專利名稱：大鼠睪丸特異基因rtSH3p13的克隆及其蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一個在精子發(fā)生過程中參與網(wǎng)格蛋白(clathrin)復(fù)合體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的基因/蛋白(命名為rtSH3p13基因/蛋白)，涉及生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)中新基因、新蛋白質(zhì)的開發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域。
SH3p4基因以腦組織表達為主；SH3p8在多種組織中有表達且表達水平相似；SH3p13則在睪丸組織中高水平表達。
目前研究主要集中于探討SH3p4/8/13在神經(jīng)組織中的功能，Ringstad等應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)及蛋白質(zhì)overlay assay實驗發(fā)現(xiàn)synaptojanin、dynamin能夠與SH3p4、SH3p13蛋白相互作用，在突觸的形成和維持過程中有重要的作用。有人發(fā)現(xiàn)SH3p13蛋白的人的類似物SH3GL3能夠與神經(jīng)退化性疾病舞蹈癥(Huntington’disease，HD)蛋白的外顯子1(Hdexlp)蛋白相互作用。但至今尚無有關(guān)SH3p13蛋白在睪丸組織中功能的研究報道。
發(fā)明目的克隆在睪丸曲細精管區(qū)段差異表達、在精子細胞發(fā)育過程中可能起重要作用的基因rtSH3p13，表達其編碼蛋白質(zhì)，了解其在轉(zhuǎn)錄與表達的階段，闡明其生理生化功能，更清楚地了解精子細胞的發(fā)生機理以及基因表達調(diào)控規(guī)律，從而為相關(guān)疾病的基因診斷和基因治療以及新藥篩選和抗生育研究提供可能的目標基因。
內(nèi)容與要求應(yīng)用基因組信息學(xué)原理、睪丸曲細精管分段分離技術(shù)、差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR、斑點雜交、分子克隆、cDNA文庫篩選、DNA序列測定技術(shù)、Northern印跡雜交、蛋白質(zhì)表達與純化技術(shù)、抗血清制備、免疫組織化學(xué)和免疫電鏡技術(shù)、親和層析、Western blot檢測、細胞培養(yǎng)技術(shù)、以及細胞免疫熒光和激光共聚焦顯微技術(shù)等，克隆鑒定編碼rtSH3p13蛋白的新基因全長cDNA，通過Northern印跡雜交進行組織表達譜和睪丸發(fā)育階段表達分析，純化原核表達的目標蛋白質(zhì)并免疫家兔制備抗血清，進而進行免疫組織化學(xué)和免疫電鏡分析，綜合運用親和層析以及細胞免疫熒光和激光共聚焦顯微技術(shù)初步確定rtSH3p13基因/蛋白的功能。該基因/蛋白達到的技術(shù)指標為1. rtSH3p13基因的cDNA序列全長為1463bp，GenBank接收號為AF227439。此序列有一個936bp的開放閱讀框架，編碼一個312個氨基酸的蛋白質(zhì)。位于457-459位的ATG是編碼氨基酸的起始密碼子，上游-177核苷酸處有一個框內(nèi)終止密碼。說明這段序列是一完整的全長cDNA序列。
2. rtSH3p13蛋白氨基端為螺旋結(jié)構(gòu)，中段為可變區(qū)，羧基端第253-307氨基酸編碼SH3結(jié)構(gòu)域。
3. rtSH3p13基因的表達具有組織特異性和睪丸組織發(fā)育階段特異性。Western結(jié)果顯示該基因僅在大鼠睪丸和腦組織有轉(zhuǎn)錄表達，且在睪丸組織的表達水平遠高于腦組織(見

圖1)。發(fā)現(xiàn)出生后6天的大鼠睪丸尚無rtSH3p13基因的轉(zhuǎn)錄表達，18天、21天、40天的大鼠睪丸均有rtSH3p13基因的轉(zhuǎn)錄表達，至60天即成年大鼠的睪丸rtSH3p13基因的轉(zhuǎn)錄表達量明顯較高(見圖2)。
4. rtSH3p13基因中包括可變區(qū)與SH3結(jié)構(gòu)域共306bp(編碼102個氨基酸)于大腸桿菌中獲得明顯表達，經(jīng)親和層析純化后的產(chǎn)物免疫家兔，制備了高滴度抗rtSH3p13蛋白抗體(見圖3)。
