專利名稱：異戊二烯醇的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及異戊二烯醇的制備方法。
背景技術(shù)：
萜類化合物(類異戊二烯)的生物合成，開始于香葉基二磷酸(GPP；C10)，法呢基二磷酸(FPP；C15)和香葉基香葉基二磷酸(GGPP；C20)的合成，這三種物質(zhì)都屬于直鏈異戊二烯基二磷酸，順次經(jīng)由異戊烯基二磷酸(IPP；C5)與一個(gè)烯丙基二磷酸底物的縮合反應(yīng)進(jìn)行(

圖1)。圖1中，方框中的縮寫和名稱表示酶。特定的，hmgR表示羥甲基戊二酰基輔酶A(HMG輔酶A)還原酶；GGPS表示GGPP合酶；FPS表示FPP合酶。
在各種異戊二烯基二磷酸中，F(xiàn)PP是生物合成中最重要的中間體，也是許多種類萜類化合物合成的前體，例如，包括麥角固醇(維生素原D2)的類固醇，醌類物質(zhì)的側(cè)鏈(維生素K；VK)，倍半萜烯，(角)鯊烯(SQ)，法呢基化蛋白質(zhì)的錨著分子，天然橡膠，等等。
GGPP也是萜類化合物生物合成的一個(gè)重要中間體，并對(duì)一些化合物的生物合成而言是必不可少的，諸如視黃醇(維生素A；VA)，β-胡羅卜素(維生素原A)，葉綠醌(維生素K1；VK1)，香葉基香葉基蛋白質(zhì)的錨著分子，葉綠素的側(cè)鏈，赤霉素，以及古細(xì)菌的醚脂。
法呢醇(FOH；C15)和香葉基香葉醇(GGOH；C20)，分別是FPP和GGPP的醇衍生物，它們的異構(gòu)體如橙花叔醇(NOH；C15)是用于制造香水的香精油中的芳香物質(zhì)。它們也在各種不同的化合物，包括上述作為藥理劑的維生素的合成中作為重要的起始物質(zhì)(圖1)。
因此，希望能夠建立一個(gè)體系，可大量制備所謂活性型異戊二烯醇的純產(chǎn)物，而不是順和反((Z)-和(E)-)兩種異構(gòu)體的混合物。
盡管業(yè)界普遍認(rèn)為所有IPP的生物合成均通過(guò)甲羥戊酸途徑完成(該途徑中，IPP由乙酰輔酶A經(jīng)由甲羥戊酸而合成)，但是M.Rohmer等人于80年代末闡明了利用細(xì)菌合成IPP的新途徑。該途徑被稱為非甲羥戊酸途徑或DXP(1-脫氧木酮糖5-磷酸)途徑，該途徑中，IPP由甘油醛-3-磷酸鹽合成，丙酮酸經(jīng)由1-脫氧木酮糖5-磷酸合成。
目前，GGOH是采用化學(xué)合成的方法制備的(例如，見(jiàn)日本未審查專利公開No.8-133999)?？墒?，化學(xué)法合成GGOH所需的步驟多于化學(xué)合成短碳鏈的FOH或NOH所需的步驟，因此也需要更高的成本。此外，盡管化學(xué)方法合成的GGOH和天然存在的GGOH相比，具有相同的碳骨架結(jié)構(gòu)，但是獲得的卻是(E)-型(反式)和(Z)-型(順式)、兩種雙鍵模式的混合物。(E，E，E)-GGOH(以下縮寫為(全-E)-GGOH)是生物體代謝途徑中合成的構(gòu)型，具有工業(yè)價(jià)值。為獲得單一構(gòu)型的(全-E)-GGOH，需采用柱層析精煉，高精度蒸餾等方法。不過(guò)，由于GGOH是一種熱不穩(wěn)定的烯丙醇，因此很難采用高精度蒸餾的方法。同樣，采用柱層析法精煉的方法也不適用于工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐，因?yàn)樵摲椒ㄐ枰罅康娜軇┖椭盍?，還需要分析、回收連續(xù)洗脫餾分，及去除溶劑的復(fù)雜操作；因此，該方法不僅操作復(fù)雜而且需要很高的成本。目前情況下，希望能夠建立一種通過(guò)控制順?lè)磧煞N幾何異構(gòu)體的產(chǎn)生，或利用某些特性，如反應(yīng)產(chǎn)物的重復(fù)結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行(全-E)-GGOH生物合成的方法。不過(guò)，這樣的方法還沒(méi)有建立起來(lái)。GGOH合成的底物由細(xì)胞，如芽殖的啤酒糖酵母細(xì)胞中的甲羥戊酸途徑提供。然而，即使采用被認(rèn)為是GGOH合成中的關(guān)鍵酶HMG輔酶A還原酶，其作用也僅增加了通過(guò)合成FPP來(lái)合成鯊烯的能力。(日本未審查專利公開No.5-192184；Donald et al.，(1997)Appl.Environ Microbiol.63，3341-3344)。此外，即使培養(yǎng)一種獲得了固醇吸收能力的鯊烯合酶基因缺乏的特殊芽殖酵母菌株，也僅在培養(yǎng)液中顯示出每升1.3mg的FOH積累量。(Chambon et al.，(1990)Curr.Genet.18，41-46)而NOH的生物合成方法還不知道。關(guān)于GGOH的生物合成，在日本未審查專利公開No.9-238692中，通過(guò)培養(yǎng)植物細(xì)胞可得到每升培養(yǎng)液0.66-3.25mg的產(chǎn)率。不過(guò)，這一方法需要昂貴的、不適用于工業(yè)應(yīng)用的植物細(xì)胞培養(yǎng)基，以及需要對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行光照。因此，這一方法即使同傳統(tǒng)的從天然產(chǎn)物，如香精油中制備GGOH的方法相比，都是不實(shí)用的。已經(jīng)知道的方法中還沒(méi)有適用于工業(yè)化的生物合成GGOH的方法，例如，通過(guò)培養(yǎng)微生物來(lái)生物合成GGOH。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供一種通過(guò)培養(yǎng)重組DNA轉(zhuǎn)化的重組體來(lái)制備異戊二烯醇的方法，該重組DNA含有一個(gè)異戊二烯基二磷酸合酶基因。
針對(duì)上述難題的解決方法進(jìn)行了大量廣泛而且集中的研究后，本發(fā)明人努力開發(fā)了異戊二烯醇的制備體系，即將與合成異戊二烯基二磷酸相關(guān)的酶基因?qū)胨拗?。作為宿主，采用的是那些很早就已?jīng)被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，可通過(guò)甲羥戊酸途徑或DXP途徑合成異戊二烯基二磷酸，且使用易于進(jìn)行多種遺傳工程技術(shù)改造的微生物，例如單細(xì)胞真核生物(特別是酵母)或原核生物(如細(xì)菌，特別是大腸桿菌)。為了在酵母內(nèi)構(gòu)建與異戊二烯基二磷酸合成相關(guān)的酶基因(例如，以HMG輔酶A還原酶基因，IPPΔ-異構(gòu)酶基因，多種異戊二烯基二磷酸合成酶基因，或其突變體或融合基因?yàn)榇淼募琢u戊酸途徑相關(guān)的酶基因)在宿主細(xì)胞內(nèi)人工表達(dá)的體系，構(gòu)建了含有組成型(永久表達(dá)型)或誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子、及各種營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記的表達(dá)穿梭載體。然后，將一個(gè)關(guān)注的基因或其突變體整合到載體中，再將該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。發(fā)明人成功地在得到的重組體的培養(yǎng)物中獲得異戊二烯醇(特別是香葉基香葉醇)，達(dá)成上述目標(biāo)。本發(fā)明也因而得以完成。當(dāng)細(xì)菌，特別是大腸桿菌，被用作宿主時(shí)，采用了一種常規(guī)載體，將與異戊二烯基二磷酸合成相關(guān)的一種酶基因(例如FPP合酶基因的突變體，或IPPΔ異構(gòu)酶基因)導(dǎo)入宿主細(xì)胞。培養(yǎng)該重組體，脫磷酸化后，從得到的培養(yǎng)物中獲得了香葉基香葉醇。這就達(dá)成了上述目標(biāo)，本發(fā)明也得以完成。
本發(fā)明總結(jié)如下(1)一種制備異戊二烯醇(例如香葉基香葉醇)的方法，包括通過(guò)將均含有異戊二烯基二磷酸合酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主而構(gòu)建一個(gè)重組體；培養(yǎng)得到的重組體；及從得到的培養(yǎng)物中回收異戊二烯醇。
(2)一種制備異戊二烯醇的方法，包括通過(guò)將均含有異戊二烯基二磷酸合酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA以及均含有羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主而構(gòu)建一個(gè)重組體；培養(yǎng)得到的重組體；及從得到的培養(yǎng)物中回收異戊二烯醇。
(3)一種制備香葉基香葉醇的方法，包括通過(guò)將均含有異戊二烯基二磷酸合酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA以及均含有異戊烯基二磷酸Δ異構(gòu)酶基因的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主而構(gòu)建一個(gè)重組體；培養(yǎng)得到的重組體；及從得到的培養(yǎng)物中回收香葉基香葉醇。
(4)異戊二烯基二磷酸合酶基因可選自下列基因(a)和(b)以及融合基因(c)和(d)(a)法呢基二磷酸合酶基因或其突變體(b)香葉基香葉基二磷酸合酶基因或其突變體(c)由法呢基二磷酸合酶基因或其突變體和香葉基香葉基二磷酸合酶基因或其突變體組成的融合基因(d)添加一個(gè)編碼His Asp Glu Leu氨基酸序列的核苷酸序列的上述基因(a)或(b)或融合基因(c)。
法呢基二磷酸合酶基因的特定實(shí)例包括一個(gè)編碼如SEQ ID NO2或4中所示氨基酸序列的基因；香葉基香葉基二磷酸合酶基因的特定實(shí)例包括一個(gè)編碼如SEQ ID NO6中所示氨基酸序列的基因。
(5)一種制備香葉基香葉醇的方法，包括通過(guò)將均含有羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主而構(gòu)建一個(gè)重組體；培養(yǎng)得到的重組體；及從得到的培養(yǎng)物中回收香葉基香葉醇。
(6)一種制備香葉基香葉醇的方法，包括通過(guò)將均含有羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA以及含有選自下列(e)到(j)的基因的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主而構(gòu)建一個(gè)重組體(e)異戊烯基二磷酸Δ-異構(gòu)酶基因(f)甲羥戊酸激酶基因(g)乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶基因(h)羥甲基戊二酰輔酶A合酶基因(i)磷酸甲羥戊酸激酶基因
(j)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因培養(yǎng)得到的重組體；及從得到的培養(yǎng)物中回收香葉基香葉醇。
(7)根據(jù)上述的方法，可制備出濃度至少為0.05mg/L的香葉基香葉醇。在這些方法中可采用宿主的特定實(shí)例包括酵母(例如啤酒糖酵母)和大腸桿菌。在這些方法中可采用的優(yōu)選啤酒糖酵母株包括A451株，YPH499株，YPH500株，W303-1A株和W303-1B株，或這些菌株的任意一種衍生的菌株。
(8)一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA，含有選自上述基因(a)、基因(b)、融合基因(c)和融合基因(d)中的任一基因，以及轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子。
(9)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子可選自ADH1啟動(dòng)子、TDH3(GAP)啟動(dòng)子、TEF2啟動(dòng)子、GAL1啟動(dòng)子和tac啟動(dòng)子的任意一個(gè)；轉(zhuǎn)錄終止子可以是CYC1終止子。
(10)一種重組體，該重組體是通過(guò)將上述重組DNA導(dǎo)入宿主而獲得的。宿主的特定實(shí)例如上所述。
(11)一種制備異戊二烯醇的方法，包括采用含下列組分(i)-(vi)之一的培養(yǎng)基，培養(yǎng)具有產(chǎn)生異戊二烯醇能力的微生物(i)糖(ii)醇(11i)氨氣，氨水和/或銨鹽(iv)氫氧化鈉和硫酸的混合物(v)KH2PO4、硫酸鎂、硫酸銨、玉米浸漬液、氯化鈣和表面活性劑的混合物(vi)上述組分(i)-(v)中的兩種或以上的混合物；并且從得到的培養(yǎng)物中回收異戊二烯醇。
在上文(11)中所描述的方法中，可以使用補(bǔ)料液培養(yǎng)微生物，該補(bǔ)料液含有下列組分(i)、(ii)或(iii)或這些組分中的兩種或兩種以上的混合物(i)糖(ii)醇(iii)氨氣、氨水和/或銨鹽。
補(bǔ)料液可含有下述的組分，也可按下述方式添加到培養(yǎng)基中，例如簡(jiǎn)言之，補(bǔ)料液的碳源組分從培養(yǎng)開始到培養(yǎng)開始后12-24小時(shí)之間僅由葡萄糖組成，在此之后碳源組分更換為含乙醇的組分。這一更換可按照如下方式進(jìn)行，即在培養(yǎng)開始12-24小時(shí)后，乙醇與補(bǔ)料液中總碳源組分的比率為50％或以上。作為選擇，在培養(yǎng)開始12-24小時(shí)后，補(bǔ)料液的碳源組分可僅由乙醇組成。
術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)料”指在培養(yǎng)過(guò)程中，將一種特定的溶液或組分以任意方式補(bǔ)充或添加進(jìn)培養(yǎng)液中。將特定組分補(bǔ)充或添加進(jìn)發(fā)酵罐的培養(yǎng)方法被稱為“補(bǔ)料分批培養(yǎng)”。
異戊二烯醇在培養(yǎng)物中積累的濃度至少為0.1g/L或更高，優(yōu)選地為1g/L或更高。香葉基香葉醇可作為異戊二烯醇的一個(gè)特定實(shí)例；微生物的特定實(shí)例包括酵母，如啤酒糖酵母。本發(fā)明可采用啤酒糖酵母A451株、YPH499株、W303-1A株或W303-1B株，或任一上述菌株的衍生菌株。
此外，在上文(11)描述的方法中，優(yōu)選的微生物是重組體。這樣的重組體的特定實(shí)例，可以是下面的(a)或(b)a)通過(guò)將均含有甲羥戊酸途徑相關(guān)基因或其突變體，或異戊二烯基二磷酸合酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主而構(gòu)建的重組體。
b)通過(guò)將均含有異戊二烯基二磷酸合酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA以及均含有甲羥戊酸途徑相關(guān)基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主而構(gòu)建的重組體。
宿主的特定實(shí)例包括啤酒糖酵母。更為明確地可采用啤酒糖酵母A451株、YPH499株、YPH500株、W303-1A株或W303-1B株，或任一上述菌株的衍生菌株。
甲羥戊酸途徑相關(guān)基因的特定實(shí)例包括羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因(即HMG1基因)。
異戊二烯基二磷酸合酶基因的特定實(shí)例，包括選自下列基因(a)、基因(b)、融合基因(c)和融合基因(d)的任意基團(tuán)(a)法呢基二磷酸合酶基因或其突變體(b)香葉基香葉基二磷酸合酶基因或其突變體
(c)由法呢基二磷酸合酶基因或其突變體和香葉基香葉基二磷酸合酶基因或其突變體組成的融合基因(d)添加一個(gè)編碼His Asp Glu Leu氨基酸序列的核苷酸序列的上述基因(a)或(b)或融合基因(c)。
此外，本發(fā)明采用的微生物可以是一種原養(yǎng)型微生物、一種雙倍體細(xì)胞，或者既是原養(yǎng)型微生物，也是雙倍體細(xì)胞。
此外，本發(fā)明以培養(yǎng)基pH控制為特征。pH控制是通過(guò)采用如氨氣、銨鹽溶液、氫氧化鈉溶液或硫酸來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
下文中，將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為具體的描述。本說(shuō)明含公開于日本專利申請(qǐng)No.2000-403067的說(shuō)明書和/或附圖中的內(nèi)容，基于此專利申請(qǐng)，本申請(qǐng)要求優(yōu)先權(quán)。
利用代謝工程技術(shù)，本發(fā)明人試圖建立一個(gè)制備活性異戊二烯醇，尤其是(全-E)-香葉基香葉醇(以下稱為“GGOH”)的體系。
業(yè)界相信GGOH是以香葉基香葉基二磷酸為前體(GGPP)合成而來(lái)。通常，簡(jiǎn)單地提高GGPP合酶活性將僅引起從異戊烯基二磷酸(IPP)和3，3-二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)合成GGPP的加速，而且不可預(yù)知這種提高是否會(huì)導(dǎo)致GGOH的產(chǎn)生(圖1)。另外，已知在體內(nèi)，GGPP僅作為類胡羅卜素和異戊二烯化的蛋白質(zhì)等多種終產(chǎn)物合成的前體(圖1)。這樣，即使在GGPP合成加速、這些終產(chǎn)物水平也可望提高的情況下，仍不可預(yù)知是否能夠建立一種具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的GGPP合成體系。即使通過(guò)提高HMG輔酶A還原酶的酶活性或上文列于(e)-(j)中的酶的活性，從而提高了HMG輔酶A還原酶(一種甲羥戊酸途徑中的關(guān)鍵酶)的表達(dá)水平，仍不可預(yù)知哪種合成(即FPP合成或GGPP合成)會(huì)加強(qiáng)；因此，不能期望上述表達(dá)水平的提高對(duì)GGPP的合成是有效果的。此外，根據(jù)迄今為止積累的資料，也不能預(yù)期FPP合酶基因的表達(dá)(FPP合酶催化法呢基二磷酸(FPP)的合成，是FOH的前體)會(huì)對(duì)GGOH的制備有效(圖1)。
本發(fā)明中，通過(guò)構(gòu)建用于將異戊二烯基二磷酸合酶基因、HMG輔酶A還原酶基因和/或IPPΔ-異構(gòu)酶基因?qū)胨拗骷?xì)胞的各種重組DNA，及用這些重組DNA構(gòu)建重組體，發(fā)明人從而發(fā)展了大量制備異戊二烯醇、特別是GGOH的體系。
1.用于表達(dá)的重組DNA或用于基因組整合的DNA片段的制備本發(fā)明中，通過(guò)將一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子DNA和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子DNA連接或插入到一個(gè)異戊二烯基二磷酸合酶基因內(nèi)，可獲得用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA的實(shí)例。預(yù)先制備一個(gè)含有異戊二烯基二磷酸合酶基因的基因表達(dá)盒也是可能的，該異戊二烯基二磷酸合酶基因已連接了一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子，然后將該基因表達(dá)盒整合到一個(gè)載體內(nèi)。啟動(dòng)子和終止子的連接或插入可按任意順序進(jìn)行，但優(yōu)選的是將啟動(dòng)子和終止子分別連接到異戊二烯基二磷酸合酶基因的上游和下游。作為選擇，本發(fā)明中，一個(gè)異戊二烯基二磷酸合酶基因，一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子可被順序摻入一個(gè)適當(dāng)?shù)腄NA，如一個(gè)載體中。如果正確地考慮轉(zhuǎn)錄方向，就可按任意順序完成摻入。
異戊二烯基二磷酸合酶基因的特定實(shí)例包括法呢基二磷酸合酶基因(稱為“FPP合酶基因”)和香葉基香葉基二磷酸合酶基因(稱為“GGPP合酶基因”)。FPP合酶基因的特定實(shí)例包括啤酒糖酵母ERG20(SEQ ID NO1)、大腸桿菌ispA(SEQ ID NO3)和嗜熱脂肪芽孢桿菌來(lái)源的FPP合酶基因(日本未審查專利公開No.5-219961；美國(guó)專利No.5,786,192)。GGPP合酶基因的特定實(shí)例包括啤酒糖酵母BTS1(SEQ ID NO5)，嗜酸熱硫化葉菌(日本未審查專利公開No.7-308913；美國(guó)專利No.5,773,273)和棲熱嗜熱菌Tth(日本未審查專利公開No.9-107974；美國(guó)專利No.6,107,072)。這些基因可通過(guò)常規(guī)基因分離方法或使用商業(yè)試劑盒而獲得。本發(fā)明中，也可能采用一個(gè)FPP合酶基因的突變體或一個(gè)GGPP合酶基因的突變體。
此外，本發(fā)明中，可構(gòu)建一個(gè)載體，該載體含有一個(gè)由GGPP合酶基因或其突變體和FPP合酶基因或其突變體組成的融合基因，使得經(jīng)GGPP合酶基因和FPP合酶基因表達(dá)產(chǎn)生的多肽具有融合蛋白的形式。本發(fā)明中，這樣一種用兩種或兩種以上基因構(gòu)建、使融合蛋白作為一種表達(dá)產(chǎn)物而產(chǎn)生出來(lái)的基因，被稱為“融合基因”。為制備融合基因，可采用下述方法，即用一種適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化一個(gè)DNA，然后將用同一種酶作用下預(yù)消化的另一個(gè)DNA以特定的方式連接到前一個(gè)DNA，該方式中后者DNA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的讀碼框架不發(fā)生移碼。
此外，本發(fā)明中，為添加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)過(guò)渡信號(hào)(氨基酸序列表現(xiàn)為His Asp Glu Leu(SEQ ID NO24)；下文參見(jiàn)“HDEL序列”)到異戊二烯基二磷酸合酶基因或其突變體或上述融合基因表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的C-端上，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列可被添加到異戊二烯基二磷酸合酶基因或融合基因上，從而構(gòu)建出一種修飾的基因。
此外，本發(fā)明中，通過(guò)將單獨(dú)的羥甲基戊二酰輔酶A(HMG輔酶A)還原酶基因(SEQ ID NO7)或其突變體，或含上述異戊二烯基二磷酸合酶基因(包括其突變體)的融合基因?qū)胨拗髦?，并表達(dá)基因，也可能制備異戊二烯醇(特別是GGOH)。作為選擇，也可將異戊二烯基二磷酸合酶基因或其突變體和HMG輔酶A還原酶基因或其突變體一起導(dǎo)入宿主中，從而共表達(dá)兩種基因。HMG輔酶A還原酶基因的特定實(shí)例包括啤酒糖酵母HMG1和HMG2。
上述異戊二烯基二磷酸合酶基因和HMG輔酶A還原酶基因的突變體可以是缺失突變體基因，即有一部分區(qū)域的缺失(例如HMG輔酶A還原酶基因最多可缺失2217個(gè)核苷酸)，或者是在野生型基因或上述缺失突變基因的核苷酸序列中具有缺失、替代或添加1個(gè)或幾個(gè)至10個(gè)核苷酸的突變基因。因此，由這樣的突變基因編碼的氨基酸序列可能有一個(gè)(或多個(gè))突變。特定的，野生型異戊二烯基二磷酸合酶的氨基酸序列(FPP合酶SEQ ID NO2或4；GGPP合酶SEQ ID NO6)或野生型MMG輔酶A還原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO8)可能有一個(gè)(或多個(gè))突變，如缺失、替代或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸(例如1-10個(gè)，優(yōu)選的是1-3個(gè))。野生型HMG輔酶A還原酶的氨基酸序列(SEQ ID NO8)最多有739個(gè)氨基酸的缺失，且這種缺失突變型酶還可能進(jìn)一步發(fā)生一個(gè)(或幾個(gè))突變，例如缺失、添加、替代或插入了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸(例如1-10個(gè)，優(yōu)選的是1-3個(gè))。特定的，本發(fā)明可采用圖2B中闡明的野生型HMG輔酶A還原酶基因或其缺失突變體，且由于核苷酸替代的原因，由它們編碼的氨基酸序列可能會(huì)有1-10個(gè)位點(diǎn)特異性替代，可參見(jiàn)圖2A。此外，當(dāng)一個(gè)野生型異戊二烯基二磷酸合酶(例如SEQ ID NO1，3或5)或野生型HMG輔酶A還原酶基因(SEQ ID NO7)經(jīng)PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增后，由于DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶的低準(zhǔn)確性，使得核苷酸的替代突變發(fā)生在得到的DNA片段上，被稱為“PCR錯(cuò)誤”。例如在本發(fā)明中可用到的一種HMG輔酶A還原酶基因所編碼的多肽具有替代突變，該突變是由于以野生型HMG輔酶A還原酶基因(SEQ ID NO7)為模板，由于PCR錯(cuò)誤造成的核苷酸替代引起的；該HMG輔酶A還原酶基因被命名為“HMG1”。在以野生型HMG輔酶A還原酶基因(SEQ ID NO7)為模板，由于PCR錯(cuò)誤造成的核苷酸替代的實(shí)施方案見(jiàn)圖2A。HMG1’具有如SEQ ID NO9中所示的核苷酸序列，由其編碼的氨基酸序列如SED ID NO10中所示。圖2A中，核苷酸突變按如下順序表示替代前的相關(guān)核苷酸(以一個(gè)字母代碼表示)，按照在野生型HMG輔酶A還原酶基因的起始密碼子中第一個(gè)核苷酸的位置為1進(jìn)行記數(shù)的該核苷酸的位置，替代后的核苷酸(以一個(gè)字母代碼表示)。包含在PCR錯(cuò)誤型HMG輔酶A還原酶的氨基酸序列中的氨基酸突變，按如下順序表達(dá)替代前的相關(guān)氨基酸(以一個(gè)字母代碼表示)，該氨基酸在HMG輔酶A還原酶中的位置，替代后的氨基酸(以一個(gè)字母代碼表示)。此外，上述的PCR錯(cuò)誤型核苷酸序列可通過(guò)諸如定點(diǎn)誘變的技術(shù)進(jìn)行部分修飾。這種修飾過(guò)的HMG輔酶A還原酶基因也可用于本發(fā)明。PCR錯(cuò)誤引起的核苷酸替代的實(shí)施方案如圖2A所示。此外，上述的PCR錯(cuò)誤類型核苷酸序列可通過(guò)諸如定點(diǎn)誘變形成技術(shù)進(jìn)行部分修飾。編碼該修飾型HMG輔酶A還原酶(SEQ ID NO12)的基因(SEQ ID NO11)也可用于本發(fā)明。
此外，PCR錯(cuò)誤型HMG輔酶A還原酶基因HMG1’的缺失突變體HMG1Δ基因(Fig 2B)可作為HMG輔酶A還原酶基因(包括PCR錯(cuò)誤型)的一個(gè)實(shí)例，該基因編碼了預(yù)測(cè)跨膜域缺失的缺失突變體。該圖中最高一行表示沒(méi)有缺失的HMG1’。由細(xì)實(shí)線(一)指出的部分表示缺失區(qū)域。下表1顯示在每個(gè)缺失突變體基因中，HMG1’基因(SEQ ID NO9)缺失了哪一個(gè)區(qū)域。根據(jù)缺失模式，HMG1’缺失突變體表示為“HMG1Δxxy”，“xx”表示缺失模式，“y”是一個(gè)工作數(shù)字(任意數(shù)字)。圖2B中，“Δ026”即HMG1Δ02y的一個(gè)實(shí)例。(其它缺失模式實(shí)例也以相同方式表達(dá))
表1缺失的實(shí)施方式預(yù)測(cè)跨膜缺失突變體 域的缺失的命名 引物1引物2質(zhì)粒(s) 缺失區(qū)域 缺失后序列HMG1Δ02y HMG1(558-532)HMG1(799-825)pYHMG02X#2-#3Nucleotide Positions 559-798 SEQ ID NO13HMG1Δ04y HMG1(1191-1165) HMG1(1267-1293) pYHMG04X#6 Nucleotide Positions 1192-1266SEQ ID NO14HMG1Δ05y HMG1(1380-1354) HMG1(1573-1599) pYHMG05X#7 Nucleotide Positions 1381-1572SEQ ID NO15HMG1Δ06y HMG1(558-532)HMG1(1267-1293) pYHMG06X#2-#6Nucleotide Positions 559-1266 SEQ ID NO16HMG1Δ07y HMG1(558-532)HMG1(1573-1599) pYHMG07X#2-#7Nucleotide Positions 559-1572 SEQ ID NO17HMG1Δ08y HMG1(27-1) HMG1(1573-1599) pYHMG08X#1-#7Nucleotide Positions 27-1572 SEQ ID NO18HMG1Δ10y HMG1(27-1) HMG1(1816-1842) pYHMG10X#1-#7(-605aa)Nucleotide Positions 27-1815 SEQ ID NO19HMG1Δ11y HMG1(27-1) HMG1(1891-1917) pYHMG11X#1-#7(-631aa)Nucleotide Positions 27-1890 SEQ ID NO20HMG1Δ12y HMG1(27-1) HMG1(1990-2016) pYHMG12X#1-#7(-663aa)Nucleotide Positions 27-1989 SEQ ID NO21HMG1Δ13y HMG1(27-1) HMG1(2218-2244) pYHMG13X#1-#7(-739aa)Nucleotide Positions 27-2217 SEQ ID NO22引物序列HMG1(27-1) 5′TTT CAG TCC CTT GAA TAG CGG CGG CAT 3′ SEQ ID NO77HMG1(558-532) 5′GTC TGC TTG GGT TAC ATT TTC TGA AAA 3′ SEQ ID NO61HMG1(799-825) 5′CAC AAA ATC AAG ATT GCC CAG TAT GCC 3′ SEQ ID NO78HMG1(1191-1165)5′AGA AGA TAC GGA TTT CTT TTC TGC TTT 3′ SEQ ID NO79HMG1(1267-1293)5′AAC TTT GGT GCA AAT TGG GTC AAT GAT 3′ SEQ ID NO80HMG1(1380-1354)5′TTG CTC TTT AAA GTT TTC AGA GGC ATT 3′ SEQ ID NO81HMG1(1573-1599)5′CAT ACC AGT TAT ACT GCA GAC CAA TTG 3′ SEQ ID NO62HMG1(1816-1842)5′GCA TTA TTA AGT AGT GGA AAT ACA AAA 3′ SEQ ID NO82HMG1(1891-1917)5′CCT TTG TAC GCT TTG GAG AAA AAA TTA 3′ SEQ ID NO83HMG1(1990-2016)5′TCT GAT CGT TTA CCA TAT AAA AAT TAT 3′ SEQ ID NO84HMG1(2218-2244)5′AAG GAT GGT ATG ACA AGA GGC CCA GTA 3′ SEQ ID NO85
此外，本發(fā)明中，通過(guò)將一個(gè)異戊烯基二磷酸Δ-異構(gòu)酶(IPPΔ-異構(gòu)酶)基因和上述異戊二烯基二磷酸合酶基因或其突變體一起導(dǎo)入宿主中而制備異戊二烯醇，尤其是GGOH，也是可能的。IPPΔ-異構(gòu)酶基因的特定實(shí)例包括大腸桿菌來(lái)源的idi(SEQ ID NO32)。異戊二烯基二磷酸合酶基因的特定實(shí)例包括大腸桿菌來(lái)源的ispAm突變基因(Y79MSEQ ID NO37；Y79E；SEQ ID NO35；Y79DSEQ ID NO33)和嗜熱脂肪芽孢桿菌來(lái)源的fpsm(Y81MSEQ ID NO39)。從ispA來(lái)源的突變基因編碼突變酶，其中位于野生型FPP合酶(SEQ IDNO4)79位上的氨基酸殘基Tyr經(jīng)替代突變被改變?yōu)锳sp(SEQ IDNO34)、Glu(SEQ ID NO36)或Met(SEQ ID NO38)。
本發(fā)明用到的DNA只要可在宿主細(xì)胞中遺傳保留，就不用特定限制。可采用DNA的特定實(shí)例包括質(zhì)粒DNA、噬菌體、逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子DNA、酵母人工染色體DNA(YAC酵母人工染色體)等。至于用于基因組整合的DNA片段，這些片段不需要復(fù)制能力。這樣就可采用PCR或化學(xué)合成的方法制備DNA片段。
可用質(zhì)粒DNA的特定實(shí)例包括YCp型大腸桿菌-酵母穿梭載體，如pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112或pAUR123；YEp型大腸桿菌-酵母穿梭載體，如pYBS2或YEp13；YIp型大腸桿菌-酵母穿梭載體，如pRS403，pRS404，pRS405，pRS406，pAUR101或pAUR135；大腸桿菌衍生質(zhì)粒(例如ColE質(zhì)粒，如pBR322，pBR325，pUC18，pUC19，pUC118，pUC119，pTV118N，pTV119N，pBluescript，pHSG298，pHSG396或pTrc99A；p15A質(zhì)粒，如pACYC177或pACYC184；和pSC101質(zhì)粒，如pMW118，pMW119，pMW218或pMW219)和枯草芽孢桿菌衍生質(zhì)粒(例如pUB110，pTP5)?？捎玫氖删wDNA的特定實(shí)例包括λ噬菌體(Charon4A，Charon21A，EMBL3，EMBL4，λgt10，λgt11，λZAP)，φX174，M13mp18和M13mp19。可用的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的特定實(shí)例包括Ty因子。YAC載體的特定實(shí)例包括pYACC2。
當(dāng)將各種重組DNA導(dǎo)入宿主時(shí)，很多情況下會(huì)采用選擇性標(biāo)記基因。不過(guò)，如果有一種合適的分析方法，采用標(biāo)記基因并不是必要的。
組成型(永久表達(dá)型)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子都可作為轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。術(shù)語(yǔ)“組成型啟動(dòng)子”意指一個(gè)涉及主要代謝途徑的基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子在很多生長(zhǎng)條件下都具有轉(zhuǎn)錄能力?！罢T導(dǎo)型啟動(dòng)子”意指僅在特定生長(zhǎng)條件下才具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動(dòng)子，且其轉(zhuǎn)錄活性在其他生長(zhǎng)條件下受到抑制。
只要在諸如酵母的宿主內(nèi)具有轉(zhuǎn)錄活性，任何轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子都可被采用。例如GAL1啟動(dòng)子、GAL10啟動(dòng)子、TDH3(GAP)啟動(dòng)子、ADH1啟動(dòng)子、TEF2啟動(dòng)子或相似的啟動(dòng)子都可用于酵母內(nèi)的表達(dá)。用于大腸桿菌表達(dá)的啟動(dòng)子，可采用trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子等。
此外，如需要，重組DNA可包含順式元件，如增強(qiáng)子，剪切信號(hào)，聚腺苷酸附加信號(hào)，選擇性標(biāo)記等。可用的選擇性標(biāo)記的特定實(shí)例包括標(biāo)記基因，如指示物是非營(yíng)養(yǎng)缺陷型表型的URA3，LEU2，TRP1和HIS3，和抗生素抗性基因，如Ampr，Tetr，Cmr，Kmr和AUR1-C。
只要在諸如酵母的宿主內(nèi)具有活性，就可采用來(lái)源于任何基因的轉(zhuǎn)錄終止子。對(duì)于酵母中表達(dá)，可采用ADH1終止子，CYC1終止子等終止子。對(duì)于大腸桿菌中表達(dá)，可采用rrnB終止子。為在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)出感興趣的基因，也可將一個(gè)SD序列(代表性的是5’-AGGAGG-3’)作為核糖體結(jié)合位點(diǎn)整合到基因起始密碼子的上游，用于有效翻譯。
可通過(guò)在所用質(zhì)粒名稱之后指出相關(guān)基因名稱來(lái)命名和識(shí)別本發(fā)明制備的表達(dá)載體，這些表達(dá)載體是作為用于基因轉(zhuǎn)移的重組DNA。表2顯示的是采用pRS435GAP質(zhì)粒時(shí)，表達(dá)載體的名稱和組成之間的關(guān)系。采用pRS434、pRS444、pRS445質(zhì)粒和上述啟動(dòng)子組合時(shí)，也可以相同于pRS435GAP的方式描述所述關(guān)系。
表2

