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      中華蜜蜂大胡蜂溶血肽前體基因及編碼的多肽和制備方法

      文檔序號:422591閱讀:958來源:國知局
      專利名稱:中華蜜蜂大胡蜂溶血肽前體基因及編碼的多肽和制備方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域,尤其涉及中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前體(Prepromelittin)基因及其編碼的多肽和制備方法。
      背景技術(shù)
      意大利蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒溶血肽(Melittin)是意大利蜜蜂蜂毒的基本組成成分,約占蜂毒的40%~50%(Vol.3.New YorkAcademic,1971,535),按來源和生化性質(zhì),它是一種活性多肽,其中90%的溶血肽以游離狀態(tài)存在,而另外的10%則以Melittin N1-甲酰化形式存在(Biochem.Biophys.Res.Commun.,1967,27275-280)。它具有非常重要的生物學(xué)活性,能引起紅細胞溶解(Z.Physiol.Chem.,1970,351,884)、脂質(zhì)體釋放標記離子(marker ions)(J.Biol.Chem.,1969,244,3575)以及肥大細胞釋放組胺(J.Pharmacol,1965,25,29)等等。Melittin合成時有兩種前體存在。一種是Promelittin,在蜜蜂毒腺或注入蜂王毒腺提取物的蛙卵中發(fā)現(xiàn)。在蛙卵中合成時,Promelittin是穩(wěn)定的終產(chǎn)物,而在毒腺中,它將緩慢地轉(zhuǎn)變?yōu)镸elittin;第二種稱為Prepromelittin,分子量比Promelittin大,只能在無細胞體系中轉(zhuǎn)錄的MelittinmRNA上發(fā)現(xiàn)(Proc.Natl.Acad.Sct.USA,1978,75,701-704)。
      1983年,Vlasak等利用意大利蜜蜂蜂王毒腺總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后將合成的雙鏈cDNA克隆到pBR322載體中,構(gòu)建cDNA文庫,用探針篩選出帶有大于200bp插入片段的陽性克隆,然后再將它們亞克隆到PUC8載體中,再經(jīng)酶切鑒定從中篩選出2個陽性克隆,對其中含有最大插入片段的PUM13/4進行測序,結(jié)果顯示該插入序列為Prepromelittin的核苷酸序列,該cDNA所編碼的成熟肽--蜂毒溶血肽前體蛋白為49個氨基酸殘基(Eur.J.Biochem.,1983,135123-126)。Prepromelittin蛋白實質(zhì)上是蜂毒溶血肽的天然融合蛋白,它在蜜蜂毒腺細胞中合成后經(jīng)二肽蛋白酶水解成蜂毒Melittin。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明目的之一是提供一種中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的多核苷酸,該多核苷酸編碼意大利蜜蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的一個同系物。本發(fā)明目的之二是提供一種由中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin多核苷酸編碼的最終產(chǎn)物--中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Melittin蛋白。
      本發(fā)明目的還提供了這種制備中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin核苷酸探針、含中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin核苷酸和Prepromelittin基因末端的130-213核苷酸序列(即Melittin這一部分的核苷酸序列)的重組載體、含重組載體的宿主細胞,以及多肽抗體的方法。
      在本發(fā)明,提供了一種分離出的DNA分子,它包括編碼具有中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的多肽的核苷酸序列,所述的核苷酸序列與SEQ ID No.5中從核苷酸1-213位的核苷酸序列有至少70%同源性,或者所述的核苷酸序列能在中度嚴格條件下與SEQ ID No.5中從核苷酸1-213位的核苷酸雜交,較佳地,該多肽具有SEQ ID No.6所示的序列。更佳地,該序列具有SEQ ID No.5中從核苷酸1-213位的核苷酸序列。
      在本發(fā)明還提供了一種分離的中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的最終表達產(chǎn)物--Melittin蛋白活性多肽,它包括具有SEQ ID No.6氨基酸序列的多肽、或其活性片段,或其活性衍生物。較佳地,該多肽是具有SEQ ID No.6序列的多肽。本發(fā)明還提供了一種載體,它含有上述分離出的DNA;一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
      本發(fā)明還提供了一種制備具有中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的最終表達產(chǎn)物--Melittin蛋白的活性多肽的方法,該方法包括(a)將編碼具有中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的多肽的核苷酸序列和編碼具有Prepromelittin基因末端的130~213核苷酸序列(即Melittin這一部分的核苷酸序列)可操作地連于表達調(diào)控序列,形成中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin和Melittin的表達載體,所述的核苷酸序列與SEQ ID No.5核苷酸1-213位的核苷酸序列有至少70%的同源性;(b)將步驟(a)中的表達載體轉(zhuǎn)入宿主細胞,形成中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin和Melittin的重組細胞;(c)在適合表達中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin和Melittin的條件下,培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞;(d)分離出具有中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Melittin蛋白活性的多肽。
      本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種編碼中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的基因,該基因所編碼的Prepromelittin是蜂毒Melittin的天然融合蛋白,而蜂毒Melittin則是一種生物活性肽,可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)上心血官疾病、腫瘤等疾病的治療,可作為抗原用于蜂毒免疫制劑、蜂毒過敏診斷試劑的制備,可作為一種天然抗微生物肽用于植物病、蟲害的防治,也可作為一種模型肽用于膜作用機制、鈣調(diào)蛋白作用機理等方面的研究。中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin基因可為研究中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒中與Melittin相關(guān)的分子作用機理,為開發(fā)利用中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒資源提供新的依據(jù)。
