專(zhuān)利名稱(chēng)：生長(zhǎng)抑素基因疫苗(dna疫苗)的基因工程體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為構(gòu)建生產(chǎn)用于家畜和家禽促進(jìn)生長(zhǎng)的生長(zhǎng)抑素基因疫苗(DNA疫苗)的基因工程體，屬生物高新技術(shù)領(lǐng)域的尖端產(chǎn)品。
一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，對(duì)疫苗主動(dòng)免疫和以抗體被動(dòng)免疫的研究一直是免疫學(xué)的重點(diǎn)。傳統(tǒng)的疫苗和抗血清被用于誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫力，以對(duì)抗病原體或毒素。隨著生物化學(xué)、免疫學(xué)、神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)和生物工程學(xué)的發(fā)展，一門(mén)嶄新的邊緣學(xué)科——激素免疫學(xué)相應(yīng)興起，并衍生出激素免疫中和技術(shù)(HIN)，即用主動(dòng)誘導(dǎo)或被動(dòng)輸入抗激素抗體以中和內(nèi)源性激素的生物活性，從而影響、調(diào)控內(nèi)分泌系統(tǒng)的一種極為靈敏的、高特異性的方法。這一技術(shù)無(wú)論對(duì)基礎(chǔ)理論研究還是在畜牧業(yè)、醫(yī)學(xué)等方面均具有重要意義。
激素在動(dòng)物體的物質(zhì)代謝和細(xì)胞分裂、分化，組織器官的發(fā)育和生長(zhǎng)，體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)恒定，以及對(duì)有害環(huán)境的適應(yīng)等生理過(guò)程中起著重要作用。體內(nèi)各種激素的基礎(chǔ)分泌量是相對(duì)穩(wěn)定的，激素分泌的調(diào)節(jié)一是通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，二是通過(guò)反饋方式。以往，人類(lèi)通過(guò)給動(dòng)物注射額外的激素來(lái)調(diào)節(jié)或打破動(dòng)物體內(nèi)自身的生理平衡而達(dá)到某種目的。如注射促黃體激素釋放激素(LHRH)、絨毛膜促性腺激素(HCG)以促進(jìn)排卵、提高受胎率和控制同步發(fā)情；給肉雞皮下埋植乙烯雌酚作化學(xué)去勢(shì)，以改善肉質(zhì)。但外源激素易破壞動(dòng)物體內(nèi)激素的平衡，造成激素調(diào)節(jié)的紊亂，并且當(dāng)在食用動(dòng)物上應(yīng)用時(shí)，可能會(huì)有激素殘留的問(wèn)題。
應(yīng)用激素免疫中和技術(shù)中和激素活性，通過(guò)免疫調(diào)節(jié)亦能達(dá)到相應(yīng)的目的，但不會(huì)造成激素殘留，并且更方便。目前，主要通過(guò)兩種方式①直接應(yīng)用激素制成疫苗，激發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生抗體以中和激素活性，如用HCG制成避孕疫苗，用雄烯二酮制成多胎疫苗等；②用下丘腦分泌的調(diào)控激素制成疫苗，通過(guò)調(diào)控激素間接調(diào)節(jié)某種內(nèi)源激素的釋放。
動(dòng)物生長(zhǎng)是一種十分復(fù)雜的生理效應(yīng)，參與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的激素有多種生長(zhǎng)激素(GH)、生長(zhǎng)介素(SM)亦稱(chēng)胰島素樣生長(zhǎng)因子(TGFs)、生長(zhǎng)抑素(SS)、生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF)、胰島素、甲狀腺素(TSH)、催乳素(PRL)等。其中GH和SM為調(diào)節(jié)核心，GH的主要作用是與肝細(xì)胞上的受體結(jié)合后，促使肝臟合成和分泌SM，而SM則能直接作用于多種組織，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖，促使肌肉、內(nèi)臟和骨骼的生長(zhǎng)。而GH和SM的合成和分泌又受多種激素的影響，下丘腦分泌的兩種高位調(diào)節(jié)激素GRF和SS，前者促進(jìn)GH合成和分泌，后者起抑制作用。此外，腺垂體產(chǎn)生的TSH、PRL和胰島細(xì)胞產(chǎn)生的胰島素均對(duì)肝臟產(chǎn)生SM起正向調(diào)節(jié)作用。
直接應(yīng)用GH、SM等低位調(diào)節(jié)激素注射動(dòng)物亦能取得一定的增重效果，但往往因反饋?zhàn)饔煤推渌绊懚茐募に仄胶狻＠缱⑸銰H時(shí)，胰島素分泌受到抑制，而后者又可影響肝臟SM的生成。其次，直接應(yīng)用激素，可能會(huì)造成激素殘留。因此，通過(guò)HIN技術(shù)中和體內(nèi)SS，從而解除抑制，使GH、SM及其他正向調(diào)節(jié)的激素水平提高，必將成為促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的更理想的方法。
生長(zhǎng)抑素(SS)在哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)中都是相同的，無(wú)種屬特異性。SS很小，無(wú)免疫原性，必須與蛋白質(zhì)載體連接后，制成復(fù)合抗原，才能激發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生抗體。常用的載體蛋白有人血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白等。由于天然提取的SS十分昂貴，從50萬(wàn)頭綿羊下丘腦中提取才能得到純品8.5mg。因此，早期多采用人工合成的SS連接載體后，制成免疫原，此類(lèi)疫苗稱(chēng)為合成肽疫苗。
