專利名稱：鉤端螺旋體溶血素及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼鉤端螺旋體溶血素的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。
背景技術(shù)：
鉤端螺旋體病是一種分布廣泛的人獸共患病，主要分布在中國南方以及東南亞、南亞等發(fā)展中國家和地區(qū)。在中國，本病1995年列入法定傳染病。1955-1993年，年平均發(fā)病率為十萬分之七，年平均死亡率占發(fā)病人數(shù)的1.02％。
中國鉤端螺旋體病的的流行菌群以黃疸出血群和波摩那群為主。黃疸出血群有15個(gè)血清型，其中以賴型最為常見。
中國雖在該病的防治方面取得了巨大的成功，但對該病的致病免疫的機(jī)理、疫苗的高效保護(hù)等問題仍未解決。
鉤端螺旋體(Leptospira sp.)屬格蘭氏陰性菌。鉤端螺旋體病患者不同程度上出現(xiàn)黃疸，同時(shí)有或者無出血或者肝腎功能受損，黃疸的程度通常并不與肝壞死有關(guān)，病情恢復(fù)后肝功能正常。一般認(rèn)為這與紅細(xì)胞受損有關(guān)，紅細(xì)胞受到溶血素等毒素的作用后發(fā)生溶血，大量的膽紅素進(jìn)入組織中，肝臟不能完全代謝而導(dǎo)致黃疸，續(xù)而發(fā)生高膽紅素癥狀。
然而，目前為止，仍沒有公開過鉤端螺旋體溶血素。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的鉤端螺旋體溶血素，以便為研究鉤端螺旋體病的致病機(jī)制及診斷提供了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供新的鉤端螺旋體溶血素以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的溶血素多肽，它包含；具有SEQID NO2、4、6、8、10、12、14、16氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16氨基酸序列的多肽。更佳地該多肽不含信號肽序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供分離的編碼上述多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述鉤端螺旋體溶血素多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或者被上述多核苷酸直接轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備鉤端螺旋體溶血素多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達(dá)鉤端螺旋體溶血素的條件下，培養(yǎng)上述被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出鉤端螺旋體溶血素多肽。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的鉤端螺旋體溶血素多肽特異性結(jié)合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子。
在本發(fā)明的第六方面，提供了檢測樣品中是否存在溶血素的方法，它包括將樣品與溶血素的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在溶血素。
在本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明的鉤端螺旋體溶血素的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，或者作為探針用于雜交反應(yīng)，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第八方面，提供了一種檢測鉤端螺旋體的試劑盒，其特征在于，它含有特異性檢測鉤端螺旋體溶血素的引物和/或與鉤端螺旋體溶血素特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明的第九方面，提供了一種疫苗組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的鉤端螺旋體溶血素多肽或其片段以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1顯示了本發(fā)明各溶血素的功能結(jié)構(gòu)域。圖中各編號含義如下PD011673是PRECURSOR HYDROLASE SIGNAL SPHINGOMYELINASE HEMOLYSIS SMASEPHOSPHODIESTERASE BPD447657是PRECURSOR HYDROLASE SIGNAL SPHINGOMYELINASE HEMOLYSIS SMASEPHOSPHODIESTERASE BPD041204是C SPHINGOMYELINASE PRECURSOR SMASE HEMOLYTIC SIGNAL HYDROLASEPHOSPHODIESTERASEPD314750是Leptospira borgpetersenii serovar hardjo type hardjobovis(TrEMBLQ9RMG4，HEM)PD191426是HEMOLYTIC HEMOLYSIN HLPA From Prevotella intermediaTrEMBL 068620，HEM；TrEMBL Q9ZGK8-LEPBO lipopolysaccharide O-antigen；TrEMBL Q9X5J4-MYCAV，HEM)PD007579是COMPLETE PROTEOME HEMOLYSIN TLYA HAEMOLYSIN HEMOLYSIN-LIKE U0247AMEMBRANE HEMOLYSIS MJ1257 From Tr051459-BORBU，HEM；TrQ9PQ54-UREPA，HEM；HLYA-TREHY，HEMPD406054是PROTEOME COMPLETE HEMOLYSIN HLYA from TrEMBLQ9F6Y3-CHLAU，TrEMBLP74319-SYNY3；TrEMBLQ9X1R2-THEMAPD002457是COMPLETE PROTEOME INTEGRAL MEMBRANE TRANSMEMBRANE CBS DOMAIN REPEATHEMOLYSIN PLASMIDPD002327是COMPLETE PROTEOME HEMOLYSIN CBS DOMAIN MAGNESIUM COBALT REPEATTRANSPORT EFFLUXPD005611是PROTEOME COMPLETE HEMOLYSIN CBS DOM TrEMBL066507-AQUAE，HEM具體實(shí)施方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，從問號鉤端螺旋體(Leptospirainerrogans)黃疸出血群賴型賴株中分離純化和鑒定了一類新的溶血素。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術(shù)語“鉤端螺旋體溶血素多肽”或“鉤端螺旋體溶血素”可互換使用，都指具有鉤端螺旋體溶血素氨基酸序列(SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的鉤端螺旋體溶血素，以及含有或不含有信號肽的溶血素。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。例如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的溶血素或多肽”是指溶血素多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化溶血素。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，但優(yōu)選的是非糖基化的。
