專利名稱：一種生產(chǎn)d－(－)－3－羥基丁酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸的方法，屬基因工程及微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
基因phaA或phbA編碼催化合成乙酰乙酰輔酶A的β-酮硫解酶；基因phaB或phbB編碼催化合成D-(-)-3-羥基丁酰輔酶A的乙酰乙酰輔酶A還原酶，基因phaA或phbA與phaB或phbB聯(lián)合運(yùn)用催化生成羥基丁酰輔酶A；基因ptb編碼磷酸轉(zhuǎn)丁?；福换騜uk編碼丁酸激酶，基因ptb，buk聯(lián)合運(yùn)用能夠催化羥基丁酰輔酶A生成D-(-)-3-羥基丁酸?；騪haA或phbA，phaB或phbB，ptb，buk的來(lái)源是很廣泛的，它們可以來(lái)自假單孢菌、Ralstonia eutropha、廣泛產(chǎn)堿菌、著色菌、囊硫菌、酵母菌；梭菌，熱袍菌等多種微生物，例如基因phaA和phaB可以是AF029714、AF078795、U47026、X93358(Gene bank登陸號(hào))等；基因phbA和phbB的序列可以是J04987、L01112、L01113等；基因ptb的序列可以是L04468、AB035092、AJ278958等；基因buk的序列可以是L04468、AB035092等。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)含有基因phaA或phbA、phaB或phbB和ptb、buk的重組微生物菌株。
基因phaA或phbA、phaB或phbB和ptb、buk的選擇范圍很寬，具有前述功能的微生物基因均可以選擇，其中優(yōu)選的是所述基因phaA和phaB為AF029714、AF078795(gene bank登錄號(hào))；基因phbA和phbB為J04987、L01112；所述基因ptb及buk為L(zhǎng)04468、AB035092。
所述重組微生物菌株優(yōu)選大腸桿菌。大腸桿菌選自JM109、HB101、DH5α或野生型菌株。
本發(fā)明方法包括以下步驟(1)將基因phaA或phbA、phaB或phbB以及ptb、buk克隆到質(zhì)粒中構(gòu)建出新質(zhì)粒；(2)將所構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)到菌株中構(gòu)建DNA重組菌株；(3)培養(yǎng)重組菌株獲取D-(-)-3-羥基丁酸。
所述基因phaA或phbA、phaB或phbB、ptb、buk可以克隆在一個(gè)質(zhì)粒中，也可以隨機(jī)組合克隆在一個(gè)以上的質(zhì)粒中。
所述重組菌株的適宜培養(yǎng)溫度為28-42℃，適宜培養(yǎng)pH值為5.5-8.5。
可以用分批培養(yǎng)的方式培養(yǎng)所述重組菌株，也可以用流加(fed-batch)培養(yǎng)的方式培養(yǎng)所述重組菌株。
本發(fā)明設(shè)計(jì)構(gòu)思非常巧妙，所涉及的質(zhì)粒構(gòu)建與重組菌株篩選均采用現(xiàn)有基因工程操作的方法，包括對(duì)含有基因phaA或phbA、phaB或phbB和ptb，kb的DNA片段和所用質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，限制酶切割，連接酶連接，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，重組菌株篩選，重組菌株的培養(yǎng)及產(chǎn)物合成的確認(rèn)及高性能重組生產(chǎn)菌株的獲得等。發(fā)酵過(guò)程中不需購(gòu)置新的設(shè)備，既可以采用微生物常規(guī)工業(yè)發(fā)酵方法，也可以采用自動(dòng)控制為基礎(chǔ)的流加發(fā)酵法。
本發(fā)明創(chuàng)造性地采用基因重組微生物進(jìn)行發(fā)酵，使一步法直接生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸得以實(shí)現(xiàn)。簡(jiǎn)化了從聚合物降解獲得D-(-)-3-羥基丁酸的生產(chǎn)工藝，提高了生產(chǎn)效率，降低了傳統(tǒng)化學(xué)合成對(duì)設(shè)備的高要求，簡(jiǎn)化了繁瑣的工藝流程，省去了手性分離的復(fù)雜過(guò)程，因此可以使D-(-)-3-羥基丁酸的生產(chǎn)成本得到大幅度降低。同時(shí)利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸還解決了由于化學(xué)合成和手性分離帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例做進(jìn)一步說(shuō)明。
圖2為質(zhì)粒pBHR68CM與質(zhì)粒p68CMPTK的構(gòu)建圖3為質(zhì)粒pMCS2PTK構(gòu)建質(zhì)粒構(gòu)建1、如

圖1所示，將含有基因phbB和phbA的限制性內(nèi)切酶PstI酶切片段插入質(zhì)粒載體pUC18中。所得到的質(zhì)粒pUCAB含有位于啟動(dòng)子lac下游的基因phbB和phbA。
培養(yǎng)基為L(zhǎng)BG培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨10，酵母浸出物5，NaCl 10，60μg/L氨卞青霉素和/或50μg/L卡那青霉素。碳源濃度根據(jù)需要而定。
2、如圖2所示，將含有phbABC操縱子的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶AccIII和BglII雙酶切割后，用T4 DNA聚合酶將大片段粘端補(bǔ)平，T4 DNA連接酶連接后得到質(zhì)粒pBHR68CM。將含有基因ptb、buk的限制性內(nèi)切酶BamHI酶切片段插入質(zhì)粒pBHR68CM中，得到質(zhì)粒p68CMPTK。