斯潘塞(Spencer)等將人工合成的SS連接于α-球蛋白，制成合成肽疫苗，用以免疫綿羊，觀察3個(gè)月，結(jié)果試驗(yàn)組比單獨(dú)注射α-球蛋白的對(duì)照組增重17.6％，首次證實(shí)SS主動(dòng)免疫能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。隨后他們進(jìn)一步用SS合成肽疫苗免疫妊娠母羊，結(jié)果免疫組羔羊初生體重比對(duì)照組高10％，免疫母羊早期泌乳量亦比對(duì)照組顯著增多(9％)，使試驗(yàn)組羔羊差別生長(zhǎng)速度顯著高于對(duì)照組。經(jīng)屠宰試驗(yàn)，兩組骨骼、肌肉、脂肪之間比例正常，不屬于畸形發(fā)育。
對(duì)肉牛免疫試驗(yàn)也獲得成功，免疫牛血中SS抗體和GH水平均顯著升高，平均日增重提高17.6％，SS抗體效價(jià)與日增重呈正相關(guān)。
但人工合成SS成本太高，不適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。發(fā)明人之一杜念興教授，于七五期間主持農(nóng)業(yè)部生物技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目——生長(zhǎng)抑素基因工程疫苗研究。最早構(gòu)建的工程菌，其表達(dá)產(chǎn)物為SS與β半乳糖苷酶融合蛋白，用粗提的表達(dá)產(chǎn)物免疫大白鼠，取得了初步免疫效果。但考慮到此種單決定簇的可溶性亞單位苗，其免疫原性不強(qiáng)，且提取困難。因此，進(jìn)一步將SS基因插入人乙肝表面抗原(HBsAg)基因，并在痘苗病毒中得到表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物——HBsAg/SS呈病毒樣顆粒，具有良好的免疫原性。重組痘苗病毒(vv-HBs/SS)大量增殖后，毋需提取，即可應(yīng)用，稱(chēng)為生長(zhǎng)抑素基因工程活載體疫苗，簡(jiǎn)稱(chēng)激生1號(hào)苗。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室小試，增重效果顯著。于1995年通過(guò)農(nóng)業(yè)部鑒定，被認(rèn)為國(guó)內(nèi)外第一個(gè)有望用于促進(jìn)家畜生長(zhǎng)的基因工程苗，處于國(guó)際領(lǐng)先水平。建議進(jìn)行中試，盡快將本成果推廣應(yīng)用，轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。1997年列入國(guó)家科委(科技部)中國(guó)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心863中試項(xiàng)目，并經(jīng)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)生物遺傳工程體及其產(chǎn)品安全委員會(huì)審批為安全等級(jí)1級(jí)。經(jīng)中間試制和田間試驗(yàn)結(jié)果表明該疫苗生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，不造成環(huán)境污染，免疫豬、牛、羊等家畜安全有效。于1999年批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)，并申報(bào)專(zhuān)利。專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?0107295.1。2000年通過(guò)科技部驗(yàn)收，同年獲得大北農(nóng)科技成果獎(jiǎng)和香港中華專(zhuān)利博覽會(huì)金獎(jiǎng)。
鑒于激生1號(hào)疫苗只能用于家畜，不能用于家禽，免疫期3個(gè)月，再次免疫時(shí)因產(chǎn)生抗痘苗病毒抗體，效果不理想。為彌補(bǔ)以上缺點(diǎn)，又設(shè)計(jì)研制了生長(zhǎng)抑素基因工程亞單位苗。先后構(gòu)建了多株基因工程體，所制的疫苗分別簡(jiǎn)稱(chēng)為激生2號(hào)苗和激生3號(hào)苗。以上2種疫苗的基因工程體均已報(bào)請(qǐng)專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)柗謩e為00105675.1和02104212，8。
但科學(xué)的發(fā)展是無(wú)止境的，特別是近年來(lái)生命科學(xué)的進(jìn)展，突飛猛進(jìn)。在疫苗領(lǐng)域又出現(xiàn)比基因工程更先進(jìn)的，被稱(chēng)為第三代疫苗的基因疫苗(亦稱(chēng)DNA疫苗)?；蛞呙缭趧?dòng)物細(xì)胞內(nèi)能持續(xù)表達(dá)2～3個(gè)月，不斷分泌免疫原。強(qiáng)化免疫效果。一次免疫有效期可達(dá)5個(gè)月。這是基因疫苗的最大優(yōu)點(diǎn)。目前在生長(zhǎng)抑素疫苗的領(lǐng)域內(nèi)，還沒(méi)有生長(zhǎng)抑素基因疫苗。
本研究的目的是提供生產(chǎn)生長(zhǎng)抑素基因疫苗的基因工程體。使其表達(dá)產(chǎn)物呈顆粒性多價(jià)免疫苗，免疫原性?xún)?yōu)于常規(guī)基因工程亞單位苗。所構(gòu)建的基因工程體可用發(fā)酵生產(chǎn)，回收菌體，提取質(zhì)粒后，即直接配苗。生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，適于大規(guī)模生產(chǎn)，成本低廉，使用方便，無(wú)激素殘留，無(wú)潛在危險(xiǎn)。疫苗免疫后，該表達(dá)質(zhì)粒能在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)2～3個(gè)月，不斷分泌免疫原，誘導(dǎo)產(chǎn)生SS抗體，從而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。其免疫期較長(zhǎng)，且可多次加強(qiáng)免疫，提高免疫增重效果。