5. rtSH3p13蛋白的表達具有精子發(fā)生周期的階段特異性。rtSH3p13蛋白從精子發(fā)生第VIII期的圓形精細胞開始表達，直至以后的所有精子細胞均有rtSH3p13蛋白的表達(見圖4)。
6. 該基因的編碼蛋白質(zhì)在精子細胞中位于質(zhì)膜和頂體之間的區(qū)域(見圖5)。
7. rtSH3p13蛋白可以與synaptojanin I相互作用(見圖6)并參與網(wǎng)格蛋白(clathrin)復(fù)合體的功能(見圖7，圖8)。
8. 該基因及其編碼蛋白質(zhì)與內(nèi)吞過程、精子發(fā)生等生命現(xiàn)象密切相關(guān)。
采用甲醛變性的1％瓊脂糖凝膠電泳，每個泳道上樣所提組織總RNA 25μg，電泳結(jié)束后，用DEPC處理過的水淋洗凝膠數(shù)次，50mM的NaOH處理20min以水解RNA，無RNA酶的水淋洗數(shù)次，并用20X SSC浸泡凝膠45min，用20X SSC轉(zhuǎn)膜16-20h，轉(zhuǎn)移結(jié)束后，于6XSSC中漂洗濾膜，晾干，80℃干烤固定1-2h。室溫存放待雜交用。
用PCR擴增rtSH3p13片段，擴增片段的回收、定量，探針標記DNA用量為25ng，采用隨機引物標記試劑盒(Boehringer Mannheim)對探針進行放射性標記，雜交液使用Clontech公司Express Hyb TM Hybridization Solution。將雜交液68℃預(yù)熱，使液體均勻。將Northern膜放入6X SSC中浸濕，然后置于雜交管中。固定有核酸的一面朝上，膜與雜交管之間勿留氣泡，加入5ml雜交液，68℃預(yù)雜交30min。將標記探針于100℃處理10min，然后冰浴10min，繼而與預(yù)熱的雜交液混勻，加到雜交管中。68℃雜交1-2h。雜交結(jié)束后，小心將膜自雜交管中取出。置于2XSSC/0.5％SDS中室溫洗三次，每次15min。然后再用0.1XSSC/0.1％ SDS 68℃洗膜兩次，每次20min。將濕膜置于保鮮膜內(nèi)，壓X光膠片，-70℃曝光(圖1，圖2)。3. rtSH3p13基因片段的原核表達及純化將編碼rtSH3p13蛋白的可變區(qū)-SH3結(jié)構(gòu)域(V.SH3)的cDNA分別克隆到pET30a(+)、pGEX-4T3載體中，并用CaCl2法轉(zhuǎn)化BL21細胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后分別獲得高效表達的His-tag和GST融合蛋白。
首先小量培養(yǎng)鑒定GST-V.SH3融合蛋白表達水平及該融合蛋白在細胞內(nèi)的表達形式，然后進行大量表達，自經(jīng)過鑒定的質(zhì)粒保存板中挑單菌落入100ml新鮮LB的錐形瓶(含卡那霉素50μg/ml)。37℃，劇烈搖動，培養(yǎng)過夜。將過夜菌液按1/10比例接種到一個含500ml LB(含卡那霉素)的2000ml錐形瓶中，37℃，劇烈搖動，培養(yǎng)1-1.5h，使菌液的A600nm值達0.4-0.6。加入終濃度為0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達3-4h。收集培養(yǎng)液，5000rpm離心10min，棄上清。PBS洗菌體沉淀，用PBS按照5ml/g重懸，冰浴下以工作10s/冷卻20s/300W/20次的參數(shù)，超聲破碎細胞。12000rpm離心20min，分別取少量上清和沉淀，進行SDS-PAGE檢測，分析蛋白質(zhì)在胞內(nèi)表達形式。其余于-70℃凍存?zhèn)溆谩?br> 采用Novagen公司的His.Bind metal chelation resin產(chǎn)品進行重組蛋白質(zhì)的純化。經(jīng)鑒定表達蛋白質(zhì)以可溶性形式表達，以0.45μm濾膜過濾上清。輕混Ni-NTA樹脂，使其與保存液混勻呈完全懸浮狀態(tài)。吸取2.5ml樹脂懸液加到聚丙烯柱內(nèi)，使樹脂在重力作用下沉積。分別以3倍柱床體積去離子水、5倍體積charging buffer(50mM NiSO4)及3倍體積bindingbuffer(5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris·HCl，pH7.9)洗柱。當(dāng)Binding Buffer下降到柱床上緣時，加入已經(jīng)準備好的待純化樣品。調(diào)節(jié)流速約為10滴/min。分別以10倍體積的Binding Buffer、6倍體積的(40mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris·HCl，pH7.9)洗柱。以6倍柱床體積或更少Washing Buffer的Elute Buffer(1M咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris·HCl，pH7.9)，洗脫柱子。收集洗脫液。取少量進行SDS-PAGE鑒定。