當(dāng)HMG1基因被連接到pRS434GAP質(zhì)粒時(shí)，得到的載體表達(dá)為“pRS434GAP-HMG1”。表3顯示的是采用pRS434GAP質(zhì)粒時(shí)，表達(dá)載體的名稱和其組成之間的關(guān)系。當(dāng)采用pRS435GAP、pRS445GAP或類似的質(zhì)粒時(shí)，名稱與組成之間的關(guān)系也可以相同方式描述。
表3

2.重組體的制備通過(guò)將本發(fā)明的各種重組DNA以特定方式導(dǎo)入宿主，可以獲得本發(fā)明的重組體，該方式即能夠表達(dá)不同異戊二烯基二磷酸合酶基因或其融合基因、和/或HMG輔酶A還原酶基因(包括這些基因的突變體；無(wú)另外說(shuō)明，也適用于本發(fā)明的其余部分)、或IPPΔ異構(gòu)酶基因。本發(fā)明采用的宿主類型無(wú)需特別限定。只要是可產(chǎn)生異戊二烯醇的宿主，就可采用。優(yōu)選的宿主是酵母或大腸桿菌。
本發(fā)明中，將包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子、一個(gè)異戊二烯基二磷酸合酶基因、HMG輔酶A還原酶基因、IPPΔ異構(gòu)酶基因或上文中(e)-(j)所列基因之一的重組DNA導(dǎo)入包括單細(xì)胞真核生物如酵母在內(nèi)的真菌、原核生物、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞等；從而獲得重組體。
本發(fā)明可采用的真菌包括粘菌、藻狀菌、子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌。在真菌當(dāng)中，一些單細(xì)胞真核生物如酵母在工業(yè)應(yīng)用上扮演重要角色?？梢粤信e出屬于子囊菌、擔(dān)子菌、或半知菌的酵母。本發(fā)明可采用酵母的特定實(shí)例包括屬于子囊菌的酵母，尤其是芽殖酵母，如啤酒糖酵母(稱作Baker’s酵母)、產(chǎn)朊假絲酵母或畢赤巴斯德酵母；裂殖酵母，如粟酒裂殖酵母。本發(fā)明可采用的酵母菌株只要可產(chǎn)生異戊二烯醇就無(wú)需特別限定。在采用啤酒糖酵母的情況下，可采用菌株的特定實(shí)例包括如下所示的A451、EUG5、EUG8、EUG12、EUG27、YPH499、YPH500、W303-1A、W303-1B、ATCC28382、AURGG101、AURGG102、AH1和YH1。就將重組DNA導(dǎo)入酵母中的方法而言，可應(yīng)用電穿孔方法、原生質(zhì)球法、或乙酸鋰方法。
A451(ATCC200589，MATa can1 leu2 trp1 ura3 aro7)YPH499(ATCC76625，MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ63 his3-Δ200leu2-Δ1，Stratagene，La Jolla，CA)YPH500(ATCC76626，MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ63 his3-Δ200leu2-Δ1，Stratagene)W303-1A(MATa leu2-3 leu2-112 his3-11 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100)W303-1B(MATa leu2-3 leu2-112 his3-11 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100)
AURGG101(A451，aur1::AUR1-C)本發(fā)明構(gòu)建的A451衍生菌株；整合有AUR1-C基因。
AURGG102(A451，aur1::GAL1p-BTS1&AUR1-C)本發(fā)明構(gòu)建的A451衍生菌株；含有GAL1啟動(dòng)子，BTS1和CYC1終止子及AUR1位點(diǎn)上的AUR1-C基因。
EUG5，EUG8(A451，ERG9p::URA3-GAL1p)本發(fā)明構(gòu)建的A451衍生菌株；含有鯊烯合酶基因ERG9，轉(zhuǎn)化株選擇標(biāo)記基因URA3和轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子GAL1p。
EUG12(YPH499，ERG9p::URA3-GAL1p)本發(fā)明構(gòu)建的YPH499衍生菌株；含有ERG9，URA3和GAL1p。
EUG27(YPH500，ERG9p::URA3-GAL1p)本發(fā)明構(gòu)建的YPH500衍生菌株；含有ERG9，URA3和GAL1p。
AH1菌株(pRS434GAP-HMG1/A451)本發(fā)明構(gòu)建的A451衍生菌株；A451菌株中導(dǎo)入有pRS434GAP-HMG1。
YH1菌株(pRS434GAP-HMG1/YPH499)本發(fā)明構(gòu)建的YPH499衍生菌株；YPH499菌株中導(dǎo)入有pRS434GAP-HMG1。
本發(fā)明可采用的原核生物包括古生菌和細(xì)菌。就古生菌而言，可列舉出產(chǎn)甲烷微生物，如甲烷桿菌；嗜鹽微生物，如嗜鹽桿菌；和嗜溫嗜酸微生物，如硫化葉菌。就細(xì)菌而言，可列舉出多種在工業(yè)或科學(xué)研究領(lǐng)域具有非常高應(yīng)用價(jià)值的革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，如埃希氏菌，如大腸桿菌；桿菌，如枯草芽孢桿菌或短芽孢桿菌；假單胞菌，如惡臭假單胞菌；土壤桿菌，如根癌土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌；棒狀桿菌，如谷氨酸棒桿菌；乳酸菌，如胚芽乳桿菌和放射菌，如放線菌或鏈霉菌。
當(dāng)一種細(xì)菌，如大腸桿菌被用做宿主時(shí)，本發(fā)明優(yōu)選的重組DNA可在宿主內(nèi)自主復(fù)制，且由一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，一個(gè)如核糖體RNA結(jié)合位點(diǎn)的SD序列，和本發(fā)明的基因組成。該重組DNA中也可正確插入一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子，該DNA還可包含控制啟動(dòng)子的基因。本發(fā)明采用的大腸桿菌菌株的特定實(shí)例包括BL21，DH5α，HB101，JM101，JM109，MV1184，TH2，XL1-Blue和Y-1088，但不僅限于這些菌株。就轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子而言，只要可在宿主，如大腸桿菌中，指導(dǎo)本發(fā)明基因的表達(dá)，就可以采用。例如，可采用一種大腸桿菌或噬菌體來(lái)源的啟動(dòng)子，如trp啟動(dòng)子，lac啟動(dòng)子，PL啟動(dòng)子或PR啟動(dòng)子。也可采用人工改變過(guò)結(jié)構(gòu)的啟動(dòng)子。就導(dǎo)入重組載體到細(xì)菌的方法而言，可采用將DNA轉(zhuǎn)移入細(xì)菌的方法。如，可采用利用鈣離子、電穿孔等方法。
可運(yùn)用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))法或DNA印跡雜交法驗(yàn)證本發(fā)明的基因是否被導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)。例如，從得到的重組體制備DNA，采用一對(duì)特異于轉(zhuǎn)移動(dòng)DNA的引物，進(jìn)行PCR。然后，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)由瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳純化，繼而由溴化乙啶、SYBR Green溶液等進(jìn)行染色，或用紫外檢測(cè)儀進(jìn)行DNA的檢測(cè)。通過(guò)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是一條譜帶或譜峰，就可驗(yàn)證轉(zhuǎn)移的DNA。作為選擇，可通過(guò)帶熒光染料或類似物的標(biāo)記引物進(jìn)行PCR操作，由此檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.異戊二烯醇的制備本發(fā)明通過(guò)培養(yǎng)上述重組體，該重組體含有一個(gè)異戊二烯基二磷酸合酶基因或其突變體(包括融合基因)、和/或一個(gè)HMG輔酶A還原酶基因或其突變體、或一個(gè)選自上文(e)-(j)的甲羥戊酸途徑相關(guān)酶基因；及從得到的培養(yǎng)物中進(jìn)行回收，從而可獲得異戊二烯醇。此處所用術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)物”指下列任一物質(zhì)培養(yǎng)上清液、培養(yǎng)細(xì)胞或微生物本身、或來(lái)自培養(yǎng)細(xì)胞或微生物中的破裂產(chǎn)物。本發(fā)明重組體的培養(yǎng)采用培養(yǎng)其宿主的傳統(tǒng)方法。GGOH可作為異戊二烯醇的一個(gè)特定實(shí)例。異戊二烯醇可單獨(dú)或以混合物形式在培養(yǎng)物中積累。
就培養(yǎng)得自微生物宿主的重組體的培養(yǎng)基而言，無(wú)論天然或合成的培養(yǎng)基，只要含有可被微生物同化的碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽，并可有效培養(yǎng)重組體，都可被采用。就碳源而言，可列舉出碳水化合物，如葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖、淀粉；有機(jī)酸，如乙酸、丙酸；醇類，如乙醇和丙醇。就氮源而言，可列舉氨水；無(wú)機(jī)或有機(jī)酸的銨鹽，如氯化銨、硫酸銨、乙酸銨、磷酸銨；其它含氮化合物；蛋白胨；肉提取物；玉米浸漬液，多種氨基酸，等。就無(wú)機(jī)物而言，可列舉出磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣，等等。通常，重組體在通氧、26-42℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。但宿主為啤酒糖酵母時(shí)，優(yōu)選的是在30℃培養(yǎng)重組體2-7天；當(dāng)宿主為大腸桿菌時(shí)，在37℃培養(yǎng)重組體12-18小時(shí)。pH的調(diào)節(jié)是利用無(wú)機(jī)或有機(jī)酸、堿溶液等物質(zhì)來(lái)進(jìn)行的。
在培養(yǎng)一個(gè)整合了含有可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的表達(dá)載體的重組體時(shí)，可在需要時(shí)向培養(yǎng)基中添加一種誘導(dǎo)劑。例如，在載體中用到GAL1啟動(dòng)子時(shí)，可采用半乳糖作為碳源。在培養(yǎng)用含有一個(gè)可用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物時(shí)，可在培養(yǎng)基中添加IPTG。
在上述條件下進(jìn)行培養(yǎng)，宿主可高產(chǎn)量地產(chǎn)出異戊二烯醇。為大量制備異戊二烯醇，可應(yīng)用一種發(fā)酵罐培養(yǎng)設(shè)備。尤其是當(dāng)宿主為YPH499啤酒糖酵母，且導(dǎo)入的質(zhì)粒DNA為pRS435GGF或pRS434GAP-HMG1時(shí)，重組體可產(chǎn)出每升培養(yǎng)基1.5mg甚至更多的異戊二烯醇；根據(jù)培養(yǎng)條件，重組體可產(chǎn)出128mg甚至更多的異戊二烯醇。
本發(fā)明中，通過(guò)添加諸如萜類化合物、油類、或表面活性劑之類的物質(zhì)，有可能提高異戊二烯醇的產(chǎn)出率。這些添加物的特定實(shí)例包括如下物質(zhì)萜類化合物鯊烯、生育酚、IPP、DMAPP油類大豆油、魚油、杏仁油、橄欖油表面活性劑Tergitol，Triton X-305，Span85，ADEKANOL LG109(Asahi Denka)，ADEKANOL LG294(Asahi Denka)，ADEKANOL LG295S(Asahi Denka)，ADEKANOL LG297(Asahi Denka)，ADEKANOL B-3009A(Asahi Denka)，ADEKA PLURONIC L-61(Asahi Denka)油類濃度為0.01％或大于0.01％，優(yōu)選為1-3％。表面活性劑的濃度為0.005-1％，優(yōu)選為0.05-0.5％。萜類化合物濃度為0.01％或大于0.01％，優(yōu)選為1-3％。
此外，本發(fā)明中，采用含有下列化合物(i)-(vi)中任意一種的培養(yǎng)基，并從得到的培養(yǎng)物中回收異戊二烯醇，也可培養(yǎng)具有產(chǎn)出異戊二烯醇能力的微生物。進(jìn)一步采用含下述化合物(i)-(v)中任意一種的補(bǔ)料液可以進(jìn)行補(bǔ)料-批式培養(yǎng)。
(i)糖(ii)醇(iii)氨氣、氨水和/或銨鹽(iv)氫氧化鈉和硫酸的混合物(v)磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸銨、玉米漫漬液、氯化鈣和一種表面活性劑的混合物(vi)兩種或兩種以上上述化合物(i)-(v)的混合物上述的糖的特定實(shí)例包括葡萄糖、蔗糖、半乳糖和乳糖。上述醇組合的特定實(shí)例包括甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇和丁醇。
就補(bǔ)料液中的碳源組分而言，優(yōu)選的是葡萄糖和乙醇的組合，更為優(yōu)選的是在培養(yǎng)基中添加用于控制pH的氨氣或一種銨鹽(例如乙酸銨)。就補(bǔ)料方法而言，優(yōu)選的是在培養(yǎng)開始到開始后12-24小時(shí)采用碳源僅為葡萄糖的補(bǔ)料液，然后就更換為乙醇作為另一種碳源組分的補(bǔ)料液。作為選擇，葡萄糖可以是貫穿整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程的單一碳源物質(zhì)。乙醇在補(bǔ)料液中與總碳源中可以是任何比例。可以是50％或更多，甚至100％。
無(wú)需在培養(yǎng)基中補(bǔ)充特定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就能增殖的菌株被稱為原養(yǎng)型。通常，原養(yǎng)型是在營(yíng)養(yǎng)需求上同相應(yīng)的野生型菌株具有相同表型的菌株。另一方面，為構(gòu)建重組體，營(yíng)養(yǎng)缺陷型(營(yíng)養(yǎng)缺陷型的突變菌株)經(jīng)常被用做宿主菌株?？赏ㄟ^(guò)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷突變，將該營(yíng)養(yǎng)缺陷型的表型改造成與相應(yīng)原養(yǎng)型相同的表型。簡(jiǎn)言之，就是將對(duì)應(yīng)于導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變的突變基因的一種野生型基因轉(zhuǎn)移至營(yíng)養(yǎng)缺陷體。當(dāng)與導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變的突變基因相比，野生型基因更占優(yōu)勢(shì)時(shí)，也可采用具有野生型基因的菌株，通過(guò)交配或接合營(yíng)養(yǎng)缺陷型來(lái)補(bǔ)充突變。本發(fā)明中，例如，通過(guò)將一些在產(chǎn)GGOH克隆(YH1菌株含一個(gè)由GGPP合酶基因與FPP合酶基因組成的融合基因)的基因組引起營(yíng)養(yǎng)需求的突變基因替換為相應(yīng)的野生型基因，然后用一種與保留的突變基因相比，具有優(yōu)勢(shì)的野生型基因的YPH500衍生克隆與上述得到的克隆雜交，可獲得一種原養(yǎng)型。本發(fā)明中，優(yōu)選的是采用是二倍體細(xì)胞，同時(shí)也是原養(yǎng)型的微生物。
培養(yǎng)后，如果微生物或細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生醇，可采用諸如勻漿器處理破壞微生物或細(xì)胞，從而回收異戊二烯醇。作為選擇，采用有機(jī)溶劑可無(wú)需破壞細(xì)胞直接提取出醇類物質(zhì)。如果本發(fā)明的異戊二烯醇在微生物或細(xì)胞外產(chǎn)生，培養(yǎng)液將直接利用，或通過(guò)離心等方法除去微生物或細(xì)胞。因此，可通過(guò)例如有機(jī)溶劑抽提法，從培養(yǎng)物中提取出目的異戊二烯醇。如有必要，可通過(guò)多種類型的色譜法或類似方法提純和分離異戊二烯醇。
本發(fā)明中，宿主菌株和載體的優(yōu)選組合，及這些組合與異戊二烯醇產(chǎn)量之間的關(guān)系在下表4中闡明。
表4




