)的基因轉錄的化合物，所述試劑盒包括含有構建體的第一株細胞系，該構建體包含與第一報道基因可操作連接的p53結合元件；含有構建體的第二株細胞系，該構建體包含與第二報道基因可操作連接的p53結合元件；以及含有構建體的第三株細胞系，該構建體包含與第三報道基因可操作連接的啟動子。
29.一種試劑盒，其用于鑒定影響p53穩(wěn)定性的化合物，所述試劑盒包括含有構建體的細胞系，其表達與p52-融合的報道蛋白和對照報道蛋白。
30.一種鑒定影響受目的蛋白調節(jié)的基因轉錄的化合物的方法，所述方法包含下列步驟提供第一株含有構建體的細胞系，該構建體包含與第一報道基因可操作連接、已知結合目的蛋白的元件；提供第二株含有構建體的細胞系，該構建體包含與第二報道基因可操作連接、已知結合目的蛋白的元件；提供第三株含有構建體的細胞系，該構建體包含與第三報道基因可操作連接的啟動子；將測試化合物與三株細胞系中的各株的細胞接觸；以及確定測試化合物對報道基因表達的影響。
31.一種鑒定影響受目的蛋白調節(jié)的基因轉錄的化合物的方法，所述方法包含下列步驟提供第一株含有構建體的細胞系，該構建體包含與第一報道基因可操作連接、已知結合目的蛋白的元件；提供第二株含有構建體的細胞系，該構建體包含與第二報道基因可操作連接、已知結合目的蛋白的元件；將測試化合物與兩株細胞系中的各株的細胞接觸；以及確定測試化合物對報道基因表達的影響。
32.一種鑒定影響目的蛋白穩(wěn)定性的化合物的方法，所述方法包含下列步驟提供轉染有構建體的細胞系，其表達與目的蛋白融合的第一報道蛋白和第二對照報道蛋白；將測試化合物與細胞系的細胞接觸；將細胞與DNA損傷劑接觸；以及比較第一報道蛋白與第二報道蛋白的水平。
33.一種鑒定影響目的蛋白穩(wěn)定性的化合物的方法，所述方法包含下列步驟提供轉染有構建體的細胞系，其表達與目的蛋白融合的第一報道蛋白和第二對照報道蛋白；將測試化合物與細胞系的細胞接觸；將細胞與DNA損傷劑接觸；以及比較第一報道蛋白與第二報道蛋白的水平。
全文摘要
本發(fā)明提供測定方法用于鑒定影響目的蛋白轉錄活性或影響目的蛋白穩(wěn)定性的化合物。三倍讀出測定系統(tǒng)可用來鑒定影響目的蛋白轉錄活性的化合物，使用三株細胞系以對非特異效果如插入基因兩側的序列和細胞毒性進行控制。雙倍讀出測定系統(tǒng)評估蛋白穩(wěn)定性并利用報道蛋白和目的蛋白的融合蛋白。這些測定系統(tǒng)在鑒定影響轉錄因子和腫瘤抑制物的化合物方面是特別有用的。在特別的實施方案中，腫瘤抑制物p53是在研的靶蛋白。
文檔編號C12N15/85GK1639355SQ01821527
公開日2005年7月13日 申請日期2001年10月25日 優(yōu)先權日2000年10月27日
發(fā)明者金泰國 申請人:哈佛學院校長同事會