GST融合蛋白的純化應(yīng)用Pharmacia公司純化試劑盒進行。用預(yù)冷的3倍柱床體積PBS緩沖液平衡glutathione-Sepharose親和柱后，4℃下將破菌液掛柱。50～80倍柱床體積PBS緩沖液緩慢沖洗層析柱，用考馬斯亮蘭G250檢測流出液至沒有蛋白質(zhì)為止。用還原型谷胱苷肽處理洗滌glutathione-Sepharose親和柱以循環(huán)利用，電泳檢測洗出液，確定蛋白質(zhì)純度(圖3)。4. rtSH3p13抗血清的制備三只2kg重的新西蘭大白兔。兩只作為實驗組，一只為對照。免疫前從耳緣靜脈取0.5ml正常血清做對照。
將純化的His6-V.SH3與福氏完全佐劑混合，采用背部皮內(nèi)多點注射，約20-30點。對照組取泡膠液與佐劑混合。初始免疫后2、4、8周采用抗原和福氏不完全佐劑混合進行加強免疫。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)抗體滴度，Western Blot檢測抗體特異性。5. 睪丸組織切片的免疫組織化學(xué)分析5μm厚睪丸組織冰凍切片，改良Bouin液固定10min。PBS洗2次，每次5min。3％ H2O2室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。5-10％正常羊血清(PBS配)，室溫封閉10min。傾去血清，滴加適當(dāng)稀釋的抗rtSH3p13血清，4℃過夜。PBS洗3次，每次5min。滴加適當(dāng)稀釋的生物素標記二抗，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。滴加適當(dāng)稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈親和素，37℃孵育30min。PBS洗3次，每次5min。AEC顯色(4mg AEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml 0.1M乙酸緩沖液，pH5.2，加入15ul 30％ H2O2，過濾后即可)40min。自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，封片。(圖4)6. rtSH3p13蛋白在睪丸生精細胞的免疫電鏡定位取新鮮成年大鼠睪丸4％甲醛加0.2％戊二醛經(jīng)動脈插管灌流1h，在-20℃恒冷箱中以K4M低溫包埋劑(Chemishe Werkelowi，Germany)進行包埋。超薄切片機LKB-2088A做半薄切片1-2f，切片置于潔凈載玻片上，60℃烤片過夜，1％甲苯胺藍染色，自來水沖洗，光鏡下定位。超薄切片機制LKB-2088超薄切片厚300-500。
以下實驗步驟在鎳網(wǎng)上完成1％ BSA封閉液，室溫封閉5min，0.01M PB洗網(wǎng)4次，每次2min。加抗rtSH3p13多克隆抗體室溫孵育4h，0.01M PB洗網(wǎng)4次，每次2min。加1∶25稀釋的金標二抗(10nm Gold-Goat Anti-Rabbit IgG，美國Amersham)，室溫孵育1h。0.01M PB洗網(wǎng)4次，每次2min。靜置干燥。醋酸鈾染色2min，枸櫞酸鉛染色1-2min。電鏡觀察(圖5)。7. 睪丸生精細胞抽提液的制備取成年大鼠四只，斷頸后迅速取其雙側(cè)睪丸，稱重。去掉白膜及表面可見的大血管，將睪丸組織放入2ml DMEM不完全培養(yǎng)基(含0.02M HEPES，0.1％膠原酶I)中，用尖頭鑷子輕輕分散曲細精管，33℃溫育30分鐘后加入10ml PBS(含1mM EDTA)，輕輕混合后靜置5分鐘，燒杯底部管狀物重懸于10ml上述DMEM不完全培養(yǎng)基中，33℃溫育15分鐘后，加10ml PBS(含1mM EDTA)輕輕吹打數(shù)次，靜置待管狀物沉淀。