本發(fā)明為用于生產(chǎn)生長(zhǎng)抑素基因疫苗的基因工程體，其特征在于將SS基因插入人乙肝表面抗原基因(HBs)的第223密碼子之后，構(gòu)建成HBs/SS融合基因。并將其插入能在直核細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)的pcDNA3.1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，即成本發(fā)明的基因工程體-E.coli-pcDNA3.1-HBs/SS。
菌種分類(lèi)大腸埃希氏桿菌命名E.coli-pcDNA3.1-HBs/SS。
保藏單位中國(guó)微生物菌種保管委員會(huì)普通微生物中心保藏地址中國(guó)北京中關(guān)村2714信箱保藏號(hào)0709其主基因?yàn)镾S基因，它是14個(gè)氨基酸組成的短肽，各種哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)之間無(wú)種屬差異。
SS的氨基酸序列和堿基密碼如下 本發(fā)明生長(zhǎng)抑素基因疫苗的基因工程體，其特征在于用以下方法構(gòu)建而成。1 人工合成SS基因設(shè)計(jì)將SS基因5’端加BamHI酶切位點(diǎn)，3’加2個(gè)終止子和HindIII位點(diǎn)，在2個(gè)酶切位點(diǎn)之外均有2個(gè)保護(hù)性堿基；在BamHI位點(diǎn)之后，加1個(gè)框架保證堿基；在SS第1個(gè)氨基酸密碼子之前，加了1個(gè)甲硫氨酸(M)密碼子，以便在融合蛋白中，用溴化氰裂解出SS多肽分子。全部基因設(shè)計(jì)如下SS基因BamHI M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 105’-ACGGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT3’-TG CCTAGGC TAC CGA CCG ACG TTC TTG AAG AAG ACC TTC TGA11 12 13 14 終止子TTC ACA TCC TGT TAG TAAGCT TTA-3’AAG TGT AGG ACA ATC ATT CGA AAT-5’HindIII人工合成正負(fù)2條中間有12個(gè)堿基互補(bǔ)的寡聚DNA片段，分別稱(chēng)為L(zhǎng)1和L2，序列如下L15’-ACGGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACTBamHITTC ACA TCC TGT3’L25’-TAAAGC TTA CTA ACA GGA TGT GAA 3’HindIII 終止子將L1和L2按常規(guī)方法退火、延伸、補(bǔ)齊，即獲得按設(shè)計(jì)要求的SS基因。用BamHI和HindIII雙酶切后，回收帶粘性末端的SS基因，即可用于連接反應(yīng)。2 pUC12-SS質(zhì)粒的構(gòu)建從E.coli-pUC12提取pUC12質(zhì)粒，用BamHI和HindIII雙酶切，回收酶切大片段，在連接溶液中，與帶粘性末端的SS基因連接，即獲得pUC12-SS重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM103(DE3)。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種含氨卡青霉素(AMP)、β半乳糖苷酶(Lacz)、半乳糖苷(xgal)和異丙基硫化半乳糖苷(IPTG)的LB平板上，在37℃培養(yǎng)12h，挑選白色菌落，大量培養(yǎng)后作酶切鑒定和序列分析。
培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，分別用SmaI、BamHI和HindIII單酶切。所選菌落不被SmaI切開(kāi)，而能被HamHI和HindIII切開(kāi)，表明構(gòu)建成功。
上述所提取的質(zhì)粒DNA，用常規(guī)雙脫氧終止法測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下M 1 2 3 4 5 6 7 8.........GGA TCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGGBamHISS基因9 10 11 12 13 14 終止子 測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)要求完全符合，表明pUC12-SS質(zhì)粒構(gòu)建成功。3 pUC12-SS質(zhì)粒的改造在pUC12-SS初級(jí)質(zhì)粒中，在SS基因的3’端之后，尚有一個(gè)多酶切位點(diǎn)，其中包括BamHI和HindIII等重復(fù)位點(diǎn)。因此加以改造以除去這些重復(fù)酶切位點(diǎn)。
提取pUC12-SS質(zhì)粒，用HindIII單酶切，將其切開(kāi)后，重新連接。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，提取質(zhì)粒DNA，分別用HamHI和PsTz單酶切，挑選保持有HamHI位點(diǎn)，而PstI位點(diǎn)消失的菌落作進(jìn)一步鑒定。
從上述重組大腸桿菌提取的質(zhì)粒DNA，再用HamHI、HindIII、EcoRI、SacI、SalI和PstI作單酶切。結(jié)果所選菌株均保持HindIII、BamHI、EcoRI、SacI等位點(diǎn)，而SalI和PstI位點(diǎn)消失。證明pUC13-SS2質(zhì)粒的改造成功。