在“GGOH產(chǎn)量”一欄中，標(biāo)“1”的一欄顯示的是下限，標(biāo)“2”的一欄顯示的是優(yōu)選范圍，標(biāo)“3”的一欄顯示的是更為優(yōu)選的范圍“宿主”一欄中，“Sc”表示啤酒糖酵母，“Ec”表示大腸桿菌“fps”表示嗜熱脂肪芽胞桿菌FPS基因“fpsm”表示嗜熱脂肪芽胞桿菌FPSm(Y81M)基因“idi”表示大腸桿菌IPP異構(gòu)酸基因。/質(zhì)粒為p3-47-13“ispAm”表示大腸桿菌ispAm(Y79M)基因。/質(zhì)粒為pALispA16m
(i)當(dāng)質(zhì)粒pRS445GG被導(dǎo)入宿主A451或YPH499菌株時(shí)，GGOH產(chǎn)量增加(大約平均為0.4mg/L)，該質(zhì)粒是通過(guò)將GGPP合酶基因BTS1整合到pRS445GAP而得到的。
(ii)當(dāng)通過(guò)將一個(gè)由GGPP合酶基因BTS1和FPP合酶基因ERG20組成的融合基因整合到質(zhì)粒pRS435GAP或pRS445GAP而制備質(zhì)粒pRS435FGG、pRS445FGG、pRS435GGF、pRS445GGF并將其導(dǎo)入宿主A451或YPH499菌株時(shí)；或當(dāng)制備含有編碼連接到上述融合基因一個(gè)末端的HDEL序列的核苷酸序列的質(zhì)粒(即含有一個(gè)修飾基因的質(zhì)粒，它使得HDEL序列被添加到通過(guò)融合基因表達(dá)產(chǎn)生的多肽的C-端)pRS435FGGHDEL、pRS445FGGHDEL或pRS435GGHDEL并將其導(dǎo)入A451或YPH499菌株時(shí)，具有ERG20-BTS1融合基因的菌株，能平均產(chǎn)出0.2mg/L的GGOH；具有BTS1-ERG20融合基因的菌株，能平均產(chǎn)出0.39mg/L的GGOH；具有BTS1-ERG20-HDEL融合基因的菌株，能平均產(chǎn)出0.62mg/L的GGOH。
(iii)當(dāng)將質(zhì)粒pRS434GAP-HMG1(整合了HMG輔酶A還原酶基因HMG1的pRS434GAP)和含有上述融合基因的質(zhì)粒pRS435GGF導(dǎo)入宿主YPH499，且共表達(dá)時(shí)，該重組體平均產(chǎn)出1.55mg/L GGOH。當(dāng)在YMO培養(yǎng)基(補(bǔ)充有大豆油等物質(zhì)的YM培養(yǎng)基)中30℃培養(yǎng)該重組體7天，可產(chǎn)出5.61mg/L的GGOH。
(iv)當(dāng)pRS435GGFHDEL和pRS434GAP-HMG1都被導(dǎo)入宿主YPH499中，并共表達(dá)，該重組體平均產(chǎn)出1.50mg/L的GGOH。當(dāng)在YMO培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)該重組體7天，可產(chǎn)出5.64mg/L的GGOH。
(v)當(dāng)pRS435GGF和pRS434GAP-HMG1都被導(dǎo)入宿主YPH499中，并在發(fā)酵罐中培養(yǎng)得到的重組體109小時(shí)，可產(chǎn)出128mg/L的GGOH。
(vi)當(dāng)HMG輔酶A還原酶基因和GGF融合基因被共表達(dá)時(shí)，大多數(shù)重組克隆產(chǎn)出100mg/L或更多的GGOH，最多可產(chǎn)出189mg/L的GGOH。
(vii)當(dāng)補(bǔ)料-分批培養(yǎng)pRS435GGF/YH3克隆時(shí)，該克隆是通過(guò)將一種共表達(dá)HMG輔酶A還原酶基因和GGF融合基因的克隆轉(zhuǎn)化到一種原養(yǎng)型微生物中，并隨后二倍化而獲得的，培養(yǎng)開始20小時(shí)后采用500g/L的葡萄糖溶液作為補(bǔ)料液，該克隆產(chǎn)生0.47g/L的GGOH；采用400g/L乙醇溶液作為補(bǔ)料液時(shí)，該克隆產(chǎn)生1.16g/L的GGOH。
(viii)當(dāng)補(bǔ)料-分批培養(yǎng)pRS435GGF/YH3克隆時(shí)，下列條件下，該克隆能夠產(chǎn)生2.5g/L的GGOH培養(yǎng)開始21小時(shí)后乙醇占補(bǔ)料液中總碳源比例為71％，且補(bǔ)料液中添加有乙酸銨。
附圖簡(jiǎn)述圖1為一幅顯示甲羥戊酸途徑相關(guān)酶代謝途徑的圖表。
圖2A為一個(gè)顯示一種替代突變模式的表框。
圖2B為一幅缺失型HMG1基因的構(gòu)建示意圖。
圖3為一幅顯示質(zhì)粒pRS414的示意圖。
圖4為一幅顯示質(zhì)粒pYES2的示意圖。
圖5顯示ADH1啟動(dòng)子和終止子的序列。
圖6A為一幅顯示質(zhì)粒pRS414PTadh的示意圖。
圖6B為一幅顯示質(zhì)粒pRS414TPadh的示意圖。
圖7A為一幅顯示質(zhì)粒pRS434GAP的示意圖。
圖7B為一幅顯示質(zhì)粒pRS434TEF的示意圖。
圖7C為一幅顯示質(zhì)粒pRS435GAP的示意圖。
圖7D為一幅顯示質(zhì)粒pRS444GAP的示意圖。
圖7E為一幅顯示質(zhì)粒pRS444TEF的示意圖。
圖7F為一幅顯示質(zhì)粒pRS445GAP的示意圖。
圖8為一幅顯示每種插入pT7載體的甲羥戊酸途徑相關(guān)酶的方向示意圖。
圖9為一幅質(zhì)粒Palhmg106的物理圖譜。
圖10為一幅顯示在ORF182片段上的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)的示意圖。
圖11為一幅顯示用于嗜熱脂肪芽孢桿菌FPP合酶突變基因(Y81M)的表達(dá)載體的示意圖。
圖12呈出顯示DNA印跡雜交結(jié)果的照片。
圖13呈出顯示PCR圖譜結(jié)果的照片。
圖14呈出顯示RNA印跡結(jié)果的照片。
圖15A呈出顯示異戊二烯基二磷酸合酶在粗酶溶液中的比活性曲線圖。
圖15B呈出顯示異戊二烯基二磷酸合酶在粗酶溶液中的比活性曲線圖。
圖16為一幅顯示通過(guò)將連接有一個(gè)組成型啟動(dòng)子的HMG1基因?qū)階451，從而獲得的重組體的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖17為一幅顯示以A451或AURGG101(均保留有含GAL1p-HMG1的YEp表達(dá)載體)為宿主獲得的每種重組體的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖18為一幅顯示通過(guò)將質(zhì)粒pYES2-HMG導(dǎo)入AURGG102或AURGG703，從而獲得的每種重組體的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖19為一幅顯示當(dāng)將一個(gè)缺失型HMG1’基因插入含GAL1p的pYES2載體時(shí)，每種重組體的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖20為一幅顯示當(dāng)將一個(gè)缺失型HMG1’基因插入含GAL1p的pYES2載體時(shí)，每種重組體的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖21為一幅顯示當(dāng)將一個(gè)缺失型HMG1’基因插入含GAL1p的pYES2載體時(shí)，每種重組體的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖22為一幅顯示當(dāng)將一個(gè)缺失型HMG1’基因插入含GAL1p的pYES2載體時(shí)，每種重組體的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖23為一幅顯示在含有IPP和DMAPP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)保留有p4M、p16M等的重組大腸桿菌時(shí)的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖24為一幅顯示用于構(gòu)建BTS1-ERG20融合基因的引物，及這些引物的位點(diǎn)和方向的示意圖。
圖25為一幅顯示將ERG20-BTS1融合基因?qū)階451衍生的克隆時(shí)GGOH產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果曲線圖。
圖26為一幅顯示將ERG20-BTS1融合基因?qū)隮PH499衍生的克隆時(shí)GGOH產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果曲線圖。
圖27為一幅顯示經(jīng)TEF2p-HMG1轉(zhuǎn)化的YPH499衍生的克隆中GGOH產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果曲線圖。
圖28為一幅顯示經(jīng)TDH3p-HMG1轉(zhuǎn)化的YPH499衍生的克隆中GGOH產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果曲線圖。
圖29A為一幅顯示在A451衍生的克隆中GGOH產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果曲線圖。
圖29B為一幅顯示在A451衍生的克隆中GGOH產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果曲線圖。
圖30A為一幅顯示在YPH499衍生的克隆中GGOH產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果曲線圖。
圖30B為一幅顯示在YPH499衍生的克隆中GGOH產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果曲線圖。
圖31A為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的A451菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)2天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖31B為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的A451菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)4天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖31C為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的A451菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)7天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖32A為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的AH1菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)2天的GGOH產(chǎn)率曲線圖。
圖32B為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的AH1菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)4天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖32C為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的AH1菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)7天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖33A為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的EUG5菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)2天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖33B為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的EUG5菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)4天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖33C為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的EUG5菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)7天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖34A為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的YPH499菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)2天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖34B為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的YPH499菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)4天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖34C為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的YPH499菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)7天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖35A為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的YH1菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)2天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖35B為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的YH1菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)4天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖35C為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的YH1菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)7天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖36A為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的EUG12菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)2天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖36B為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的EUG12菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)4天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖36C為一幅顯示經(jīng)pRS435GGF或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的EUG12菌株在有指出的糖組合物的條件下培養(yǎng)7天的GGOH產(chǎn)量的曲線圖。
圖37為一幅顯示在含有大豆油培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)pRS435GGF/YH1(pRS435GAP-HMG1/YPH499)克隆時(shí)的異戊二烯醇產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果曲線圖。
圖38為一幅顯示在含大豆油培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)15-2克隆時(shí)的異戊二烯醇產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果曲線圖。
圖39呈出顯示用于驗(yàn)證融合基因表達(dá)的RNA印跡雜交法檢測(cè)結(jié)果的照片。
圖40呈出顯示蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果的照片。
圖41A呈出顯示共表達(dá)HMG輔酶A還原酶基因和一個(gè)由GGPP合酶基因和FPP合酶基因組成的融合基因的克隆的GGOH產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果曲線圖。
圖41B呈出顯示在共表達(dá)HMG輔酶A還原酶基因和一個(gè)由GGPP合酶基因和FPP合酶基因組成的融合基因的克隆的GGOH產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果曲線圖。
圖41C呈出顯示在雙表達(dá)HMG輔酶A還原酶基因和一個(gè)由GGPP合酶基因和FPP合酶基因組成的融合基因的克隆的GGOH產(chǎn)量的檢測(cè)結(jié)果曲線圖。
圖42為一幅顯示一種補(bǔ)料液的流速條件的曲線圖。
發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案下文中，本發(fā)明將引用下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為明確的描述。不過(guò)，本發(fā)明的技術(shù)范圍不僅限于這些實(shí)例。
實(shí)施例包含下列內(nèi)容(1)表達(dá)載體，如pRS435GAP，是采用pRS載體(Stratagene)，pYES載體(Invitrogen)，啤酒糖酵母YPH499來(lái)源的基因組DNA等制備的。
(2)甲羥戊酸途徑相關(guān)酶基因的克隆克隆乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因、HMG輔酶A還原酶基因或其突變體、甲羥戊酸激酶基因、磷酸甲羥戊酸激酶基因、二磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因、異戊烯基二磷酸Δ異構(gòu)酶基因、法呢基二磷酸合酶基因或其替代突變體、及香葉基香葉基二磷酸合酶基因后，制備它們的表達(dá)載體。
(3)將含甲羥戊酸途徑相關(guān)酶基因的質(zhì)粒導(dǎo)入A451、YPH499等宿主。同樣，通過(guò)將A451或YPH499基因組DNA中的ERG9轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子替換為pYES2衍生的GAL1轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子，構(gòu)建突變菌株(EUG菌株)，并將之作為宿主，用于導(dǎo)入異戊二烯基二磷酸合酶基因。
(4)AURGG101是一種整合有AUR1-C基因的A451衍生菌株；AURGG102是一種含GAL1啟動(dòng)子、BTS1和CYC1終止子，且其AUR1基因座有AUR1-C基因的A451衍生的菌株，構(gòu)建這兩種菌株，作為宿主，用于導(dǎo)入基因。
(5)將異戊二烯基二磷酸合酶基因表達(dá)載體導(dǎo)入宿主，然后在YM7培養(yǎng)基(pH用NaOH調(diào)至7的YM培養(yǎng)基)、YMO培養(yǎng)基、IPP和含DMAPP培養(yǎng)基等培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)該宿主。將每種培養(yǎng)液進(jìn)行分離和提取，并定量測(cè)定其中的異戊二烯醇(特別是GGOH)。為大量獲得異戊二烯醇，在發(fā)酵罐中對(duì)已顯示良好結(jié)果的重組體進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)。此外，分析了當(dāng)重組體被更換為原養(yǎng)型微生物，并二倍體化后對(duì)GGOH產(chǎn)量的影響。同樣，分析了添加進(jìn)培養(yǎng)基中的化合物(如乙醇或氨氣)對(duì)GGOH產(chǎn)量的影響。
表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)(1)大腸桿菌-啤酒糖酵母穿梭載體質(zhì)粒pRS404、pRS404和pRS414(圖3)購(gòu)自Stratagene。質(zhì)粒pAUR123購(gòu)自Takara，質(zhì)粒pYES2(圖4)購(gòu)自Invitrogen(Carlsbad，CA)。
(2)基因組DNA采用購(gòu)自Takara的Dr.GenTLETM試劑盒(一種用于酵母的基因組DNA制備試劑盒)，并根據(jù)試劑盒所附說(shuō)明從啤酒糖酵母YPH499制備啤酒糖酵母基因組DNA。
按如下步驟從大腸桿菌JM109(Takara)制備大腸桿菌基因組DNA。簡(jiǎn)言之，在1.5ml 2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)JM109細(xì)胞，并通過(guò)離心收獲。將567μl TE(pH8.0)，3μl 20mg/ml蛋白酶K(BoehringerMannheim，Mannheim，Germany)和30μl 10％SDS加入這些細(xì)胞中。將得到的混合物37℃保溫1小時(shí)后，加入100μl 5M NaCl，使之混合。再加入80μl CTAB/NaCl溶液(10％CTAB，0.7MNaCl)，65℃加熱得到的混合物10分鐘。用700μl氯仿/異戊醇(24∶1)抽提該混合物，進(jìn)一步用600μl苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提水相。抽提后，將0.6體積的異丙醇添加到水相，而后離心水相。用70％乙醇洗滌沉淀，干燥，繼而將之溶解于100μl TE(pH8.0)中，獲得大腸桿菌基因組DNA溶液。測(cè)定DNA的OD260值，并定量測(cè)定DNA。然后，將TE加入溶液中，獲得一種1μg/μL濃度的DNA。
采用Wizard PureFection質(zhì)粒DNA純化系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)制備大腸桿菌質(zhì)粒DNA。
(3)ADH1p-ADH1t片段插入到pRS414用Nael和PvuII消化pRS414質(zhì)粒(圖3)，從而獲得一個(gè)長(zhǎng)度為4.1kbp的無(wú)flori和LacZ部分的片段。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化該片段。分別用BamHI消化、Klenow酶鈍端化質(zhì)粒pAUR123。然后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化一個(gè)長(zhǎng)度為1.0kbp、含ADH1轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(ADH1p)和ADH1轉(zhuǎn)錄終止子(ADH1t)(圖5；SEQ ID NO23)的片段。來(lái)源于pRS414的長(zhǎng)度為4.1kbp的片段仍保留了大腸桿菌和酵母的復(fù)制起點(diǎn)，用于大腸桿菌的轉(zhuǎn)化標(biāo)記Ampγ，和用于酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記TRP1。另一方面，來(lái)源于pAUR123的長(zhǎng)度為1.0kbp的片段含ADH1p、ADH1t和一個(gè)位于它們中間的克隆位點(diǎn)。通過(guò)DNA連接試劑盒(Takara)將這兩個(gè)片段彼此連接，并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌SURE2超感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene，La Jolla，CA)。
從得到的重組體中制備質(zhì)粒DNA。用SalI和ScaI得到的DNA圖譜顯示出ADH1p-ADHt片段以兩個(gè)方向被插入pRS414中，從而產(chǎn)生出兩種質(zhì)粒pRS414PTadh(圖6A)和pRS414TPadh(圖6B)。
(4)CYC1t片段插入到pRS載體由PCR制備CYC1t(CYC1轉(zhuǎn)錄終止子)片段。以下列各種寡聚DNA、Xhol-Tcyc1FW和ApaI-Tcyc1RV為PCR引物。模板采用pYES2。
XhoI-Tcyc1FW5′-TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG-3′(SEQID NO40)ApaI-Tcyc1RV5′-CAT TAG GGC CCG GCC GCA AAT TAA AGC CTT CG-3′(SEQ ID NO41)簡(jiǎn)言之，制備50μl的反應(yīng)溶液，該溶液含0.1μg pYES2、50pmol每種引物DNA、含MgSO4的1x Pfu緩沖液(Promega，Madison，WI)、10nmol dNTPs、1.5單位的PfuDNA聚合酶(Promega)和1μl完全匹配聚合酶增強(qiáng)子(Stratagene)。反應(yīng)條件如下95℃第一次變性2分鐘；95℃變性45秒，共30次循環(huán)，60℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；和72℃最終延伸5分鐘。反應(yīng)完成后，于4℃儲(chǔ)存該溶液。用XhoI和ApaI消化擴(kuò)增DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化得到的260bpDNA片段，從而獲得CYC1t-XA。
將CyC1t-XA插入到pRS404和pRS406的XhoI-ApaI位點(diǎn)，從而分別獲得pRS404Tcyc和pRS406Tcyc。
(5)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的制備以pAUR123或酵母基因組DNA為模板，通過(guò)PCR制備含轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的DNA片段?？刹捎玫囊顳NA如下SacI-Ptdh3FW5′-CAC GGA GCT CCA GTT CGA GTT TAT CAT TAT CAA-3′(SEQ ID NO42)SacII-Ptdh3RV5′-CTC TCC GCG GTT TGT TTG TTT ATG TGT GTT TAT TC-3′(SEQ ID NO43)SacI-Ptef2FW5′-CCG CGA GCT CTT ACC CAT AAG GTT GTT TGT GAC G-3′(SEQ ID NO44)SacII-Ptef2RV5′-CTT TCC GCG GGT TTA GTT AAT TAT AGT TCG TTGACC-3′(SEQ ID NO45)就擴(kuò)增ADH1轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(ADH1p)而言，以SacI-Padh1FW和SacII-Padh1RV為PCR引物，以pAUR123為模板。就擴(kuò)增TDH3(GAP)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(TDH3p(GAPp))而言，以SacI-Ptdh3FW和SacII-Ptdh3RV為PCR引物；就擴(kuò)增TEF2轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(TEF2p)而言，以SacI-Ptef2FW和SacII-Ptef2RV為PCR引物。對(duì)這些啟動(dòng)子而言，以酵母基因組DNA為模板。制備100μl反應(yīng)溶液，含0.1μg pAUR123或0.46μg酵母基因組DNA、100pmol每種引物DNA、1x ExTaq緩沖液(Takara)、20nmoldNTPs、0.5U的ExTaqDNA聚合酶(Takara)和1μl完全匹配聚合酶增強(qiáng)子(Stratagene)。反應(yīng)條件如下95℃第一次變性2分鐘；95℃變性45秒，共30次循環(huán)，60℃1分鐘，72℃延伸2分鐘，72℃延伸4分鐘。反應(yīng)完成后，于4℃儲(chǔ)存該溶液。用SacI和SacII消化擴(kuò)增的4種類型DNA，且經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化分離出得到的620bp、680bp、710bp和400bpDNA片段，從而分別獲得TDH3p和TEF2p。
(6)2μDNA復(fù)制起點(diǎn)區(qū)域的制備用SspI和NheI消化一種YEp載體，pYES2。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化得到的長(zhǎng)度為1.5kbp、含2μDNA復(fù)制起點(diǎn)(2μori)的片段，然后將其鈍端化。該DNA片段被命名為2μOriSN。
(7)YEp型表達(dá)載體的制備將2μOriSN插入pRS404Tcyc和pRS406Tcyc的NaeI位點(diǎn)，該位點(diǎn)事先經(jīng)過(guò)BAP(細(xì)菌堿性磷酸酯酶Takara)的預(yù)處理。將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌SURE2后，制備質(zhì)粒DNA。用DraIII、和EcoRI、HapI或PstI、和PvuII消化質(zhì)粒DNA；繼而經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)2μori的插入情況及方向。將2μori分別插入pRS404Tcyc和pRS405Tcyc，插入的方向與2μori插入pYES2的方向相同，獲得的質(zhì)粒被分別命名為pRS434Tcyc2μOri和pRS435Tcyc2μOri。將2μori插入pRS404Tcyc和pRS405Tcyc，插入的方向與2μori插入pYES2的方向相反，獲得的相應(yīng)質(zhì)粒被分別命名為pRS444Tcyc2μOri和pRS445Tcyc2μOri。
將含ADH1p、TDH3p(GAPp)、PGK1p或TEF2p片段的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子插入到上述四種質(zhì)粒，即pRS434Tcyc2μOri、pRS435Tcyc2μOri、pRS444Tcyc2μOri、pRS445Tcyc2μOri的SacI-SacII位點(diǎn)，克隆DNA。獲得下列四種質(zhì)粒(i)從pRS445Tcyc2μOri獲得pRS434GAP和pRS434TEF；(ii)從pRS435Tcyc2μOri獲得pRS435GAP；(iii)從pRS444Tcyc2μOri獲得pRS444GAP和pRS444TEF；(iv)從pRS445Tcyc2μOri獲得pRS445GAP(圖7A-7F)。
本發(fā)明制備的表達(dá)載體總結(jié)于下表5中。
表5

*出現(xiàn)在標(biāo)記和基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄單位后的“+”和“-”標(biāo)記分別表示下游方向和上游方向。出現(xiàn)在ori之后的“+”標(biāo)記表示ori被插入的方向與其插入pRS(用于YCp載體)或pYES(用于YEp載體)的方向相同；出現(xiàn)在ori之后的“-”標(biāo)記表示ori被插入的方向與其插入pRS(用于YCp載體)或pYES(用于YEp載體)的方向相反。
(8)YEp型表達(dá)載體在酵母中的導(dǎo)入為了檢查已制備的YEp型表達(dá)載體的DNA復(fù)制區(qū)域是否發(fā)揮作用，采用Frozen-EZ酵母轉(zhuǎn)化II(Zymo Research，Orange，CA)將大約40ng的每種YEp型表達(dá)載體導(dǎo)入YPH499菌株。(步驟遵照試劑盒所附說(shuō)明)。然后，檢測(cè)30℃下、在SD-W(DOB+CMS(-Trp)；BI0101，Vista，CA)瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落。其結(jié)果如下表6所示表6

