專利名稱：深海魚皮組織工程用膠原蛋白和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種深海魚皮組織工程用膠原蛋白和制備方法。利用深海魚皮作為原料，提取供制備生物替代物的膠原蛋白，具體地說，本發(fā)明涉及利用堿溶液處理魚皮，再利用限制性酶解方法處理上述魚皮，凈化酶解上清液即得可降解生物相容性的魚皮膠原蛋白。
目前，國(guó)際上已出現(xiàn)一批以膠原蛋白為主要成分的生物制品，包括可溶性膠原、不溶性膠原以及由膠原和非膠原基質(zhì)組成的復(fù)合物。這些材料可用于制備膠原溶液、膠原膏劑、膠原薄膜、膠原縫合線等，從而廣泛用于創(chuàng)傷和燒傷的修復(fù)、整形美容、神經(jīng)再生及血瓣膜手術(shù)等。
目前臨床上應(yīng)用的膠原制劑的膠原蛋白主要是哺乳動(dòng)物豬、牛皮膚的膠原蛋白。這類膠原蛋白的提取的前處理比較麻煩，為得到干凈衛(wèi)生的皮膚原材料，屠宰前后清潔皮膚所需的工作量大，需要的成本也就相應(yīng)的提高。此外，在臨床上使用牛皮膠原可能在個(gè)別病例中引起不同程度的免疫反應(yīng)。特別是最近瘋牛病的危險(xiǎn)性被廣泛認(rèn)識(shí)，大大限制了膠原蛋白的來源。
近幾年出現(xiàn)了從大馬哈魚、比目魚等皮膚中提取膠原蛋的方法。魚皮膠原蛋白，特別是深海魚皮膠原蛋白，由于魚的體溫低，膠原蛋白的變性溫度相當(dāng)?shù)停幌笈Ｆつz原蛋白那樣限制細(xì)胞的增殖。而且有實(shí)驗(yàn)表明它能促進(jìn)細(xì)胞的粘著和增殖，不會(huì)誘發(fā)細(xì)胞的癌化(JP910,246)。由于原料的不同，制備魚皮膠原時(shí)的前處理也就不同于哺乳動(dòng)物皮膚的前處理，魚皮的前處理包括去鱗、去脂、去腥、去色等，用有機(jī)溶劑去除魚皮中非膠原蛋白成分，還會(huì)有部分脂肪不能除去，且該處理魚皮的方法成本高，污染環(huán)境。Shimizu et.al.(US6,271,350)利用鹽鹽漬魚皮的方法，可以有效的去除魚皮中的非膠原成分。該方法鹽漬處理需一周，耗時(shí)長(zhǎng)；用70-90℃的蒸餾水提取的膠原蛋白僅供工業(yè)和食品的需要。Holzer(US 5,484,888)利用1.6-12.5％的堿浸泡原料3-60天，再用pH5的弱酸溶液于45-55℃提取制備高強(qiáng)度白明膠用于食品填充物、攝影膠片和藥物膠囊。HaddenUS 5,162,506在制備作食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)氨基酸用的膠原纖維時(shí)，利用飽和的堿溶液去除原料中殘留的可溶性非膠原蛋白和多糖。I型膠原蛋白的β、γ鏈的非螺旋區(qū)是膠原蛋白的抗原決定簇。Piere et.al.(US 5420248)利用魚腹部魚的皮粉碎后，酸溶提取，所得膠原蛋白中α鏈占44％，β占56％。若用作生物材料，受體個(gè)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的可能性大大增加。此外，膠原蛋白的純化程度不高也限制所制備膠原蛋白的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的還提供一種上述深海魚皮組織工程用膠原蛋白的制備方法。該方法制得的魚皮膠原蛋白純度高，細(xì)胞相容性好，制備成本低，適合組織工程用材料。
本發(fā)明的一種深海魚皮的膠原蛋白，該深海魚皮膠原蛋白不含有γ鏈，其中α鏈的含量≥75％，β鏈的含量≤25％。本發(fā)明制備的膠原蛋白與Corning細(xì)胞培養(yǎng)板生物相容性比較結(jié)果如表1所示表1本發(fā)明制備的膠原蛋白與Corning細(xì)胞培養(yǎng)板生物相容性比較材料 人LA肝細(xì)胞 人LA肝細(xì)胞細(xì)胞增殖率(3d) 細(xì)胞存活力(％)Coming細(xì)胞培養(yǎng)板 3.26±1.83100％魚皮膠原蛋白(50μg/ml)7.58±0.31100％本發(fā)明的上述深海魚皮的膠原蛋白制備方法如下；1.堿溶液處理。清洗干凈的深海魚皮用0.5％-10％稀堿溶液在0-16℃浸泡處理，再用如Ca(OH)2、Mg(OH)2或Na+、K+、Ca2+、Mg2+等的弱酸鹽溶液浸泡1-7天，魚皮與稀堿溶液的重量與體積比為1∶1-10(公斤/升)，用去離子水充分清洗堿處理后魚皮，直到pH6.5-7.5左右為止。經(jīng)本發(fā)明的堿溶液處理方法，去除原料中的非膠原蛋白同時(shí)，還切除了膠原蛋白的非螺旋端。