      具體實施例方式
      在本發(fā)明的一個具體實施方案中,本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為213個核苷酸,其詳細序列見SEQ ID No.5,開放讀框位于1-213位核苷酸。在本發(fā)明中,“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指,該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來;還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開,而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
      在本發(fā)明中,術(shù)語“中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的多肽的核苷酸序列,如SEQ ID No.5中1-213位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指位于SEQ ID No.5序列的編碼框1-213位核苷酸中,有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性,所以與SEQ ID No.5中1-213位核苷酸序列同源性低至約70%。簡并序列也能編碼出SEQ ID No.6所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴格條件下,更佳地在高度嚴格條件下,與SEQ ID No.5中從核苷酸1-213位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與SEQ ID No.5中從核苷酸1-213位的核苷酸序列的同源性至少70%,較佳地至少80%,更佳地至少90%的核苷酸序列。
      該術(shù)語還包括能編碼具有與中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin相同功能的蛋白的SEQ ID No.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個核苷酸的缺失、插入和或取代,以及在5’和/或3’端添加數(shù)個核苷酸。
      在本發(fā)明中,“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其占樣品總物質(zhì)的至少20%,較佳地至少50%,更佳地至少80%,最佳地至少90%(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量,如用柱層折、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?;炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
      在本發(fā)明中,術(shù)語“中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin蛋白多肽”指具有中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的SEQ ID No.6序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin蛋白相同功能的SEQ ID No.6序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸。例如,在本領(lǐng)域中,用性能相近或相似的氨基酸進行取代時,通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的片段和衍生物。
      該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體,誘導(dǎo)突變體,在高或低的嚴謹度條件下能與中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的最終表達產(chǎn)物--Melittin多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽,如包含中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外,本發(fā)明還包括了中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin多肽的可溶性片段。通常,該片段具有中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin多肽編碼序列的至少約10個連續(xù)氨基酸,通常至少約30個連續(xù)氨基酸,較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸,最佳地為70個連續(xù)氨基酸。
      發(fā)明還提供中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin蛋白或多肽的類似物,這些類似物與天然中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異,也可以是不影響序列的修飾形式上的差異,或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到,如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變,還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ氨基酸)的類似物。應(yīng)理解,本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
      修飾(通常不改變—級結(jié)構(gòu))形式包括;體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?;螋然?。修飾還包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸,磷酸絲氨酸,磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
      本發(fā)明還包括中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin多肽編碼序列及其片段的反義序列,這種反義序列可用于抑制細胞內(nèi)中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的表達。
      本發(fā)明還包括一種探針分子,該分子通常具有中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin多肽編碼序列的8-100個,較佳地1-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin核苷酸分子。