本發(fā)明還包括鉤端螺旋體溶血素的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然鉤端螺旋體溶血素相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語“鉤端螺旋體溶血素多肽”指具有鉤端螺旋體溶血素活性或免疫原性的SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與鉤端螺旋體溶血素相同功能的、上述序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。該術(shù)語還包括鉤端螺旋體溶血素的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與鉤端螺旋體溶血素DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗鉤端螺旋體溶血素多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含鉤端螺旋體溶血素多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了鉤端螺旋體溶血素多肽的可溶性片段。通常，該片段具有鉤端螺旋體溶血素多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。這些片段也可用作免疫原以誘導(dǎo)針對鉤端螺旋體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。
發(fā)明還提供鉤端螺旋體溶血素或多肽的類似物。這些類似物與天然鉤端螺旋體溶血素多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“鉤端螺旋體溶血素保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。以溶血素lep919_12為例，編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，以溶血素lep919_12為例，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ IDNO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。本發(fā)明的其他蛋白依此類推。本發(fā)明的核苷酸序列可以根據(jù)密碼子的對應(yīng)關(guān)系，根據(jù)SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16的氨基酸推導(dǎo)出。
編碼成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與成熟的鉤端螺旋體溶血素有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼溶血素的多聚核苷酸。
本發(fā)明的鉤端螺旋體溶血素核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的DNA文庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的DNA文庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或溶血素編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；224；1431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的溶血素多肽。一般來說有以下步驟；(1).用本發(fā)明的編碼鉤端螺旋體溶血素多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，鉤端螺旋體溶血素多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含鉤端螺旋體溶血素編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO的動(dòng)物細(xì)胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的鉤端螺旋體溶血素或多肽有多方面的用途，其中包括(但不限于)將溶血素的某些片段融合在一起構(gòu)成具有免疫原性且沒有毒性的融合抗原，用作免疫原。
另一方面，本發(fā)明還包括對鉤端螺旋體溶血素DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于鉤端螺旋體溶血素基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與鉤端螺旋體溶血素基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的鉤端螺旋體溶血素基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的鉤端螺旋體溶血素基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)鉤端螺旋體溶血素或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1菌體培養(yǎng)1)培養(yǎng)基使用EMJH液體培養(yǎng)基，配制5×的EMJH培養(yǎng)基1000毫升，稱取BSA50g。無水醋酸鈉0.5g，丙酮酸鈉1g，硫酸亞鐵0.25g，1.5％的氯化鎂3.5ml，0.4％的硫酸鋅5ml，0.15的硫酸銅1ml，磷酸氫二鈉12.6g，磷酸二氫鉀1.5g，氯化鈉5g，氯化銨1.25g，0.05％的VB122ml，VB10.025g，調(diào)pH為7.2-7.6，定容至1000ml分別以0.7、0.45、0.2nm孔徑的硝酸纖維素膜過濾除菌。使用時(shí)，用無菌水其5倍稀釋。
2)培養(yǎng)條件30℃，100轉(zhuǎn)/分鐘搖動(dòng)培養(yǎng)40小時(shí)。
3)菌株問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株。
實(shí)施例2溶血素的核酸序列和氨基酸序列用常規(guī)方法抽提鉤端螺旋體DNA，構(gòu)建文庫。測定基因組全序列。根據(jù)計(jì)算機(jī)分析，合成引物，以抽提的鉤端螺旋體DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得溶血素的ORF序列。再次測序驗(yàn)證，與基因組序列相符。這些ORF編碼具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的8種溶血素的基本情況如下表所示。
表A溶血素的核酸序列和氨基酸序列


本發(fā)明的鉤端螺旋體溶血素No.1-8與其他細(xì)菌的溶血素都有一定的同源性，且具有溶血素特有的結(jié)構(gòu)域(圖1)。
實(shí)施例3蛋白表達(dá)用常規(guī)基因工程方法將鉤端螺旋體溶血素基因克隆入融合表達(dá)載體pET28b(Novagene公司)，融合表達(dá)的受體菌選用大腸桿菌BL21(DE3)。常規(guī)條件發(fā)酵后，提取重組菌體蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分子量與預(yù)測值基本相同。大腸桿菌中表達(dá)的溶血素(帶有His-tag的融合蛋白)，通過Ni-NTA柱分離純化，得到純的鉤端螺旋體溶血素(融合蛋白)。