表6中的結(jié)果顯示本發(fā)明制備的各種YEp型載體通常作為載體被保留。
實(shí)施例2甲羥戊酸途徑相關(guān)酶基因的克隆采用一種購(gòu)自Clontech(Palo Alto，CA)的啤酒糖酵母DBY746來(lái)源的cDNA庫(kù)“Quick-Clone cDNA″對(duì)源自酵母cDNA的基因進(jìn)行克隆。
(1)法呢基二磷酸合酶基因的克隆(1-1)啤酒糖酵母來(lái)源的FPP合酶基因ERG20以上述cDNA為模板，PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增一個(gè)編碼啤酒糖酵母FPP合酶基因ERG20(SEQ ID NO1)、長(zhǎng)度大約為0.9kbp的DNA片段。采用的PCR引物如下引物1(SCFPS1)5’-ATG GCT TCA GAA AAA GAA ATT AG-3’(SEQ ID NO46)引物2(SCFPS2)5’-CTA TTT GCT TCT CTT GTA AAC TT-3’(SEQ ID NO47)10x Ex Taq緩沖液(Takara) 5μl2.5mM dNTP混合物 4μl5U/μl Ex Taq(Takara)1μl10pmol 引物110pmol 引物20.5ngcDNA共計(jì)50μl在上述反應(yīng)溶液中進(jìn)行PCR反應(yīng)，即30個(gè)循環(huán)過(guò)程，每個(gè)循環(huán)包括94℃45秒，55℃1分鐘和72℃2分鐘。
如無(wú)其它說(shuō)明，以下實(shí)施例的PCR反應(yīng)條件均與上述條件相同。
經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化擴(kuò)增后的片段，然后通過(guò)T/A連接將其克隆到pT7Blue-T(Novagen，Madison，WI)。發(fā)現(xiàn)ERG20被插入pT7Blue-T的方向與lacZ在該質(zhì)粒上的方向相同(圖8)。檢測(cè)克隆后片段的核苷酸序列，并將其同記錄于SGD(酵母基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，http//genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/)中相應(yīng)的核苷酸序列比較。結(jié)果沒(méi)有在1-300和610-1059的核苷酸位置上發(fā)現(xiàn)PCR錯(cuò)誤。
制備的質(zhì)粒DNA被命名為pT7ERG20。
(1-2)大腸桿菌來(lái)源的FPP合酶基因ispA以大腸桿菌基因組DNA為模板、以下列合成寡聚DNA為引物，PCR克隆大腸桿菌來(lái)源的FPP合酶基因ispA(SEQ ID NO3)。
ISPA15′-TGA GGC ATG CAA TTT CCG CAG CAA CTC G-3′(SEQ ID NO48)ISPA25′-TC AGA ATT CAT CAG GGG CCT ATT AAT AC-3′(SEQ ID NO49)在100μl反應(yīng)溶液中進(jìn)行PCR反應(yīng)，該反應(yīng)溶液含有1x EXTaq緩沖液、0.5mM dNTPs、100pmol ISPA1、100pmol ISPA2、0.2μg大腸桿菌基因組DNA和5單位ExTaq，反應(yīng)經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)過(guò)程，每個(gè)循環(huán)包括94℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃1.5分鐘。PCR產(chǎn)物由EcoRI和SphI消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，得到一個(gè)長(zhǎng)度為1.0kbp的DNA片段。將該片段插入pALTER-Ex2(Promega)的EcoRI-SphI位點(diǎn)后，再將其導(dǎo)入大腸桿菌JM109，用于克隆基因。結(jié)果獲得質(zhì)粒pALispA4、pALispA8、pALispA15、pALispA16、pALispA18；采用限制性內(nèi)切酶EcoRI、SphI、NdeI、SmaI和BamHI得到的圖譜證實(shí)ispA基因被正確地導(dǎo)入這些質(zhì)粒中。
(1-3)嗜熱脂肪芽孢桿菌來(lái)源的FPP合酶基因用NotI和SmaI消化公開于日本未審查專利公開No.5-219961中的pFE15，經(jīng)純化，得到含一個(gè)長(zhǎng)度為2.9kbp轉(zhuǎn)錄單位的FPP合酶基因片段。將該基因片段插入到pACYC177(Nippon Gene)的ScaI位點(diǎn)，從而制備出一個(gè)含有嗜熱脂肪芽孢桿菌來(lái)源的FPP合酶基因fps(SEQ ID NO25)的表達(dá)載體。
(2)香葉基香葉基二磷酸合酶基因的克隆啤酒糖酵母來(lái)源的GGPP合酶基因BTS1(SEQ ID NO5)克隆方法如下文。
簡(jiǎn)言之，即基于記錄在GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html/)(A.N.U31632)(Y.Jiang，et al.，J.Biol.Chem.270(37)，21793-21799(1995))中關(guān)于啤酒糖酵母來(lái)源的GGPP合酶基因的資料，構(gòu)建一對(duì)引物，該引物與基因編碼的蛋白質(zhì)的N-末端和C-末端匹配。以這些引物和一個(gè)酵母cDNA庫(kù)(Clontech；No.CL7220-1)為模板，進(jìn)行PCR。
N-末端引物5’-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG CT-3’(SEQ ID NO50)C-末端引物5，-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC TA-3’(SEQ ID NO51)采用完全匹配聚合酶增強(qiáng)子(Stratagene)進(jìn)行PCR，需進(jìn)行30個(gè)循環(huán)過(guò)程，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性45秒、55℃退火1分鐘、和72℃延伸2分鐘。
感興趣的片段(長(zhǎng)度大約為1.0kbp)已經(jīng)得到證實(shí)。將該BTS1片段克隆到可TA克隆的pT7Blue T載體中，然后對(duì)BTS1的全部區(qū)域進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示該基因的核苷酸序列與記錄于GenBank(SEQ IDNO5)中相應(yīng)的核苷酸序列完全相同。這就證實(shí)該基因是啤酒糖酵母來(lái)源的GGPP合酶基因。
(3)乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的克隆采用ExTaq DNA聚合酶，PCR擴(kuò)增一個(gè)長(zhǎng)度大約為1.2kbp的基因組DNA片段，該片段編碼啤酒糖酵母乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶基因ERG10(SEQ ID NO26)。將得到的片段克隆到pRS435GAP和pRS445GAP的SacII-XbaI位點(diǎn)。采用的PCR引物如下引物1(SacII-ERG10)5’-TCCCCG CGGATG TCT CAG AAC GTTTAC ATT GT-3’(SEQ ID NO52)引物2(XbaI-ERG10)5’-TGCTCT AGATCA TAT CTT TTC AAT GACAAT GGA-3’(SEQ ID NO53)(下劃線部分表示限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。)
在完全匹配聚合酶增強(qiáng)子的共存在下進(jìn)行PCR操作，需經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)過(guò)程，每個(gè)循環(huán)包括95℃45秒、60℃1分鐘、和72℃2分鐘。由SmaI、ScaI、NcoI和BamHI識(shí)別位點(diǎn)圖譜檢驗(yàn)得到的質(zhì)粒是否與設(shè)計(jì)的一致。成功制備的質(zhì)粒被分別命名為pRS435GAP-ERG10和pRS445GAP-ERG10。
(4)HMG輔酶A合酶基因的克隆以cDNA為模板，采用PCR擴(kuò)增一個(gè)長(zhǎng)度大約為1.5kbp的片段，該片段編碼啤酒糖酵母HMG輔酶A合酶基因HMGS(SEQ ID NO27)。退火溫度采用50℃。采用的PCR引物如下引物1(HMGS-1-2)5’-ATG AAA CTC TCA ACT AAA CTT TGT T-3’(SEQ ID NO54)引物2(scHMGS-15)5’-GTT CAG CAA GAT GCA ATC GAT GGG G-3’(SEQ ID NO55)用瓊脂糖凝膠電泳純化PCR片段，再經(jīng)T/A連接將其克隆到pT7Blue-T。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGS被插入pT7Blue的方向與lacZ在該質(zhì)粒上的方向相反(圖8)。檢測(cè)該克隆片段的核苷酸序列。與SGD中相應(yīng)的核苷酸序列比較的結(jié)果顯示由于PCR錯(cuò)誤，39位上的核苷酸A(以起始密碼子ATG的第一個(gè)核苷酸A為第1位)被改變?yōu)镚(A39G；下文中的PCR錯(cuò)誤以相同方式表達(dá))。
此外，也發(fā)現(xiàn)了另外5個(gè)錯(cuò)誤T144C、T223C、T1038C、C1122T和A1370G。在這些PCR錯(cuò)誤中，T223C和A1370G引起編碼氨基酸的改變。T223C將75位的Ser改變?yōu)镻ro(S75P；下文中，氨基酸序列錯(cuò)誤以相同方式表示)，A1370G引起另一個(gè)氨基酸序列錯(cuò)誤K457R。
得到的質(zhì)粒被命名為pT7HMGS。
(5)HMG輔酶A還原酶基因的克隆克隆啤酒糖酵母來(lái)源的HMG輔酶A還原酶基因HMG1的方法描述如下。
簡(jiǎn)言之，即基于記錄在GenBank關(guān)于啤酒糖酵母來(lái)源的HMG輔酶A還原酶基因HMG1(A.N.M22002)(M.E.Basson，et al.，Mol.Cell.Biol.8，3797-3808(1988)SEQ ID NO7)的資料，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，該引物匹配了由該基因編碼蛋白質(zhì)的N-末端和C-末端。以這兩種引物和酵母cDNA庫(kù)(Clontech)為模板，進(jìn)行PCR。
N-末端引物5’-ATG CCG CCG CTA TTC AAG GGA CT-3’(SEQ ID NO56)C-末端引物5’-TTA GGA TTT AAT GCA GGT GAC GG-3’(SEQ ID NO57)采用完全匹配聚合酶增強(qiáng)子進(jìn)行PCR，需進(jìn)行30個(gè)循環(huán)過(guò)程，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性45秒、55℃退火1分鐘、和72℃延伸2分鐘。
感興趣的片段(長(zhǎng)度大約為3.2kbp)已經(jīng)得到證實(shí)。將該片段(HMG1)克隆到可TA克隆的pT7BlueT載體中，從而獲得pT7-HMG1。檢測(cè)該克隆HMG1的核苷酸序列。結(jié)果顯示獲得了如SEQ ID NO9所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。由于PCR錯(cuò)誤，檢測(cè)得到的核苷酸序列與記錄于GenBank中相應(yīng)的核苷酸序列有部分不同(圖2A)。這個(gè)包含PCR錯(cuò)誤的突變型HMG輔酶A還原酶基因被命名為HMG1’。
(6)HMG輔酶A還原酶基因PCR錯(cuò)誤的糾正通過(guò)來(lái)自pT7HMG1的HMG1片段的亞克隆糾正PCR錯(cuò)誤，而在HMG1區(qū)域糾正這些錯(cuò)誤會(huì)引起氨基酸替代突變。
簡(jiǎn)言之，即從含有HMG1’，HMG輔酶A還原酶基因HMG1的PCR錯(cuò)誤型DNA的質(zhì)粒pT7HMG1亞克隆一個(gè)HMG1’基因片段。然后，通過(guò)定點(diǎn)誘變糾正在HMG1區(qū)域的PCR錯(cuò)誤所引起的氨基酸替代突變，從而得到pALHMG106。該制備的具體方法描述如下。
pT7HMG1質(zhì)粒被用做克隆的HMG1。就用于導(dǎo)入定點(diǎn)突變的載體而言，可采用購(gòu)買的pALTER-1(Promega)。
根據(jù)Promega出版的“Protocols and Application Guide，3rdedition，1996 Promega，ISBN1-882274-57-1”中描述的步驟進(jìn)行定點(diǎn)誘變。就用于導(dǎo)入突變的寡聚核苷酸而言，可采用下列三種化學(xué)合成的寡聚核苷酸。
HMG1(190-216)5′-CCAAATAAAGACTCCAACACTCTATTT-3′(SEQ ID NO58)HMG1(1807-1833)5′-GAATTAGAAGCATTATTAAGTAGTGGA-3′(SEQ ID NO59)HMG1(2713-2739)5′-GGATTTAACGCACATGCAGCTAATTTA-3′(SEQ ID NO60)首先，用SmaI、ApaLI、SalI消化pT7HMG1，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，得到一個(gè)長(zhǎng)度為3.2kbp的HMG1片段。將該片段插入到pALTER-1的SmaI-SalI位點(diǎn)，從而制備了pALHMG1。經(jīng)堿變性處理該質(zhì)粒后，將上述用于導(dǎo)入突變的寡聚核苷酸、Amp修復(fù)寡聚核苷酸(Promega)作為修復(fù)寡聚核苷酸、和Tet剔除寡聚核苷酸(Promega)作為剔除寡聚核苷酸進(jìn)行退火。將得到的質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌ES1301(Promega)。然后，將保留有已導(dǎo)入定點(diǎn)突變的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體采用125μg/ml的氨芐青霉素進(jìn)行富集培養(yǎng)，繼而制備質(zhì)粒DNA。由具有如下序列的引物檢測(cè)得到的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列。結(jié)果顯示所有對(duì)應(yīng)于HMG1(190-216)、HMG1(1807-1833)和HMG1(2713-2739)的序列已被糾正為指定序列(SEQ ID NO11)。由已糾正核苷酸序列(SEQID NO12)編碼的氨基酸序列與由HMG1’(SEQ ID NO10)(沉默突變體)編碼的氨基酸序列相一致。
HMG1(558-532)5′-GTCTGCTTGGGTTACATTTTCTGAAAA-3′(SEQ ID NO61)HMG1(1573-1599)5′-CATACCAGTTATACTGCAGACCAATTG-3′(SEQ ID NO62)HMG1(2458-2484)5′-GAATACTCATTAAAGCAAATGGTAGAA-3′(SEQ ID NO63)已糾正HMG1區(qū)域內(nèi)序列的質(zhì)粒被命名為pALHMG106(圖9)。
(7)甲羥戊酸激酶基因的克隆以cDNA為模板，采用PCR擴(kuò)增一個(gè)長(zhǎng)度大約為1.3kbp的片段，該片段編碼啤酒糖酵母甲羥戊酸激酶基因ERG12(SEQ ID NO28)。采用的PCR引物如下所示。
引物1(ATM-1)5’-AAC TGC AGA TGT CAT TAC CGT TCT TAA CTTC-3’(SEQ ID NO64)引物2(ATM-2)5’-CCG AGC TCT TAT GAA GTC CAT GGT AAA TTCG-3’(SEQ ID NO65)(下劃線部分表示限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。)用PstI和SacI消化得到的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后，將其克隆到pT7Blue的PstI-SacI位點(diǎn)。通過(guò)這些步驟，ERG12插入pT7Blue的方向與lacZ在該質(zhì)粒的方向相反(圖8)。將克隆片段的核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定，并與記錄在SGD中的相應(yīng)的序列相對(duì)照。結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PCR錯(cuò)誤。
得到的質(zhì)粒DNA被命名為pT7ERG12。
(8)磷酸甲羥戊酸激酶基因的克隆以cDNA為模板，采用PCR擴(kuò)增一個(gè)長(zhǎng)度大約為1.3kbp的片段，該片段編碼啤酒糖酵母ERG8(SEQ ID NO29)。采用的PCR引物如下所示。
引物1(YSCE-1)5’-AAC TGC AGA TGT CAT TAC CGT TCT TAACTT C-3’(SEQ ID NO66)引物2(YSCE-2)5’-CCG AGC TCT TAT GAA GTC CAT GGT AAATTC G-3’(SEQ ID NO67)瓊脂糖凝膠電泳純化PCR擴(kuò)增片段后，通過(guò)T/A連接將其克隆到pT7Blue-T中。經(jīng)過(guò)這些步驟，ERG8插入pT7Blue-T中的方向與lacZ在該質(zhì)粒中的方向相反(圖8)。檢測(cè)克隆片段的核苷酸序列，并與記錄于SGD中的相應(yīng)序列相對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)下面的PGR錯(cuò)誤A70C、A72G、G146A、C171G、G224C、A306G、T387C、G574T、C637G、G638C、G729A、G739A、T759A、A879G和A1222G。在這些錯(cuò)誤中，A70C和A72G引起T24P的一個(gè)氨基酸錯(cuò)誤；G146A引起G49E的一個(gè)氨基酸錯(cuò)誤；G224C引起S75T的一個(gè)氨基酸錯(cuò)誤；G574T引起A192S的一個(gè)氨基酸錯(cuò)誤；C637G和G638C引起R213A的一個(gè)氨基酸錯(cuò)誤；G739A引起D247N的一個(gè)氨基酸錯(cuò)誤；A1222G引起T408A的一個(gè)氨基酸錯(cuò)誤。
得到的質(zhì)粒DNA被命名為pT7ERG8。
(9)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因的克隆以cDNA為模板，采用PCR擴(kuò)增一個(gè)長(zhǎng)度大約為1.2kbp的片段，該片段編碼啤酒糖酵母二磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因ERG19(MVD1)(SEQID NO30)。采用的PCR引物如下所示。
引物1(SCU-1)5’-AAC TGC AGA TGA CCG TTT ACA GAG CAT CCGT-3’(SEQ ID NO68)引物2(SCU-2)5’-CGG AAT TCT TAT TCC TTT GGT AGA CCA GTCT-3’(SEQ ID NO69)(下劃線表示限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn))用PstI和EcoRI消化擴(kuò)增片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后，將其克隆到pT7Blue的PstI-EcoRI位點(diǎn)。通過(guò)這些步驟，ERG19(MVD1)插入pT7Blue的方向與lacZ在該質(zhì)粒中的方向相反(圖8)。將克隆片段的核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定，并與記錄在SGD中的相應(yīng)的序列對(duì)照。結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PCR錯(cuò)誤。
得到的質(zhì)粒DNA被命名為pT7ERG19。
(10)異戊烯基二磷酸Δ異構(gòu)酶基因的克隆(10-1)啤酒糖酵母來(lái)源的IPPΔ異構(gòu)酶基因IDII以cDNA為模板，采用PCR擴(kuò)增一個(gè)長(zhǎng)度大約為0.9kbp的片段，該片段編碼啤酒糖酵母IDII基因(SEQ ID NO31)。采用的PCR引物為引物1(SCIPP-1)和引物2(SCIPP-2)。
引物1(SCIPP-1)5’-ATG ACT GCC GAC AAC AAT AGT AT-3’(SEQ ID NO70)引物2(SCIPP-2)5’-TTA TAG CAT TCT ATG AAT TTG CC-3’(SEQ ID NO71)瓊脂糖凝膠電泳純化PCR擴(kuò)增片段后，通過(guò)T/A連接將其克隆到pT7Blue-T。經(jīng)過(guò)這些步驟，IDII插入pT7Blue-T的方向與lacZ在該質(zhì)粒中的方向相反(圖8)。將克隆片段的核苷酸序列進(jìn)行測(cè)定，并與記錄在SGD中的相應(yīng)的序列相對(duì)照。結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PCR錯(cuò)誤。
得到的質(zhì)粒DNA被命名為pT7IDII。
(10-2)大腸桿菌來(lái)源的IPPΔ異構(gòu)酶基因idi以質(zhì)粒p3-47-13(Hemmi et al.，(1998)J.Biochem.123，1088-1096)為模板，將含有大腸桿菌ORF182(預(yù)期可以編碼一個(gè)同源于IPPΔ異構(gòu)酶的多肽的開放讀碼框架；基因名稱idi)的基因組DNA克隆到該質(zhì)粒中，PCR擴(kuò)增一個(gè)長(zhǎng)度大約為0.55kbp的ORF182片段。在完全匹配聚合酶增強(qiáng)子的共存在下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)過(guò)程以完成PCR反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)包括95℃45秒、60℃1分鐘、和72℃2分鐘。采用的PCR引物如下所示。
引物1(SacII-ORF182(1-23))5’-TCCCCG CGGATG CAA ACGGAA CAC GTC ATT TT-3’(SEQ ID NO72)引物2(XbaI-ORF182(549-525))5’-TGC TCT AGA TTA TTTAAG CTG GGT AAA TGC AGA-3’(SEQ ID NO73)(下劃線部分表示限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn))用SpeI、DraIII和AluI消化PCR產(chǎn)物后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化。結(jié)果獲得如圖10所示的物理圖譜，該物理圖譜與EcoGene(http//bmb.med.miami.edu/EcoGene/EcoWeb/)的ORF182片段(idi)的核苷酸序列數(shù)據(jù)(SEQ ID NO32)一致。然后，用SacII和XbaI消化擴(kuò)增后得到的長(zhǎng)度為0.55kbp的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后，將其克隆到pRS435GAP和pRS445GAP的SacII-XbaI位點(diǎn)。得到的質(zhì)粒被分別命名為pRS435GAP-ORF182和pRS445GAP-ORF182。
大腸桿菌IPPΔ異構(gòu)酶基因(SEQ ID NO32)曾被稱為OPF182(根據(jù)NCBI BLAST檢索；GenBank Accession No.AE000372)，不過(guò)Hahn等人，(1999)J.Bacteriol.，1814499-4504命名這個(gè)基因?yàn)閕di。就被克隆進(jìn)idi的質(zhì)粒而言，本發(fā)明用到了在Hemmi等人，(1998)J.Biochem.1231088-1096中描述的p3-47-11和p3-47-13。
實(shí)施例3突變基因的克隆(1)大腸桿菌FPP合酶基因被轉(zhuǎn)化為GGPP合酶基因(FPP合酶基因突變體的克隆)采用實(shí)施例2(1-2)節(jié)中獲得的pALispA4、pALispA8、pALispA15、pALispA16和pALispA18，根據(jù)Promega出版的“Protocols and Applications Guide，3rdedition，1996 Promega，ISBN 1-882274-57-1”中描述的方法，通過(guò)替代突變修飾編碼多肽79位的氨基酸殘基Tyr的密碼子，該多肽由大腸桿菌ispA編碼。下列用于導(dǎo)入突變的寡聚核苷酸(有時(shí)為“突變寡聚核苷酸”)是通過(guò)化學(xué)合成法制備的。
ISPA-D5′-ATC ATG AAT TAA TGAGTCAGC GTG GAT GCA TTC AAC GGCGGC AGC-3′(SEQ ID NO74)ISPA-E5′-ATC ATG AAT TAA TGATTCAGC GTG GAT GCA TTC AAC GGCGGC AGC-3′(SEQ ID NO75)ISPA-M5′-ATC ATG AAT TAA TGACATAGC GTG GAT GCA TTC AAC GGCGGC AGC-3′(SEQ ID NO76)在上述突變寡聚核苷酸ISPA-M中，在16-18位的核苷酸(有下劃線的3個(gè)核苷酸)相當(dāng)于編碼野生型FPP合酶79位的氨基酸殘基Tyr的密碼子；設(shè)計(jì)這三個(gè)核苷酸以使該密碼子編碼Met。同樣，設(shè)計(jì)突變寡聚核苷酸ISPA-D和IDPA-E以使這個(gè)密碼子分別編碼Asp和Glu。設(shè)計(jì)在上述突變寡聚核苷酸中的26-31位上的核苷酸(下劃線的6個(gè)核苷酸)以使一個(gè)EcoT22I(NsiI)位點(diǎn)由于替代突變的原因而重新形成。帶有該位點(diǎn)的突變基因可輕易通過(guò)限制性內(nèi)切酶圖譜被辨別出。這些突變寡聚核苷酸經(jīng)由T4多核苷酸激酶(Promega)在其5’末端的磷酸化后，在使用前需通過(guò)Nick Column(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)的凝膠過(guò)濾，使其純化。在突變體的導(dǎo)入過(guò)程中，Cm修復(fù)寡聚核苷酸(Promega)被用作修復(fù)寡聚核苷酸，Tet剔除寡聚核苷酸(Promega)被用作剔除寡聚核苷酸。Cm修復(fù)寡聚核苷酸，Tet剔除寡聚核苷酸和突變寡聚核苷酸被退火到經(jīng)堿變性處理的pALispA16后，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌ES1301 mutS(Promega)。從生長(zhǎng)在有20μg/ml Cm(氨霉素)存在的環(huán)境中的大腸桿菌菌落制備質(zhì)粒DNA并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109。然后，從生長(zhǎng)在含有20μg/ml氯霉素的瓊脂平板上的菌落中制備出質(zhì)粒DNA。這些含有替代突變型ispA(稱為“ispAm”)的質(zhì)粒分別被命名為p4D、p4E和p4M，ispAm是通過(guò)以pALispA4為模板，以ISPA-D、ISPA-E或ISPA-M為突變寡聚核苷酸構(gòu)建的。同樣，通過(guò)以pALisp8為模板制備的那些質(zhì)粒分別被命名為p8D、p8E和p8M；通過(guò)以pALisp15為模板制備的那些質(zhì)粒分別被命名為p15D、p15E和p15M；通過(guò)以pALisp16為模板制備的那些質(zhì)粒分別被命名為p16D、p16E和p16M；通過(guò)以pALisp18為模板制備的那些質(zhì)粒分別被命名為p18D、p18E和p18M。
編碼Y79D突變型氨基酸序列(SEQ ID NO34)的基因如SEQ IDNO33所示；編碼Y79E突變型氨基酸序列(SEQ ID NO36)的基因如SEQ ID NO35所示；編碼T79M突變型氨基酸序列(SEQ ID NO38)的基因如SEQ ID NO37所示。這樣，獲得的質(zhì)粒就可被恰當(dāng)?shù)剡x擇和利用。
(2)嗜熱脂肪芽孢桿菌FPP合酶基因突變體的克隆從公開在Ohnuma et al.，(1996)J.Biol.Chem.，271，30748-30754中的pFPS(Y81M)制備出含嗜熱脂肪芽孢桿菌FPP合酶基因(fpsSEQ ID NO39)的一個(gè)替代突變體基因的表達(dá)載體。
pFPS是一種在pTV118N(Takara)的lac啟動(dòng)子下游整合了fps的質(zhì)粒，并且在IPTG存在的環(huán)境中，該質(zhì)?？稍诖竽c桿菌中表達(dá)嗜熱脂肪芽孢桿菌FPP合酶基因。首先，通過(guò)定點(diǎn)誘變將Y81M突變(即替代突變，該突變將被FPP合酶基因編碼的氨基酸序列的81位上的Tyr改變?yōu)镸et)導(dǎo)入FPP合酶基因[從而獲得pFPS(Y81M)]。Y81M突變體的導(dǎo)入使得被編碼在pEPS(Y81M)上的酶的反應(yīng)產(chǎn)物特異性被改變；在沒(méi)有降低編碼酶的比活性的情況下，F(xiàn)PP合酶基因被修飾成為一個(gè)GGPP合酶基因。隨后，由PshBI消化Pfps(Y81M)，并由Klenow酶對(duì)其進(jìn)行鈍端化。接著，純化含轉(zhuǎn)錄單位的一個(gè)長(zhǎng)度為2.7Kbp的片段，并將其插入到pACYC177中Amp’基因的HincII位點(diǎn)。以與Amp’基因相反的方向插入突變fps基因片段得到的質(zhì)粒被命名為pFPS21m；以與Amp’基因相反的方向插入突變fps基因片段的質(zhì)粒被命名為pFPS31m(圖11)。
(3)HMG輔酶A還原酶基因缺失突變體的克隆均含有一個(gè)組成型啟動(dòng)子ADH1p的載體pRS414PTadh和Prs414TPadh經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，插入HMG1，從而制備出質(zhì)粒pRS414PTadh-HMG1和PRS414TPadh-HMG1。
用BamHI、SalI和ScaI消化實(shí)施例2(5)中制備的pT7-HMG1，獲得有PCR錯(cuò)誤的HMG1’基因。將該基因?qū)氲絧YES2(Invitrogen，Carlsbad，CA)的BamHI-XhoI位點(diǎn)，從而獲得一個(gè)重組載體pYES-HMG1。該載體中的核苷酸序列經(jīng)證實(shí)是SEQ ID NO3的核苷酸序列。pYES是一個(gè)用于在酵母中表達(dá)的穿梭載體，該酵母有作為復(fù)制始點(diǎn)的酵母2μmDNA的ori和可被半乳糖誘導(dǎo)的GAL1啟動(dòng)子(圖4)。
為制備用于HMG輔酶A還原酶基因缺失突變體的表達(dá)載體，該缺失突變體有與HMG輔酶A還原酶跨膜區(qū)域相應(yīng)的區(qū)域缺失，以上文中制備的pYES-HMG1為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而產(chǎn)生缺失部分HMG1編碼區(qū)域的DNA片段(包括載體部分)。用Klenow酶使獲得片段鈍端化，通過(guò)自連接環(huán)化后，導(dǎo)入大腸桿菌JM109。然后制備質(zhì)粒DNA。用作引物的合成DNA序列及其組合如上表1中所示。
就獲得的每種質(zhì)粒DNA而言，373A DNA測(cè)序儀(Perkin Elmer，F(xiàn)oster City，CA)證實(shí)在HMG1的缺失區(qū)域上游與下游之間的氨基酸的讀碼框架上沒(méi)有發(fā)生偏移，在結(jié)合位點(diǎn)周圍也沒(méi)有因PCR錯(cuò)誤引起的氨基酸替代。這樣就獲得了在結(jié)合位點(diǎn)周圍沒(méi)有因PCR錯(cuò)誤引起的氨基酸替代，且在讀碼框架沒(méi)有任何偏移的情況下可以缺失一部分基因的下列質(zhì)粒。根據(jù)缺失模式將HMG1基因的缺失突變體表示為，如“Δ02y”(y代表任意工作數(shù)字)，包含有Δ02y的pYES2載體可表示為，如pYHMG026。(這一表示方式也適用于其它缺失突變體。)
HMG1Δ026SEQ ID NO13HMG1Δ044SEQ ID NO14HMG1Δ056SEQ ID NO15HMG1Δ062SEQ ID NO16HMG1Δ076SEQ ID NO17HMG1Δ081SEQ ID NO18HMG1Δ100SEQ ID NO19HMG1Δ112SEQ ID NO20HMG1Δ122SEQ ID NO21HMG1Δ133SEQ ID NO22質(zhì)粒pYHMG026，pYHMG027，pYHMG044，pYHMG045，pYHMG059，pYHMG062，pYHMG063，pYHMG065，pYHMG076，pYHMG081，pYHMG083，pYHMG085，pYHMG094，pYHMG100，pYHMG106，pYHMG107，pYHMG107，pYHMG109，pYHMG112，pYHMG122，pYHMG123，pYHMG125，pYHMG133和pYHMG134，實(shí)施例4基因亞克隆到載體中對(duì)具有一個(gè)組成型轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的大腸桿菌-啤酒糖酵母YEp穿梭載體而言，采用實(shí)施例1中制備的pRS載體。
(1)FPP合酶基因型的亞克隆(1-1)啤酒糖酵母來(lái)源的FPP合酶基因ERG20用XbaI和BamHI消化實(shí)施例2(1-1)節(jié)描述的pT7ERG20，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化獲得長(zhǎng)度為1.1kbp的ERG20基因片段。將該片段插入到pRS435GAP和pRS445GAP的XbaI-BamHI位點(diǎn)，從而分別獲得pRS435GAP-ERG20和pRS445GAP-ERG20。
(1-2)大腸桿菌來(lái)源的FPP合酶基因ispA用SphI和EcoRI消化實(shí)施例2(1-2)節(jié)描述的pALispA4，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化得到長(zhǎng)度為1.0kbp的ispA基因片段。將SphI-SacII接頭DNA(5’-pTTT CCG CGG AAA CAT G-3’；SEQ ID NO86)和EcoRI-Eco52I接頭DNA(5’-pAAT TGA CGG CCG TC-3’；SEQ IDNO87)連接到該片段。然后，經(jīng)SacII和Eco52I消化該片段。為了亞克隆，將得到的長(zhǎng)度為1.0kbp的SacII-Eco52I片段插入pRS435GAP和pRS445GAP的SacII-EGo52I位點(diǎn)。就每種亞克隆質(zhì)粒而言，得到了SacI、SacII、NdeI、NsiI(EcoT22I)、Aor51HI、XbaI、SmaI、BamHI、PstI、NdeI、PvuII和EcoT14I的識(shí)別位點(diǎn)圖譜，然后挑選出按設(shè)計(jì)構(gòu)建的質(zhì)粒。挑選出的質(zhì)粒分別被命名為pRS435GAP-ispA和pRS445GAP-ispA。
(1-3)嗜熱脂肪芽孢桿菌來(lái)源的FPP合酶基因?qū)⑹葻嶂狙挎邨U菌來(lái)源的FPP合酶基因從一個(gè)染色體PCR片段直接克隆到一個(gè)載體中。
(2)GGPP合酶基因或其突變體的亞克隆(2-1)啤酒糖酵母來(lái)源的GGPP合酶基因BTS1用BamHI和SalI消化實(shí)施例2(2)中描述的pT7Blue-T載體，獲得一個(gè)編碼BTS1的片段，將其導(dǎo)入到pYES2(Invitrogen)的BamHI-XhoI位點(diǎn)。得到的重組載體被命名為pYESGGPS。
用BamHI和MluI消化pYESGGPS后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，得到一個(gè)長(zhǎng)度為1.3kbp的片段。將該片段插入到pRS435GAP和pRS445GAP的BamHI-MluI位點(diǎn)，從而分別獲得pRS435GAP-BTS1和pRS445GAP-BTS1。
(2-2)大腸桿菌來(lái)源的GGPP合酶基因(替代突變型FPP合酶基因)ispAm用SphI和EcoRI消化實(shí)施例3(1)中描述的p16M后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，得到一個(gè)長(zhǎng)度為1.0kbp的片段，該片段編碼ispAm基因。將本實(shí)施例(1-2)中描述的SphI-SacII接頭DNA和EcoRI-Eco52I接頭DNA連接到該片段，然后，經(jīng)SacII和Eco52I消化。為了亞克隆，將得到的SacII-Eco52I片段(1.0kbp)插入到pRS435GAP和pRS445GAP的SacII-Eco52I位點(diǎn)。對(duì)每種亞克隆質(zhì)粒而言，得到SacI、SacII、NdeI、NsiI(EcoT22I)、Aor51HI、XbaI、SmaI、BamHI、PstI、PvuII和EcoT14I的識(shí)別位點(diǎn)圖譜，然后挑選出按設(shè)計(jì)構(gòu)建的質(zhì)粒。在這些識(shí)別位點(diǎn)中，NsiI(EcoT22I)識(shí)別位點(diǎn)是當(dāng)導(dǎo)入一個(gè)替代突變體到ispA中時(shí)被新導(dǎo)入的位點(diǎn)。如質(zhì)?？杀辉撓拗菩詢?nèi)切酶切割，就證實(shí)質(zhì)粒中的基因是ispA突變基因ispAm。挑選出的質(zhì)粒被分別命名為pRS435GAP-ispAm和pRS445GAP-ispAm。
(3)乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的亞克隆將乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶基因ERG10從一個(gè)基因組PCR片段直接克隆到pRS載體中。
(4)HMG輔酶A合酶基因的亞克隆從實(shí)施例2(4)中描述的pT7HMGS制備一個(gè)長(zhǎng)度為1.5kbp編碼HMGS基因的BamHI-SalI片段，將其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的BamHI-SalI位點(diǎn)。通過(guò)KpnI限制位點(diǎn)圖譜檢測(cè)HMGS-亞克隆質(zhì)粒后，選擇按設(shè)計(jì)構(gòu)建的質(zhì)粒。挑選出的質(zhì)粒分別被命名為pRS435GAP-HMGS和pRS445GAP-HMGS。
(5)HMG輔酶A還原酶基因或其突變體的亞克隆用BamHI、SalI和ScaI消化實(shí)施例2(5)中描述的pT7Blue-T載體，從而切除編碼一個(gè)PGR錯(cuò)誤型突變HMG輔酶A還原酶的HMG1’基因。將該基因插入到pYES2(Invitrogen)的BamHI-XhoI位點(diǎn)。得到的質(zhì)粒被命名為pYES-HMG1。
用SmaI和SalI消化載體pRS414PTadh和pRS414TPadh，這兩種載體都含有一個(gè)組成型ADH1p。將HMG1基因插入消化后的兩種載體，從而制備出pRS414PTadh-HMG1和pRS414TPadh-HMG1。
進(jìn)一步用SmaI和SalI消化在實(shí)施例2(6)中描述的pALHMG106(圖9)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化得到一個(gè)長(zhǎng)度為3.2kbp的片段，該片段編碼已糾正PCR錯(cuò)誤的HMG1基因。將該片段插入到pRS434GAP、pRS444GAP、pRS434TEF、pRS444TEF、pRS434PGK、pRS444PGK的SmaI-SalI位點(diǎn)。通過(guò)使用XhoI、SpeI、NaeI和SphI得到的限制性內(nèi)切酶圖譜，及確認(rèn)插入的長(zhǎng)度為3.2kbp的HMG1基因的邊緣區(qū)域的核苷酸序列，來(lái)檢驗(yàn)HMG1-亞克隆質(zhì)粒的物理圖譜。然后，挑選出精確按設(shè)計(jì)構(gòu)建的質(zhì)粒，并分別命名為pRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1、pRS434TEF-HMG1、pRS444TEF-HMG1、pRS434PGK-HMG1、pRS444PGK-HMG1。
從pYES2衍生的質(zhì)粒中獲得HMG輔酶A還原酶基因的缺失突變體，該衍生質(zhì)粒摻入了實(shí)施例3描述的HMG1的相應(yīng)缺失突變體，以前面章節(jié)中描述的方式將HMG輔酶A還原酶基因的缺失突變體克隆到pRS434GAP中。
(6)甲羥戊酸激酶基因的亞克隆從實(shí)施例2(7)中描述的pT7ERG12制備一個(gè)長(zhǎng)度為1.3kbp的SmaI-SalI片段，該片段編碼ERG12基因，將其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的SmaI-SalI位點(diǎn)。經(jīng)KpnI識(shí)別位點(diǎn)圖譜檢測(cè)ERG12-亞克隆質(zhì)粒，繼而挑選出精確按設(shè)計(jì)構(gòu)建的質(zhì)粒，并分別命名為pRS435GAP-ERG12和pRS445GAP-ERG12。
(7)磷酸甲羥戊酸激酶基因的亞克隆從實(shí)施例2(8)描述的pT7ERG8制備一個(gè)長(zhǎng)度為1.3kbp BamI-SalI片段，該片段編碼ERG8基因，并將其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的SmaI-SalI位點(diǎn)。經(jīng)XbaI識(shí)別位點(diǎn)圖譜檢驗(yàn)ERG8-亞克隆的質(zhì)粒，繼而挑選出精確按設(shè)計(jì)構(gòu)建的質(zhì)粒，并分別命名為pRS435GAP-ERG8和pRS445GAP-ERG8。
(8)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因的亞克隆用BamHI和SalI消化實(shí)施例1(9)中描述的pT7ERG19，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，得到一個(gè)長(zhǎng)度為1.5kbp的BamHI-SalI片段，該片段編碼ERG19基因。將該片段插入到pRS435GAP和pRS445GAP的BamHI-SalI位點(diǎn)。挑選出精確按設(shè)計(jì)構(gòu)建的質(zhì)粒，并分別命名為pRS435GAP-ERG19和pRS445GAP-ERG19。
(9)異戊烯基二磷酸Δ異構(gòu)酶基因的亞克隆(9-1)啤酒糖酵母來(lái)源的IPPΔ異構(gòu)酶基因IDI1從實(shí)施例2(10-1)中描述的pT7IDI1制備一個(gè)長(zhǎng)度為0.9kbp的BamHI-SalI片段，并將其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的BamHI-SalI位點(diǎn)。用NcoI和BamHI識(shí)別位點(diǎn)圖譜檢測(cè)亞克隆質(zhì)粒，挑選出精確按設(shè)計(jì)構(gòu)建的質(zhì)粒，并分別命名為pRS435GAP-IDI1和pRS445GAP-IDI1。
(9-2)大腸桿菌來(lái)源的IPPΔ異構(gòu)酶基因ORF182(idi)按實(shí)施例2(10-2)的描述將ORF182(idi)從一個(gè)基因組PGR片段直接克隆到pRS載體。
實(shí)施例5AURGG101、AURGG102和AURGG703的制備以實(shí)施例4(2-1)中描述的pYESGGPS為模板，并采用下列引物PYES2(1-27)和PYES2(861-835)，經(jīng)PCR制備一個(gè)長(zhǎng)度為1.9kbp的SalI片段，該片段具有GAL1啟動(dòng)子＝BTS1＝CYC1終止子(GAL1p-BTS1-CYC1t)一級(jí)結(jié)構(gòu)。
PYES2(1-27)5′-GGC CGC AAA TTA AAG CCT TCG AGC GTC-3′(SEQ ID NO88)PYES2(861-835)5′-ACG GAT TAG AAG CCG CCG AGC GGG TGA-3′(SEQ ID NO89)將該片段插入到pAUR101(Takara)的SalI位點(diǎn)，從而獲得pAURGG115。經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)在pAURGG115中的BTS1基因沒(méi)有PCR錯(cuò)誤。
用Eco065I線性化pAURGG115質(zhì)粒，通過(guò)乙酸鋰法將該質(zhì)粒導(dǎo)入A451菌株和YPH499菌株。然后，挑選出能夠在30℃、含有1μg/ml金擔(dān)子素的YPD瓊脂平板(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、2％瓊脂)上生長(zhǎng)的菌落，將其作為轉(zhuǎn)化體。
在金擔(dān)子素選擇性平板上重新培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，以挑選出單菌落。
結(jié)果獲得A451衍生的重組體的兩種菌株AURGG101和AURGG102。同樣獲得作為YPH499衍生的重組體的菌株AURGG703。下述DNA印跡雜交(圖12)和PCR圖譜(圖13)結(jié)果顯示BTS1基因沒(méi)有被整合到AURGG101中，并且在該菌株中，AURI被一個(gè)標(biāo)記基因AUR1-C所替代。另一方面，發(fā)現(xiàn)GAL1啟動(dòng)子＝BTS1＝CYC1終止子被整合在AURGG102的AUR1基因座。
實(shí)施例6EUG菌株的構(gòu)建從SGD獲得鯊烯合酶基因ERG9附近的一個(gè)基因圖譜。根據(jù)該圖譜，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增DNA片段的各種PCR引物DNA，擴(kuò)增片段被用于替代ERG9轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子(ERG9p)。另一方面，以pYES2Δ為模板，該模板是通過(guò)用NaeI和NheI消化pYES2，再由Klenow酶將該質(zhì)粒鈍端化，通過(guò)自連接刪除2μori而獲得的，采用PCR擴(kuò)增法制備一個(gè)長(zhǎng)度為1.8kbp的DNA片段，該片段含一個(gè)轉(zhuǎn)化體選擇標(biāo)記基因URA3和一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)于GALIp。
采用的PCR擴(kuò)增引物如下所示
E-MCSf5′-GCC GTTGACAGA GGG TCC GAG CIC GGT ACC AAG-3′(SEQ ID NO90)E-URA3r5′-CAT ACTGACCCA TTG TCA ATG GGT AAT AAC TGA T-3′(SEQ ID NO91)在上述每種引物中，都加入一個(gè)Eaml105I識(shí)別位點(diǎn)(下劃線部分)，使得可以通過(guò)T/A連接，將一個(gè)長(zhǎng)度為0.7kbp、含有YHR189W的一個(gè)下游部分的DNA片段和一個(gè)長(zhǎng)度為0.9kbp、含有ERG9的一個(gè)上游部分的DNA片段連接到一個(gè)長(zhǎng)度為1.8kbp片段上。YHR189W片段是以YHR189Wf和YHR189Wr為引物，以YPH499基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增制備的。ERG9片段是以ERG9f和ERG9r為引物，以YPH499基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增制備的。YPH499染色體DNA是用一個(gè)酵母基因組DNA制備試劑盒“Dr.GenTLETM”(Takara)制備的。
YHR189Wf5′-TGT CCG GTA AAT GGA GAC-3′(SEQ ID NO92)YHR189Wr5′-TGT TCT CGC TGC TCG TTT-3′(SEQ ID NO93)ERG9f5′-ATG GGA AAG CTA TTA CAA T-3′(SEQ ID NO94)ERG9r5′-CAA GGT TGC AAT GGC CAT-3′(SEQ ID NO95)簡(jiǎn)言之，用Eaml105I消化長(zhǎng)度為1.8kbp的DNA片段后，將其連接到長(zhǎng)度為0.7kbp的DNA片段上。以得到的片段為模板，采用上述引物YHR189Wf和E-MCSf進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。再用Eaml105I消化經(jīng)上述步驟得到的長(zhǎng)度為2.5kbp的DNA片段，將其連接到長(zhǎng)度為0.9kbp的DNA片段上。以得到的片段為模板，采用下述引物YHR189W-3f和ERG9-2r進(jìn)行第三次PCR擴(kuò)增。結(jié)果得到長(zhǎng)度為3.4kbp的DNA片段。該DNA片段將用于轉(zhuǎn)化。
YHR189W-3f5’-CAA TGT AGG GCT ATA TAT G-3’(SEQ ID NO96)ERG9-2r5’-AAC TTG GGG AAT GGC ACA-3’(SEQ ID NO97)采用購(gòu)自Zymo Research(Orange，CA)的Frozen EZ酵母轉(zhuǎn)化II試劑盒將載體導(dǎo)入酵母菌株。將獲得的重組體培養(yǎng)在特定瓊脂培養(yǎng)基(稱為SGR(-URA)培養(yǎng)基)上，培養(yǎng)溫度為30℃，該培養(yǎng)基是通過(guò)將CSM(-URA)(購(gòu)自EIO 101，Vista，CA)和硫酸腺嘌呤(終濃度為40mg/L)加入到SGR培養(yǎng)基中而獲得的。將生長(zhǎng)于該培養(yǎng)基上的菌落再次涂布于相同培養(yǎng)基上，可得到分離的單菌落。
獲得的重組體被命名為EUG(ERG9p::URA3-GAL1p)克隆。在這些克隆中，A451衍生的克隆被命名為EUG1-EUG10；YPH499衍生的克隆被命名為EUG11-EUG20；YPH500衍生的克隆被命名為EUG21-EUG30；W303-1A衍生的克隆被命名為EUG31-EUG50；W303-1B衍生的克隆被命名為EUG51-EUG70。
可挑選出那些顯示出生長(zhǎng)速率下降的克隆，生長(zhǎng)速率下降是由于SD培養(yǎng)基中的葡萄糖抑制了ERG9表達(dá)而造成的。結(jié)果從A451中獲得EUG5和EUG8；從YPH499中獲得EUG12；從YPH500中獲得EUG27。
采用Dr.GenTLETM，從EUG5、EUG8、EUG12和EUG27制備基因組DNA，以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果證實(shí)長(zhǎng)度為1.8kbp、含有URA3和GAL1p的PCR片段被整合到每個(gè)基因組的ERG9編碼區(qū)域的上游。
實(shí)施例7基因和酶活性分析本實(shí)施例中，采用各種不同的技術(shù)，包括異戊二烯基二磷酸合酶的酶活測(cè)定、RNA印跡雜交、DNA印跡雜交、PCR作圖和異戊二烯醇產(chǎn)量測(cè)定，來(lái)分析所制備的不同重組酵母克隆中(就其制備而言，見(jiàn)描述異戊二烯醇制備的實(shí)施例8-13)的基因表達(dá)情況。
(1)DNA印跡法采用酵母DNA純化試劑盒Dr.GenTLETM，根據(jù)試劑盒所附說(shuō)明制備酵母DNA。
制備的酵母DNA經(jīng)NdeI和StuI消化后，采用0.8％瓊脂糖凝膠電泳，每泳道DNA上樣量為3μg。分子量標(biāo)記采用0.5μg的1kb的序列梯和0.5μg的λ/HindIII(均購(gòu)自Promega，Madison，WI)。電泳完成后，根據(jù)傳統(tǒng)方法，將DNA堿變性、中和、并通過(guò)20x SSC的毛細(xì)管印跡轉(zhuǎn)移到Hybond N尼龍膜(Amersham，Buckinghamshire，England)。在最適交聯(lián)條件下，用UV交聯(lián)儀(Stratagene)對(duì)尼龍膜進(jìn)行照射，以固定DNA到膜上。
(2)RNA印跡法根據(jù)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，pp.13.12.2-13.12.3中描述的方法，并稍加修改而制備RNA。該修改即將已制備的RNA樣品進(jìn)一步用Dnase I處理。
經(jīng)甲醛變性的瓊脂糖凝膠電泳分離RNA后，根據(jù)傳統(tǒng)方法，將RNA通過(guò)20x SSC的毛細(xì)管印跡轉(zhuǎn)移到Hybond N尼龍膜。每泳道電泳上樣量為5μg總RNA。分子量標(biāo)記采用20ng的DIG-RNA標(biāo)記I。在最適交聯(lián)條件下用UV交聯(lián)儀(Stratagene)對(duì)得到的膜進(jìn)行紫外照射，以固定RNA到膜上。
(3)PCR作圖為檢測(cè)一個(gè)源自pAURGG115(實(shí)施例5中制備的一個(gè)YIp載體)的片段是如何被整合進(jìn)染色體的，以上述已制備的0.3-0.6μg的酵母DNA為模板，采用合成寡聚核苷酸引物AUR-FWc和AUR-RVc，或AUR-SAL1和AUR-SAL2的組合為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件如下30個(gè)循環(huán)過(guò)程，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30秒，55℃退火1分鐘，72℃延伸3分鐘。
AUR-FWc5′-TCT CGA AAA AGG GTT TGC CAT-3′(SEQ ID NO98)AUR-RVc5′-TCA CTA GGT GTA AAG AGG GCT-3′(SEQ ID NO99)AUR-SAL15′-TGT TGA AGC TTG CAT GCC TGC-3′(SEQ ID NO100)AUR-SAL25′-TTG TAA AAC GAC GGC CAG TGA-3′(SEQ ID NO101)(4)DIG標(biāo)記的探針DNA的制備制備探針I(yè)、II、III和V(表7)，作為雜交探針。
表7.雜交探針