用剪刀將管狀物剪成小段，輕輕吹打管狀物數(shù)次后靜置5分鐘，用尼龍網(wǎng)過濾上清，600g離心10分鐘，沉淀即為生精細胞。用20ml RIPA緩沖液(50mMHepes，pH7.4、150mM NaCl、2mM EDTA、2mM EGTA、1％ TritonX-100、50mM NaF、5mM焦磷酸鈉、50mM β-甘油磷酸鈉、1mM正釩酸鈉、1mM DTT、1mM PMSF、10μg/ml Leupeptin、10μg/mlAprotinin)懸浮上述制備的生精細胞。4℃充分混勻1小時。于4℃ 12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。上清即為睪丸組織生精細胞提取液，福林—酚法定量后-70℃凍存待用。8. 親和層析(Pull down試驗)結(jié)合Western Blot檢測rtSH3p13與synaptojanin I的結(jié)合取含300.μg重組GST-V.SH3融合蛋白溶液和GST蛋白溶液分別與100μl谷胱苷肽凝膠珠混合，4℃孵育2-3h后加到分離柱中，使管內(nèi)液體自然流出。用含1％ TritonX-100的PBS漂洗柱子三次后，用RIPA緩沖液平衡柱子。向兩個柱子中分別加入來自2g睪丸組織制備的生精細胞提取液10ml，用蓋子封上柱子兩端，混懸管內(nèi)谷胱苷肽凝膠珠和提取液，4℃慢搖3h。固定分離柱，打開兩端蓋子，讓液體自下端流出。用含1％ TritonX-100的PBS漂洗柱子三次。
將柱內(nèi)凝膠珠移至1.5ml離心管，加入1XSDS/PAGE上樣緩沖液200μl，懸浮凝膠珠，100℃煮沸10分鐘，取20μl行12％ SDS-PAG電泳。SDS-PAGE結(jié)束后，將塑料支架平放，依次放置海綿墊、3層濾紙、凝膠、NC膜、3層濾紙、海綿墊，趕走各層間氣泡，夾好支架，在冰浴中進行電轉(zhuǎn)，40V，8-10h；或100V，1h 20min(PVDF膜需經(jīng)100％甲醇浸透，電轉(zhuǎn)液平衡20min后方可使用)。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，將膜置于去離子水中漂洗5min。切下邊側(cè)的蛋白質(zhì)分子量Marker條帶，浸入0.2％氨基黑染液染色1-2min，然后10％乙酸脫色至可見蛋白質(zhì)條帶，蒸餾水漂洗觀察轉(zhuǎn)移效果，并密封保存留待以后作為分析結(jié)果時分子量的參照。轉(zhuǎn)移的濾膜勿干，準備用于雜交。將做好標記的濾膜經(jīng)TBS漂洗后，加入適量封閉液(含5％脫脂奶粉、1％正常馬血清的TBS-T溶液)中，室溫輕搖2h。將濾膜放入雜交袋內(nèi)，按照0.1ml/cm2加入1∶1000的一抗(抗synaptojanin I抗體，羊IgG)，抗體的稀釋度遵循提供者建議。除盡氣泡，封口。于4℃輕搖過夜。取出濾膜，用TBS-T洗三次，每次10min。將膜放入塑料袋內(nèi)，按照0.1ml/cm2加入堿性磷酸酶標記的抗羊血清。趕除氣泡，封口。室溫振蕩2h。取出濾膜，用TBS-T洗三次，每次10min。用顯色緩沖液(100mMNaCl，5mM MgCl2，100mM Tris-HCl pH9.5)洗膜5min。將濾膜浸入含100μl Reagent A與100μlReagent B(Bio-Rad)的10ml顯色緩沖液中，于室溫下輕輕搖晃使蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)，蒸餾水中漂洗，4℃避光保存并掃描(圖6)。9. 以EGFR介導(dǎo)的內(nèi)吞作用為例，應(yīng)用細胞免疫熒光結(jié)合激光共聚焦技術(shù)進行共定位研究將rtSH3p13克隆入pEGFP N1(Clontech公司)構(gòu)建融合綠色熒光蛋白表達載體，并對重組質(zhì)粒進行測序鑒定。將上述重組載體和空載體分別轉(zhuǎn)入CHO細胞，進行Wεστερν和細胞熒光檢測，確認融合蛋白得到表達。
將蓋玻片分次置于濃酸中浸泡2小時，用去離子水洗凈后室溫干燥。將經(jīng)酸處理的蓋玻片置于10倍稀釋的多聚賴氨酸溶液中，室溫放置5分鐘后取出，置于60℃干燥1小時或室溫過夜。用前將蓋玻片浸泡于75％乙醇中至少30分鐘。