培養(yǎng)基為0.5g/L(NH4)2SO4，0.2g/L MgSO4，9.65g/L NaHPO4·12H2O，2.65g/L KH2PO4，60μg/L氨卞青霉素和/或50μg/L卡那青霉素，1ml/L微量元素(1mol/LHCl中(g)20 FeCl3·6H2O，10 CaCl2，0.03 CuSO4·5H2O，0.05 MnCl2·4H2O，0.1ZnSO4·7H2O)。碳源、有機(jī)氮源種類和濃度根據(jù)需要而定。
3、如圖3所示，將含有基因ptb、buk的限制性內(nèi)切酶BamHI酶切片段插入質(zhì)粒pBBR1MCS2中，得到質(zhì)粒含有基因ptb，buk的質(zhì)粒pMCS2PTK。
培養(yǎng)基為4g/L KH2PO4，4g/L K2HPO4，12g/L Na2HPO4·12H2O，0.5NH4Cl，1.2g/L(NH4)2SO4，2.2g/L MgSO4·7H2O，9.65g/L NaHPO4·12H2O，2.65g/L KH2PO4，60μg/L氨卞青霉素和/或50μg/L卡那霉素，1ml/L微量元素(1mol/L HCl中(g)20FeCl3·6H2O，10CaCl2，0.03CuSO4·5H2O，0.05MnCl2·4H2O，0.1ZnSO4.7H2O)。碳源、有機(jī)氮源種類和濃度根據(jù)需要而定。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化用電擊轉(zhuǎn)化法或化學(xué)轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入菌株E.coli。
在該實(shí)施例中，大腸桿菌E.coli還可以選自JM109，DH5α以及野生型大腸桿菌如AB1157等，phaA還可以是AF078795，phaB還可以是AF078795，基因phbA還可以是L01112，phbB還可以是L01112，基因ptb還可以是AB035092，buk還可以是AB035092，但構(gòu)建基因重組菌株的方法和步驟是相同的。
實(shí)施例2、高溫低pH以葡萄糖為碳源分批培養(yǎng)重組大腸桿菌合成D-(-)-3-羥基丁酸菌種含單質(zhì)粒的重組大腸桿菌，質(zhì)粒中基因phbA為(J04987)、phbB為(J04987)，基因ptb為(L04468)，buk為(L04468)。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方式化學(xué)轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)溫度42℃培養(yǎng)基培養(yǎng)基1pH5.5通氣量3L/min發(fā)酵時(shí)間36小時(shí)攪拌轉(zhuǎn)速150～900rpm
工藝流程如下將種子液接入加有滅菌發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，接種量為每升發(fā)酵液接入100毫升種子液。葡萄糖濃度40g/L。起始攪拌150rpm，溶氧設(shè)置為10％，隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，攪拌不斷增加，最后至900rpm，但溶氧始終維持高于10％。發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)樣品離心、洗滌、分析得到細(xì)胞干重和D-(-)-3-羥基丁酸含量等有關(guān)數(shù)據(jù)。
36小時(shí)后得到D-(-)-3-羥基丁酸含量為12g/L。
實(shí)施例3、低溫高pH以蔗糖為碳源，蛋白胨為有機(jī)氮源恒定濃度流加培養(yǎng)重組大腸桿菌合成D-(-)-3-羥基丁酸菌種含雙質(zhì)粒的重組大腸桿菌，質(zhì)粒中的基因phaA為(AF029714)、phaB為(AF029714)，基因ptb為(AB035092)，buk為(AB035092)。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法電擊轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)溫度28℃培養(yǎng)基培養(yǎng)基2pH8.5通氣量2L/min發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)攪拌轉(zhuǎn)速150～900rpm工藝流程如下將種子液接入加有滅菌發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，接種量為每升發(fā)酵液接入100毫升種子液。牛肉浸出物10g/L，初始蔗糖濃度30g/L，起始攪拌150r/m，通過(guò)控制攪拌速度控制溶氧濃度高于10％。發(fā)酵過(guò)程中監(jiān)測(cè)蔗糖濃度變化，當(dāng)濃度達(dá)到10g/L時(shí)開(kāi)始用可控流速泵流加基質(zhì)，并控制蔗糖濃度10g/L。流加結(jié)束后，繼續(xù)培養(yǎng)，直至碳源消耗完全。發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)樣品離心、洗滌、分析得到細(xì)胞干重和D-(-)-3-羥基丁酸含量等有關(guān)數(shù)據(jù)。
48小時(shí)得到D-(-)-3-羥基丁酸25g/L。
實(shí)施例4、甘油為碳源恒定溶氧流加培養(yǎng)重組大腸桿菌合成D-(-)-3-羥基丁酸菌種含雙質(zhì)粒的重組大腸桿菌，質(zhì)粒中基因phaA為(AF078795)、phbB為(L04468)，基因ptb為(AJ278958)，buk為(AB035092)。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法電擊轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)溫度35℃培養(yǎng)基培養(yǎng)基3