2.限制性酶解。將上述處理后的深海魚皮溶解于0.01-2.0MpH3.5-5.5的醋酸-醋酸鈉鹽、磷酸鹽、鄰苯二甲酸鉀-氫氧化鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸或磷酸二氫鈉-檸檬酸的緩沖液中，添加蛋白酶，酶和魚皮的重量比為1∶10-100，于0-16℃條件下酶解1-5天，過濾。殘?jiān)梢栽俅蜗拗菩悦附馓幚恚喜纱螢V液。
3.凈化膠原蛋白 將上述pH3.5-5.5的濾液于2,000-10,000rpm低溫離心，收集上清液，用醋酸-醋酸鈉鹽、磷酸鹽、鄰苯二甲酸鉀-氫氧化鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸、磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液梯度透析，最后用純水透析，直到透析液呈中性為止。
經(jīng)透析的膠原蛋白液可以0-16℃保存，也可以干燥后于0-16℃保存。
上述清洗干凈的深海魚皮是將新鮮或冰凍保存的深海魚皮用0-16℃的自來水浸泡沖洗干凈，再用去離子水浸泡沖洗3-5次。所述的深海魚皮是大馬哈魚、比目魚、馬鮫魚、鮭魚、鱈魚或鯊魚等的皮膚。所述的Na+、K+、Ca2+、Mg2+等的弱酸鹽，可以是磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽。本發(fā)明中所述的堿溶液處理、限制性酶解、凈化膠原蛋白或保存方法中，推薦溫度為2-10℃。
本發(fā)明的深海魚皮膠原蛋白其它膠原蛋白(牛)相比，不僅不含有γ鏈，而且α鏈的含量高，β鏈的含量低，如α鏈的含量可高達(dá)79.65％，相對(duì)β鏈的含量為20.35％，生物相容性好。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)便，制得的魚皮膠原蛋白純度高，制備成本低，適合組織工程用材料。


圖1、本發(fā)明制備的膠原蛋白電泳圖譜。
圖2、Corning細(xì)胞培養(yǎng)板上細(xì)胞接種12小時(shí)細(xì)胞貼壁照片。
圖3、本發(fā)明制備的膠原蛋白膜上細(xì)胞接種12小時(shí)細(xì)胞貼壁照片。
附圖符號(hào)說明1-次高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；2-鹽漬酶解的膠原蛋白；3-堿漬酶解的膠原蛋白。
本發(fā)明制備的膠原蛋白電泳圖譜如圖1所示，說明本發(fā)明制備的膠原蛋白3不含有γ鏈，而且α鏈的含量高達(dá)79.65％，β鏈的含量低.僅為20.35％，而鹽漬酶解的膠原蛋白2含有小量γ鏈，β鏈的含量31.46％，α鏈的含量為68.54％。(參照US 5420248方法處理魚皮并本發(fā)明的酶解方法)Corning細(xì)胞培養(yǎng)板上(圖2)和本發(fā)明制備的膠原蛋白膜上(圖3)分別細(xì)胞接種12小時(shí)細(xì)胞貼壁的照片顯示為細(xì)胞貼壁分散不呈梭形和細(xì)胞貼壁不分散呈梭形。其中圖2放大倍率為40倍；圖3放大倍率為80倍。
具體實(shí)施例方式
通過下述實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例1魚皮膠原蛋白制備1.清洗魚皮將冰凍保存的大馬哈魚皮膚1公斤用4℃的自來水浸泡沖洗干凈，剔除魚鱗和皮下組織，直到浸泡液中除整塊魚皮外沒有其它固形物為止，再用去離子水浸泡沖洗5次。
2.堿處理魚皮用5％Na2CO3溶液10升于4℃浸泡(1)處理后的魚皮1個(gè)星期，每天更換一次3％Na2CO3溶液。再用去離子水充分清洗堿處理后魚皮，直到pH7左右為止。
3.限制性酶解魚皮將(2)處理的魚皮溶解于5升1.0M的醋酸鹽緩沖液中，添加1.0％胰蛋白酶，于4℃條件下酶解1天，用紗布過濾。殘?jiān)俅蜗拗菩悦附馓幚?，步驟同上，合并兩次濾液。