探針I(yè)以實(shí)施例2(1-1)中制備的pT7ERG20為模板，以SCEPS1和SCEPS2為引物，用PCR DIG探針合成試劑盒(Roche Diagnostics，MannheimGermany)合成一種DIG標(biāo)記的探針DNA。實(shí)驗(yàn)條件與試劑盒所附制造商的說(shuō)明一致。PCR需進(jìn)行30個(gè)循環(huán)過(guò)程，每個(gè)循環(huán)包括94℃30秒、58℃1分鐘、72℃3分鐘。繼而經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到的DIG標(biāo)記的探針DNA的合成狀態(tài)。
探針I(yè)I一種DIG標(biāo)記的探針DNA，其合成方式與合成探針I(yè)描述的方式相同，引物是合成寡聚核苷酸BSTS1(1-21)和BTS1(1008-988)，模板為(見(jiàn)實(shí)施例4(2-1))pYESGGPS。
BTS1(1-21)5′-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG-3′(SEQ ID NO102)BTS1(1008-988)5′-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC-3′(SEQ ID NO103)探針I(yè)II一種DIG標(biāo)記的探針DNA，其合成方式與合成探針I(yè)描述的方式相同，采用的引物是合成寡聚核苷酸HMG1(1267-1293)和HMG1(2766-2740)，模板為(見(jiàn)實(shí)施例3(3))pYES-HMG1。
HMG1(1267-1293)5′-AAC TTT GGT GCA AAT TGG GTC AAT GAT-3′(SEQ ID NO80)HMG1(2766-2740)5′-TCC TAA TGC CAA GAA AAC AGC TGT CAC-3′(SEQ ID NO104)探針V一種DIG標(biāo)記的探針DNA，其合成方式與合成探針I(yè)描述的方式相同，采用的引物是合成寡聚核苷酸AUR-FW和AUR-RV，模板為pAUR123(Takara)。
AUR-FW5′-ATG GCA AAC CCT TTT TCG AGA-3′(SEQ ID NO105)AUR-RV5′-AGC CCT CTT TAC ACC TAG TGA-3′(SEQ ID NO106)
(5)探針的雜交和檢測(cè)在探針濃度為20ng/ml、42℃條件下、采用DIG Easy Hyb(Roche)進(jìn)行持續(xù)時(shí)間24小時(shí)的DNA印跡雜交。在探針濃度為100ng/ml、50℃下、采用DIG Easy Hyb進(jìn)行持續(xù)時(shí)間24小時(shí)的RNA印跡雜交。每次雜交前，在DIG Easy Hyb溶液中先進(jìn)行持續(xù)時(shí)間24小時(shí)的預(yù)雜交，預(yù)雜交溫度與各次雜交的溫度相同。雜交完成后，于65℃、用2x SSC、0.1％SDS洗滌膜3次，每次持續(xù)時(shí)間為10分鐘；然后于65℃、用2xSSC、0.1％SDS洗滌膜2次，每次持續(xù)時(shí)間為15-20分鐘。接著，采用DIG發(fā)光檢測(cè)試劑盒(Roche)使膜上的DIG標(biāo)記探針可以化學(xué)發(fā)光，再將印跡曝光到X射線膠片上，使其顯影。
(6)酶活性的測(cè)定在制備的重組體中，下列宿主菌株和重組體被應(yīng)用在本實(shí)驗(yàn)。根據(jù)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，Inc.，pp.13.7.1-13.7.2中描述的乙酸鋰法，或者采用Frozen EZ酵母轉(zhuǎn)化II試劑盒(Zymo Research，Orange，CA)(操作步驟與試劑盒所附說(shuō)明一致)，將各個(gè)載體導(dǎo)入宿主。在下列清單中，通過(guò)將pYES-HMG1導(dǎo)入到A451中獲得克隆1-2；通過(guò)將pYHMG044導(dǎo)入到A451中獲得克隆3-2；通過(guò)將pYES-HMG1導(dǎo)入到AURGG101中獲得克隆13-2；通過(guò)將pYHMG044導(dǎo)入到AURGG101中獲得克隆15-2。
No.1宿主菌株A451No.2 GAL1p-BTS1(YIp)AURGG101(A451，aur1::AUR1-C)No.3 GAL1p-BTS1(YIp)AURGG102(A451，aur1::BTS1-AUR1-C)No.4 GAL1p-HMG1(YEp)1-2(pYES-HMG1/A451)No.5 GAL1p-HMG1Δ(YEp)3-2(pYHMG044/A451)No.6 GAL1p-HMG1(YEp)&GAL1p-BTS1(YIp)13-2(pYES-HMG1/AURGG101)No.7 GAL1p-HMG1Δ(YEp)&GAL1p-BTS1(YIp)15-2(pYHMG044/AURGG101)No.8 GAL1p-HMG1(YEp)&GAL1p-BTS1(YIp)24-1(pYES-HMG1/AURGG102)No.9 GAL1p-HMG1Δ(YEp)&GAL1p-BTS1(YIp)27-2(pYHMG045/AURGG102)No.10 GAL1p-HMG1Δ(YEp)&GAL1p-BTS1(YIp)31-2(pYHMG076/AURGG102)
在26℃分別預(yù)培養(yǎng)No.1-10的菌株/克隆。用生理鹽水洗滌1毫升的預(yù)培養(yǎng)物，將其加入到300ml Erlenmeyer燒瓶中的100ml培養(yǎng)液中，于26℃、120次/分鐘的振蕩條件下培養(yǎng)。該培養(yǎng)采用SD或SG培養(yǎng)基(將SD培養(yǎng)基中的葡萄糖組分替換為半乳糖)。保留URA3標(biāo)記的重組體被培養(yǎng)在SD-U[加CSM(-URA)的SD培養(yǎng)基]或SG-U[加CSM(-URA)的SG培養(yǎng)基]。AURGG菌株則培養(yǎng)在含1μg/ml金擔(dān)子素的培養(yǎng)基中。
測(cè)定細(xì)胞的OD600值，以監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。當(dāng)OD600值達(dá)到3-4(培養(yǎng)開始后23-52小時(shí))時(shí)停止培養(yǎng)。將培養(yǎng)物在冰中冷卻后，制備DNA、RNA和粗酶溶液，方法描述如下。
通過(guò)離心從每種培養(yǎng)液中收獲細(xì)胞后，采用與制備RNA相同的方式，在4℃用玻璃珠破碎細(xì)胞。然后，將細(xì)胞懸浮在無(wú)菌水中，制成菌懸液。再用冷凍微離心機(jī)以12,000rpm轉(zhuǎn)速、離心10分鐘該菌懸液，回收得到的上清作為粗酶提取物。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，由Bio-Rad蛋白測(cè)定(Bio-Rad，Hercules，CA)檢測(cè)該粗酶提取物中的蛋白質(zhì)濃度。簡(jiǎn)言之，即37℃下，在200μl、含下列物質(zhì)的反應(yīng)混合物中反應(yīng)10μg的粗酶提取物40分鐘。
0.125mM[14C]IPP(185 GBq/mol)0.125mM香葉基二磷酸(Sigma Chemical，St.Louis，MO)100mM Tris·HCl(pH7.0)10mM NaF，5mM MgCl25mM 2-巰基乙醇0.05％Triton X-1000.005％BSA反應(yīng)完畢，用水飽和的丁醇提取延伸的異戊二烯基二磷酸。經(jīng)由液體閃爍計(jì)數(shù)檢測(cè)一份異戊二烯基二磷酸的放射活性。用馬鈴薯酸磷酸酶將剩余樣品脫去磷酸，再用薄層層析法[板LKC18(Whatman，Clifton，NJ)；顯影劑∶H2O/丙酮＝1∶19]顯影，接著根據(jù)Koyama等人的方法(Koyama T.，F(xiàn)ujii，H.and Ogura，K.，1985，Meth.Enzymol.110153-155)用Bio圖像分析儀BAS2000(Fuji Flim)進(jìn)行放射自顯影成像，以檢測(cè)相對(duì)放射活性。
(7)觀察結(jié)果(7-1)DNA印跡雜交和PCR圖譜DNA印跡雜交結(jié)果如圖12所示。AUR1附近的PCR圖譜結(jié)果如圖13所示。在圖12和圖13中，1-10泳道對(duì)應(yīng)的是上文(6)中采用的菌株/克隆(No.1-No.7)的編號(hào)。
出現(xiàn)在每泳道編號(hào)下的“N”表示DNA被NdeI消化；“S”表示DNA被StuI消化。自下列菌株/克隆制備出每泳道上樣的各種DNA。
泳道1A451；泳道2AURGG101；泳道3AURGG102；泳道4pYES-HMG1/A451；泳道5pYHMG044/A451；泳道6pYES-HMG1/AURGG101；泳道7pYHMG044/AURGG101；泳道8pYES-HMG1/AURGG102；泳道9pYHMG045/AURGG102；和泳道10pYHMG076/AURGG102發(fā)現(xiàn)檢測(cè)的所有菌株/克隆中ERG20(FPP合酶基因)都是相同的，并且在每個(gè)菌株/克隆基因組中的ERG20附近區(qū)域沒(méi)有變化(圖12)。
當(dāng)以BTS1(GGPP合酶基因)和AUR1為探針時(shí)，發(fā)現(xiàn)BTS1被整合進(jìn)AURGG102的AUR1區(qū)域，而AURGG101中出現(xiàn)的條帶與在宿主菌株A451中出現(xiàn)的條帶相同。在AURGG101中，只有AUR1基因被pAUR101來(lái)源的AUR1-C基因所替代；發(fā)現(xiàn)GAL1-BTS1片段沒(méi)有被整合進(jìn)該菌株的基因組中。當(dāng)由PCR檢測(cè)因染色體整合引起的AUR1位點(diǎn)復(fù)制時(shí)，僅在AURGG102中檢測(cè)到預(yù)期的條帶，在AURGG101中沒(méi)有檢測(cè)到預(yù)期條帶(圖13)。
圖12中，當(dāng)以HMG1為探針時(shí)，在NdeI消化的各種DNA(泳道4-7)中出現(xiàn)一個(gè)質(zhì)粒來(lái)源的條帶。在StuI消化的各種DNA中，原先預(yù)期能夠如在克隆1-2(No.4)的情況一樣，出現(xiàn)一個(gè)長(zhǎng)度為8.2kbp、來(lái)源自質(zhì)粒的條帶(重疊了一個(gè)長(zhǎng)度為8.3kbp、來(lái)源自基因組的條帶)。然而，由于基因組中的HMG1臨近區(qū)域與導(dǎo)入質(zhì)粒發(fā)生重組，使得在克隆13-2(No.6)和克隆15-2(No.7)中觀察到一個(gè)條帶偏移。
從DNA印跡雜交和PCR圖譜的結(jié)果中，可以總結(jié)本實(shí)施例采用的菌株/克隆基因型如下表8中所示。該表中，“AUR”指一種加入了金擔(dān)子素的培養(yǎng)基?！芭囵B(yǎng)基1”指用于預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基，“培養(yǎng)基2”指用于主培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
表8

(7-2)RNA印跡雜交RNA印跡雜交結(jié)果如圖14所示。雜交時(shí)用到了表7中所列的探針I(yè)、II、III和V。
圖14中，泳道1-10所用的菌株/克隆同圖12中所用的菌株/克隆相同。標(biāo)記“-”表示在SD培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)錄物，標(biāo)記“+”表示在SG培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)錄物。
當(dāng)SG培養(yǎng)基誘導(dǎo)GAL1p轉(zhuǎn)錄時(shí)，在克隆13-2(No.6)和克隆15-2(No.7)中，ERG20轉(zhuǎn)錄物顯示出減少的趨勢(shì)。
當(dāng)在GAL1轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下，SG培養(yǎng)基誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)，BTS1轉(zhuǎn)錄物僅在特定的菌株中增加，即AURGG102(No.3)，該菌株中，染色體整合了GAL1p-BTS1片段。
然而，當(dāng)同HMG1轉(zhuǎn)錄物比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)BTS1的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)程度比較低。當(dāng)由SG培養(yǎng)基誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄時(shí)，在克隆No.4-No.7中HMG1轉(zhuǎn)錄物有非常顯著的增加，這些克隆都通過(guò)質(zhì)粒導(dǎo)入了GAL1p-HMG1片段。
(7-3)異戊二烯基二磷酸合酶活性以香葉基二磷酸(GPP)和14C標(biāo)記的IPP為烯丙基二磷酸底物，測(cè)定在粗酶組分中異戊二烯基二磷酸合酶活性。
簡(jiǎn)言之，將以(GPP)和[14C]IPP為底物合成的各個(gè)異戊二烯基二磷酸脫磷酸，經(jīng)TLC顯影，繼而檢測(cè)每個(gè)斑點(diǎn)的放射活性。結(jié)果是，F(xiàn)PP合酶活性最高，其次是HexPP(六異戊二烯基二磷酸)合酶活性，并發(fā)現(xiàn)該酶活性遠(yuǎn)高于GGPP合酶活性。然后，從放射自顯影圖中推算出反應(yīng)產(chǎn)物的相對(duì)含量，繼而推算總蛋白質(zhì)的比活性。結(jié)果如圖15所示。圖15A中，上圖顯示FPP合酶(FPS)活性，下圖顯示GGPP合酶(GGPS)活性。圖15B中，上圖顯示HexPP合酶(HexPS)活性，下圖顯示PT酶(總異戊二烯基二磷酸合酶)活性。陰影柱顯示在SD培養(yǎng)基中的結(jié)果，空白柱顯示在SG培養(yǎng)基中的結(jié)果。總異戊二烯基二磷酸合酶活性的大部分是FPP合酶活性。因SG培養(yǎng)基造成的該活性的增加是可以觀察到的。尤其是FPP合酶活性在克隆13-2(No.6)和15-2(No.7)中有顯著的增加。總體上，當(dāng)GPP被作為烯丙基底物時(shí)，GGPP合酶活性大約為FPP合酶活性的1/20000，大約是HexPP合酶活性的1/300。在SG培養(yǎng)基中，HexPP合酶活性是降低的。
DNA導(dǎo)入宿主及宿主的培養(yǎng)(通過(guò)啤酒糖酵母表達(dá))該實(shí)施例中，為構(gòu)建一個(gè)甲羥戊酸途徑相關(guān)酶基因在啤酒糖酵母中永久表達(dá)的體系，通過(guò)將啤酒糖酵母來(lái)源的基因?qū)牒幸粋€(gè)組成型啟動(dòng)子和多種不同營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的表達(dá)穿梭載體，從而制備用于甲羥戊酸途徑相關(guān)酶基因的表達(dá)載體。然后評(píng)估這些基因高表達(dá)對(duì)異戊二烯醇制備的效果。
(1)酵母的轉(zhuǎn)化將得到的用于每個(gè)甲羥戊酸途徑相關(guān)酶基因的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主。在新導(dǎo)入的載體里，每個(gè)甲羥戊酸途徑相關(guān)酶基因被插入到TDH3轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子TDH3p(＝GAPp)的下游。就宿主而言，可采用下列菌株/克隆。
A451AURGG101YPH499AURGG703YPH500
W303-1AW303-1BEUG5(來(lái)源自A451)EUG8(來(lái)源自A451)EUG12(來(lái)源自YPH499)EUG24(來(lái)源自YPH500)EUG27(來(lái)源自YPH500)15-2(pYHMG044/AURGG101)(來(lái)源自AURGG101)(2)酵母的培養(yǎng)根據(jù)采用的標(biāo)記基因，在SD選擇性培養(yǎng)基中，預(yù)培養(yǎng)每個(gè)導(dǎo)入甲羥戊酸途徑相關(guān)酶基因的酵母克隆。然后，將25μl的預(yù)培養(yǎng)液加入到2.5ml的YM或SG(SD的葡萄糖組分被半乳糖替代)培養(yǎng)基中，以130rpm、26℃條件下反復(fù)振蕩培養(yǎng)4天。在將預(yù)培養(yǎng)液加入SG培養(yǎng)基前，預(yù)先用生理鹽水洗滌細(xì)胞，以免葡萄糖組分被帶入培養(yǎng)基。當(dāng)采用YPH499來(lái)源的克隆時(shí)，在培養(yǎng)基中加入硫酸腺嘌呤，濃度為40μg/ml。
(3)戊烷抽提在甲羥戊酸途徑相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)化的酵母克隆的培養(yǎng)完成后，檢測(cè)培養(yǎng)物的30倍稀釋液的OD600值。然后，加入2.5ml甲醇到該稀釋液中，并使其混合。再加入5ml戊烷，并劇烈振蕩。繼而將得到的混合物靜置后，轉(zhuǎn)移戊烷層到一個(gè)干凈的玻璃試管中。將該試管置于通風(fēng)櫥內(nèi)，使戊烷蒸發(fā)以濃縮溶質(zhì)。隨后，以10μl 1.0ml/L十一醇作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物加入其中，從而制備出用于GC/MS的樣品。
(4)GC/MS分析用HP6890/5973 GC/MS系統(tǒng)(Hewlett-Packard，Wilmington，DE)將戊烷抽提組分進(jìn)行分離、鑒定和定量檢測(cè)。采用的色譜柱是HP-5MS(0.25mm×30m；膜厚0.25μm)。分析條件如下所示。相同的條件也適用于本說(shuō)明書中所有的GC/MS分析。
入口溫度250℃檢測(cè)器溫度260℃[MS區(qū)域溫度]
MS四極桿溫度150℃MS離子源溫度230℃質(zhì)量掃描范圍35-200[進(jìn)樣參數(shù)]自動(dòng)進(jìn)樣模式樣品容量2μl甲醇洗滌3遍，正己烷洗滌2遍分流比1/20載氣氦氣1.0ml/分鐘溶劑延遲2分鐘[爐加熱條件]115℃90秒以70℃/分鐘的速度加熱至250℃，并維持2分鐘以70℃/分鐘的速度加熱至300℃，并維持7分鐘0小時(shí)后內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)0.01μl 1-十一醇于乙醇中可信標(biāo)準(zhǔn)(全E)-橙花叔醇(Eisai)(全E)-法呢醇(Sigma)(全E)-香葉基香葉醇(Eisai)鯊烯(Tokyo Kasei Kogyo)(5)結(jié)果基因、表達(dá)載體、宿主、培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時(shí)間)與最大GGOH產(chǎn)量之間的關(guān)系總結(jié)于下表9中。
表9.最大GGOH產(chǎn)量