上述pUC12-SS2質(zhì)粒用雙脫氧末端終止法測(cè)序。
結(jié)果，SS的DNA序列以及附近酶切點(diǎn)的DNA序列完全正確，證實(shí)了可以用pUC12-SS2作為基因嵌入的受體。所測(cè)序列如下M 1 2 3 4 5 6.......GAATTC GAGCTC GCCC GGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTCEcoRI SacIBamHI SS基因78 9 10 11 12 13 14 終止子 4 pUC13-HBs/SS質(zhì)粒的構(gòu)建首先提取帶HBs的質(zhì)粒一pWR13-HBs/6，用SacI和BglII雙酶切，回收700bp左右的帶粘性末端的HBs-DNA片段，然后提取上述改造的pUC12-SS2質(zhì)粒，用SacI和BamHI雙酶切，回收質(zhì)粒大片段，與HBs連接后，獲得pUC12-HBs/SS重組質(zhì)粒。
用HindIII和BamHI雙酶切pUC12-HBs/SS，得到約為730bp片段，即為HBs/SS融合基因。表明pUC13-HBs/SS質(zhì)粒構(gòu)建成功。
同上法測(cè)定HBs/SS融合基因的DNA序列，結(jié)果如下5’ CCCGGGGATCCTCTAGAGTCGATCGACCTGCAGGTCGAGGACTGGGASma IBamH IXbal Sal I/Sal I Pst ISal I/XholHBs 1 2 3 4 217 218 219 220 221 222CCCTGCACCGAAC ATG GAG AAC ACA…… ATT TTC TTT TGT CTT TGG223 Ser Asp Pro Met 1 2 3 4 56 78 9 10GTA TCA GAT CCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TCC TGG AAG ACT11 12 13 14TTC ACA TCC TGT TAG TAAGCTT GGCA 3’終止子 HindIII前1～223為HBs的密碼子，后1～14為SS基因的密碼子。閱讀框架以及起碼終止碼都完全正確。證實(shí)pUC12-HBs/SS質(zhì)粒建成功。5 pcDNA3.1-HBs/SS質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計(jì)和合成1對(duì)HBs/SS融合基因的引物L(fēng)1和L2。
L15’CGAAGCTT ATGGAGAACACACAATCAGG 3’Hind III
L25’GCGAATTCTTACTAACAGGATGTGAAGT3’EcoRI 終止子然后提取pUC12-HBs/SS質(zhì)粒，供作PCR的DNA模板。用PCR擴(kuò)增出帶有酶切位點(diǎn)和終止密碼的HBs/SS融合基因。
提取pcDNA3.1質(zhì)粒，用HindIII和EcoRI雙酶切，用收質(zhì)粒大片段，與同樣酶切的HBs/SS基因連接，獲得pcDNA3.1-HBs/SS重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，即獲得用于生產(chǎn)生長(zhǎng)抑素基因疫苗的基因工程體-E.coli-pcDNA3.1-HBs/SS。
本發(fā)明所構(gòu)建的基因工程體，經(jīng)大量發(fā)酵后，回收菌體，提取質(zhì)粒，即可用以配制，用以促進(jìn)家畜、家禽生長(zhǎng)的SS-DNA疫苗。本疫苗與現(xiàn)有同類(lèi)產(chǎn)品相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果1.本基因工程體表達(dá)產(chǎn)物-HBs/SS融合蛋白能形成大小20nm左右的病毒樣顆粒(VLP)。見(jiàn)圖5。顆粒表面暴露有多個(gè)SS表位，是一種多價(jià)顆粒性抗原，其免疫原性?xún)?yōu)于常規(guī)基因工程亞單位苗。
2.本疫苗中的表達(dá)質(zhì)粒能在宿主肌肉細(xì)胞或上皮細(xì)胞內(nèi)，持續(xù)表達(dá)2～3個(gè)月，不斷分泌HBs/SS融合蛋白，強(qiáng)化免疫效果，一次免疫可以持續(xù)增長(zhǎng)5個(gè)月以上。仔豬免疫一次即可達(dá)到出欄體重。對(duì)大家畜如乳牛可間隔一定時(shí)間加強(qiáng)免疫一次，可促使整個(gè)泌乳期的乳產(chǎn)量增加，亦可用蛋雞，蛋雞增加蛋產(chǎn)量。
3.本疫苗中的表達(dá)質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞內(nèi)停止表達(dá)后，即自行降解，不整合細(xì)胞，沒(méi)有激素和其他有害物質(zhì)殘留，無(wú)任何潛在危險(xiǎn)。安全性良好。
4.本基因工程體發(fā)酵后，回收菌體，提取質(zhì)粒，即可用以配制SS-DNA疫苗。生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，成本低廉。在生產(chǎn)過(guò)程中，不排毒，不散毒，不污染環(huán)境，是一種綠色企業(yè)。
5.SS-DNA疫苗可用于家畜、家禽促進(jìn)生長(zhǎng)，可與激生1號(hào)苗或激生3號(hào)苗配合應(yīng)用，也可單獨(dú)應(yīng)用?？啥啻渭訌?qiáng)免疫，其應(yīng)用面覆蓋整畜牧業(yè)領(lǐng)域，應(yīng)用面廣，市場(chǎng)前景十分寬闊。


