專利名稱：一種人/山羊肝嵌合模型的建立及其鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物組織細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及建立一種人/山羊肝嵌合模型的方法及其鑒定方法造血干細(xì)胞因其來源較易和臨床應(yīng)用價(jià)值廣泛而引起更多研究者的關(guān)注，認(rèn)為造血干細(xì)胞就是循環(huán)狀態(tài)中的具有可塑性的一類干細(xì)胞。因此，人干細(xì)胞跨種系移植到動(dòng)物體內(nèi)是否可以有效地保存和擴(kuò)增它。通過此方法可以在受體中產(chǎn)生人的細(xì)胞，并合成有正常功能的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到治療某些疾病的目的。
還有報(bào)道在妊娠的適當(dāng)時(shí)期進(jìn)行宮內(nèi)移植已經(jīng)制成了嵌合體的小鼠、綿羊和猴。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將外源基因?qū)朊庖呦到y(tǒng)成熟前的胎羊體內(nèi)，產(chǎn)生了表達(dá)外源基因的嵌合綿羊。這類動(dòng)物對(duì)于外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物都產(chǎn)生了免疫耐受。在植入β-半乳糖苷酶基因的受體綿羊中已發(fā)現(xiàn)有其蛋白產(chǎn)物的表達(dá)。這類實(shí)驗(yàn)為探索用干細(xì)胞移植技術(shù)治療疾病提供了線索。
本發(fā)明采用了人/山羊造血干細(xì)胞異種移植模型，作為一種新的受體進(jìn)行人造血干細(xì)胞的移植潛能研究。與綿羊相比，山羊平均體重15-25公斤，易于飼養(yǎng)，體重和大小及其多胎妊娠特點(diǎn)適合實(shí)驗(yàn)操作和研究。本發(fā)明經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)在移植山羊的肝臟中帶有人抗人細(xì)胞核因子抗原(PCNA)和抗人肝細(xì)胞特異抗原(HSA)的肝細(xì)胞，不但證實(shí)人源性細(xì)胞的存在，而且證明這些細(xì)胞在胎山羊肝臟內(nèi)可以分化。本發(fā)明動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中一只受體羊中大量表達(dá)PCNA，其他三只受體羊表達(dá)活性中等。人造血干細(xì)胞在受體羊體內(nèi)發(fā)生部分分化，但仍可保持表型穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)10個(gè)月。
本發(fā)明通過以下方法建立人/山羊肝嵌合模型1、構(gòu)建人/山羊肝細(xì)胞嵌合移植模型首先收集新鮮人臍血，然后分離出人HSC，將分離的HSC移植入胎山羊腹腔中。整個(gè)過程在8-16小時(shí)內(nèi)完成。待胎羊分娩后3個(gè)月、6個(gè)月、10個(gè)月分別抽取靜脈血進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證山羊體內(nèi)確實(shí)嵌合有人HSC及其含量和分化程度。在此基礎(chǔ)上獲得人/山羊肝細(xì)胞嵌合模型。
2、鑒定人/山羊HSC移植模型肝細(xì)胞嵌合體(1)鑒定山羊造血系的嵌合，采用了一系列人特異的CD抗原的單克隆抗體，常規(guī)選擇CD20/CD7；GPA/CD45；D34/CD15；CD14/38(PE/FITC標(biāo)記)以及CD3，CD4，CD8，CD56等單抗進(jìn)行FACS測(cè)定。
應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)(FACS)進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)移植的山羊外周血DNA和RNA分別用PCR和RT-PCR方法檢測(cè)是否有人CD34和血型糖蛋白A的存在和表達(dá)。
(2)免疫組織化學(xué)分析肝臟組織取血液標(biāo)本鑒定陽(yáng)性山羊肝臟進(jìn)行免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞儀分析。正常山羊肝組織為對(duì)照。人肝組織取自意外死亡的正常健康個(gè)體肝組織標(biāo)本。