      本發(fā)明還包括檢測中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin核苷酸序列的方法,它包括用上述的探針與樣品進行雜交,然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合,較佳地,該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物,其中PCR擴增引物對應(yīng)于中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin多肽的編碼序列,并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間,引物長度一般為15-50個核苷酸。
      在本發(fā)明中,可選用本領(lǐng)域已知的各種載體,如市售的載體。
      在本發(fā)明中,術(shù)語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌,枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞、和哺乳動物細胞,較佳地,該宿主細胞是真核細胞,如Tn細胞、CHO細胞、COS細胞等。
      另一方面,本發(fā)明還包括對中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體,尤其是單克隆抗體。這里,“特異性”是指抗體能結(jié)合于中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin基因產(chǎn)物或片段。較佳地,指那些能與中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin基因的最終表達產(chǎn)物--Melittin蛋白的分子,也包括那些并不影響中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin基因的最終表達產(chǎn)物--Melittin蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin基因的最終表達產(chǎn)物--Melittin結(jié)合的抗體。
      本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體,而且還包括具有免疫活性的抗體片段,如Fab’或(Fab)2片段;抗體重鏈;抗體輕鏈;遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人,美國專利No.4,946,778);或嵌合抗體,如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒的抗體部分的抗體。
      本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備,例如,純化的中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段,可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的,表達中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來制備抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人,Nature 256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol,6511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol,6292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin基因的最終表達產(chǎn)物--Melittin功能的抗體以及不影響中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Melittin功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū),通過常規(guī)免疫技術(shù)而獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin基因的最終產(chǎn)物未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細胞(例如E.coli)中制備的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生;與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽),可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
      在本發(fā)明的一個實施例中,中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的cDNA核苷酸序列是如此獲得的,以中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒毒腺總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,用一對寡核苷酸為引物—A5’-GCTCGAGATGAAATTCTTAGTCAACGTT-3’為正向向引物,寡核苷酸B5’-GAAGCTTCTAACCCTGTTGCCTCTT-3’為反向引物,進行PCR。對擴增產(chǎn)物進行測序后得到SEQ ID No.5的cDNA序列。中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Melittin為中華蜜蜂、大胡蜂毒腺中Prepromelittin基因表達的最終蛋白,本發(fā)明的中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin為研究中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒中與Melittin相關(guān)的分子作用機理提供了基礎(chǔ)。
      下面結(jié)合具體實例,進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
      實施例1,中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的cDNA的克隆和測定1.引物擴增以中華蜜蜂、大胡蜂毒腺總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,用一對寡核苷酸為引物—A5’-GCTCGAGATGAAATTCTTAGTCAACGTT-3’(SEQ ID No.1)為正向向引物,寡核苷酸B5’-GAAGCTTCTAACCCTGTTGCCTCTT-3’(SEQ IDNo.2)為反向引物,進行PCR。A/B的PCR條件為94℃3分鐘,隨之以94℃40秒鐘,54℃40秒鐘和72℃ 1分鐘進行35個循環(huán),最后72℃延伸10分鐘,電泳檢測得到約220 bp的目的片段。
      2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑸鲜鯬CR擴增產(chǎn)物A/B與PGEM-T載體(Promega)連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,用堿法提取質(zhì)粒,用BigDye terminator v2.0(Applied Biosystem Incorporation)測序試劑盒對抽提的質(zhì)粒進行測序,最后用電腦軟件拼接順序,獲得cDNA序列,共213bp,詳細序列見SEQ ID No.5,其中開放讀框位于1-213位核苷酸。
      根據(jù)得到的cDNA序列推導(dǎo)出中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的氨基酸序列,共70個氨基酸殘基,其氨基酸序列詳見SEQ ID No.6。