圖1 pUC12-SS質(zhì)粒的構(gòu)建圖2 pUC12-SS質(zhì)粒的改造圖3 pUC12-HBs/SS質(zhì)粒的構(gòu)建圖4 pcDNA3.1-HBs/SS質(zhì)粒的構(gòu)建圖5 由HBs/SS融合蛋白組裝成的病毒樣顆粒電鏡圖實(shí)施例1 人工合成SS基因?yàn)榱吮阌诨虿僮?，設(shè)計(jì)將SS基因5’端加BamHI酶切位點(diǎn)，3’加2個(gè)終止子和HindIII位點(diǎn)，在2個(gè)酶切位點(diǎn)之外均有2個(gè)保護(hù)性堿基；在BamHI位點(diǎn)之后，加1個(gè)框架保證堿基；在SS第1個(gè)氨基酸密碼子之前，加了1個(gè)甲硫氨酸密碼子，以便在融合蛋白中，用溴化氰裂解出SS多肽分子.全部基因設(shè)計(jì)如下SS基因BamHI M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 105’-ACGGATCCGM ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT3’-TG CCTAGGC TAC CGA CCG ACG TTC TTG AAG AAG ACC TTC TGA11 12 13 14 終止子TTC ACA TCC TGT TAG TAAGCT TTA 3’AAG TGT AGG ACA ATC ATT CGA AAT5’HindIII人工合成正負(fù)2條中間有12個(gè)堿基互補(bǔ)的寡聚DNA片段，分別稱(chēng)為L(zhǎng)1和L2，序列如下L15’-ACGGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACTBamHITTC ACA TCC TGT 3’L25’-TAAAGC TTA CTA ACA GGA TGT GAA 3’HindIII 終止子化學(xué)合成是以保護(hù)核苷β-氰乙基-亞磷酰胺為縮合單體，經(jīng)四氮唑活化后，在固相載體上逐個(gè)延長(zhǎng)寡核苷酸DNA鏈。在自動(dòng)合成儀上進(jìn)行，待合成至所需長(zhǎng)度，取下載體，加濃氨水，置50～55℃處理過(guò)夜，即可獲得寡聚DNA片段的粗品。經(jīng)PAGE電泳后，得到純品。然后在Sephadex G-25柱上，用重蒸去離子水上洗脫去鹽，無(wú)水乙醇濃縮后，分別溶于一定量的pH8.0的TM緩沖液(0.5mol/L Tris-HCl、0.1mol/L MgCl2)中。
分別將Ll與L2按常規(guī)方法退火。先按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南上介紹的方法》配制10×dsDNA合成反應(yīng)緩沖液，然后按下法配制反應(yīng)液退火后的DNA片段50μl10×dsDNA合成反應(yīng)緩沖液10μl
10mmol/L dNTP 10μl滅菌超純水 20μlDNA聚合酶Klenew1片段 1.5μl混勻后，置37℃水浴1.5h，將該DNA片段延伸、補(bǔ)齊。然后再加入5mmol/LNaCl 6μl，無(wú)水乙醇300μl，置冰浴中過(guò)夜，12000g離心15min，取沉淀，再加入預(yù)冷的70％乙醇200μl，混勻，同上法離心，取沉淀懸浮于20μl pH8.0的TME緩沖液中。即獲得按設(shè)計(jì)要求的SS基因。-20℃凍存?zhèn)溆谩? 構(gòu)建pUC12-SS質(zhì)粒2.1 SS基因的酶切人工合成、退火、補(bǔ)齊后的SS基因，分別用BamHI和HindIII雙酶切，回收帶粘性末端的SS基因，即可直接用于連接反應(yīng)。2.2 pUC12質(zhì)粒的提取、酶切和回收質(zhì)粒的提取按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法進(jìn)行，用BamHI和Hind III雙酶切。取10μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳，回收酶切大片段，置液氮中冷凍10min，然后置37℃水浴中融化，10000r/min離心10min，吸取上清，置-20℃凍存?zhèn)溆谩?.3 連接按DNA連接藥盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，其反應(yīng)體系如下pET32c質(zhì)粒雙酶切回收產(chǎn)物 2.5μlSS基因雙酶切回收產(chǎn)物 7.8μlDNA連接溶液 10μl混勻后，置16℃反應(yīng)30min后，即為pUC12-SS質(zhì)粒，立即可用于轉(zhuǎn)化。2.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法制備大腸桿菌JM103感受態(tài)細(xì)胞。2.5 轉(zhuǎn)化取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化200μl JM103(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，具體操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法進(jìn)行。取200μl轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂布含Amp 50mg/ml的LB瓊脂平板，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)大腸桿菌作對(duì)照(陰性對(duì)照)，接種后置37℃液箱，培養(yǎng)18h。2.6 pUC12-SS質(zhì)?？寺≈甑暮Y選pUC12質(zhì)粒含有氨卡青霉素抗性基因，同時(shí)還有β-半乳糖苷酶基因(LacZ)。含有該質(zhì)粒的大腸桿菌在半乳糖苷(Xgal)和異丙基硫化半乳糖苷(IPTG)存在的情況下，由于β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)表達(dá)，而生長(zhǎng)為藍(lán)色菌落。外源基因插入后，該基因由于移碼而失活，則所長(zhǎng)菌落呈白色。將上述轉(zhuǎn)化后大腸桿菌接種于含Amp Xgal和IPTG的LB平板上，37℃培養(yǎng)12h。挑選白色菌落，大量培養(yǎng)后，進(jìn)一步作酶切鑒定。2.7 重組質(zhì)粒酶切鑒定在pUC12質(zhì)粒的BamHI和HindIII之間尚有1個(gè)SmaI位點(diǎn)。