肝組織標(biāo)本固定于4％中性福爾馬林液中，石蠟包埋，切片厚度4μm，用0.05％胰蛋白酶稀釋至1∶250，37℃5分鐘修復(fù)抗原。在過氧化物酶耦聯(lián)的免疫染色中，內(nèi)源性的過氧化物酶用0.3％的過氧化氫滅活。非特異性抗原用5％正常馬血清封閉。然后用抗人增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的單抗孵育。用抗生物素蛋白—生物素復(fù)合物法染色，光鏡觀察結(jié)果。
(3)流式細(xì)胞儀分析肝組織PBS充分沖洗新鮮肝組織去除血跡，于冰內(nèi)用含1mM EDTA的PBS勻漿化。溶胞產(chǎn)物用紗布濾除組織塊，然后在含0.002％的膠原酶(II型)和10u/ml的DNA酶溶液中37℃溫育20分鐘。得富集的單個(gè)肝臟細(xì)胞懸液。肝細(xì)胞(約108個(gè))在含有0.05％Triton X-100的PBS中重懸用以增加膜的通透性。血清封閉后，細(xì)胞用抗人HSA的單抗4℃溫育20分鐘。清洗后加PE結(jié)合抗鼠IgG的抗體4℃放置20分鐘，進(jìn)行FACS檢測(cè)。
(4)表達(dá)hHNF-3β和hALB mRNA經(jīng)篩選確定人肝細(xì)胞核因子(hHNF-3β)，和人血清白蛋白(hALB)的mRNA表達(dá)，作為檢測(cè)山羊肝組織中人肝細(xì)胞基因表達(dá)的依據(jù)。前者是人肝臟發(fā)育早期表達(dá)的一種特異性標(biāo)記蛋白而后者是人肝臟組織表達(dá)的一種特異性蛋白。以此確定山羊肝中有人源性肝細(xì)胞并具有活性。具體步驟如下①反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)(RT)取RNA(0.5～1μg)3μl，寡聚脫氧胸腺嘧啶0.5μl，RNA酶抑制劑0.5μl，焦碳酸二乙脂處理水(DEPC·H2O)8μl混和，置70℃水浴10分鐘后，插入冰中，再依次加入5倍濃度反轉(zhuǎn)錄緩沖液(5×buffer)4μl，0.1M二硫蘇糖醇(DTT)2μl，脫氧酸核苷酸混合液(dNTPs)(10mM)1μl，逆轉(zhuǎn)錄酶(MMLV)200u 1μl，取上述混合液置37℃1小時(shí)。
②設(shè)計(jì)RT-PCR引物人肝細(xì)胞核因子(hHNF-3β)mRNA的目的片段為368bp，上下游引物分分別為5′-CCTACGCCAACATGAACTCC-3′和5′-GTAGCAGCCGTTCTCGAACA-3′；特異于人血清白蛋白(hALB)mRNA的PCR引物的設(shè)計(jì)已知人與羊的ALBcDNA具有80％的同源性，本發(fā)明設(shè)計(jì)了多組能擴(kuò)增ALBcDNA的引物。通過比較，選擇了最合適的引物作為本發(fā)明常規(guī)PCR擴(kuò)增hALBcDNA的引物。其上游引物(A)相當(dāng)于hALBcDNA的第450位核苷酸至468位核苷酸，下游引物(B)相當(dāng)于hALBcDNA的第830位核苷酸至849位核苷酸。用于指導(dǎo)擴(kuò)增hALBcDNA共400bp的核苷酸片段。
上下游引物序列分別為5′-CCGATTGGTGAGACCAGAG-3′和5′-GCAGCATTCCGTGTGGACT-3′③用RT-PCR法檢測(cè)人肝細(xì)胞核因子(hHNF-3β)使用國(guó)產(chǎn)0.5ml Tip管。PCR試劑購(gòu)自TAKARA公司?？偡磻?yīng)體積25μl。PCR反應(yīng)時(shí)每管加入10×buffer2.5μl、dNTP2.0μl(2.5mM/μl)、引物HNFβ-1 1μl(10pmol/μl)、HNFβ-2 0.2μl(10pmol/μl)、TaqE(5u/μl)、H2O 17.7μl(滅菌水)、cDNA模板1μl(10-50ng)，加入石蠟油。放入Eppendorf Mastercycler Gradient PCR儀中進(jìn)行PCR檢測(cè)。
反應(yīng)條件94℃變性5分鐘后，進(jìn)入PCR循環(huán)94℃1分鐘，56-63℃45秒鐘，72℃1分鐘，最后在72℃延伸10分鐘。進(jìn)行30-32次循環(huán)。