實(shí)施例4制備抗體將實(shí)施例3中獲得的純化的、重組His-融合蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下將融合蛋白用等量的完全Freund′s佐劑乳化。用200μg乳化過的蛋白，對家兔進(jìn)行淋巴結(jié)注射。一個(gè)月后，用等量的非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原，對家兔以200μg的劑量進(jìn)行淋巴結(jié)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用ELISA檢驗(yàn)抗體滴度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白發(fā)生結(jié)合。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生物工程研究中心<120>鉤端螺旋體溶血素及其編碼序列<130>021333<160>16<170>PatentIn version3.1<210>1<211>720<212>DNA<213>鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)<400>1atgaaaatga tacaaaatat tttgcgaaaa gaaaaagtta aaacatggaa tcaattgaaa 60ggctctaaat ttttcagatg ttgttgtctg tttattattt tatttttttt cgattgttta 120cctgatttac agtcttctga aaataattta tttttatctt tgctttctct tccaaaaaat 180caaggtataa tattaagaaa cgataaatct attgcaaagt ctaaaacgac acgaaaatac 240ggctgggtta cttttacatc tcaagtaacc ggaaaaaaaa tccaagcaga tcctgaacga 300cctgacggat ggttaagagt gaatgcttcg agtaacacgg attttacgac gttcacttta 360tatcaggatg gaaaagatcc agattgtatc aaaggcggcc ctatccgggt tgagcctact 420gcgtatcgaa attattattg gaattggtgg cttggaggag gtgcgggtaa ttacgcctat 480tatcctaaat ataaagatgg ttctaacaaa cttcaaattt acgttttaaa agtcagcggc 540tgtttggaat caggagatag agtcttattt tcggattatg atactataac tcaggatgat 600tattttgtca tagattggga tggaggcagc tggaatgagt atctttttct ttggtataaa 660tttcctaagg ttcagagagg atatttttat gttcaattga atgaaggccc tgaggaataa 720<210>2<211>239<212>PRT<213>鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)<400>2Met Lys Met Ile Gln Asn Ile Leu Arg Lys Glu Lys Val Lys Thr Trp1 5 10 15Asn Gln Leu Lys Gly Ser Lys Phe Phe Arg Cys Cys Cys Leu Phe Ile20 25 30Ile Leu Phe Phe Phe Asp Cys Leu Pro Asp Leu Gln Ser Ser Glu Asn35 40 45Asn Leu Phe Leu Ser Leu Leu Ser Leu Pro Lys Asn Gln Gly Ile Ile50 55 60Leu Arg Asn Asp Lys Ser Ile Ala Lys Ser Lys Thr Thr Arg Lys Tyr65 70 75 80Gly Trp Val Thr Phe Thr Ser Gln Val Thr Gly Lys Lys Ile Gln Ala85 90 95Asp Pro Glu Arg Pro Asp Gly Trp Leu Arg Val Asn Ala Ser Ser Asn100 105 110Thr Asp Phe Thr Thr Phe Thr Leu Tyr Gln Asp Gly Lys Asp Pro Asp115 120 125Cys Ile Lys Gly Gly Pro Ile Arg Val Glu Pro Thr Ala Tyr Arg Asn130 135 140Tyr Tyr Trp Asn Trp Trp Leu Gly Gly Gly Ala Gly Asn Tyr Ala Tyr145 150 155 160Tyr Pro Lys Tyr Lys Asp Gly Ser Asn Lys Leu Gln Ile Tyr Val Leu165 170 175Lys Val Ser Gly Cys Leu Glu Ser Gly Asp Arg Val Leu Phe Ser Asp180 185 190Tyr Asp Thr Ile Thr Gln Asp Asp Tyr Phe Val Ile Asp Trp 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Leu Leu Glu Arg Ile Lys Thr Arg290 295 300Ile Trp Pro Asp Lys Ser Asn Leu Leu305 310
權(quán)利要求
1.一種分離的鉤端螺旋體溶血素多肽，其特征在于，它包含具有選自SEQID NO2、4、6、8、10、12、14、16的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16的氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性；(a)編碼如權(quán)利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2、4、6、8、10、12、14、16所示氨基酸序列的多肽。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組(a)具有SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種鉤端螺旋體溶血素多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)鉤端螺旋體溶血素的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出鉤端螺旋體溶血素多肽。
9.一種能與權(quán)利要求1所述的鉤端螺旋體溶血素特異性結(jié)合的抗體。
10.一種檢測鉤端螺旋體的試劑盒，其特征在于，它含有特異性檢測鉤端螺旋體溶血素的引物和/或與鉤端螺旋體溶血素特異性結(jié)合的抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一類新的鉤端螺旋體溶血素，編碼溶血素的多核苷酸和經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生這類溶血素的方法。本發(fā)明還公開了這類溶血素及其編碼序列的用途。
文檔編號C12N15/11GK1443774SQ0211099
公開日2003年9月24日 申請日期2002年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月11日
發(fā)明者任雙喜, 傅剛, 曾嶸, 蔣秀高, 張怡軒, 趙國屏, 陳竺, 繆有剛, 徐海, 郭小奎 申請人:中國科學(xué)院上海生物工程研究中心