實驗前兩天將處理過的蓋玻片放置于6孔培養(yǎng)板板中，將處于對數(shù)生長期的CHO細胞接種于6孔板中，每孔3×105個細胞，37℃，5％ CO2培養(yǎng)至70％飽和度。用50μl無抗生素?zé)o血清DMEM分別稀釋3μg質(zhì)粒和3.5μl Lipofectamine2000。室溫放置2分鐘后將稀釋的質(zhì)粒和Lipofectamine 2000混勻，室溫放置20分鐘。將上述混合物滴加到6孔培養(yǎng)板中，37℃，5％ CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)染后24小時將培養(yǎng)基換為無血清DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％ CO2培養(yǎng)6小時。
對于相應(yīng)的實驗組誘導(dǎo)EGFR介導(dǎo)的內(nèi)吞作用取出經(jīng)饑餓處理的細胞，6孔板置于冰上5分鐘。加入rhEGF至終濃度為100ng/ml，冰上10分鐘。將細胞置于37℃，5％ CO2培養(yǎng)30分鐘。
細胞免疫熒光染色1)細胞固定用PBS清洗細胞兩次，取出蓋玻片，用濾紙將殘留液體吸干，以4％多聚甲醛固定液室溫固定10分鐘。2)PBS漂洗，3×5分鐘。3)細胞透化室溫下，0.5％ Triton/PBS透化處理10分鐘。4)PBS漂洗，3×5分鐘。5)細胞封閉以3％ BSA/PBS封閉，37℃，30分鐘或4℃過夜。6)一抗孵育抗體按1∶100稀釋，37℃，30分鐘。7)PBS漂洗，3×5分鐘。8)二抗孵育抗體按1∶50稀釋37℃，30分鐘。9)PBS漂洗，3×5分鐘。10)去離子水漂洗，2×5分鐘。11)封片取10μl封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細胞的一面朝下封片，周圍用指甲油封住。12)用激光共聚焦顯微鏡觀察(圖7，圖8)。10. 全長rtSH3p13 cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列:
1 CGG GCC AGG AGC TAA TGG TTC TGG AGA AAT GCT AGA GCC AAA GAG AAG 4849 CCC GGA TAC AGG TGT GAA CTG CGA GCG TTG AGG ACA ACA GTA GTG TTG 9697 ATG ACC CCT GAC CCG ACG TTG GGA AGC GTC CAC AGA ATG CCA TTC CTT 144145 TTA GGT AGA GAC TGA AAG TTG GAT GGT GTT TGT GTT GGT GTG AAG CAT 192193 CGC TGA AGT GGA TTG AAG GCA TTG GGA GCC ACA GGG CCT TTG AAA GGT 240241 CAG ATT CAG GGA AAG TAG ACT TGT TGG TGG CAC AAG AAT TGA TGC AAG 288289 GTC CGT TTC TGT GAC TGG GTA GAC ATA CTG TTC AGT AGG AGC TCT AGA 336337 CCC TGT GGA AAG GGT CCG GTG TAC AGG ACT CTC CCG AAG ACC AGT CTG 384385 AAC AAT ACT CTG CTG TTT AGT GAA AAA ATA AGT GGT GCA GAA GGA ACG 432433 AAG CTA GAT GAA GAG TTT CTG GAT ATG GAA AAG AAA ATA GAT ATT ACC 4801 M E K K I D I T8481 AGT AAA GCT GTT GCA GAA ATT CTT TCA AAA GCC ACA GAG TAT CTC CAG 5289 S K A V A E I L S K A T E Y L Q 24529 CCC AAT CCA GCA TAC AGA GCT AAG CTA GGA ATG CTG AAC ACT ATG TCG 57625 P N P A Y R A K L G M L N T M S 40577 AAG CTC CGA GGG CAG GTG AAG GCC ACC GGC TAC CCA CAG ACC GAA GGC 62441 K L R G Q V K A T G Y P Q T E G 56625 TTG CTG GGG GAC TGC ATG CTC AAG TAC GGC AGG GAG CTT GGA GAA GAC 67257 L L