④用RT-PCR法檢測(cè)人血清白蛋白(hALB)使用國(guó)產(chǎn)0.5ml Tip管。PCR試劑購(gòu)自TAKARA公司?？偡磻?yīng)體積25μl。PCR反應(yīng)時(shí)每管加入10×buffer2.5μl、dNTP2.0μl(2.5mM/μl)、引物A 1μl(10pmol/μl)、引物B 1μl(10pmol/μl)、TaqE(5u/μl)0.2μl、H2O 17.7μl(滅菌水)、cDNA模板1μl(約為10-50ng)，加入石蠟油。放入Eppendorf Mastercycler Gradient PCR儀中進(jìn)行PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件94℃變性5分鐘后，進(jìn)入PCR循環(huán)94℃1分鐘，52-64℃1分鐘，72℃1-2分鐘，最后在75℃延伸10分鐘。進(jìn)行30次循環(huán)。
⑤檢測(cè)PCR產(chǎn)物PCR產(chǎn)物用3％NuSieve瓊脂糖凝膠電泳40mA、1小時(shí)溴化乙錠染色后觀察結(jié)果。
RT-PCR結(jié)果顯示在正常人和受體山羊肝臟都有特異性368bp的hHNF-3β片段和400bp hALB的片段存在。正常對(duì)照組山羊和未成功植入HSC的山羊均無上述片段出現(xiàn)。
本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下1、山羊嵌合體的鑒定FACS分析發(fā)現(xiàn)在移植HSC的山羊血液中人的CD抗原(包括CD14，CD20，CD34和GPA)占較大比例，但正常對(duì)照羊中未見。PCR和RT-PCR分析證實(shí)移植后山羊白細(xì)胞中存在人的CD34和GPA抗原。上述結(jié)果表明人的HSC已成功植入受體羊中。
2、山羊肝組織的免疫化學(xué)分析正常人肝臟標(biāo)本用作陽(yáng)性對(duì)照，所有細(xì)胞顯示人肝細(xì)胞核PCNA染色陽(yáng)性。對(duì)照組羊肝標(biāo)本不同部位的切片均呈陰性，而移植HSC的羊肝臟標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞核PCNA染色陽(yáng)性的人源肝細(xì)胞存在。
正常人肝臟標(biāo)本和HSC移植山羊肝臟均有人HSA染色陽(yáng)性的細(xì)胞，證明山羊肝內(nèi)有人源性細(xì)胞。
3、FACS檢測(cè)山羊體內(nèi)的人肝細(xì)胞移植后山羊肝勻漿中檢出有人HSA表達(dá)，正常對(duì)照組山羊無人HSA表達(dá)。
4、hHNF-3β和hALB mRNA的表達(dá)RT-PCR顯示在正常人肝臟標(biāo)本和受體山羊肝臟均有特異性368bp的hHNF-3β片段和400bp hALB的片段存在。正常對(duì)照組山羊和未成功植入HSC的山羊則無上述片段出現(xiàn)。證明上述所表達(dá)的人源性細(xì)胞是有功能的。
B嵌合山羊肝臟組織有HSA染色陽(yáng)性細(xì)胞C對(duì)照組山羊肝臟細(xì)胞不顯色圖3是嵌合山羊肝臟細(xì)胞用HSA標(biāo)記后進(jìn)行FACS分析其中M1對(duì)照組山羊M2實(shí)驗(yàn)組山羊圖4是對(duì)嵌合山羊肝臟組織用RT-PCR方法分析人肝細(xì)胞核因子(hHNF-3β)和人血清白蛋白(hALB)mRNA的表達(dá)情況，產(chǎn)物在恒電流40mA下3％瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果其中AhHNF-3β mRNA表達(dá)情況M100bp DNA梯度標(biāo)記1未移植人HSC的山羊，hHNF-3β mRNA不表達(dá)2-4移植人HSC的受體羊，有hHNF-3β mRNA表達(dá)5空白對(duì)照，6人肝臟組織，有hHNF-3β mRNA表達(dá)7人臍血，hHNF-3β mRNA不表達(dá)8人血，hHNF-3β mRNA不表達(dá)BhALB mRNA表達(dá)情況M10bp DNA梯度標(biāo)記1未移植人HSC的對(duì)照山羊，hALB mRNA不表達(dá)2-4移植人HSC的受體羊，有hALB mRNA表達(dá)5空白對(duì)照6人肝臟組織，有hALB mRNA表達(dá)
權(quán)利要求
1.一種建立人/山羊肝細(xì)胞嵌合模型的方法，其特征在于通過下述步驟進(jìn)行1)構(gòu)建人/山羊肝細(xì)胞嵌合移植模型在建立人/山羊造血干細(xì)胞異種移植模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)行人特異CD抗原單克隆抗體和流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)以及分析鑒定山羊外周血DNA和RNA的人CD34和血型糖蛋白A的存在和表達(dá)，得人/山羊肝細(xì)胞嵌合模型，2)免疫組織化學(xué)法和流式細(xì)胞儀分析肝組織細(xì)胞，用RT-PCR方法鑒定檢測(cè)人肝細(xì)胞核因子及人血清白蛋白mRNA的表達(dá)，3)表達(dá)hHNF-3β和hALB mRNA