SS基因插入后，此位點(diǎn)消失，BamHI和HindIII則仍保留。將上述選出的大腸桿菌大量培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，分別用SmaI、BamHI和HindIII單酶切。所選菌落均不被SmaI切開(kāi)，而能被BamHI和HindIII切開(kāi)，表明克隆成功。2.8 重組質(zhì)粒序列分析按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序，由于pUC12質(zhì)粒DNA與M13菌體在DNA多酶接頭處有一致的序列。因此序列分析物采用M13 17寡聚核苷酸片段作引物，并以[r-32P]ATP作同位素源。序列分析結(jié)果表明，克隆基因的堿基序列與設(shè)計(jì)的SS基因完全符合，證實(shí)目的的基因已在大腸桿菌JM83中克隆成功，pUC13-SS質(zhì)粒的構(gòu)建完成。見(jiàn)圖1。所測(cè)序列如下M 1 2 3 4 5 6 7 8.........GGA TCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGGBamHISS基因9 10 11 12 13 14 終止子 3 pUC12-SS質(zhì)粒的改造在pUC12-SS初級(jí)質(zhì)粒中，在SS基因的3’端之后，尚有一個(gè)多酶切位點(diǎn)，其中包括BamHI和HindIII等重復(fù)位點(diǎn)。因此加以改造以除去這些重復(fù)酶切位點(diǎn)。3.1 用HindIII酶切pUC12-SS質(zhì)粒取pUC12-SS質(zhì)粒(0.3mg/μl)5，然后加入10×中鹽緩沖液1μl，重蒸離子水2μl，HindIII內(nèi)切酶2μl，總體積為10μl。37℃保溫2h后，于0.8％瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)酶切是否完全。3.2 克隆株的篩選上述酶切完全的DNA，經(jīng)過(guò)酚、氯仿抽提和酒精沉淀，并溶于7μl重蒸去離子水中，然后分別加入ATP(10mmol/L)1μl。10×T4連接反應(yīng)緩沖液1μl。T4 DNA連接酶(5u/μl)1μl，混勻，15℃保溫過(guò)夜。參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所示方法，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑取5個(gè)菌落，培養(yǎng)后提取少量質(zhì)粒DNA。每個(gè)樣品各取4μl，分別作HamHI和Pst I單酶切。并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳。檢查酶切結(jié)果。選擇保持有HamHI位點(diǎn)，而Pst I位點(diǎn)消失的菌株，作進(jìn)一步鑒定。3.3 多酶切位點(diǎn)的鑒定在以后的基因融合的過(guò)程中，要運(yùn)用一些酶切位點(diǎn)，故對(duì)克隆株需再用HamHI、HindIII、EcoRI、SacI、SalI和PstI作單酶切。結(jié)果所選菌株均保持HindIII、BamHI、EcoRI、SacI等位點(diǎn)，而SalI和PstI位點(diǎn)消失。證明pUC13-SS2質(zhì)粒的改造成功。3.4 DNA序列分析采用雙脫氧末端終止法，直接以堿裂解的pUC12-SS2 DNA為模板，[α35-S]dATP為同位素源測(cè)定，結(jié)果，SS的DNA序列以及附近酶切點(diǎn)的DNA序列完全正確，證實(shí)pUC12-SS構(gòu)建成功，見(jiàn)圖2。所測(cè)序列如下M 1 2 3 4 5 6......GAATTC GAGCTC GCCC GGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTCEcoRI SacIBamHI SS基因7 8 9 10 11 12 13 14終止子 4 pUC12-SS/HBs的構(gòu)建4.1 從pWR13-HBs/6質(zhì)粒切取HBs DNA片段從本組保存的帶HBs的E.coli-pWR13-HBs/6按2.2法提取質(zhì)粒，取pWR13-HBs/6 DNA 15μl(5μg)，加入中鹽緩沖液3μl、水10μl SacI和BglII各1μl，總體積30μl，37℃反應(yīng)2h。經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳，切下回收700bp左右面的HBs-DNA片段，并經(jīng)抽提純化。4.2 HBs與SS基因融合和pUC13-HBs/SS質(zhì)粒的構(gòu)建提取上述構(gòu)建的pUC12-SS2質(zhì)粒經(jīng)SacI和BamHI雙酶切，抽提純化后，加入HBs-DNA片段，進(jìn)行連接反應(yīng)。反應(yīng)體系為切開(kāi)的pUC12-SS DNA 0.1μg，加入HBs基因片段0.5μg、10倍連接緩沖液1μl、10mmol/L ATP 1μl、T4DNA連接酶1μl，補(bǔ)水至10μl，15℃反應(yīng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切篩選鑒定。