G D C M L K Y G R E L G E D 72673 TCT GCT TTT GGC AAC TCA TTG GTA GAA GTT GGT GAG GCC CTG AAA CTC 72073 S A F G N S L V E V G E A L K L 88721 ATG GCT GAG GTG AAG GAC TCT CTG GAT ATT AAT GTG AAG CAG ACT TTT 76889 M A E V K D S L D I N V K Q T F 104769 ATT GAC CCA CTA CAG CTA CTG CAA GAC AAA GAT TTA AAA GAG ATT GGG 816105 I D P L Q L L Q D K D L K E I G 120817 CAC CAC CTG AGA AAG CTA GAA GGC CGC CGT CTG GAC TAT GAT TAT AAA 864121 H H L R K L E G R R L D Y D Y K 136865 AAG AAG CGG GTG GGT AAG ATC CCC GAG GAA GAA ATC AGA CAA GCA GTA 912137 K K R V G K I P E E E I R Q A V 152913 GAA AAG TTT GAA GAG TCA AAG GAG TTG GCC GAA AGA AGC ATG TTT AAT 960153 E K F E E S K E L A E R S M F N 168961 TTT TTA GAA AAT GAC GTA GAG CAA GTG AGT CAG CTG GCC GTG TTT GTA1008169 F L E N D V E Q V S Q L A V F V 1841009 GAG GCG GCG TTA GAC TAT CAC AGG CAG TCC ACC GAG ATC CTG CAG GAG1056185 E A A L D Y H R Q S T E I L Q E 2001057 CTG CAG AAC AAG CTA GAG CTG CGA ATA GCT CTT GCA TCC CAA GTC CCT1104201 L Q N K L E L R I A L A S Q V P 2161105 AGG CGA GAC TAC ATG CCA AAG CCT GTG AAC ACG AGT TCC ACC AAT GCC1152217 R R D Y M P K P V N T S S T N A 2321153 AAC GGG GTC GAA CCC AGC TCT TCG TCA AAG TTA ACA GGT ACT GAC ATT1200233 N G V E P S S S S K L T G T D I 2481201 CCC TCG GAC CAG CCC TGC TGT CGT GGT CTC TAT GAC TTT GAG CCA GAA1248249 P S D Q P C C R G L Y D F E P E 2641249 AAC GAA GGA GAA TTG GGA TTT AAA GAA GGG GAC ATC ATT ACA TTA ACC1296265 N E G E L G F K E G D I I T L T 2801297 AAT CAG ATA GAT GAA AAC TGG TAT GAA GGA ATG CTC CGT GGG GAA TCC1344281 N Q I D E N W Y E G M L R G E S 2961345 GGC TTC TTC CCT ATT AAT TAC GTG GAA GTC ATT GTG CCT TTA CCT CGG1392297 G F F P I N Y V E V I V P L P R 3121393 TAA ATG TGT CTT TTG GAC CTG ACT TCA GAA CTG AAA TGA ATT GGC ACC1440313 * 3131441 AGT GTT CAA AAA AAA AAA AAA AA 146權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一個自大鼠睪丸曲細精管區(qū)段差異表達的、參與網(wǎng)格蛋白(clathrin)復(fù)合體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的基因/蛋白，命名為rtSH3p13基因/蛋白(GenBank注冊號AF227439)。