HMG1Δ(YEp)→BTS1(基因組)pYHMG027 Sc AURGG102SG26480.078pYHMG044 Sc AURGG102SG26480.120PYHMG044 Sc AURGG102SG26960.415pYHMG045 Sc AURGG102SG26480.610pYHMG059 Sc AURGG102SG26480.099pYHMG062 Sc AURGG102SG26480.120pYHMG062 Sc AURGG102SG26480.418pYHMG063 Sc AURGG102SG26480.110pYHMG076 Sc AURGG102SG26480.400pYHMG083 Sc AURGG102SG26480.210pYHMG094 Sc AURGG102SG26480.170pYHMG108 Sc AURGG102SG26480.120pYHMG122 Sc AURGG102SG26480.160pYHMG123 Sc AURGG102SG26480.097pYHMG134 Sc AURGG102SG26480.110pYHMG044 Sc AURGG703SG26960.201pYHMG062 Sc AURGG703SG26960.243HMG1Δ(YEp)+ispAm(YEp)pYHMG044+pRS435GAP-lspAm Sc AURGG101SG26961.36HMG1Δ(YEp)+ORF182(YEp)pYHMG044+pRS435GAP-ORF182Sc AURGG101SG26960.626pYHMG044+pRS445GAP-ORF182Sc AURGG101SG26961.16HMG1Δ(YEp)+HMGS(YEp)pYHMG044+pRS435GAP-HMGS Sc AURGG101SG26961.30pYHMG044+pRS445GAP-HMGS Sc AURGG101SG26960.883HMG1Δ(YEp)+ERG12(YEp)pYHMG044+pRS435GAP-ERG12 Sc AURGG101SG26960.702pYHMG044+pRS445GAP-ERG12 Sc AURGG101SG26961.01HMG1Δ(YEp)+ERG8(YEp)pYHMG044+pRS435GAP-ERG8 Sc AURGG101SG26960.700pYHMG044+pRS445GAP-FRG8 Sc AURGG101SG26962.72HMG1Δ(YEp)+ERG10(YEp)pYHMG044+pRS435GAP-ERG10 Sc AURGG101SG26961.16pYHMG044+pRS445GAP-ERG10 Sc AURGG101SG26961.22HMG1Δ(YEp)+ERG19(YEp)pYHMG044+pRS435GAP-ERG19 Sc AURGG101SG26961.89pYHMG044+pRS446GAP-FRG19 Sc AURGG101SG26961.02fpsm(Y81M)pFPSm21 Ec JM109 2xYT*** 371616.1ispAm(Y79M)p16M Ec JM109 2xYT*** 371621.9ispAm(Y79D)p15D Ec JM109 2xYT*** 37160.12ispAm(Y79E)p4E Ec JM109 2xYT*** 37160.26ispAm(Y79M)+idipALispA16m+p3-47-13 Ec JM109 2xYT 37160.07- Sc A451**0.02- Sc AURGG101 0.02- Sc YPH4990.00- Sc YPH5000.00- Sc W303-1A 0.00- Sc W303-1B 0.00Ec JM109 0.00HMG1pRS434GAP-HMG1 Sc EUG8 YM 30960.16pRS444GAP-HMG1 Sc EUG8 YM 30960.12pRS434GAP-HMG1 Sc EUG12 YM 30961.03pRS444GAP-HMG1 Sc EUG12 YM 30961.02pRS434GAP-HMG1 Sc EUG12 YM 30960.55pRS434GAP-HMG1 Sc EUG27 YM 30960.55pRS434GAP-HMG1 Sc EUG27 YM 30960.63
HMG1ΔpYHMG044Sc AURGG101YMO261573.58pRS434GAP-HMG026Sc EUG5YM 3096 0.09pRS434GAP-HMG044Sc EUG5YM 3096 0.09pRS434GAP-HMG056Sc EUG5YM 3096 0.11pRS434GAP-HMG062Sc EUG5YM 3096 0.13pRS434GAP-HMG076Sc EUG5YM 3096 0.15pRS434GAP-HMG081Sc EUG5YM 3096 0.14pRS434GAP-HMG100Sc EUG5YM 3096 0.18pRS434GAP-HMG112Sc EUG5YM 3096 0.34pRS434GAP-HMG122Sc EUG5YM 3096 0.13pRS434GAP-HMG133Sc EUG5YM 3096 0.71pRS434GAP-HMG026Sc EUG12 YM 3096 0.63pRS434GAP-HMG044Sc EUG12 YM 3098 0.44pRS434GAP-HMG056Sc EUG12 YM 3096 0.4pRS434GAP-HMG062Sc EUG12 YM 3096 0.45pRS434GAP-HMG076Sc EUG12 YM 3096 0.55PRS434GAP-HMG081Sc EUG12 YM 3096 0.49pRS434GAP-HMG100Sc EUG12 YM 3096 0.44pRS434GAP-HMG112Sc EUG12 YM 3096 0.53pRS434GAP-HMG122Sc EUG12 YM 3096 0.5pRS434GAP-HMG133Sc EUG12 YM 3096 0.44BTS1(載體)pRS435GGSc EUG8YM 3096 1.4pRS435GGSc EUG12 YM 3096 1.58pRS435GGSc EUG27 YM 3096 1.53FPS基因pFPSm21 Ec JM109 2xYT***3716 16.1pFPSm31 Ec JM109 2xYT***3716 6.9p4D Ec JM109 2xYT***3716 0.09p4E Ec JM109 2xYT***3716 0.26p4M Ec JM109 2xYT***3716 15.5p8M Ec JM109 2xYT***3716 0.31p15DEc JM109 2xYT***3716 0.12p15EEc JM109 2xYT***3716 0.21p16DEc JM109 2xYT***3718 0.06p16EEc JM109 2xYT***3716 0.88p16MEc JM109 2xYT***3716 21.9p18EEc JM109 2xYT***3716 0.14p16MEc JM109 2xYT***3716 6FPS基因+idip16M+p3-47-13 Ec JM109 2xYT 3716 0.07GGHDELpRS445GGHDELSc YPH499 YM 3096 0.23FGG融合體pRS435FGG Sc YPH499 YM 3096 0.46pRS435FGGHDEL Sc YPH499 YM 3096 0.29
GGF融合體pRS435GGF Sc A451 YM 3096 0.28pRS435GGF Sc A451 YMO 3096 0.48pRS435GGF Sc A451 YM 301680.28pRS435GGF Sc A451 YMO 301681.01pRS435GGF Sc YPH499 YM 3098 2.1pRS435GGF Sc YPH499 YMO 3096 1.49pRS435GGF Sc YPH499 YM 301680.37pRS435GGF Sc YPH499 YMO 301682.92pRS435GGF Sc EUG5 YM 3096 5.2pRS435GGF Sc EUG5 YMO 3096 4.2pRS435GGF Sc EUG5 YM(100) 3096 3.5pRS435GGF Sc EUG5 YM 301687.32pRS435GGF Sc EUG5 YMO 3016810.1pRS435GGF Sc EUG12 YM 3096 0.47pRS435GGF Sc EUG12 YMO 3096 2.38pRS435GGF Sc EUG12 YM(20) 3096 7.04pRS435GGF Sc EUG12 YM 301681.43pRS435GGF Sc EUG12 YMO 301685.78pRS435GGFHDEL Sc A451 YMO 3096 0.13pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YM 3096 1.9pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YMO 3096 1.69pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YM 301680.54pRS435GGFHDEL Sc YPH499 YMO 301682.5pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YM 3096 5.78pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YMO 3096 3.97pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YM(75) 3096 3.94pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YM 301686.99pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YMO 3016810.8pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YM 3096 0.6pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YMO 3096 2.33pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YM(20) 3098 8.01pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YM 301881.18pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YMO 301685.78HMG1+GGF融合體pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFSc A451 YM 3098 0.55pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFSc A451 YMO 3096 0.36pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFSc A451 YM 301680.93pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFSc A451 YMO 301681.01pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFSc A451 YM(50) 3016B4.54pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFSc YPH499 YM 3096 0.78pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFSc YPH499 YMO 3096 2.46pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFSc YPH499 YM(50) 3098 2.25pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFSc YPH499 YMO 33109128pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFSc YPH499 YM 301681.28pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFSc YPH499 YMO 301685.66pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFSc YPH499 YM(100) 301682.5pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDELSc A451 YM 3096 0.54pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDELSc A451 YMO 3096 0.41pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDELSc A451 YM 301680.76pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDELSc A451 YMO 301883.49pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDELSc A451 YM(75) 301685.74pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDELSc YPH499 YM 3096 1pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDELSc YPH499 YMO 3096 2.6pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDELSc YPH499 YM(100) 301682.85pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDELSc YPH499 YM 301682.45pRS434GAP-HMG1+pRS435GGFHDELSc YPH499 YMO 3068 6.16*加入了0.1％ADEKANOL+5％Glc。
**當(dāng)培養(yǎng)宿主本身時(shí)，在任何培養(yǎng)條件下都不產(chǎn)生GGOH。
***加入了IPP和DMAPP在“基因”一欄中，“YEp″意指采用YEp載體轉(zhuǎn)移的基因，“基因組”意指通過(guò)基因組整合轉(zhuǎn)移的基因。
在上表中，在宿主一欄中的“Ec”意指大腸桿菌，“Sc”意指啤酒糖酵母。在“培養(yǎng)基”一欄中，“YM(20)”意指該YM培養(yǎng)基含20％Glc-80％Gal的初始糖成分，并且在2天的培養(yǎng)中，Glc被進(jìn)一步加進(jìn)該培養(yǎng)基中，達(dá)到5％的終濃度。培養(yǎng)基的其它組分及數(shù)值有相同的意義。
(5-1)通過(guò)ERG20表達(dá)制備GGOH當(dāng)pRS435GAP-ERG或pRS445GAP-ERG被導(dǎo)入A451時(shí)，重組體高效產(chǎn)出GGOH。當(dāng)采用pRS445GAP-ERG時(shí)，可產(chǎn)出0.73mg/L的GGOH(表9)。
(5-2)通過(guò)BTS1表達(dá)制備GGOH當(dāng)pRS435GAP-BTS1或pRS445GAP-BTS1被導(dǎo)入A451或YPH499時(shí)，GGOH產(chǎn)量大幅度增加(表9)。當(dāng)宿主為A451時(shí)，重組體平均產(chǎn)出0.10-0.11mg/L的GGOH，最多為0.585mg/L(表9)。此外，當(dāng)pRS435GAP-BTS1或pRS445GAP-BTS1被導(dǎo)入W303-1A或W303-1B時(shí)，最多產(chǎn)出0.19-0.85mg/L的GGOH(表9)。
(5-3)通過(guò)HMG輔酶A還原酶基因或其突變體表達(dá)制備GGOH(i)當(dāng)組成型啟動(dòng)子連接的HMG1基因被導(dǎo)入A451時(shí)GGOH的制備(表達(dá)為“組成型啟動(dòng)子；HMG1；A451”；該表示方式也應(yīng)用于下文描述的其它重組體)GGOH產(chǎn)量的測(cè)定結(jié)果如圖16所示。在圖16中，434和444分別表示采用pRS434GAP和pRS444GAP載體時(shí)的結(jié)果。該圖表中的右柱顯示的是培養(yǎng)基因?qū)肭暗乃拗?A451)所得到的結(jié)果。
這些結(jié)果顯示在pRS343GAP-HMG/A451中，GGOH產(chǎn)率有改善，平均產(chǎn)出0.105mg/L的GGOH，并且根據(jù)菌落的不同，僅活化了HMG1基因的轉(zhuǎn)錄，最多就可產(chǎn)出0.348mg/L的GGOH(表9)。這樣，該重組體被認(rèn)為對(duì)GGOH的制備是有效的。
(ii)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；HMG1；A451 & AURGG101將質(zhì)粒pYES2-HMG導(dǎo)入到A451和AURGG101(A451，aur1::AUR1-C)中，該質(zhì)粒是通過(guò)將一個(gè)HMG1基因(HMG1’，一個(gè)PCR錯(cuò)誤型HMG1)插入到含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1p的載體pYES2而獲得。
結(jié)果獲得GGOH高產(chǎn)克隆。AURGG101衍生的克隆的GGOH產(chǎn)量平均達(dá)到1.1mg/L，最多達(dá)到2.2mg/L(圖17)。
(iii)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；HMG1 &BTS1；AURGG102 &AURGG703將質(zhì)粒pYES-HMG導(dǎo)入到A451衍生的AURGG102和YPH499衍生的AURGG703(該宿主染色體中整合有BTS1)中，該質(zhì)粒是通過(guò)將一個(gè)HMG1’插入到含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1p的載體pYES2而獲得。
結(jié)果，當(dāng)以AURGG102或AURGG703為宿主時(shí)，只要采用GAP1p就可獲得GGOH高產(chǎn)克隆(圖18)。AURGG102衍生的克隆最多可產(chǎn)出1.28mg/L的GGOH。
(iv)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；HMG1Δ；A451將下列質(zhì)粒分別導(dǎo)入A451中，這些質(zhì)粒均通過(guò)將HMG1’基因的缺失突變體插入到含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1p的載體pYES2而獲得。
pYHMG026pYHMG044pYHMG056pYHMG062pYHMG076pYHMG081pYHMG100pYHMG112pYHMG122在SG培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的重組體，繼而測(cè)定GGOH產(chǎn)量(圖19)。圖19中，“HMG1Δ026”表示當(dāng)把pYHMG026導(dǎo)入A451時(shí)的結(jié)果。其它基因的導(dǎo)入也以相同方式表示。
當(dāng)用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)HMG1基因的缺失突變體時(shí)，獲得GGOH高產(chǎn)克隆。HMG1Δ056和HMG1Δ062對(duì)GGOH制備是有效的。(HMG062/A451克隆平均產(chǎn)出0.063mg/L的GGOH。)(v)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；HMG1Δ；AURGG101將下列質(zhì)粒分別導(dǎo)入AURGG101中，這些質(zhì)粒均通過(guò)將HMG1’基因的缺失突變體插入到含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1p的載體pYES2中而獲得。
pYHMG026pYHMG044pYHMG056pYHMG062
pYHMG076pYHMG081pYHMG100pYHMG112pYHMG122pYHMG133在SG培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的重組體，繼而測(cè)定GGOH產(chǎn)量(圖20)。結(jié)果在HMG1Δ044中測(cè)到大約3.1mg的GGOH產(chǎn)量。在圖20中，最右邊的柱表示基因?qū)肭暗乃拗鰽URGG101的GGOH產(chǎn)量。
(vi)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；HMG1Δ&BTS1；AURGG102將下列質(zhì)粒分別導(dǎo)入AURGG102中，這些質(zhì)粒均通過(guò)將HMG1’基因的缺失突變體插入到含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1p的載體pYES2而獲得。
pYHMG027pYHMG044pYHMG045pYHMG059pYHMG062pYHMG063pYHMG076pYHMG083pYHMG094pYHMG106pYHMG112pYHMG123pYHMG134在SG培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的重組體，繼而測(cè)定GGOH產(chǎn)量。
結(jié)果當(dāng)導(dǎo)入pYHMG045時(shí)，獲得平均產(chǎn)出0.36mg/L GGOH的克隆(圖21)。
(vii)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；HMG1Δ&BTS1；AURGG703
將質(zhì)粒pYHMG044和pYHMG062分別導(dǎo)入AURGG703中，這兩種質(zhì)粒均通過(guò)將HMG1’基因的缺失突變體插入到含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GAL1p的載體pYES2而獲得。在SG培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的重組體，繼而測(cè)定GGOH產(chǎn)量。
結(jié)果是導(dǎo)入pYHMG062的克隆平均產(chǎn)出0.21mg/L GGOH的克隆(圖22)。
(5-4)通過(guò)BTS1和HMG輔酶A還原酶基因共表達(dá)制備GGOH將pRS435GAP-HMG1或pRS445GAP-HMG1同BTS1一起導(dǎo)入YPH499中，測(cè)定得到的重組體的GGOH產(chǎn)量。結(jié)果當(dāng)導(dǎo)入pRS435GAP-HMG1時(shí)，獲得一個(gè)最多產(chǎn)出0.58mg/L GGOH的克隆(表9)。
(5-5)通過(guò)ispAm、0RF182(idi)、HMGS、ERG8、ERG10或ERG19與HMG輔酶A還原酶基因的一個(gè)缺失突變體(HMG1Δ)共表達(dá)制備GGOH將ispAm、ORF182(idi)、HMGS、ERG8、ERG10或ERG19與HMG1Δ一起導(dǎo)入AURGG101中，繼而測(cè)定得到的重組體的GGOH產(chǎn)量。結(jié)果獲得最多可產(chǎn)出0.6-2.7mg/L GGOH的克隆。
DNA導(dǎo)入宿主及宿主的培養(yǎng)(在大腸桿菌中的表達(dá))將下列載體導(dǎo)入大腸桿菌JM109中，用大腸桿菌FPP合酶基因ispA的表達(dá)載體pALisp4、pALisp15、pALisp16和pALisp18；用作通過(guò)轉(zhuǎn)化自ispA的GGPP合酶基因ispA(Y79D)、ispA(Y79E)和ispA(Y79M)的替代突變的表達(dá)載體p4D、p4E、p4M、p8M、p15D、p15E、p16D、p16E、p16M、p18E和p18M；以及用作嗜熱脂肪芽孢桿菌FPP合酶基因fps的Y81M突變體的表達(dá)載體pFPSm21和pFPSm31。預(yù)培養(yǎng)得到的重組體。將0.5ml的預(yù)培養(yǎng)液加入到裝有50ml含2xYT和1mM IPTG的培養(yǎng)基的300m1燒瓶中。如有需要，還可加入抗生素(氨芐青霉素和氯霉素)、5mM(大約0.12％(w/v))IPP和5mM DMAPP，37℃下振蕩培養(yǎng)細(xì)胞16小時(shí)。
培養(yǎng)完成后，將馬鈴薯酸磷酸酶加入到培養(yǎng)液上清中，經(jīng)超聲波破碎產(chǎn)生的沉淀，繼而用有機(jī)溶劑戊烷將異戊二烯醇抽提出來(lái)。然后，由GC/MS對(duì)異戊二烯醇進(jìn)行鑒別和定量測(cè)定。進(jìn)一步地，為確定在沒(méi)有IPP和DMAPP加入的情況下，是否能夠產(chǎn)出異戊二烯醇，將實(shí)施例3(1)中獲得的質(zhì)粒p16M(命名為pALispA16m)和實(shí)施例2(10-2)中獲得的保留有IPPΔ異構(gòu)酶基因idi的p3-47-13導(dǎo)入大腸桿菌JM109中，然后預(yù)培養(yǎng)。將0.5ml的預(yù)培養(yǎng)液加入到裝有50ml含2xYT和1mM IPTG的培養(yǎng)基的300ml燒瓶中。如有需要，還可加入抗生素(氨芐青霉素和氯霉素)。然后，37℃下振蕩培養(yǎng)細(xì)胞16小時(shí)。
當(dāng)加入IPP和DMAPP到培養(yǎng)基中時(shí)，GGOH產(chǎn)量結(jié)果如下。當(dāng)導(dǎo)入突變體fps(圖23的pFPSm21和pFPSm31)時(shí)，GGOH產(chǎn)量為16.1mg/L和6.9mg/L。當(dāng)導(dǎo)入突變體ispA時(shí)，保留p4M、p16M和p18M的JM109細(xì)胞分別產(chǎn)出15.5mg/L、21.9mg/L和6.0mg/L的GGOH(圖23)。在導(dǎo)入Y79M突變的p4M和p16M中，驗(yàn)證出其沉淀組分中有高GGOH活性。從這些結(jié)果，可以認(rèn)為pALispA4和pALispA16在大腸桿菌細(xì)胞中能表達(dá)具有活性的FPP合酶基因，且其替代突變型質(zhì)粒p4M和p16M也有足夠的表達(dá)活性。
當(dāng)沒(méi)有加入IPP和DMAPP到培養(yǎng)基中時(shí)，在保留pALispA16m的JM109中，GGOH產(chǎn)量為0.07mg/L。當(dāng)pALispA16m和p3-47-13(保留IPPΔ異構(gòu)酶基因)被共表達(dá)時(shí)，以GGOH計(jì)算，異戊二烯醇的產(chǎn)率為0.12mg/L。
通過(guò)融合基因表達(dá)制備異戊二烯醇假定被啤酒糖酵母BTS1編碼的GGPP合酶傾向以FPP而非DMAPP(二甲基烯丙基二磷酸)為起始底物?？梢哉J(rèn)為，在加強(qiáng)FPP合成能力的同時(shí)，需要加強(qiáng)從IPP合成GGPP(GGOH的前體)的能力。
考慮到這一點(diǎn)，該實(shí)施例中試圖構(gòu)建由BTS1和ERG20組成的融合基因，以在啤酒糖酵母細(xì)胞中將其表達(dá)，并確定GGOH的產(chǎn)率是否改善。進(jìn)一步也試圖摻入在BTS1、ERG20或其融合基因的下游編碼一個(gè)ER過(guò)渡信號(hào)的核苷酸序列，并檢測(cè)其對(duì)異戊二烯醇制備的影響。
(1)質(zhì)粒DNA的制備以pYESGGPS和pT7ER20為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，這兩種質(zhì)粒，前者是摻入GGPP合酶基因BTS1的pYES2質(zhì)粒，后者是摻入FPP合酶基因ERG20的pT7質(zhì)粒。PCR引物如下所示。
SacII-BTS15′-TCCCCG CGGATG GAG GCC AAG ATA GAY-3′(SEQ ID NO107)BTS1-XhoI5′-CAACTC GAGTCA CAA TTC GGA TAA GTG-3′(SEQ ID NO108)ERG20HDEL-XbaI5′-GCT CTA GAG TTC GTC GTG TTT GCT TCT CTT GTAAAC TT-3′(SEQ ID NO109)BTS1HDEL-XhoI5′-TATCTC GAGTCA CAA TTC GTC ATG TAA ATT GG-3′(SEQ ID NO110)BTSI-109I5′-GCAGGG ACC CCA ATT CGG ATA AGT GGT C-3′(SEQ ID NO111)109I-BTS15′-GTAGGG TCC CTG GAG GCC AAG ATA GAT G-3′(SEQ ID NO112)ERG20-109I5′-GCAGGG ACC CTT TGC TTC TCT TGT AAA CT-3′(SEQ ID NO113)109I-ERG205′-GTAGGG TCC TCA GAA AAA GAA ATT AGG AG-3′(SEQ ID NO114)-215′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′(SEQ ID NO115)T75′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3′(SEQ ID NO116)ERG20HDEL-XbaI5′-GCT CTA GAG TTC GTC GTG TTT GCT TCT CTT GTAAAC TT-3′(SEQ ID NO117)BTSlHDEL-XhoI5′-TATCTC GAGTCA CAA TTC GTC ATG TAA ATT GG-3′(SEQ ID NO118)ERG20HDEL-XbaI的3-8位的核苷酸與BTS1HDEL-XhoI4-9位的核苷酸(下劃線部分)表示用于載體連接的SacII、XhoI或XbaI識(shí)別位點(diǎn)。BTS1-109I、109I-BTS1、ERG20-109I和109I-ERG20的4-10位的核苷酸(下劃線部分)分別表示用于融合基因制備的Eco0109I識(shí)別位點(diǎn)。
在下述反應(yīng)溶液中進(jìn)行PCR。
1xKOD-Plus緩沖液(Toyobo)0.2mM dNTPs0.25mM MgSO415pmol引物115pmol引物20.01-0.1μg模板DNA1單位KOD-Plus DNA聚合酶(Toyobo)共計(jì)50μlKOD-Plus含1.6μg/μl的KOD抗體。接著在94℃下初始變性2分鐘，再進(jìn)行30個(gè)循環(huán)過(guò)程完成PCR，每個(gè)循環(huán)包括94℃15秒、55℃30秒和68℃1分鐘。然后，將溶液置于68℃2分鐘。
如表10和圖24所示的方法采用模板和引物(引物1+引物2)的組合進(jìn)行第一次PCR。PCR產(chǎn)物的命名如表10和圖24所示。在圖24中，最終質(zhì)粒的命名如最左邊的列所示。以灰色字母書寫的序列表示氨基酸序列。其中，GS被導(dǎo)入融合基因的結(jié)合序列，HDEL被作為ER過(guò)渡信號(hào)插入。箭頭指示用于PCR的各個(gè)引物的位置及方向。
表10

用限制性酶Eco0109I消化PCR產(chǎn)物#9、#10、#11、#12、#13和#14。然后，將#9和#11、#10和#12、#9和#13、及#10和#14彼此單獨(dú)連接。以得到的連接溶液為模板，以SacII-BTS1和-21的組合、T7和BTS1-XhoI的組合、SacII-BTS1和ERG20HDEL-XbaI的組合、及T7和BTS1HDEL-XhoI的組合為引物1和引物2，進(jìn)行第二次PCR，反應(yīng)條件與進(jìn)行第一次PCR的條件相同。結(jié)果獲得第二次PCR的產(chǎn)物#9-#11、#10-#12、#9-#13和#10-#14。
用SacII和BamHI消化產(chǎn)物#9-#11，并將其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的SacII-BamHI位點(diǎn)，從而分別獲得pRS435GGF和pRS445GGF。
用XbaI和XhoI消化產(chǎn)物#10-#12，并將其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的XbaI-XhoI位點(diǎn)，從而分別獲得pRS435FGG和pRS445FGG。
用SacII和XbaI消化產(chǎn)物#9-#13，并將其插入到pRS435GAP的SacII-XbaI位點(diǎn)，從而獲得pRS435GGFHDEL。
用XbaI和XhoI消化產(chǎn)物#10-#14，并將其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的XbaI-XhoI位點(diǎn)，從而分別獲得pRS435FGGHDEL和pRS445FGGHDEL。
用SacII和XbaI消化產(chǎn)物#7，并將其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的SacII-XbaI位點(diǎn)，從而分別獲得pRS435FHDEL和pRS445FHDEL。
用BamHI和XhoI消化產(chǎn)物#6，并將其插入到pRS435GAP和pRS445GAP的BamHI-XhoI位點(diǎn)，從而分別獲得pRS435GGHDEL和pRS445GGHDEL。
通過(guò)DNA測(cè)序證實(shí)每一種得到的質(zhì)粒DNA都具有與設(shè)計(jì)精確一致的核苷酸序列。
就用于分別表達(dá)非融合BTS1和ERG20基因的質(zhì)粒而言，采用了pRS435GAP-BTS1(稱為pRS435GG)、pRS445GAP-BTS1(稱為pRS445GG)、pRS435GAP-ERG20(稱為pRS435F)和pRS445GAP-ERG20(稱為pRS445F)。就用于表達(dá)HMG1的質(zhì)粒而言，采用的是pRS434TEF-HMG1和pRS434GAP-HMG1。
(2)重組體的制備用Frozen EZ酵母轉(zhuǎn)化試劑盒(Zymo Research，Orange，CA)將上述步驟制備的質(zhì)粒導(dǎo)入宿主，從而制備出重組體。就宿主而言，可以采用A451、YPH499、AH1(pRS434GAP-HMG1/A451)、YH1(pRS434GAP-HMG1/YPH499)、EUG5和EUG12。
(3)異戊二烯醇產(chǎn)量的測(cè)定將除EUG菌株以外的重組體接種到SD(合成右旋糖)選擇性液體培養(yǎng)基中。EUG菌株被接種到SGR培養(yǎng)基(即將SD培養(yǎng)基中的葡萄糖組分用半乳糖和棉籽糖替代后得到的培養(yǎng)基)中。然后全部在30℃下培養(yǎng)，以制備預(yù)培養(yǎng)液。將10或25μl的預(yù)培養(yǎng)液加入到1.0或2.5ml的YM7+ade培養(yǎng)基(YM，pH7，40μg/ml硫酸腺嘌呤)或YMO培養(yǎng)基[YM7+ade，1％大豆油，0.1％ADEKANOL LG-109(Asahi Denka Kogyo，Tokyo，Japan)]中，然后以130rpm，30℃下反復(fù)振蕩培養(yǎng)4天或7天。
培養(yǎng)完成后，將等體積的甲醇加入到培養(yǎng)液中，將之混合。再將大約2體積的戊烷加入到該混合液中，劇烈振蕩后靜置。將得到的相應(yīng)戊烷層轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的玻璃試管中，然后置于通風(fēng)櫥內(nèi)。戊烷在通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)后即可濃縮溶質(zhì)組分。隨后，通過(guò)GC/MS鑒定異戊二烯醇，并以十一醇為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)定量檢測(cè)。與此同時(shí)，可以將20μl培養(yǎng)液用水稀釋30倍后，在600nm測(cè)其吸光度，以考查細(xì)胞生長(zhǎng)的程度。
就GC/MS分析法而言，采用PH6890/5973 GC/MS系統(tǒng)(Hewlett-Packard，Wilmington，DE)。
(4)觀察結(jié)果通過(guò)表達(dá)融合基因獲得的最大GGOH產(chǎn)量如表11所列。
表11通過(guò)融合基因表達(dá)的最大GGOH產(chǎn)量