pH7.0通氣量2L/min發(fā)酵時(shí)間52小時(shí)攪拌轉(zhuǎn)速150～900rpm工藝流程如下將種子液接入加有滅菌發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，接種量為每升發(fā)酵液接入100毫升種子液。發(fā)酵液中不加有機(jī)氮源，初始甘油濃度20g/L，起始攪拌150r/m，通過(guò)控制攪拌速度控制溶氧濃度高于10％。當(dāng)甘油耗盡時(shí)攪拌轉(zhuǎn)速下降。保持?jǐn)嚢?00r/m，流加甘油以控制溶氧在10％左右。流加結(jié)束后，繼續(xù)培養(yǎng)，直至碳源消耗完全。發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)樣品離心、洗滌、分析得到細(xì)胞干重和D-(-)-3-羥基丁酸含量等有關(guān)數(shù)據(jù)。
52小時(shí)得到D-(-)-3-羥基丁酸22g/L。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)含有基因phaA或phbA、phaB或phbB和ptb、buk的重組微生物菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸的方法，其特征在于所述基因基因phaA和phaB是AF029714、AF078795、U47026、X93358；phbA和phbB的序列是J04987、L01112、L01113；基因ptb的序列是L04468、AB035092、AJ278958；基因buk的序列是L04468、AB035092。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸的方法，其特征在于所述重組微生物菌株為大腸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸的方法，其特征在于所述大腸桿菌選自JM109、HB101、DH5α或野生型菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)將基因phaA或phbA、phaB或phbB以及ptb、buk克隆到質(zhì)粒中構(gòu)建出新質(zhì)粒；(2)將所構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)到菌株中構(gòu)建DNA重組菌株；(3)培養(yǎng)重組菌株獲取D-(-)-3-羥基丁酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸的方法，其特征在于所述基因phbA、phbB、ptb、buk克隆在一個(gè)質(zhì)粒中。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸的方法，其特征在于所述基因phaA或phbA、phaB或phbB、ptb、buk隨機(jī)組合克隆在一個(gè)以上的質(zhì)粒中。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸的方法，其特征在于所述重組菌株的培養(yǎng)溫度為28-42℃。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸的方法，其特征在于所述重組菌株的培養(yǎng)pH值為5.5-8.5。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸的方法，其特征在于用分批培養(yǎng)的方式培養(yǎng)所述重組菌株。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)D-(-)-3-羥基丁酸的方法，其特征在于用流加(fed-batch)培養(yǎng)的方式培養(yǎng)所述重組菌株。
全文摘要
本發(fā)明的名稱為一種生產(chǎn)D－(－)－3－羥基丁酸的方法，屬基因工程及微生物發(fā)酵領(lǐng)域。本發(fā)明的目的是提供一種工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)效率較高的制備D－(－)－3－羥基丁酸的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為發(fā)酵培養(yǎng)含有基因phaA或phbA、phaB或phbB和ptb、buk的重組微生物菌株。所述重組微生物菌株優(yōu)選大腸桿菌。利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)D－(－)－3－羥基丁酸，簡(jiǎn)化了從聚合物降解獲得D－(－)－3－羥基丁酸的生產(chǎn)工藝，提高了生產(chǎn)效率，降低了傳統(tǒng)化學(xué)合成對(duì)設(shè)備的高要求，簡(jiǎn)化了繁瑣的工藝流程，省去了手性分離的復(fù)雜過(guò)程，使D－(－)－3－羥基丁酸的生產(chǎn)成本得到大幅度降低。同時(shí)利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)D－(－)－3－羥基丁酸還解決了由于化學(xué)合成和手性分離帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12P7/40GK1429912SQ0210001
公開(kāi)日2003年7月16日 申請(qǐng)日期2002年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月4日
發(fā)明者陳國(guó)強(qiáng), 高海軍 申請(qǐng)人:清華大學(xué)