pUC12-SS2經(jīng)質(zhì)粒SacI和BamHI酶切后，加入帶有SacI和Bgl II粘性末端的HBsDNA片段，所構(gòu)成的pUC12-HBs/SS不為Bgl II酶切。由于融合基因質(zhì)粒與非融合基因質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的細(xì)菌都為白色菌落。挑取17株白色菌落，少量抽提質(zhì)粒DNA，直接置0.8％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果有6株的質(zhì)粒DNA比pUC12-SS2 DNA大。進(jìn)一步酶切鑒定都為融合基因克隆質(zhì)粒，重組率為35.3％(6/17)。用HindIII和BamHI雙酶切pUC12-HBs/SS，得到約為730bp片段，即為HBs/SS融合基因。表明pUC13-HBs/SS質(zhì)粒構(gòu)建成功。4.3 融合基因的DNA序列分析同3.4法測(cè)定HBs/SS融合基因的DNA序列。正向引物測(cè)定中，可從pUC12的HindIII位點(diǎn)開(kāi)始通讀SS基因，經(jīng)過(guò)基因融合處，直到HBs基因C末端的幾個(gè)氨基酸編碼堿基。HBs基因的第233氨基酸后緊接的是由于外加接頭生產(chǎn)的Ser密碼子，其后的Asp、Pro和M密碼子，是SS基因合成片段帶進(jìn)的。然后接SS基因。閱讀框架以及起碼終止碼都完全正確。證實(shí)pUC12-HBs/SS質(zhì)粒建成功。見(jiàn)圖3。測(cè)定DNA序列如下S’ CCCGGGGATCCTCTAGAGTCGATCGACCTGCAGGTCGAGGACTGGGASmaI BamHI Xbal Sal I/SalI PstI SalI/XholHBs 1 23 4 217 218 219 220 221 222CCCTGCACCGAAC ATG GAG AAC ACA…… ATT TTC TTT TGT CTT TGG223 Ser Asp Pro Met 1 2 3 4 56 8 9 10 11GTA TCA GAT CCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TCC TGG AAG ACT12 13 14 15
前1～223為HBs的密碼子，后1～14為SS基因的密碼子。5 pcDNA3.1-HBs/SS質(zhì)粒的構(gòu)建5.1 合成HBs/SS融合基因的引物設(shè)計(jì)1對(duì)HBs/SS融合基因的引物L(fēng)1和L2。
L15’CGAAGCTT ATGGAGAACACACAATCAGG 3’Hind IIIL25’GCGAATTCTTACTAACAGGATGTGAAGT 3’EcoRI 終止子由上海博采生物技術(shù)公司合成。5.2 提取pUC12-HBs/SS質(zhì)粒參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》新物質(zhì)，提取pUC12-HBs/SS質(zhì)粒，供作PCR的DNA模板。5.3 PCR擴(kuò)增HBs/SS融合基因取10×反應(yīng)緩沖液(含15mmol/L MgCl2)3μl，2.5mmal/L dTNP 2μl，TaqDNA聚合酶3μl(1U)，上游引物和下游引物各1μl，模板DNA 0.1μg，加滅菌雙蒸水25μl，在反應(yīng)管內(nèi)混勻，置TECHNIE公司GENINS自動(dòng)PCR儀。反應(yīng)條件94℃變性5min 1個(gè)循環(huán)；94℃變性40s，60℃復(fù)性40s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。各取10μl PCR產(chǎn)物與marker一起經(jīng)1.5％瓊脂糖電泳后，用溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察?？梢?jiàn)一條730pb左右的帶，回收后用于連接。5.4 pcDNA3.1質(zhì)粒的提取、酶切和回收參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》所介紹的方法，用堿裂解法進(jìn)行，用RNA酶消化RNA，經(jīng)酚氯仿抽提除去RNA酶，無(wú)水乙醇沉淀后，加適量TE緩沖液溶解，即獲得純化的pcDNA3.1質(zhì)粒。
上述純化質(zhì)粒用HindIII和EcoRI雙酶切，參照2.2方法回收酶切后的大片段。5.5 連接和轉(zhuǎn)化按2.3和2.4所示方法將PCR擴(kuò)增的HBs/SS融合基因，用HindIII和EcoRI雙酶切后，與上述酶切、回收的質(zhì)粒大片段連接。獲得pcDNA3.1-HBs/SS重組質(zhì)粒。按2.5方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，即獲得用于生產(chǎn)SS-DNA疫苗的基因工程體-Ecoli-pcDNA3.1-HBs/SS。5.6 重組質(zhì)粒的酶切鑒定用Hind III和EcoRI雙酶切后的HBs/SS基因片段與同樣酶切的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1連接后，Hind III和EcoRI位點(diǎn)仍保留，而二者之間的BamHI位點(diǎn)消失。從上述基因工程體中提取質(zhì)粒，分別用Hind III、EcoRI、BamHI單酶切和用Hind III與EcoRI雙酶切。結(jié)果用BamHI酶切者質(zhì)粒不被切開(kāi)，用Hind III和EcoRI酶切時(shí)，質(zhì)粒被切開(kāi)；用Hind III與EcoRI雙酶切者，則可見(jiàn)一帶720bp大小的小帶。表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。5.7 重組質(zhì)粒的序列分析從重組質(zhì)粒中插入基因的3’起測(cè)序。由上海博生物技術(shù)公司測(cè)定。結(jié)果與原設(shè)計(jì)完全符合，表明生產(chǎn)用于促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)的SS-DNA疫苗的基因工程體構(gòu)建成功。見(jiàn)圖4。6 生產(chǎn)和應(yīng)用本發(fā)明所提供的基因工程體可用發(fā)酵生產(chǎn)，回收菌體，提取質(zhì)粒后，即直接配苗。生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，適于大規(guī)模生產(chǎn)，成本低廉，使用方便，無(wú)激素殘留，無(wú)潛在危險(xiǎn)。