435GGFHDEL pRS435GGFHDEL Sc A451 YM 30960.072pRS435GGFHDEL Sc A451 YMO30960.126pRS435GGFHDEL+pRS434GAP-HMG1 Sc A451 YM 30960.540pRS435GGFHDEL+pRS434GAP-HMG1 Sc A451 YM 30168 0.760pRS435GGFHDEL+PRS434GAP-HMG1 Sc A451 YMO30960.414pRS435GGFHDEL+pRS434GAP-HMG1 Sc A451 YMO30168 3.49pRS435GGFHDEL Sc YPH499YM 30960.805pRS435GGFHDEL Sc YPH499YM 30168 0.541pRS435GGFHDEL Sc YPH499YMO30961.69pRS435GGFHDEL Sc YPH499YMO30168 2.50pRS435GGFHDEL+pRS434GAP-HMG1 Sc YPH499YM 30961.90pRS435GGFHDEL+pRS434GAP-HMG1 Sc YPH499YM 30168 2.45pRS435GGFHDEL+pRS434GAP-HMG1 Sc YPH499YMO30962.60pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YM 30955.78pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YM 30168 6.99pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YMO30963.97pRS435GGFHDEL Sc EUG5 YMO30168 10.6pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YM 30963.00pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YM 30168 1.43pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YMO30962.33pRS435GGFHDEL Sc EUG12 YMO30168 5.78EUG(ERG9p::URA3-GAL1p)-Sc EUG5 YM 30960.179-Sc EUG5 YM 30168 0.230-Sc EUG5 YMO30960.232HMG1Δ pRS434GAP-HMG026 Sc EUG5 YM 30960.093pRS434GAP-HMG044 Sc EUG5 YM 30960.087pRS434GAP-HMG056 Sc EUG5 YM 30960.108pRS434GAP-HMG062 Sc ELG5 YM 30960.132pRS434GAP-HMG076 Sc EUG5 YM 30960.148pRS434GAP-HMG081 Sc EUG5 YM 30960.140pRS434GAP-HMG100 Sc ELG5 YM 30960.184pRS434GAP-1MG112 Sc EUG5 YM 30960.340pRS434GAP-HMG122 Sc EUG5 YM 30960.127pRS434GAP-HMG133 Sc EUG5 YM 30960.714HMG1 pRS434GAP-HMG1Sc EUG8 YM 30960.074BTS1 pRS435GAP-BTS1Sc EUG8 YM 30961.42pRS445GAP-BTS1Sc EUG8 YM 30960.067-Sc EUG12 YM 30720.081-Sc EUG12 YM 30960.194-Sc EUG12 YM 30168 0.335HMG1 pRS434GAP-HMG1Sc EUG12 YM 30960.705pRS444GAP-HMG1Sc EUG12 YM 30962.05ERG20 pRS435GAP-ERG20 Sc EUG12 YM 30726.63pRS435GAP-ERG20 Sc EUG12 YM 30960.260pRS445GAP-ERG20 Sc EUG12 YM 30960.381BTS1 pRS435GAP-BTS1Sc EUG12 YM 30961.75pRS445GAP-BTS1Sc EUG12 YM 30963.70HMG1ΔpRS434GAP-HMG026 Sc EUG12 YM 30960.629pRS434GAP-HMG044 Sc EUG12 YM 30960.428pRS434GAP-HMG056 Sc EUG12 YM 30960.402pRS434GAP-HMG062 Sc EUG12 YM 30960.445pRS434GAP-HMG076 Sc EUG12 YM 30960.479pRS434GAP-HMG081 Sc EUG12 YM 30960.488pRS434GAP-HMG100 Sc EUG12 YM 30960.440pRS434GAP-HMG112 Sc EUG12 YM 30960.534pRS434GAP-HMG122 Sc EUG12 YM 30960.499pRS434GAP-HMG133 Sc EUG12 YM 30960.440-Sc EUG27 YM 30960.063HMG1 pRS434GAP-HMG1Sc EUG27 YM 30960.723pRS444GAP-HMG1Sc EUG27 YM 30960.205ERG20 pRS435GAP-ERG20 Sc EUG27 YM 30960.661pRS445GAP-ERG20 Sc EUG27 YM 30960.297BTS1 pRS435GAP-BTS1Sc EUG27 YM 30960.761pRS445GAP-BTS1Sc EUG27 YM 30960.595(4-2)在A451中ERG20和BTS1在A451中表達(dá)融合基因而引起的異戊二烯醇產(chǎn)量的變化如圖25所示。在圖25中，“435GGF”代表pRS435GGF，“435GGFHDEL”代表pRS435GGFHDEL(在以下的圖中，這些術(shù)語(yǔ)具有相同的意義)。OD600表示在600nm處的吸光度。圖25也顯示了當(dāng)整合了非融合BTS1的表達(dá)載體被導(dǎo)入A451(435GG)中時(shí)的結(jié)果。
甚至導(dǎo)入pRS445GAP-BTS1(在該圖中表示為“445GG/A451”)時(shí)，都能檢測(cè)到平均0.44mg/L的GGOH產(chǎn)量。
(4-3)在YPH499中ERG20和BTS1的表達(dá)在YPH499中表達(dá)融合基因所引起的異戊二烯醇產(chǎn)量的變化如圖26所示。在圖26中，“499”代表YPH499；“435GGF”代表pRS435GGF；“445GGFHDEL”代表pRS445GGFHDEL(在以下的圖中，這些術(shù)語(yǔ)具有相同的意義)。圖26也顯示了當(dāng)整合了非融合BTS1的表達(dá)載體被導(dǎo)入YPH499中時(shí)的結(jié)果。
當(dāng)導(dǎo)入的是pRS435GAP-BTS1(該圖中表示為“435GG/499”)時(shí)，能檢測(cè)到平均0.11mg/L的GGOH產(chǎn)量。當(dāng)導(dǎo)入的是整合有ERG20-BTS1融合基因的pRS435FGG(該圖中表示為“435FGG/499”)時(shí)，能檢測(cè)到平均0.20mg/L的GGOH產(chǎn)量。當(dāng)導(dǎo)入的是pRS435GGF(該圖中表示為“435GGF/499”)時(shí)，能檢測(cè)到平均0.39mg/L的GGOH產(chǎn)量。當(dāng)導(dǎo)入的是pRS35GGFHDEL(該圖中表示為“435GGFHDEL/499”)時(shí)，能檢測(cè)到平均0.62mg/L的GGOH產(chǎn)量。這就驗(yàn)證融合基因和HDEL序列對(duì)改進(jìn)GGOH產(chǎn)率是有效的。
(4-4)在YPH499中HMG1、ERG20和BTS1的表達(dá)本發(fā)明者認(rèn)為，通過(guò)在克隆pRS434GAP-HMG1/YPH499(YH1)和pRS434TEF-HMG1/YPH499中共表達(dá)HMG1和其它基因，是有可能從而獲得具有更高GGOH產(chǎn)率的克隆的。克隆pRS434GAP-HMG1/YPH499(YH1)和pRS434TEF-HMG1/YPH499是通過(guò)導(dǎo)入一個(gè)HMG1表達(dá)載體到Y(jié)PH499中而獲得的。
圖27顯示的是當(dāng)把一個(gè)非融合EPG20或BTS1整合的表達(dá)載體進(jìn)一步導(dǎo)入宿主克隆時(shí)，異戊二烯醇的產(chǎn)量，該宿主克隆是通過(guò)將pRS434TEF-HMG1導(dǎo)入到Y(jié)PH499中而獲得的。圖27中，“434TEFp-HMG1”表示導(dǎo)入pRS434TEF-HMG1的克隆。TEFp是TEF2基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子?！?99”表示YPH499?！?35F”表示pRS435F，“445F”表示pRS445F。(這些術(shù)語(yǔ)在下面的其它圖中也具有相同的意義)當(dāng)單獨(dú)把BTS1導(dǎo)入YPH499中時(shí)，GGOH產(chǎn)量?jī)H為0.11mg/L。另一方面，當(dāng)把BTS1表達(dá)載體導(dǎo)入TEF2p-HMG1-轉(zhuǎn)化的克隆中時(shí)，GGOH產(chǎn)量平均為0.40mg/L(見(jiàn)圖27中的“435GG&434TEFp-HMG1/499”)；當(dāng)把BTS1表達(dá)載體導(dǎo)入GAPp-HMG1-轉(zhuǎn)化的克隆中時(shí)，產(chǎn)出GGOH為0.49mg/L(見(jiàn)圖27中的“435GG&434GAPp-HMG1/499”)。這就顯示出通過(guò)HMG輔酶A還原酶基因和一個(gè)異戊二烯基二磷酸合酶基因的共表達(dá)，構(gòu)建一個(gè)大量制備異戊二烯醇體系的可能性。
隨后，以GAPp-HMG1轉(zhuǎn)化的YH1(pRS434GAP-HMG1/YPH499)為宿主，本發(fā)明制備的ERG20-BTS1融合基因或含HDEL信號(hào)的基因與TDH3轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子GAPp(TDH3p)一起在該宿主中得以表達(dá)。測(cè)定所得克隆的異戊二烯醇的產(chǎn)量。
結(jié)果如圖28所示。圖28中，“434GAPp-HMG1”表示導(dǎo)入pRS434GAP-HMG1的克隆。GAPp是TDH3基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。當(dāng)一個(gè)連接有HDEL信號(hào)的異戊二烯基二磷酸合酶基因和HMG1共表達(dá)時(shí)，GGOH產(chǎn)率可以提高。通過(guò)導(dǎo)入ERG20-BTS1融合基因可以進(jìn)一步提高產(chǎn)率。尤其是pRS435GGF轉(zhuǎn)化克隆與pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化克隆表現(xiàn)出顯著的提高。它們分別平均產(chǎn)出1.55mg/L和1.50mg/L的GGOH。(見(jiàn)圖28中“435GGF & 434GAPp-HMG1/499”和“435GGFHEDL &434GAPp-HMG1/499”)(4-5)在含大豆油的培養(yǎng)基中的異戊二烯醇產(chǎn)量ERG20-BTS1融合基因轉(zhuǎn)化的克隆，即本發(fā)明構(gòu)建的產(chǎn)GGOH重組體，在YM7(YM，pH7)培養(yǎng)基和YMO(YM7，0.1％ADEKANOL LG109，1％大豆油)培養(yǎng)基中各培養(yǎng)4-7天，繼而測(cè)定異戊二烯醇產(chǎn)量。以A451衍生的克隆為宿主得到的結(jié)果如圖29A和29B所示。以YPH499衍生的克隆為宿主得到的結(jié)果如圖30A和30B所示。在圖29A和29B中，“AH1”代表pRS434GAPp-HMG1/451，“GGFHDEL”代表pRS435GGFHDEL?！?1”代表培養(yǎng)4天后的產(chǎn)量，“-2”代表培養(yǎng)7天后的產(chǎn)量。由于細(xì)胞懸浮在YMO培養(yǎng)基中的大豆油里，細(xì)胞量以細(xì)胞的個(gè)數(shù)表示?！?03細(xì)胞/μl”意指每微升的細(xì)胞個(gè)數(shù)除以1000。
在YM7培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天的pRS435GGF/A451平均產(chǎn)出0.26mg/L的GGOH(圖29A；上圖；GGF/A451-2)，在YMO培養(yǎng)基中產(chǎn)量增加到平均0.98mg/L的GGOH(圖29B；上圖；GGF/A451-2)。同樣，當(dāng)以AH1(pRS434GAP-HMG1轉(zhuǎn)化的A451)為宿主時(shí)，pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的重組體平均產(chǎn)出2.5mg/L的GGOH(圖29B；中圖；GGFHDEL/AH1-2)，在YMO培養(yǎng)基中最多產(chǎn)出3.5mg/L的GGOH(表11；見(jiàn)基因名稱“435GGFHDEL”下面一行)。甚至當(dāng)以EUG5為宿主時(shí)，該宿主的獲得是通過(guò)將A451的ERG9轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子替換為GAL1啟動(dòng)子(見(jiàn)實(shí)施例6)，pRS435GGF轉(zhuǎn)化的重組體在YMO培養(yǎng)基中也能產(chǎn)出更多的GGOH。當(dāng)在YM7培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天該重組體，可以平均產(chǎn)出6.6mg/L的GGOH(圖29A；下圖；GGF-EUG5-2)，而在YMO培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天該重組體，GGOH產(chǎn)量可增加到平均9.6mg/L(圖29B；下圖；GGF/EUG5-2)。
當(dāng)以YPH499衍生的克隆為宿主時(shí)，也可觀測(cè)到Y(jié)MO培養(yǎng)基的使用對(duì)GGOH產(chǎn)率的促進(jìn)作用(圖30A和30B)。在YM7培養(yǎng)基培養(yǎng)7天的pRS435GGF轉(zhuǎn)化的YPH499可以產(chǎn)出平均0.19mg/L的GGOH(圖30A；上圖；GGF/YPH499-2)，而在YMO培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天可以產(chǎn)出平均2.5mg/L的GGOH(圖30B；上圖；GGF/YPH499-2)。進(jìn)一步地，將pRS435GGF或pRS435GGFHDEL導(dǎo)入共表達(dá)HMG1的YH1中，并在YMO培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，兩種重組體均產(chǎn)出平均5.6mg/L的GGOH(圖30B；中圖；GGF/YH1-2和GGFHDEL/YH1-2)。當(dāng)以EUG12為宿主時(shí)，該宿主構(gòu)建自YPH499，且構(gòu)建方式與構(gòu)建EUG5的方式相同(見(jiàn)實(shí)施例6)，pRS435GGF轉(zhuǎn)化的重組體或pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的重組體產(chǎn)出大約3.7-4.0mg/L的GGOH。因此建議可用HMG1和一個(gè)異戊二烯基二磷酸合酶基因的組合提高YPH499衍生的克隆的GGOH產(chǎn)率。
培養(yǎng)基中不同葡萄糖-半乳糖組分對(duì)異戊二烯醇制備的作用(1)載體導(dǎo)入宿主及宿主的培養(yǎng)該實(shí)施例中，檢測(cè)了在芽殖酵母中異戊二烯醇的產(chǎn)出如何隨著不同葡萄糖-半乳糖(Glc-Gal)組成比例變化。另外，也檢測(cè)了BTS1-ERG20融合基因的表達(dá)對(duì)異戊二烯醇制備的作用。
采用購(gòu)自Zymo Research(Orange，CA)的Frozen EZ酵母轉(zhuǎn)化II型試劑盒將載體導(dǎo)入酵母宿主。就用于BTS1-ERG20融合基因的表達(dá)載體而言，采用pRS435GGF和pRS435GGFHDEL。就宿主而言，可用A451、YPH499、AH1、EUG5和EUG12。將每一種得到的轉(zhuǎn)化體分別培養(yǎng)在以適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)缺陷體為指示因子的基于SGR的選擇性培養(yǎng)基的瓊脂平板上。為克隆，進(jìn)行2次在選擇性培養(yǎng)基瓊脂平板上的培養(yǎng)。
將制備的轉(zhuǎn)化體預(yù)培養(yǎng)在SGR選擇性培養(yǎng)基上。然后，把0.01-0.05ml的預(yù)培養(yǎng)液加入到1-5ml的YM7培養(yǎng)基中，在18mm直徑的試管中，30℃、130rpm反復(fù)振蕩培養(yǎng)。預(yù)先制備五種有下列糖組分(Glc-Gal組成比例)的YM7培養(yǎng)基0％Glc-100％Gal；20％Glc-80％Gal；50％Glc-50％Gal；75％Glc-25％Gal；和100％Glc-0％Gal。首先，在這些培養(yǎng)基中30℃、130rpm反復(fù)振蕩培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)兩天后，向每種培養(yǎng)基中進(jìn)一步加入Glc，以達(dá)到5％的終濃度(w/v)。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞到第七天。
(2)結(jié)果(2-1)通過(guò)A451制備GGOH當(dāng)pRS435GGF和pRS435GGFHDEL被分別導(dǎo)入A451時(shí)的GGOH產(chǎn)量如圖31A-31C所示。在兩種情況中，檢測(cè)出很少的GGOH。典型地，當(dāng)初始葡萄糖比例為20％時(shí)，培養(yǎng)4天的pRS435GGFHDEL/A451顯示出最高的GGOH產(chǎn)量(平均為0.56mg/L)。
(2-2)通過(guò)AH1制備GGOH當(dāng)pRS435GGF和pRS435GGFHDEL被分別導(dǎo)入AH1時(shí)的GGOH產(chǎn)量如圖33A-32C所示。當(dāng)初始葡萄糖比例為20％時(shí)，培養(yǎng)2-4天的BTS1-ERG20融合基因轉(zhuǎn)化的AH1克隆也顯示出最高的GGOH產(chǎn)量(3.32mg/L)。當(dāng)初始葡萄糖比例為50-80％時(shí)，培養(yǎng)7天的這些克隆顯示出最高的GGOH產(chǎn)量(平均4.13mg/L)。
(2-3)通過(guò)EUG5制備GGOH當(dāng)pRS435GGF和pRS435GGFHDEL被分別導(dǎo)入EUG5時(shí)的GGOH產(chǎn)量如圖33A-33C所示。當(dāng)初始葡萄糖比例為20-80％時(shí)，培養(yǎng)2-4天的pRS435GGF轉(zhuǎn)化克隆和pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化克隆中獲得了好的結(jié)果。
(2-4)通過(guò)YPH499制備GGOH當(dāng)pRS435GGF和pRS435GGFHDEL被分別導(dǎo)入YPH499時(shí)的GGOH產(chǎn)量如圖34A-34C所示。同通過(guò)A451制備GGOH的情況一樣，檢測(cè)出很少的GGOH。
(2-5)通過(guò)YH1制備GGOH當(dāng)pRS435GGF和pRS435GGFHDEL被分別導(dǎo)入YH1時(shí)的GGOH產(chǎn)量如圖35A-35C所示。當(dāng)初始葡萄糖比例為100％時(shí)，培養(yǎng)7天的重組體克隆獲得了高的GGOH產(chǎn)量。
(2-6)通過(guò)EUG12制備當(dāng)pRS435GGF和pRS435GGFHDEL被分別導(dǎo)入EUG12時(shí)的GGOH產(chǎn)量如圖36A-36C所示。當(dāng)初始葡萄糖比例為20％時(shí)，兩種重組體克隆都顯示出高的異戊二烯醇產(chǎn)率。當(dāng)pRS435GGF/EUG12在初始葡萄糖比例為20％時(shí)培養(yǎng)4天，盡管細(xì)胞量相當(dāng)于OD600＝1.1，該克隆仍產(chǎn)出7.6mg/L的FOH及5.4mg/L的GGOH?？紤]到細(xì)胞平均產(chǎn)量，這些制備結(jié)果被認(rèn)為是非常有效。
pRS435GGF/YH1和15-2的發(fā)酵罐培養(yǎng)(1)pRS435GGF/YH1為大量制備GGOH，將可以優(yōu)先產(chǎn)出5.6mg/LGGOH(見(jiàn)實(shí)施例10)的pRS435GGF/YH1克隆按下文描述的條件在發(fā)酵罐中培養(yǎng)。
<發(fā)酵罐培養(yǎng)基>
5％葡萄糖(YM本身含1％葡萄糖。因此，葡萄糖的終濃度為6％)YM肉湯(Difco)3％大豆油(Nacalai Tesque)0.1％ADEKANOL LG109(Asahi Denka)<操作條件>
培養(yǎng)設(shè)備MSJ-U 10L培養(yǎng)設(shè)備(B.E.Marubishi)培養(yǎng)基體積5L培養(yǎng)溫度33℃通氣速率1vvm攪拌速率300rpmpH用4N的氫氧化鈉溶液和2N的鹽酸溶液按下列參數(shù)適當(dāng)?shù)乜刂票壤齾^(qū) 1.00不敏感區(qū)0.15控制周期16秒全沖程 1秒最小沖程0秒結(jié)果是，培養(yǎng)RS435GGF/YH1克隆115小時(shí)產(chǎn)出128mg/L的GGOH。與此同時(shí)，鯊烯(SQ)、FOH和橙花叔醇(NOH)的產(chǎn)量分別為15mg/L、5mg/L和幾乎為0。因此，發(fā)明者成功構(gòu)建了一個(gè)通過(guò)發(fā)酵大量單獨(dú)制備GGOH的體系(圖37)。
(2)15-2克隆將實(shí)施例7中描述的15-2克隆(保留pYHMG044的AURGG101)從斜面接種到GSM-URA(BIO101)+DOB(BI0101)培養(yǎng)基(200ml，置于一個(gè)配有一個(gè)閥門的500ml三頸瓶)，并于30℃、130rpm培養(yǎng)2天。隨后，重復(fù)3次離心(1500rpm，5分鐘，4℃)和用滅菌的生理鹽水洗滌的操作，以完全將培養(yǎng)液中所含的葡萄糖除去。接著，與上文(1)中培養(yǎng)pRS435GGF/YH1所用的條件相同，在發(fā)酵罐中培養(yǎng)50ml的該預(yù)培養(yǎng)液。然而，采用的培養(yǎng)基如下所示，培養(yǎng)溫度為26℃。
<發(fā)酵罐培養(yǎng)基>
5％半乳糖(YM含1％葡萄糖。因此，糖的終濃度為6％)無(wú)氨基酸YMB(Difco)1％大豆油(Nacalai Tesque)0.1％ADEKANOL LG109(Asahi Denka)結(jié)果是，培養(yǎng)150小時(shí)的15-2克隆可以產(chǎn)出3mg/L的GGOH。(圖38)[實(shí)施例13]融合基因的表達(dá)為了驗(yàn)證pRS435GGF轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是否表達(dá)各自的融合基因產(chǎn)物，需要通過(guò)RNA印跡雜交和蛋白質(zhì)印跡雜交分析轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和翻譯產(chǎn)物。
(1)RNA印跡雜交圖39顯示的是對(duì)YPH499衍生重組體和YH1衍生重組體的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RNA印跡雜交分析的結(jié)果，YPH499衍生重組體中獨(dú)立導(dǎo)入了pRS435GGF和pRS435GGFHDEL，YH1衍生重組體中獨(dú)立導(dǎo)入了pRS435GGF和pRS435GGFHDEL。就探針而言，采用的是位于編碼α微管蛋白的TUB1基因編碼區(qū)的一個(gè)DNA片段和ERG20探針，BTS1探針和HMG1探針，后三種探針列于實(shí)施例7的表7中。TUB1探針的制備方式與實(shí)施例7描述的方式相同，即采用下文介紹的寡聚核苷酸TUB1f-2和TUB1r-2。RNA的制備及RNA印跡雜交以實(shí)施例7描述的方式進(jìn)行。
TUB1f-25’-ACG GTA AGA AAT CCA AGC-3’(SEQ ID NO119)
TUB1r-25’-TAT GAG TCG GCA CCC ACT-3’(SEQ ID NO120)圖39中，“-”指來(lái)自那些沒(méi)有導(dǎo)入含異戊二烯基二磷酸合酶基因質(zhì)粒的細(xì)胞的RNA樣品；“GGF”指來(lái)自pRS435GGF轉(zhuǎn)化重組體的RNA樣品；“HDEL”指來(lái)自pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化重組體的RNA樣品；“HMG1”指來(lái)自YH1衍生的重組體的RNA樣品。從采用探針TUB1(微管蛋白α基因)獲得的結(jié)果看，可以認(rèn)定從每一份制備樣本中得到了幾乎等量的信使RNA。當(dāng)采用探針ERG20和探針BTS1時(shí)，檢測(cè)出一個(gè)過(guò)表達(dá)、共有的長(zhǎng)度為3.1kbp的條帶，這說(shuō)明融合基因被有效轉(zhuǎn)錄了。采用探針ERG20檢測(cè)出長(zhǎng)度為1.8kb的條帶被認(rèn)為是基因組中的野生型ERG20基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。采用探針HMG1獲得的結(jié)果顯示在所有預(yù)先導(dǎo)入pRS434GAP-HMG1的克隆(即YH1衍生的克??；圖39中標(biāo)有“HMG1”的泳道中都大量檢測(cè)出長(zhǎng)度為4.1kbp的RNA(質(zhì)粒來(lái)源HMG1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)。這說(shuō)明即使異戊二烯基二磷酸合酶表達(dá)質(zhì)粒被作為第二質(zhì)粒進(jìn)一步導(dǎo)入，HMG1的轉(zhuǎn)錄仍有效地進(jìn)行。
(2)蛋白質(zhì)印跡雜交根據(jù)被ERG20和BTS1編碼多肽的C端序列，化學(xué)合成具有下述氨基酸序列的多肽。以這些多肽為抗原，通過(guò)傳統(tǒng)方法(描述在常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)如F.M.Ausubel et al.Eds，Short Protocols inMolocular Biology，4th Edition，(1999)John Wiley & Sons，Inc.，New York)制備鼠抗體。將下列肽各2mg交聯(lián)到KLH(KeyholeLimpet Hemocyanin)，并用作抗原。
BTS1-CNH2 Cys Tyr Ile Ile Asp His Leu Ser Glu Leu COOH(SEQ ID NO121)ERG20-CNH2 Cys Leu Asn Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys COOH(SEQ ID NO122)從6種菌株/克隆YPH499、pRS435F/YPH499、pRS435GGF/YPH499、pRS435FGG/YPH499、pRS435GGFHDEL/YPH499和pRS435GGF/YH1中制備蛋白質(zhì)的方法如下，由蛋白質(zhì)印跡分析制備的蛋白質(zhì)。簡(jiǎn)言之，將每種菌株/克隆的預(yù)培養(yǎng)液(檢測(cè)600nm處的吸光度，并且每種培養(yǎng)掖需經(jīng)生理鹽水稀釋以獲得等量的細(xì)胞)接種至一種選擇性培養(yǎng)基[對(duì)YPH499而言，采用SD培養(yǎng)基DOB(dropout base碳源為葡萄糖的基本培養(yǎng)基)，其中加入了可作為氨基酸或核酸組分的CSM(完全的補(bǔ)充混合物)；對(duì)pRS435F/YPH499而言，采用SD-L培養(yǎng)基(缺少亮氨酸的SD培養(yǎng)基)；對(duì)pRS435GGF/YPH499而言，采用SD-L培養(yǎng)基；對(duì)pRS435GG/YPH499而言，采用SD-L培養(yǎng)基；對(duì)pRS435GGFHDEL/YPH499而言，采用SD-L培養(yǎng)基；對(duì)pRS435GGF/YH1而言，采用SD-LW培養(yǎng)基(缺少亮氨酸和色氨酸的SD培養(yǎng)基)]，并在30℃、130rpm振蕩培養(yǎng)4天。離心收獲細(xì)胞后，每1g細(xì)胞加入2ml的Y-PER(PIERCE，Rockford，IL)，并于室溫下劇烈搖動(dòng)1小時(shí)以制備總蛋白溶液。20μg得到的總蛋白通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE；操作步驟見(jiàn)Short Protocols in Molecular Biology，4th Edition，(1999)John Wiley & Sons，Inc.，New York)以分子量為基礎(chǔ)分離開，再通過(guò)蛋白質(zhì)印跡(見(jiàn)Short Protocols inMolecular Biology，4th Edition，(1999)John Wiley & Sons，Inc.，New York)檢測(cè)導(dǎo)入得到的重組體的基因的表達(dá)情況。本節(jié)用到的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)在下列幾點(diǎn)有部分改動(dòng)。
1)用第一抗體處理PVDF膜的條件常規(guī)步驟中，在TBST中的第一抗體的10-1000倍稀釋液中振蕩PVDF膜30-60分鐘。
改動(dòng)步驟中，在TBST中的上文提到的抗肽的2000倍稀釋液中振蕩PVDF膜60分鐘。
2)PVDF膜的洗滌條件常規(guī)步驟中，用200mlTBST溶液洗滌膜4次，每次15分鐘。
改動(dòng)步驟中，用80ml的TBST溶液洗滌膜5次，每次5分鐘。
3)用第二抗體對(duì)PVDF膜的處理常規(guī)步驟中，用封閉液將抗IgG(H+L)堿性磷酸酶結(jié)合物稀釋200-2000倍，然后將PVDF膜浸泡其中并振蕩30-60分鐘。
改動(dòng)步驟中，將PVDF膜浸泡在TBST中的抗IgG(H+L)堿性磷酸酶結(jié)合物4000倍稀釋液中，并振蕩30分鐘。
4)檢測(cè)抗原蛋白質(zhì)條帶的方法常規(guī)步驟中，用TBST和TBS洗滌的PVDF膜浸泡在BCIP(4-溴-4-氯-3-吲哚氧基-磷酸鹽)/NBT(氮藍(lán)四唑)混合物中30分鐘，以上色。
改動(dòng)步驟中，用TBST和TBS洗滌的PVDF膜浸泡在含有穩(wěn)定的底物小鼠溶液(Promega，Madison，WI)的ProtoBlot II AP System中20-40秒以上色。
蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果如圖40所示。在圖40中，“M”代表分子標(biāo)記泳道?！癋”、“GGF”、“GGFHDEL”和“GGF/YH1”代表分別來(lái)自pRS435F/YPH499、pRS435GGF/YPH499、pRS435FGG/YPH499、pRS435GGFHDEL/YPH499和pRS435GGF/YH1的蛋白質(zhì)電泳后的泳道。
當(dāng)采用可檢測(cè)被BTS1編碼多肽的抗BTS1-C小鼠抗體時(shí)，可檢測(cè)出相當(dāng)于大約79kDa融合蛋白(分別為GGF、FGG和GGFHDEL)的多肽(見(jiàn)圖40，空心三角標(biāo)記表示遷移率的條帶)。從這些結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)來(lái)源自ERG20-BTS1融合基因的FPP合酶-GGPP合酶融合蛋白實(shí)際上在pRS435GGF轉(zhuǎn)化重組體和pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化重組體中被表達(dá)。同樣，預(yù)期由于在來(lái)自YPH499的蛋白質(zhì)中沒(méi)有檢測(cè)出條帶，在非重組細(xì)胞中被BTS1基因編碼的GGPP合酶幾乎沒(méi)有表達(dá)。
當(dāng)采用可檢測(cè)被ERG20編碼多肽的抗ERG20-C小鼠抗體時(shí)，結(jié)果顯示分子量(大約40kDa)相當(dāng)于被ERG20編碼的FPP合酶的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平在pRS435F轉(zhuǎn)化克隆中有提高(泳道“F”)(實(shí)心三角標(biāo)記表示遷移率的條帶)。在pRS435GGF轉(zhuǎn)化克隆(泳道“GGF”)和pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化克隆(泳道“GGFHDEL”)中，檢測(cè)出了相當(dāng)于融合蛋白(GGF和GGFHDEL)的多肽(顯示了對(duì)應(yīng)于79kDa遷移率的條帶，以空心三角標(biāo)記)。用抗ERG20-C抗體沒(méi)有檢測(cè)出應(yīng)該在pRS435FGG轉(zhuǎn)化克隆中表達(dá)的融合基因。相信這種情況的發(fā)生是因?yàn)樵谌诤厦钢蠫GPP合酶被融合到的FPP合酶C端，使得可以識(shí)別FPP合酶的C端部分的抗ERG20-C抗體不能很好地識(shí)別融合酶。在采用抗ERG20-C抗體檢測(cè)出的其它條帶中，一個(gè)大約45kDa的條帶被認(rèn)為是一個(gè)非特異性檢測(cè)的蛋白質(zhì)。小于40kDa的條帶被認(rèn)為是非特異性檢測(cè)的蛋白質(zhì)或是含有被ERG20基因編碼氨基酸序列的蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物。
當(dāng)HMG輔酶A還原酶基因和GGF融合基因共表達(dá)時(shí)制備GGOH為了確定增強(qiáng)HMG輔酶A還原酶基因和編碼GGPP合酶-FPP合酶融合蛋白的BTS1-ERG20融合基因的表達(dá)是否也有可能從除YPH499以外的菌株(ATCC76625、MATa ura 3-52 lys2-801 ade2-101 trp1Δ63his3Δ200 leu2Δ1)中獲得有利于工業(yè)生產(chǎn)GGOH的克隆，采用pRS434GAP-HMG1、pRS435GGF和pRS435GGFHDEL轉(zhuǎn)化下列菌株。
INVSc1(MATa/MATa ura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289 his3Δ1/his3Δ1 leu2/leu2)YPH500(ATCC76626，MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1Δ63 his3Δ200 leu2Δ1)YPH501(ATCC76627，MATa/MATa ura3-52/ura3-52 lys2-801/lys2-801 ade2-101/ade2-101 trp1Δ63/trp1-Δ63 his3Δ200/his3Δ200 leu2Δ1/leu2Δ1)W303-1A(ATCC208352，MATa leu2-3 leu2-112 his3-11 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100)W303-1B(ATCC208353，MATa leu2-3 leu2-112 his3-11 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100)簡(jiǎn)言之，將pRS434GAP-HMG1導(dǎo)入INVSc1、YPH500、YPH501、W303-1A和W303-1B，從而分別獲得IH1、YH2、YH3、WH1和WH2。以這些重組體為宿主，再導(dǎo)入pRS435GGF，獲得GGF/IH1、GGF/YH2、GGF/YH3、GGF/WH1和GGF/WH2。同樣，導(dǎo)入pRS435GGFHDEL到這些宿主內(nèi)，可獲得HDEL/IH1、HDEL/YH2、HDEL/YH3、HDEL/WH1和HDEL/WH2。在YPHO7富集培養(yǎng)基里培養(yǎng)這些重組體，繼而測(cè)定異戊二烯醇的產(chǎn)率。結(jié)果如圖41所示。每種重組體都優(yōu)先產(chǎn)出GGOH，并且它們中的大部分都可產(chǎn)出100mg/L或更多的GGOH。尤其是HDEL/YH2克隆可最多產(chǎn)出189mg/L的GGOH。
當(dāng)共表達(dá)HMG-Co還原酶基因和GGF融合基因的克隆被轉(zhuǎn)化成原養(yǎng)型并二倍體化后GGOH的制備通過(guò)用相應(yīng)的野生型基因替換導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)缺陷體的突變基因，使產(chǎn)GGOH克隆GGF/YH1被轉(zhuǎn)化為原養(yǎng)型微生物(一種無(wú)需在培養(yǎng)基中補(bǔ)充特定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也可以生長(zhǎng)的菌株)，再通過(guò)與一個(gè)YPH500衍生的克隆雜交進(jìn)行二倍體化，從而獲得GGF/YH3-AHKU克隆。制備步驟描述如下。
(1)導(dǎo)入HIS3和ADE2到GGF/YH1及導(dǎo)入LYS2和URA3到Y(jié)PH500以用PvuII和XhoI消化的pRS403GAP為模板，以寡聚核苷酸HIS3-L(5’TTT TAA GAG CTT GGT GAG CGC 3’(SEQ ID NO123))和HIS3-R(5’TCG AGT TCA AGA GAA AAA AAA 3’(SEQ ID NO124))為引物DNA，按如下條件PCR制備一個(gè)HIS3片段。
0.1μg/L模板DNA1μL100pmol引物DNA11μL100pmol引物DNA21μL10×Pyrobest緩沖液 10μL2mM dNTPmix8μL5u/μLPyrobest DNA聚合酶 0.5μLH2O 78.5μL采用相同的方式，即以經(jīng)PvuII和XhoI消化的pRS406GAP為模板，以寡聚核苷酸URA3-L(5’TTC AAT TCA TCA TTT TTT TTT 3’(SEQID NO125))和URA3-R(5’GGG TAA TAA CTG ATA TAA TTA 3’(SEQID NO126))為模板DNA，制備URA3片段。
A451染色體DNA為模板，以ADE-1(5’ATG GAT TCT AGA ACAGTT GGT 3’(SEQ ID NO127))和ADE-2(5’TTA CTT GTT TTC TAGATA AGC 3’(SEQ ID NO128))或LYS-1(5’ATG ACT AAC GAA AAGGTC TGG 3’(SEQ ID NO129))和LYS-2(5’TTA AGC TGC TGC GGAGCT TCC 3’(SEQ ID NO130))為引物DNA，在相同的反應(yīng)條件下制備ADE2片段和LYS2片段。將得到的HIS3片段和ADE2片段相繼導(dǎo)入pRS435GGF/YH1，從而獲得pRS435GGF/YH1-AH，它表現(xiàn)出無(wú)組氨酸需求和無(wú)腺嘌呤需求的表型。另一方面，將LYS2片段和URA3片段相繼導(dǎo)入YPH500，從而獲得YPHS00-KU，該重組體表現(xiàn)出無(wú)賴氨酸需求和無(wú)尿嘧啶需求的表型。
(2)雜交在YM培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)pRS435GGF/YH1-AH和YPH500-KU，并在DOB(dropout base)瓊脂平板培養(yǎng)基上劃線，使得兩種克隆彼此交錯(cuò)。然后，在30℃下培養(yǎng)細(xì)胞3天。挑出出現(xiàn)在平板上的菌落，并將之培養(yǎng)在前孢子形成平板培養(yǎng)基上(含1.6g酵母提取物、0.6g聚蛋白胨、100ml 20％葡萄糖和4g/L瓊脂)，繼而在孢子形成平板培養(yǎng)基上(含2g乙酸鉀、0.2g酵母提取物、500μl 20％葡萄糖和4g/L瓊脂)培養(yǎng)。通過(guò)顯微鏡觀察證實(shí)有孢子形成。因?yàn)榭梢栽贒OB平板(一種基本培養(yǎng)基)上生長(zhǎng)，可以證實(shí)該克隆已轉(zhuǎn)化為原養(yǎng)型，并且因?yàn)榭梢栽阪咦有纬膳囵B(yǎng)基上形成孢子，也證實(shí)該克隆已二倍體化。該克隆被命名為GGF/YH3-AHKU。
通過(guò)補(bǔ)料-分批培養(yǎng)制備GGOH(1)在下述條件下對(duì)GGF/YH3-AHKU進(jìn)行補(bǔ)料-分批培養(yǎng)，并測(cè)定GGOH產(chǎn)量。
(1)種子前培養(yǎng)培養(yǎng)基組分如下酵母提取物5g/L、麥芽提取物5g/L、Bacto蛋白胨10g/L、葡萄糖5g/L。
該培養(yǎng)基的pH未調(diào)節(jié)。將50ml該培養(yǎng)基置于一個(gè)500mlSakaguchi燒瓶中，并于120℃下滅菌20分鐘。從斜面刮下一滿接種環(huán)的GGF/YH3-AHKU，于120rpm、30℃下反復(fù)振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。OD(于562nm處測(cè)26倍的稀釋液)達(dá)到0.4。
(2)種子培養(yǎng)培養(yǎng)基組分如下葡萄糖20g/L、MAMENO(Ajinomoto Co.，Inc.)310mg/L(以總氮量計(jì)算)、KH2PO43g/L、MgSO40.5g/L、硫酸銨5g/L、CaCl20.5g/L、和消泡劑0.1ml/L。如果MAMENO的總氮濃度為63g/L，則加入到培養(yǎng)基中的MAMENO的量為4.9ml/L。
完全各種溶解培養(yǎng)基組分后，用KOH溶液將每一組分的pH值調(diào)節(jié)到5.0。調(diào)整液體體積后，將每一組分在120℃下滅菌20分鐘。
種子培養(yǎng)采用1升的小型發(fā)酵罐。將300ml的培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐內(nèi)，再接種0.06-1ml的種子前培養(yǎng)物。接種前，將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)到5.5。通氣率為1/2vvm，溫度設(shè)置為30℃。用氨水控制pH為5.5。攪拌，開始時(shí)為500rpm，然后設(shè)置為級(jí)聯(lián)控制，使得溶解氧(DO)＞20％。在pH值上升的時(shí)間點(diǎn)終止種子培養(yǎng)。OD(562nm處測(cè)51倍稀釋液)達(dá)到0.18-0.2。上述的溶解氧量是以飽和量為100％進(jìn)行計(jì)算。
(3)主培養(yǎng)培養(yǎng)基組成如下表12所示。區(qū)塊A、區(qū)塊B、區(qū)塊C和區(qū)塊D的液體體積與主培養(yǎng)物總體積的比分別為20％、20％、30％和20％。用硫酸處理玉米漫漬液(CSL)，使其pH值調(diào)整為2.0，然后在80℃預(yù)滅菌1小時(shí)。列于表12中的CSL濃度是根據(jù)總氮量表示的。加入了31.4g/L的CSL本身才達(dá)到該濃度。將每一區(qū)塊在120℃下滅菌20分鐘后，混合在一起。調(diào)整液體體積后，將混合液置于容器中。
表12