包括互補脫氧核糖核酸(cDNA)序列，編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。其特征在于rtSH3p13的cDNA全長為1463bp，相應(yīng)編碼蛋白質(zhì)有312個氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之rtSH3p13基因/蛋白，其特征在于該蛋白的羧基端第253-307氨基酸編碼SH3結(jié)構(gòu)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述之rtSH3p13基因/蛋白，其特征在于該基因的表達具有組織特異性和睪丸組織發(fā)育階段特異性。該基因在大鼠睪丸組織呈高水平轉(zhuǎn)錄表達。大鼠于出生后6天其睪丸中尚無rtSH3p13基因的轉(zhuǎn)錄表達，18天、21天、40天時均可檢出該基因的轉(zhuǎn)錄表達，至60天即成年大鼠，睪丸中rtSH3p13基因呈明顯高表達。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述之rtSH3p13基因/蛋白，其特征在于rtSH3p13蛋白的表達具有精子發(fā)生周期的階段特異性。rtSH3p13蛋白從精子發(fā)生第VIII期的圓形精細胞開始表達，直至以后的所有精子細胞均有rtSH3p13蛋白的表達。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4所述之rtSH3p13基因/蛋白，其特征在于該基因的編碼蛋白在精子細胞中位于質(zhì)膜和頂體之間的區(qū)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5所述之rtSH3p13基因/蛋白，其特征在于rtSH3p13蛋白可以與synaptojanin I相互作用并參與網(wǎng)格蛋白復(fù)合體的功能。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5、6所述之rtSH3p13基因/蛋白，其特征在于該基因及其編碼蛋白的功能與精子發(fā)生中的內(nèi)吞過程等生命現(xiàn)象密切相關(guān)，在抗生育領(lǐng)域以及新藥的設(shè)計與開發(fā)中具有潛在的應(yīng)用前景。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個自大鼠睪丸曲細精管區(qū)段差異表達的基因/蛋白，命名為rtSH3p13基因/蛋白(GenBank注冊號AF227439)。內(nèi)容包括rtSH3p13的互補脫氧核糖核酸(cDNA)序列，編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列；結(jié)構(gòu)分析顯示rtSH3p13蛋白羧基端包含一個SH3結(jié)構(gòu)域；Northern印跡分析結(jié)果表明，該基因的表達具有組織特異性和睪丸組織發(fā)育階段特異性；免疫組化實驗結(jié)果顯示，rtSH3p13蛋白的表達還具有精子發(fā)生周期的階段特異性；免疫電鏡分析結(jié)果顯示，該蛋白在精子細胞中位于細胞質(zhì)膜與頂體間區(qū)域；綜合運用親和層析以及細胞免疫熒光和激光共聚焦顯微技術(shù)，初步確定rtSH3p13蛋白能夠與synaptojaninⅠ相互作用，并且參與網(wǎng)格蛋白(clathrin)復(fù)合體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。rtSH3p13基因/蛋白的功能與精子發(fā)生中的內(nèi)吞過程等生命現(xiàn)象密切相關(guān)，闡明其生理生化功能對了解基因表達調(diào)控規(guī)律和生殖細胞的發(fā)生機理具有重要的意義。
文檔編號C12N15/12GK1443846SQ0210438
公開日2003年9月24日 申請日期2002年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月7日
發(fā)明者繆時英, 喬原, 王琳芳, 楊居祥, 張曉東, 宗書東 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所