疫苗免疫后，該表達(dá)質(zhì)粒能在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)2～3個(gè)月。表達(dá)產(chǎn)物能誘導(dǎo)產(chǎn)生SS抗體，從而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。其免疫期較長(zhǎng)，且可多次加強(qiáng)免疫，提高免疫增高效果。本疫苗既可單獨(dú)應(yīng)用，亦可與激生1號(hào)苗或激生3號(hào)苗配合應(yīng)用；既可用于家畜亦可用于家禽，更適用于生產(chǎn)期較長(zhǎng)的禽、畜。能在不增加飼料，不添加化學(xué)添加劑的前提下，增加肉、乳、旦、毛的產(chǎn)量。其應(yīng)用領(lǐng)域覆蓋整畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1 生長(zhǎng)抑素(SS)基因疫苗(DNA疫苗)的基因工程體，其特征在于將SS基因插入人乙肝表面抗原基因(HBs)的第223密碼子之后，構(gòu)建成HBs/SS融合基因。并將其插入能在直核細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)的pcDNA3.1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，即成本發(fā)明的基因工程體-E.coli-pcDNA3.1-HBs/SS；菌種分類(lèi)大腸埃希氏桿菌，命名E.coli-pcDNA3.1-HBs/SS保藏單位中國(guó)微生物菌種保管委員會(huì)普通微生物中心保藏地址中國(guó)北京中關(guān)村2714信箱保藏號(hào)0709
2根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程體，其特征在于，由以下方法構(gòu)建而成2.1 pUC12-SS質(zhì)粒的構(gòu)建和改造首先合成SS基因，設(shè)計(jì)的通式為5′-保護(hù)性堿基-內(nèi)切酶-框架保護(hù)堿基-SS基因-終止子-內(nèi)切酶-保護(hù)性堿基-3′，具體設(shè)計(jì)如下BamHI SS基因 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 105’-ACGGATCCGM ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT3’TG CCTAGGC TAC CGA CCG ACG TTC TTG AAG AAG ACC TTC TGA11 12 13 14 終止子 HindIIITTC ACA TCC TGT TAG TAAGCT TTA 3’AAG TGT AGG ACA ATC ATT CGA AAT 5’將上述人工合成的SS基因插入pUC12質(zhì)粒，構(gòu)建成pUC12-SS重組質(zhì)粒。然后除去該質(zhì)粒重復(fù)的酶切位點(diǎn)，將其改造成pUC12-SS2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)酶切鑒定和序列分析，證實(shí)構(gòu)建成功；2.2 pUC12-HBs/SS質(zhì)粒的構(gòu)建從帶HBs的pWR13-HBs/6質(zhì)粒，用SacI和BglII雙酶切，切下700bp左右的HBs-DNA片段；將其插入用SacI和BamHI雙酶切切開(kāi)的pUC12-SS2質(zhì)粒中，構(gòu)建成pUC12-HBs/SS質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)酶切鑒定和序列分析，證實(shí)構(gòu)建成功；2.3 pcDNA3.1-HBs/SS質(zhì)粒和基因工程體的構(gòu)建設(shè)計(jì)1對(duì)HBs/SS融合基因的引物L(fēng)1和L2L15’CGAAGCTT ATGGAGAACACACAATCAGG 3’Hind IIIL25’GCGAATTCTTACTAACAGGATGTGAAGT 3’EcoRI 終止子以pUC12-HBs/SS質(zhì)粒為模板，用PCR擴(kuò)增出HBs/SS融合基因。提取pcDNA3.1質(zhì)粒，用HindIII和EcoRI雙酶切后，回收質(zhì)粒大片段，用連接酶將上述擴(kuò)增并經(jīng)同樣雙酶切形成粘性末端的HBs/SS融合基因連接，構(gòu)建成pcDNA3.1-HBs/SS重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)酶切鑒定和序列分析，證實(shí)本發(fā)明的基因工程體-E.coli-pcDNA3.1-HBs/SS構(gòu)建成功。
全文摘要
本發(fā)明生長(zhǎng)抑素基因疫苗(DNA疫苗)的基因工程體,屬生物新技術(shù)領(lǐng)域。其構(gòu)建過(guò)程是:人工合成生長(zhǎng)抑素(SS)基因,構(gòu)建pUC12－SS質(zhì)粒。并將其改造成pUC12－SS2質(zhì)粒。然后,從pWR13－HBs/6質(zhì)粒切下HBs片段,與切開(kāi)的pUC12/SS2連接,構(gòu)建成帶HBs/SS融合基因的pUC13/－HBs/SS質(zhì)粒。最后用PCR擴(kuò)增出該質(zhì)粒中的HBs/SS與pcDNA3.1質(zhì)粒連接,構(gòu)建成pcDNA3.1－HBs/SS質(zhì)粒。將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸肝菌,即成本發(fā)明的基因工程體－Ecoli－pcDNA3.1－HBs/SS。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1366061SQ0210372
公開(kāi)日2002年8月28日 申請(qǐng)日期2002年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月13日
發(fā)明者杜念興, 李光富 申請(qǐng)人:杜念興, 李光富