主培養(yǎng)采用1升的小型發(fā)酵罐。將10％種子培養(yǎng)液加入到上面的混合液后，罐內(nèi)主培養(yǎng)總體積為300ml。由于滅菌后培養(yǎng)基的pH值在2.6左右，在接種前需要提高。通氣速率為1/2vvm，溫度設(shè)置為30℃。用氨水控制pH為5.5。攪拌，開始時(shí)為500rpm，然后設(shè)置為級(jí)聯(lián)控制，使得溶解氧(DO)＞20％。葡萄糖的補(bǔ)料開始于培養(yǎng)2小時(shí)后，以流速逐漸增加的方式進(jìn)行，如圖42所示。最大流速為3.5ml/小時(shí)，這相當(dāng)于大約5.8g葡萄糖/L/小時(shí)。當(dāng)通過(guò)攪拌難以保證足夠的溶解氧(DO＞20％)時(shí)，就增加通氣體積。大約培養(yǎng)20小時(shí)后，補(bǔ)充預(yù)先確定量的補(bǔ)料液。與此同時(shí)，OD(562nm處測(cè)101倍的稀釋液)達(dá)到0.9-1.0。
其后，根據(jù)培養(yǎng)條件改變補(bǔ)料和其它參數(shù)。
(1)培養(yǎng)條件的檢驗(yàn)在相同條件下培養(yǎng)細(xì)胞20小時(shí)后，檢測(cè)葡萄糖和乙醇對(duì)GGOH生產(chǎn)的影響。
簡(jiǎn)言之，將400g/L的乙醇溶液(區(qū)塊1)和500g/L的葡萄糖溶液(區(qū)塊2)補(bǔ)料到培養(yǎng)液中。進(jìn)一步將區(qū)塊1中的乙醇溶液和區(qū)塊2中的葡萄糖溶液1∶1混合以制備區(qū)塊3。補(bǔ)料液的流速最大設(shè)置為3.5ml/小時(shí)，并且需控制得使培養(yǎng)液中的底物濃度為1.0g/L或更低。累積GGOH量如表13所示。發(fā)現(xiàn)通過(guò)補(bǔ)料可作為碳源的乙醇，增加了GGOH的累積量。
表13
通過(guò)補(bǔ)料-分批培養(yǎng)制備GGOH(2)將GGF/YH3-AHKU克隆接種至200ml的DOB(dropout base)葡萄糖基本培養(yǎng)基(Q BIOgene，Carlsbad，CA)，在30℃下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)3天。隨后，將得到的培養(yǎng)液全部接種至3.35L的含0.09％葡萄糖、0.075％KH2PO4、0.14％硫酸鎂、0.45％硫酸銨、5.4％玉米浸漬液、0.031％氯化鈣和0.15％ADEKANOL LG109(Asahi Denka)的培養(yǎng)基(用氨水預(yù)調(diào)為pH5.5)，并在下述條件下培養(yǎng)。采用罐1、罐2和罐3進(jìn)行分批培養(yǎng)。
培養(yǎng)設(shè)備MSJ-U2W(10L發(fā)酵罐)(B.E.Marubishi，Chiyoda-ku，Tokyo)培養(yǎng)溫度33℃通氣速率0.74vvm攪拌速率900rpmpH5.5(用4N的氫氧化鈉溶液和2N的鹽酸溶液調(diào)節(jié))培養(yǎng)4小時(shí)后，開始補(bǔ)充40％的葡萄糖溶液。培養(yǎng)21小時(shí)后，將罐2的補(bǔ)料液改變?yōu)?0％葡萄糖+3.3％乙酸銨溶液；罐3的補(bǔ)料液改變?yōu)?.65％乙酸銨+50％乙醇+20％葡萄糖溶液。然后，進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞。以實(shí)施例8中所述方式將無(wú)菌操作取出的培養(yǎng)液樣品進(jìn)行異戊二烯醇的分析和定量檢測(cè)。為保持培養(yǎng)基中糖濃度為0.1％或低于0.1％，需調(diào)整補(bǔ)料速率(最大為18.7g/h)。
結(jié)果顯示該方法使FOH的產(chǎn)生最小化，并可通過(guò)微生物有效制備GGOH(表14)。通過(guò)補(bǔ)充除葡萄糖以及乙醇和乙酸銨，使培養(yǎng)基中的GGOH濃度達(dá)到2.5g/L。
表14罐1(補(bǔ)料溶液40％葡萄糖)

罐2 (補(bǔ)料溶液40％葡萄糖、3.3％乙酸銨)

罐3(補(bǔ)料溶液20％葡萄糖、1.65％乙酸銨、50％乙醇)

此處引述的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖艘米鳛閰⒖肌?br> 工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了制備異戊二醇烯醇的方法。既然有可能根據(jù)本發(fā)明提供的方法大量獲得異戊二烯醇(尤其是香葉基香葉醇)的，因此可以用于生產(chǎn)生物體內(nèi)重要的物質(zhì)，及用作試劑，以發(fā)現(xiàn)活性異戊二烯醇新的生理學(xué)活性。這樣，本發(fā)明的方法就具有應(yīng)用價(jià)值。
序列表文本SEQ ID NO24合成肽SEQ ID NOS25-120合成DNASEQ ID NO121合成肽SEQ ID NO122合成肽SEQ ID NOS123-130合成DNA
序列表<110>豐田自動(dòng)車株式會(huì)社<120>異戊二烯醇的制備方法<130>PH-1413-PCT<150>JP2000-403067<151>2000-12-28<160>130<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1059<212>DNA<213>啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220><221>CDS<222>(1)..(1056)<400>1atg gct tca gaa aaa gaa att agg aga gag aga ttc ttg aac gtt ttc 48Met Ala Ser Glu Lys Glu Ile Arg Arg Glu Arg Phe Leu Asn Val Phe1 5 10 15cct aaa tta gta gag gaa ttg aac gca tcg ctt ttg gct tac ggt atg 96Pro Lys Leu Val Glu Glu Leu Asn Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Met20 25 30cct aag gaa gca tgt gac tgg tat gcc cac tca ttg aac tac aac act 144Pro Lys Glu Ala Cys Asp Trp Tyr Ala His Ser Leu Asn Tyr Asn Thr35 40 45cca ggc ggt aag cta aat aga ggt ttg tcc gtt gtg gac acg tat gct 192Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Thr Tyr Ala50 55 60att ctc tcc aac aag acc gtt gaa caa ttg ggg caa gaa gaa tac gaa 240Ile Leu Ser Asn Lys Thr Val Glu Gln Leu Gly Gln Glu Glu Tyr Glu65 70 75 80aag gtt gcc att cta ggt tgg tgc att gag ttg ttg cag gct tac ttc 288Lys Val Ala Ile Leu Gly Trp Cys Ile Glu Leu Leu Gln Ala Tyr Phe85 90 95ttg gtc gcc gat gat atg atg gac aag tcc att acc aga aga ggc caa 336Leu Val Ala Asp Asp Met Met Asp Lys Ser Ile Thr Arg Arg Gly Gln100 105 110cca tgt tgg tac aag gtt cct gaa gtt ggg gaa att gcc atc aat gac 384Pro Cys Trp Tyr Lys Val Pro Glu Val Gly Glu Ile Ala Ile Asn Asp115 120 125gca ttc atg tta gag gct gct atc tac aag ctt ttg aaa tct cac ttc 432Ala Phe Met Leu Glu Ala Ala Ile Tyr Lys Leu Leu Lys Ser His Phe130 135 140aga aac gaa aaa tac tac ata gat atc acc gaa ttg ttc cat gag gtc 480Arg Asn Glu Lys Tyr Tyr Ile Asp Ile Thr Glu Leu Phe His Glu Val145 150 155 160acc ttc caa acc gaa ttg ggc caa ttg atg gac tta atc act gca cct 528Thr Phe Gln Thr Glu Leu Gly Gln Leu Met Asp Leu Ile Thr Ala Pro165 170 175gaa gac aaa gtc gac ttg agt aag ttc tcc cta aag aag cac tcc ttc 576Glu Asp Lys Val Asp Leu Ser Lys Phe Ser Leu Lys Lys His Ser Phe180 185 190ara gtt act ttc aag act gct tac tat tct ttc tac ttg cct gtc gca 624Ile Val Thr Phe Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala195 200 205ttg gcc atg tac gtt gcc ggt atc acg gat gaa aag gat ttg aaa caa 672Leu Ala Met Tyr Val Ala Gly Ile Thr Asp Glu Lys Asp Leu Lys Gln210 215220gcc aga gat gtc ttg att cca ttg ggt gaa tac ttc caa att caa gat 720Ala Arg Asp Val Leu Ile Pro Leu Gly Glu Tyr Phe Gln Ile Gln Asp225 230 235 240gac tac tta gac tgc ttc ggt acc cca gaa cag atc ggt aag atc ggt 768Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Thr Pro Glu Gln Ile Gly Lys Ile Gly245 250 255aca gat atc caa gat aac aaa tgt tct tgg gta atc aac aag gca ttg 816Thr Asp Ile Gln Asp Asn Lys Cys Ser Trp Val Ile Asn Lys Ala Leu260 265 270gaa ctt gct tcc gca gaa caa aga aag act tta gac gaa aat tac ggt 864Glu Leu Ala Ser Ala Glu Gln Arg Lys Thr Leu Asp Glu Asn Tyr Gly275 280 285aag aag gac tca gtc gca gaa gcc aaa tgc aaa aag att ttc aat gac 912Lys Lys Asp Ser Val Ala Glu Ala Lys Cys Lys Lys Ile Phe Asn Asp290 295 300ttg aaa att gaa cag cta tac cac gaa tat gaa gag tct att gcc aag 960Leu Lys Ile Glu Gln Leu Tyr His Glu Tyr Glu Glu Ser Ile Ala Lys305 310 315 320gat ttg aag gcc aaa att tct cag gtc gat gag tct cgt ggc ttc aaa 1008Asp Leu Lys Ala Lys Ile Ser Gln Val Asp Glu Ser Arg Gly Phe Lys325 330 335gct gat gtc tta act gcg ttc ttg aac aaa gtt tac aag aga agc aaa 1056Ala Asp Val Leu Thr Ala Phe Leu Asn Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys340 345 350tag 1059<210>2<211>352<212>PRT<213>啤酒糖酵母(saccharomyces cerevisiae)<400>2Met Ala Ser Glu Lys Glu Ile Arg Arg Glu Arg Phe Leu Asn Val Phe1 5 10 15Pro Lys Leu Val Glu Glu Leu Asn Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Met20 25 30Pro Lys Glu Ala Cys Asp Trp Tyr Ala His Ser Leu Asn Tyr Asn Thr35 40 45Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Thr Tyr Ala50 55 60Ile Leu Ser Asn Lys Thr Val Glu Gln Leu Gly Gln Glu Glu Tyr Glu65 70 75 80Lys Val Ala Ile Leu Gly Trp Cys Ile Glu Leu Leu Gln Ala Tyr Phe85 90 95Leu Val Ala Asp Asp Met Met Asp Lys Ser Ile Thr Arg Arg Gly Gln100 105 110Pro Cys Trp Tyr Lys Val Pro Glu Val Gly Glu Ile Ala Ile Asn Asp
115 120 125Ala Phe Met Leu Glu Ala Ala Ile Tyr Lys Leu Leu Lys Ser His Phe130 135 140Arg Asn Glu Lys Tyr Tyr Ile Asp Ile Thr Glu Leu Phe His Glu Val145 150 155 160Thr Phe Gln Thr Glu Leu Gly Gln Leu Met Asp Leu Ile Thr Ala Pro165 170 175Glu Asp Lys Val Asp Leu Ser Lys Phe Ser Leu Lys Lys His Ser Phe180 185 190Ile Val Thr Phe Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala195 200 205Leu Ala Met Tyr Val Ala Gly Ile Thr Asp Glu Lys Asp Leu Lys Gln210 215 220Ala Arg Asp Val Leu Ile Pro Leu Gly Glu Tyr Phe Gln Ile Gln Asp225 230 235 240Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Thr Pro Glu Gln Ile Gly Lys Ile Gly245 250 255Thr Asp Ile Gln Asp Asn Lys Cys Ser Trp Val Ile Asn Lys Ala Leu260 265 270Glu Leu Ala Ser Ala Glu Gln Arg Lys Thr Leu Asp Glu Asn Tyr Gly275 280 285Lys Lys Asp Ser Val Ala Glu Ala Lys Cys Lys Lys Ile Phe Asn Asp290 295 300Leu Lys Ile Glu Gln Leu Tyr His Glu Tyr Glu Glu Ser Ile Ala Lys305 310 315 320Asp Leu Lys Ala Lys Ile Ser Gln Val Asp Glu Ser Arg Gly Phe Lys325 330 335Ala Asp Val Leu Thr Ala Phe Leu Asn Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys340 345 350<210>3<211>900<212>DNA<213>大腸桿菌(Escherichia coli)<220><221>CDS<222>(1)..(897)<400>3atg gac ttt ccg cag caa ctc gaa gcc tgc gtt aag cag gcc aac cag 48Met Asp Phe Pro Gln Gln Leu Glu Ala Cys Val Lys Gln Ala Asn Gln1 5 10 15gcg ctg agc cgt ttt atc gcc cca ctg ccc ttt cag aac act ccc gtg 96Ala Leu Ser Arg Phe Ile Ala Pro Leu Pro Phe Gln Asn Thr Pro Val20 25 30gtc gaa acc atg cag tat ggc gca tta tta ggt ggt aag cgc ctg cga 144Val Glu Thr Met Gln Tyr Gly Ala Leu Leu Gly Gly Lys Arg Leu Arg35 40 45cct ttc ctg gtt tat gcc acc ggt cat atg ttc ggc gtt agc aca aac 192Pro Phe Leu Val Tyr Ala Thr Gly His Met Phe Gly Val Ser Thr Asn50 55 60acg ctg gac gca ccc gct gcc gcc gtt gag tgt atc cac gct tac tca 240Thr Leu Asp Ala Pro Ala Ala Ala Val Glu Cys Ile His Ala Tyr Ser65 70 75 80tta att cat gat gat tta ccg gca atg gat gat gac gat ctg cgt cgc 288Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ala Met Asp Asp Asp Asp Leu Arg Arg85 90 95ggt ttg cca acc tgc cat gtg 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130 135 140gat ata tac tgg aga gac ttt ctg cct gaa atc ata cct act cag gag 480Asp Ile Tyr Trp Arg Asp Phe Leu Pro Glu Ile Ile Pro Thr Gln Glu145 150 155 160atg tat ttg aat atg gtt atg aat aaa aca ggc ggc ctt ttc aga tta 528Met Tyr Leu Asn Met Val Met Asn Lys Thr Gly Gly Leu Phe Arg Leu165 170 175acg ttg aga ctc atg gaa gcg ctg tct cct tcc tca cac cac ggc cat 576Thr Leu Arg Leu Met Glu Ala Leu Ser Pro Ser Ser His His Gly His180 185 190tcg ttg gtt cct ttc ata aat ctt ctg ggt att att tat cag att aga 624Ser Leu Val Pro Phe Ile Asn Leu Leu Gly Ile Ile Tyr Gln Ile Arg195 200 205gat gat tac ttg aat ttg aaa gat ttc caa atg tcc agc gaa aaa ggc 672Asp Asp Tyr Leu Asn Leu Lys Asp Phe Gln Met Ser Ser Glu Lys Gly210 215 220ttt gct gag gac att aca gag ggg aag tta tct ttt ccc atc gtc cac 720Phe Ala Glu Asp Ile Thr Glu Gly Lys Leu Ser Phe Pro Ile Val His225 230 235 240gcc ctt aac ttc act aaa acg aaa ggt caa act gag caa cac aat gaa 768Ala Leu Asn Phe Thr Lys Thr Lys Gly Gln Thr Glu Gln His Asn Glu245 250 255att cta aga att ctc ctg ttg agg aca agt gat aaa gat ata aaa cta 816Ile Leu Arg Ile Leu Leu Leu Arg Thr Ser Asp Lys Asp Ile Lys Leu260 265 270aag ctg att caa ata ctg gaa ttc gac acc aat tca ttg gcc tac acc 864Lys Leu Ile Gln Ile Leu Glu Phe Asp Thr Asn Ser Leu Ala Tyr Thr275 280 285aaa aat ttt att aat caa tta gtg aat atg ata aaa aat gat aat gaa 912Lys Asn Phe Ile Asn Gln Leu Val Asn Met Ile Lys Asn Asp Asn Glu290 295 300aat aag tat tta cct gat ttg gct tcg cat tcc gac acc gcc acc aat 960Asn Lys Tyr Leu Pro Asp Leu Ala Ser His Ser Asp Thr Ala Thr Asn305 310 315 320tta cat gac gaa ttg tta tat ata ata gac cac tta tcc gaa ttg tga 1008Leu His Asp Glu Leu Leu Tyr Ile Ile Asp His Leu Ser Glu Leu
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155 160Asp Leu Asp Ala Glu Gly Lys His Val Pro Leu Asp Ala Leu Glu Arg165 170 175Ile His Arg His Lys Thr Gly Ala Leu Ile Arg Ala Ala Val Arg Leu180 185 190Gly Ala Leu Ser Ala Gly Asp Lys Gly Arg Arg Ala Leu Pro Val Leu195 200 205Asp Lys Tyr Ala Glu Ser Ile Gly Leu Ala Phe Gln Val Gln Asp Asp210 215 220Ile Leu Asp Val Val Gly Asp Thr Ala Thr Leu Gly Lys Arg Gln Gly225 230 235 240Ala Asp Gln Gln Leu Gly Lys Ser Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Gly Leu245 250 255Glu Gln Ala Arg Lys Lys Ala Arg Asp Leu Ile Asp Asp Ala Arg Gln260 265 270Ser Leu Lys Gln Leu Ala Glu Gln Ser Leu Asp Thr Ser Ala Leu Glu275 280 285Ala Leu Ala Asp Tyr Ile Ile Gln Arg Asn Lys290 295<210>39<211>894<212>DNA<213>嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)<400>39gtggcgcagc tttcagttga acagtttctc aacgagcaaa aacaggcggt ggaaacagcg 60ctctcccgtt atatagagcg cttagaaggg ccggcgaagc tgaaaaaggc gatggcgtac 120tcattggagg ccggcggcaa acgaatccgt ccgttgctgc ttctgtccac cgttcgggcg 180ctcggcaaag acccggcggt cggattgccc gtcgcctgcg cgattgaaat gatccatacg 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32<210>42<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>42cacggagctc cagttcgagt ttatcattat caa 33<210>43<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>43ctctccgcgg tttgtttgtt tatgtgtgtt tattc 35<210>44<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>44ccgcgagctc ttacccataa ggttgtttgt gacg 34<210>45<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>45ctttccgcgg gtttagttaa ttatagttcg ttgacc36<210>46<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>46atggcttcag aaaaagaaat tag 23<210>47<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>47ctatttgctt ctcttgtaaa ctt 23<210>48<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>48tgaggcatgc aatttccgca gcaactcg28<210>49<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>49tcagaattca tcaggggcct attaatac28<210>50<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>50atggaggcca agatagatga gct 23<210>51<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>51tcacaattcg gataagtggt cta 23<210>52<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>52tccccgcgga tgtctcagaa cgtttacatt gt 32<210>53<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>53tgctctagat catatctttt caatgacaat gga 33<210>54<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>54atgaaactct caactaaact ttgtt 25<210>55<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>55gttcagcaag atgcaatcga tgggg 25<210>56<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>56atgccgccgc tattcaaggg act23<210>57<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>57ttaggattta atgcaggtga cgg23<210>58<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>58ccaaataaag actccaacac tctattt27<210>59<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>59gaattagaag cattattaag tagtgga27<210>60<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>60ggatttaacg cacatgcagc taattta27<210>61<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>61gtctgcttgg gttacatttt 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gcc23<210>72<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>72tccccgcgga tgcaaacgga acacgtcatt tt 32<210>73<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>73tgctctagat tatttaagct gggtaaatgc aga 33<210>74<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>74atcatgaatt aatgagtcag cgtggatgca ttcaacggcg gcagc45<210>75<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>75atcatgaatt aatgattcag cgtggatgca ttcaacggcg gcagc45<210>76<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>76atcatgaatt aatgacatag cgtggatgca ttcaacggcg gcagc45<210>77<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>77tttcagtccc ttgaatagcg gcggcat27<210>78<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>78cacaaaatca agattgccca gtatgcc27<210>79<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>79agaagatacg gatttctttt ctgcttt27<210>80<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>80aactttggtg caaattgggt 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33<210>91<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>91catactgacc cattgtcaat gggtaataac tgat34<210>92<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>92tgtccggtaa atggagac 18<210>93<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>93tgttctcgct gctcgttt 18<210>94<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>94atgggaaagc tattacaat 19<210>95<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>95caaggttgca atggccat 18<210>96<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>96caatgtaggg ctatatatg 19<210>97<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>97aacttgggga atggcaca 18<210>98<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>98tctcgaaaaa gggtttgcca t 21<210>99<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>99tcactaggtg taaagagggc t 21<210>100<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>100tgttgaagct tgcatgcctg c 21<210>101<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>101ttgtaaaacg acggccagtg a 21<210>102<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>102atggaggcca agatagatga g 21<210>103<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>103tcacaattcg gataagtggt c 21<210>104<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>104tcctaatgcc aagaaaacag ctgtcac27<210>105<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>105atggcaaacc ctttttcgag a 21<210>106<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>106agccctcttt acacctagtg a 21<210>107<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>107tccccgcgga tggaggccaa gatagat27<210>108<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>108caactcgagt cacaattcgg ataagtg 27<210>109<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>109gctctagagt tcgtcgtgtt tgcttctctt gtaaactt 38<210>110<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>110tatctcgagt cacaattcgt catgtaaatt gg32<210>111<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>111gcagggaccc caattcggat aagtggt 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10<210>122<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成肽<400>122Cys Leu Asn Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys1 5 10<210>123<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>123ttttaagagc ttggtgagcg c 21<210>124<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>124tcgagttcaa gagaaaaaaa a 21<210>125<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>125ttcaattcat catttttttt t 21<210>126<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>126gggtaataac tgatataatt a 21<210>127<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>127atggattcta gaacagttgg t 21<210>128<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成NDA<400>128ttacttgttt tctagataag c 21<210>129<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>129atgactaacg aaaaggtctg g 21<210>130<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明合成DNA<400>130ttaagctgct gcggagcttc c 2權(quán)利要求
1.一種制備異戊二烯醇的方法，包括通過(guò)將均含有異戊二烯基二磷酸合酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主而構(gòu)建一個(gè)重組體；培養(yǎng)得到的重組體；及從得到的培養(yǎng)物中回收異戊二烯醇。
2.一種制備異戊二烯醇的方法，包括通過(guò)將均含有異戊二烯基二磷酸合酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA以及均含有羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主而構(gòu)建一個(gè)重組體；培養(yǎng)得到的重組體；及從得到的培養(yǎng)物中回收異戊二烯醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中的異戊二烯醇為香葉基香葉醇。
4.一種制備香葉基香葉醇的方法，包括通過(guò)將均含有異戊二烯基二磷酸合酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA以及均含有異戊烯基二磷酸Δ異構(gòu)酶基因的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主而構(gòu)建一個(gè)重組體；培養(yǎng)得到的重組體；及從得到的培養(yǎng)物中回收香葉基香葉醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的方法，其中的異戊二烯基二磷酸合酶基因選自下列基因(a)和(b)以及融合基因(c)和(d)(a)法呢基二磷酸合酶基因或其突變體(b)香葉基香葉基二磷酸合酶基因或其突變體(c)由法呢基二磷酸合酶基因或其突變體和香葉基香葉基二磷酸合酶基因或其突變體組成的融合基因(d)添加一個(gè)編碼His Asp Glu Leu氨基酸序列的核苷酸序列的上述基因(a)或(b)或融合基因(c)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中法呢基二磷酸合酶基因編碼如SEQID NO2或4所示的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中香葉基香葉基二磷酸合酶基因編碼如SEQ ID NO6所示的氨基酸序列。
8.一種制備香葉基香葉醇的方法，包括通過(guò)將均含有羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主而構(gòu)建一個(gè)重組體；培養(yǎng)得到的重組體；及從得到的培養(yǎng)物中回收香葉基香葉醇。
9.一種制備香葉基香葉醇的方法，包括通過(guò)將均含有羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA以及均含有選自下列(e)到(j)的基因的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主而構(gòu)建一個(gè)重組體(e)異戊烯基二磷酸Δ-異構(gòu)酶基因(f)甲羥戊酸激酶基因(g)乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶基因(h)羥甲基戊二酰輔酶A合酶基因(i)磷酸甲羥戊酸激酶基因(j)二磷酸甲羥戊酸脫羧酶基因；培養(yǎng)得到的重組體；及從得到的培養(yǎng)物中回收香葉基香葉醇。
10.根據(jù)權(quán)利要求3-9中任意一項(xiàng)的方法，其中在得到得培養(yǎng)物中香葉基香葉醇的濃度至少為0.05mg/L。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)的方法，其中的宿主為酵母或大腸桿菌。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中的酵母為啤酒糖酵母。
13.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中的啤酒糖酵母為啤酒糖酵母A451菌株、YPH499菌株、YPH500菌株、W303-1A菌株或W303-1B菌株，或一種衍生自上述任一菌株的菌株。
14.一種用于表達(dá)的重組DNA，含有選自以下基因(a)和基因(b)以及融合基因(c)和(d)的一種基因，以及轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子(a)法呢基二磷酸合酶基因或其突變體(b)香葉基香葉基二磷酸合酶基因或其突變體(c)由法呢基二磷酸合酶基因或其突變體和香葉基香葉基二磷酸合酶基因或其突變體組成的融合基因(d)添加一個(gè)編碼His Asp Glu Leu氨基酸序列的核苷酸序列的上述基因(a)或(b)或融合基因(c)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的重組DNA，其中的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是選自ADH1啟動(dòng)子、TDH3(GAP)啟動(dòng)子、TEF2啟動(dòng)子、GAL1啟動(dòng)子和tac啟動(dòng)子的任意一種啟動(dòng)子。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的重組DNA，其中的轉(zhuǎn)錄終止子為CYC1終止子。
17.通過(guò)將權(quán)利要求14-16中任意一項(xiàng)的重組DNA導(dǎo)入宿主而獲得的重組體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的重組體，其中的宿主為酵母或大腸桿菌。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的重組體，其中的酵母為啤酒糖酵母。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的重組體，其中的啤酒糖酵母為啤酒糖酵母A451菌株、YPH499菌株、YPH500菌株、W303-1A菌株或W303-1B菌株，或一種衍生自上述任一菌株的菌株。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任意一項(xiàng)的重組體，其中的重組體是原養(yǎng)型。
22.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任意一項(xiàng)的重組體，其中的重組體是二倍體細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任意一項(xiàng)的重組體，其中的重組體是原養(yǎng)型，且是二倍體細(xì)胞。
24.一種制備異戊二烯醇的方法，包括采用含下列組分(i)-(vi)的任意一種的培養(yǎng)基，培養(yǎng)具有產(chǎn)生異戊二烯醇能力的微生物(i)糖(ii)醇(iii)氨氣，氨水和/或銨鹽(iv)氫氧化鈉和硫酸的混合物(v)KH2PO4、硫酸鎂、硫酸銨、玉米浸漬液、氯化鈣和表面活性劑的混合物(vi)上述組分(i)-(v)中的兩種或以上的混合物；并且從得到的培養(yǎng)物中回收異戊二烯醇。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中采用補(bǔ)料液培養(yǎng)微生物，該補(bǔ)料液含有下列組分(i)、(ii)或(iii)或這些組分中的兩種或兩種以上的混合物(i)糖(ii)醇(iii)氨氣、氨水和/或銨鹽。
26.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中補(bǔ)料液的碳源組分從培養(yǎng)開始到培養(yǎng)開始后12-24小時(shí)之間僅由葡萄糖組成，在此之后碳源組分更換為含乙醇的組分。
27.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中在培養(yǎng)開始12-24小時(shí)后，補(bǔ)料液中的乙醇占總的碳源組分的比例為50％或更多。
28.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中在培養(yǎng)開始12-24小時(shí)后，補(bǔ)料液中的碳源組分僅由乙醇組成。
29.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述積累于培養(yǎng)物中的異戊二烯醇濃度至少為0.1g/L或更高。
30.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述積累于培養(yǎng)物中的異戊二烯醇濃度至少為1g/L或更高。
31.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的異戊二烯醇為香葉基香葉醇。
32.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的微生物為酵母。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中的酵母為啤酒糖酵母。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中的啤酒糖酵母為啤酒糖酵母A451菌株、YPH499菌株、YPH500菌株、W303-1A菌株或W303-1B菌株，或一種衍生自上述任一菌株的菌株。
35.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的微生物為重組體。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中的重組體是通過(guò)將均含有甲羥戊酸途徑相關(guān)基因或其突變體，或異戊二烯基二磷酸合酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主而構(gòu)建的。
37.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中的重組體是通過(guò)將均含有異戊二烯基二磷酸合酶基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA以及均含有甲羥戊酸途徑相關(guān)基因或其突變體的一個(gè)用于表達(dá)的重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主而構(gòu)建的。
38.根據(jù)權(quán)利要求36或37的方法，其中的宿主為啤酒糖酵母。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中的啤酒糖酵母為啤酒糖酵母A451菌株、YPH499菌株、YPH500菌株、W303-1A菌株或W303-1B菌株，或一種衍生自上述任一菌株的菌株。
40.根據(jù)權(quán)利要求36或37的方法，其中的甲羥二羧酸途徑相關(guān)基因?yàn)榱u甲基戊二酰輔酶A還原酶基因。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中的羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因?yàn)镠MG1基因。
42.根據(jù)權(quán)利要求36或37的方法，其中的異戊二烯基二磷酸合酶基因是選自下列基因(a)和(b)以及融合基因(c)和(d)的任意一種(a)法呢基二磷酸合酶基因或其突變體(b)香葉基香葉基二磷酸合酶基因或其突變體(c)由法呢基二磷酸合酶基因或其突變體和香葉基香葉基二磷酸合酶基因或其突變體組成的融合基因(d)添加一個(gè)編碼His Asp Glu Leu氨基酸序列的核苷酸序列的上述基因(a)或(b)或融合基因(c)。
43.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的微生物是原養(yǎng)型。
44.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的微生物是二倍體細(xì)胞。
45.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中的微生物是原養(yǎng)型，且是二倍體細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中培養(yǎng)基的pH是被控制的。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中pH的控制是采用氨氣、銨鹽溶液、氫氧化鈉溶液或硫酸進(jìn)行的。
全文摘要
一種制備異戊二烯醇的方法，其特征在于該方法包括通過(guò)將一個(gè)表達(dá)重組DNA或一個(gè)用于基因組整合的DNA導(dǎo)入宿主內(nèi)而構(gòu)建一個(gè)重組體，這兩種DNA均含有異戊二烯基二磷酸合酶基因或其變體基因；培養(yǎng)得到的重組體；然后從獲得的培養(yǎng)基中收集異戊二烯醇。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1491282SQ01822714
公開日2004年4月21日 申請(qǐng)日期2001年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月28日
發(fā)明者大音德, 小畑充生, 村松正善, 仁志圣彥, 戶塚一彥, 善, 彥, 生 申請(qǐng)人:豐田自動(dòng)車株式會(huì)社