2.按權(quán)利要求1所述的方法，所述的移植的山羊外周血DNA和RNA檢測(cè)方法是分別用PCR和RT-PCR方法檢測(cè)人CD34和血型糖蛋白A的存在和表達(dá)分析，建立人/山羊造血干細(xì)胞異種移植模型的鑒定方法。
3.按權(quán)利要求1的方法，所述的用于鑒定檢測(cè)人肝細(xì)胞核因子及人血清白蛋白mRNA的表達(dá)RT-PCR方法包括①反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)，②設(shè)計(jì)RT-PCR引物，③檢測(cè)人肝細(xì)胞核因子和人血清白蛋白，④檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
4.按權(quán)利要求3的方法，所述的反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)是取RNA(0.5～1μg)3μl，寡聚脫氧胸腺嘧啶0.5μl，RNA酶抑制劑0.5μl，焦碳酸二乙脂處理水8μl混和，置70℃水浴10分鐘后，插入冰中，再依次加入5倍濃度反轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl，0.1M二硫蘇糖醇2μl，脫氧酸核苷酸混合液(10mM)1μl，逆轉(zhuǎn)錄酶200u 1μl，取上述混合液置37℃1小時(shí)。
5.按權(quán)利要求3的方法，所述的人肝細(xì)胞核因子其上下游引物分分別為5′-CCTACGCCAACATGAACTCC-3′和5′-GTAGCAGCCGTTCTCGAACA-3′，人肝細(xì)胞核因子mRNA的目的片段為368bp。
6.按權(quán)利要求3的方法，所述的特異于人血清白蛋白mRNA的引物其上游引物相當(dāng)于hALBcDNA的第450位核苷酸至468位核苷酸，下游引物相當(dāng)于hALBcDNA的第830位核苷酸至849位核苷酸，用于指導(dǎo)擴(kuò)增hALBcDNA共400bp的核苷酸片段。上下游引物序列分別為5′-CCGATTGGTGAGACCAGAG-3′和5′-GCAGCATTCCGTGTGGACT-3′
7.按權(quán)利要求3的方法，所述的RT-PCR法的反應(yīng)條件是94℃變性5分鐘后，進(jìn)入PCR循環(huán)，94℃1分鐘，52-64℃1分鐘，在75℃延伸10分鐘，進(jìn)行30-32次循環(huán)。
8.按權(quán)利要求3的方法，所述的檢測(cè)PCR產(chǎn)物，用3％NuSieve瓊脂糖凝膠電泳40mA、1小時(shí)溴化乙錠染色后觀察結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物組織細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人造血干細(xì)胞異種移植山羊后，獲得了人/山羊肝細(xì)胞嵌合模型。鑒定結(jié)果證實(shí)，受體山羊肝內(nèi)存在人源性的肝細(xì)胞并具有人肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特征，表達(dá)人白蛋白等肝細(xì)胞特異表達(dá)的基因。在個(gè)體水平上證實(shí)HSC移植后在山羊身體的內(nèi)環(huán)境中演化為人源性肝細(xì)胞的免疫和形態(tài)學(xué)特征，并具有人肝細(xì)胞的基因表達(dá)和功能。為HSC在體內(nèi)的擴(kuò)增、分化和羊肝內(nèi)人源性肝細(xì)胞的檢測(cè)等提供新的技術(shù)平臺(tái)，開辟了HSC宮內(nèi)移植研究新途徑，為疾病的宮內(nèi)治療提供理論和技術(shù)依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N5/16GK1410532SQ0211112
公開日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2002年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月21日
發(fā)明者曾凡一, 黃淑幀, 曾溢滔 申請(qǐng)人:上海凡華生物技術(shù)有限公司