      實施例2,同源比較用本發(fā)明的中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的cDNA序列及其編碼蛋白,在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中,用Blast程序進行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn),它與意大利蜜蜂蜂毒Prepromelittin有顯著的同源性。用GENTYX軟件分析可以看出,它們的蛋白的同源性為95%(見附表1)。因此,可以推測本發(fā)明的中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin蛋白為意大利蜜蜂蜂毒Prepromelittin的同系物,并具有類似的功能。
      1983年,Vlask等人應(yīng)用生物技術(shù)方法,利用意大利蜜蜂蜂王毒腺總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過構(gòu)建cDNA文庫,然后用探針作文庫篩選,獲得了編碼意大利蜜蜂蜂毒Prepromelittin的新基因,該cDNA所編碼的Prepromelittin的信號肽和成熟肽為70個氨基酸殘基,其中開始的21個氨基酸殘基為信號肽,其余的49個為成熟肽,包括末端Melittin的氨基酸序列(44~70)。本發(fā)明中中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin基因所編碼的氨基酸序列含有以上所述的相應(yīng)的信號肽和成熟肽,包括末端的Melittin的氨基酸序列(44~70)。Prepromelittin在中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒中最后的表達產(chǎn)物為Melittin。而Melittin是目前醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和生物學(xué)方面十分有用的活性多肽,它可以通過多途徑影響細胞的信號傳導(dǎo)系統(tǒng),并可誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺合成及細胞調(diào)亡,具有抗炎、抗菌、抗病毒等多種生物學(xué)作用;同時,Melittin也已成為一種模型肽,廣泛用于膜作用機制、鈣調(diào)蛋白作用機理等方面的研究。本發(fā)明人的中華蜜蜂、大胡蜂Prepromelittin基因為研究中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒中與Melittin相關(guān)的分子作用機理,為開發(fā)利用中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒資源提供了新的依據(jù)。
      實施例3,中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin基因末端的130~213核苷酸序列(即Melittin這一部分的核苷酸序列)在大腸桿菌中的融合表達在該實施例中,以實施例1中PCR擴增產(chǎn)物作為插入片段。
      PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-CGTGGATCCGGAATTGGAGCAGTTCTG-3’(SEQ ID No.3),該引物含有BamH I限制性內(nèi)切酶的酶切位點,在該酶切位點之后是中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒編碼Melittin序列的21個核苷酸;3’端引物序列為5’-CGGGAATTCCTAACCCTGTTGCCTCTT-3’(SEQ ID No.4),該引物含有EcoR I限制性內(nèi)切酶的酶切位點,翻譯終止子和編碼中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Melittin的部分核苷酸序列。
      引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應(yīng)于細菌表達載體pGEX-4T-3上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點,該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復(fù)制起點(Ori)、一個IPTG可調(diào)啟動子/操縱子(P/O),一個核糖體結(jié)合位點(RBS),一個谷胱甘肽標記物(GST)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點。
      用BamH I和EcoR I消化pGEX-4T-3載體及插入片段,隨后將插入片段連接到pGEX-4T-3載體并保持開放讀框在細菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化商品名為BL21的E.coli菌株,BL21含有多拷貝的重組質(zhì)粒,其表達lac I阻遏物并攜帶氨芐抗性(Ampr),在含有Ampr的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子,抽提質(zhì)粒,測序驗證中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒中編碼Melittin的cDNA片段已正確插入了載體。
      在補加Ampr(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶10的稀釋率稀釋,然后接種到大體積LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)細胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時,加IPTG(“isopropyl-β-D-thiogalactoside”)至終濃度為1.0mM。通過使lacI阻遏物失活,IPTG誘導(dǎo)啟動P/O導(dǎo)致基因表達水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細胞3-5小時后,離心沉淀細胞,并用1/20體積的PBS將其懸浮;隨后超聲處理裂解細胞;再在室溫(25℃)下加入Triton X-100到終濃度1%,輕輕混合30分鐘;隨后10,000g離心5分鐘,收集上清,再用GSTPurification Modules純化已表達的融合蛋白。最后,將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10%(w/v)甘油的貯存液中。
      用15%的SDS-PAGE膠進行電泳,鑒定表達蛋白的分子量大小為約29.0KDa。
      此外,用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序,發(fā)現(xiàn)與SEQ ID No.6的序列一致。
      實施例4,中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin在真核細胞(Tn細胞株,即粉紋夜蛾細胞株)中的表達在該實施例中,以實施例1中PCR擴增產(chǎn)物作為插入片段。
      PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-GCTCGAGATGAAATTCTTAGTCAACGTT-3’(SEQ ID No.1),該引物含有Xho I限制性內(nèi)切酶的酶切位點,在該酶切位點之后是信號肽開始的中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin編碼序列的21個核苷酸;3’端引物序列為5’-GAAGCTTCTAACCCTGTTGCCTCTT-3’(SEQ ID No.2),該引物含有Hind III限制性內(nèi)切酶的酶切位點,翻譯終止子和中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的部分編碼序列。
      引物上限制性內(nèi)切酶酶切位點對應(yīng)于Tn細胞表達載體pBacFastHTb上的限制性內(nèi)切酶酶切位點,該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Gmr),一個噬菌體復(fù)制起點(Ori)、一個病毒復(fù)制起點(SV40)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV),一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
      用Xho I和Hind III消化pBacFastHTb載體及插入片段,隨后用連結(jié)混合物轉(zhuǎn)化E.coli TG I菌株,在含有Ampr和Gmr的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子,補加Ampr和Gmr的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆,抽提質(zhì)粒,測序驗證中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的cDNA片段已正確插入了載體。隨后用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH10Bac菌株,在含有Kanr、Gmr、四環(huán)素的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子,在補加Kanr、Gmr、四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆,抽提質(zhì)粒,經(jīng)Sepharose 2B柱純化,回收質(zhì)粒-70℃保存。
      質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Tn細胞是采用脂轉(zhuǎn)染法,用Lipofectin(GiBco Life)進行的。轉(zhuǎn)染48小時后,收集細胞及細胞上清,含重組病毒粒子的細胞上清用于下一輪感染。經(jīng)2-3周的TC-100連續(xù)傳代培養(yǎng),收集細胞,用超聲裂解法破碎細胞,以含NaCl 0.5mM、imidazola 5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)溶液為平衡液及洗脫液,蛋白液用經(jīng)預(yù)平衡的Ni2+Sepharose 6B柱過柱;再用含imdazola 50mM、NaCl 0.5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)的溶液,洗去雜蛋白,專一性的吸附的6×His的融合蛋白,再用含imdazola 500mM、NaCl 0.5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)的溶液進行洗脫.然后以PBS(PH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
      用含6mol/L脲素(或24%甘油)的16%T,6%C和8%T,3%C的2L-T-SDS-PAGE進行電泳,鑒定表達蛋白的分子量大小約為3.0KDa。
      此外,用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序,發(fā)現(xiàn)與SEQ白ID No.6的蛋白,序列一致。
      實施例5,制備抗體將實施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體,具體方法如下。重組分子用親和層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離,將電泳條帶從凝膠中切下。并用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。用200-300μg/頭乳化過的蛋白,對12周齡的家兔皮下注射。21天后,用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原,以100-200μg/頭的劑量進行皮下多點及腿部肌肉注射以加強免疫。21天后再進行一次臀部肌肉注射加強免疫??寡宓奶禺惙磻?yīng)活性用它在體內(nèi)沉淀中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin基因翻譯產(chǎn)物的能力來評估。SEQ ID No.1∽6的說明,SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征CA)長度28堿基CB)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲;線性(ii)分子型寡核苷酸(vi)序列描述SEQ ID NO.1GCTCGAGATGAAATTCTTAGTCAACGTTSEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度25堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子型寡核苷酸(vi)序列描述;SEQ ID NO.2GAAGCTTCTAACCCTGTTGCCTCTTSEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)長度27堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子型寡核苷酸(vi)序列描述;SEQ ID NO.3CGTGGATCCGGAATTGGAGCAGTTCTGSEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度27堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子型寡核苷酸(vi)序列描述;SEQ ID NO.4CGGGAATTCCTAACCCTGTTGCCTCTTSEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度213bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲;線性(ii)分子型cDNA(vii)(vi)序列描述SEQ ID NO.51 ATGAAATTCT TAGTCAACGT TGCCCTTGTT TTTATGGTTG TATACATTTC TTTCATCTAT61 GCGGCCCCTG AACCAGAACC GGCACCGGAG GCAGAGGCAG AGGCAGACGC GGAGGCAGAT121 CCGGAAGCAG GGATTGGAGC AGTTCTCAAA GTATTAACCA CAGGATTGCC TGCCCTTATA181 AGTTGGATTA AACGTAAGAG GCAACAGGGT TAGSEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度70個氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓撲結(jié)構(gòu);線性(ii)分子型多肽(vi)序列描述SEQ ID NO.61 Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile Ser Phe Ile Tyr21 Ala Ala Pro Glu Pro Glu Pro Ala Pro Glu Ala Glu Ala Glu Ala Asp Ala Glu Ala Asp41 Pro Glu Ala Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile61 Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln Gly表I中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin與意大利蜜蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的比較進行同源比較的兩個序列是中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒AcVmPrepromelittin殘基總數(shù)70意大利蜜蜂蜂毒AmPrepromelittin殘基總數(shù)70表示一致殘基的符號為“*”AcVmPrepromelittin1MKFLVNVALVFMVVYISFIYAAPEPEPAPEAEAEADAEADPEAGIGAVLKVLTTGLPALIAmPrepromelittin 1MKFLVNVALVFMVVYISYIYAAPEPEPAPEPEAEADAEADPEAGIGAVLKVLTTGLPALI***************** ************ *****************************AcVmPrepromelittin 61SWIKRKRQQG 70AmPrepromelittin 61SWIKRKRQQG 70**********同源性97%
      權(quán)利要求
      1.一種分離出的DNA分子,其特征在于,它包括編碼具有中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前體多肽的核苷酸序列;所述的核苷酸序列與SEQ ID No.5中從核苷酸1-213位的核苷酸序列有至少70%的同源性;或者所述的核苷酸序列能在中度嚴格條件下與SEQ ID No.5中從核苷酸1-213的核苷酸序列雜交。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1 SEQ ID No.5的DNA分子,其特征在于,所述編碼的多肽具有SEQ ID No.6所示的序列,具有SEQ ID No.5中從核苷酸1-213位的核苷酸序列。
      3.一種分離的中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前體基因的最終表達產(chǎn)物--溶血肽蛋白多肽,其特征在于,它具有SEQ ID No.6氨基酸序列的多肽、或其活性片段,或其活性衍生物,該多肽具有SEQ ID No.6序列。
      4.一種載體,其特征在于,它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
      5.一種宿主細胞,其特征在于,它是用權(quán)利要求4所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
      6.一種具有中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前體基因的最終表達產(chǎn)物--溶血肽蛋白多肽的制備方法,其特征在于,該方法包括(a)將編碼具有中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前體多肽的核苷酸序列和溶血肽前體基因末端的130-213核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列,形成中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前體和溶血肽的表達載體,所述的核苷酸序列與SEQ ID No.5中從核苷酸1-213位的核苷酸序列有至少70%的同源性;(b)將步驟(a)中表達的載體轉(zhuǎn)入宿主細胞,形成中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前體和溶血肽的重組細胞;(c)在適合表達中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前體和溶血肽的條件下,培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞;(d)分離出具有中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽蛋白活性的多肽。
      7.一種抗體,其特征在于,它是能與權(quán)利要求3所述的中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前體基因的最終表達產(chǎn)物--溶血肽蛋白活性多肽特異性結(jié)合的抗體。
      8.一種探針分子,其特征在于,它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
      9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的探針分子;其特征在于是指能與中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前體基因產(chǎn)物或片斷結(jié)合但不識別和結(jié)合與其它不相關(guān)抗原分子的抗體。
      10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的探針分子,其特征在于,它具有中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前體多肽編碼序列中15-20個連續(xù)的核苷酸。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一種中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前體基因的編碼序列及其編碼的多肽和制備方法。該cDNA序列編碼的蛋白是意大利蜜蜂蜂毒溶血肽前體的一個同系物,它與SEQ ID No.5中從核苷酸1-213位的核苷酸序列有至少70%的同源性。所述序列編碼—具有SEQ ID No.6所示的序列的多肽。此外,還提出了含中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前體和溶血肽前體基因末端的130-213核苷酸序列的載體、宿主細胞,與中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽相關(guān)的抗體,具有蛋白活性中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽的多肽、相關(guān)抗體的制備方法。本發(fā)明為進一步研究中華蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽的分子作用機理,開發(fā)與溶血肽相關(guān)的生物醫(yī)藥、診斷試劑、生化試劑以及生物殺蟲劑打下了基礎(chǔ)。
      文檔編號C12N15/11GK1377964SQ02110748
      公開日2002年11月6日 申請日期2002年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月1日
      發(fā)明者施婉君, 張傳溪, 張素方, 程家安, 沈立榮 申請人:浙江大學(xué)
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