4.凈化膠原蛋白將上述濾液于10,000rpm低溫離心，收集上清，用醋酸鹽緩沖液剃度透析，最后用純水透析，直到透析液呈中性為止。可以得到59克精制膠原蛋白。
精制膠原蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜如圖1所示。
實(shí)施例2魚皮膠原蛋白制備
1.清洗魚皮將冰凍保存的大馬哈魚皮膚1公斤用1-10℃的自來水浸泡沖洗干凈，剔除魚鱗和皮下組織，直到浸泡液中除整塊魚皮外沒有其它固形物為止，再用去離子水浸泡沖洗5次。
2.堿處理魚皮用1％Ca(OH)2溶液10升于1-10℃浸泡(1)處理后的魚皮1個(gè)星期，每天更換一次1％Ca(OH)2溶液。再用去離子水充分清洗堿處理后魚皮，直到pH7左右為止。
3.限制性酶解魚皮將(2)處理的魚皮溶解于5升1.0M的醋酸鹽緩沖液中，添加1.0％胃蛋白酶，于1-10℃條件下酶解2天，用紗布過濾。殘?jiān)俅蜗拗菩悦附馓幚?，步驟同上，合并兩次濾液。
4.凈化膠原蛋白將上述濾液于10,000rpm低溫離心，收集上清，用醋酸鹽緩沖液剃度透析，最后用純水透析，直到透析液呈中性為止?？梢缘玫?5克精制膠原蛋白。
實(shí)施例3鹽漬魚皮膠原蛋白制備1.清洗魚皮將冰凍保存的大馬哈魚皮膚1公斤用5℃的自來水浸泡沖洗干凈，剔除魚鱗和皮下組織，直到浸泡液中除整塊魚皮外沒有其它固形物為止，再用去離子水浸泡沖洗5次。
2.堿處理魚皮用NaCl鹽漬魚皮(1∶1w/w)7天。再用去離子水充分清洗堿處理后魚皮，直到pH7左右為止。
3.限制性酶解魚皮將(2)處理的魚皮溶解于5升1.0M的醋酸鹽緩沖液中，添加2.0％胃蛋白酶，于5℃條件下酶解2天，用紗布過濾。殘?jiān)俅蜗拗菩悦附馓幚恚襟E同上，合并兩次濾液。
4.凈化膠原蛋白將上述濾液于10,000rpm低溫離心，收集上清，用醋酸鹽緩沖液剃度透析，最后用純水透析，直到透析液呈中性為止?？梢缘玫?8克精制膠原蛋白。
實(shí)施例4生物相容性比較本發(fā)明制備的膠原蛋白與幾種基質(zhì)生物相容性比較1.casting制膜將膠原蛋白配制成100ug/ml的1％醋酸溶液，加200微升于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，再將培養(yǎng)板置于離心機(jī)轉(zhuǎn)頭頂部(重心偏離)，1500rpm 1分鐘，更換位置后1500rpm 1分鐘，37℃晾干即可。使用前，紫外線處理30分鐘。2.接種細(xì)胞將細(xì)胞懸液濃度調(diào)至2.5×105個(gè)細(xì)胞/毫升左右，每孔加細(xì)胞懸液1毫升。3.3天后記數(shù)(活細(xì)胞染色和記數(shù)將1滴細(xì)胞懸液與2滴臺(tái)盼藍(lán)混合，滴到記數(shù)板上，2分鐘后記數(shù)。未著色的為活細(xì)胞，呈藍(lán)色的為死細(xì)胞)Corning細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞增殖為3.26±1.83，細(xì)胞存活率為100％；100ug/ml本發(fā)明制備的魚皮膠原蛋白膜的細(xì)胞增殖為3.50±1.75，細(xì)胞存活率為100％。
該膠原蛋白電泳圖譜如圖1-2所示。
權(quán)利要求
1.一種以深海魚皮為原料制備的膠原蛋白，其特征在于所制備的深海魚皮膠原蛋白不含有γ鏈，其中α鏈的含量≥75％，β鏈的含量≤25％。
2.如權(quán)利要求1所述的一種制備深海魚皮膠原蛋白方法，其特征在于依次按下列步驟進(jìn)行1)經(jīng)清洗干凈的魚皮用0.5％-10％稀堿溶液在0-16℃浸泡處理，魚皮與稀堿溶液的重量與體積比為1∶1-10(公斤/升)，再用去離子水充分清洗堿處理后魚皮，直到pH6.5-7.5，2)限制性酶解魚皮將上述處理的魚皮溶解于0.1-2.0MpH3.5-5.5的緩沖液中，添加蛋白酶，酶和魚皮的重量比為1∶10-100，于0-16℃條件下酶解1-5天，過濾；3)凈化膠原蛋白將上述pH3.5-5.5的濾液于2,000-10,000rpm低溫離心，收集上清，用pH3.5-5.5的緩沖液梯度透析，最后用純水透析，直到透析液呈中性為止；經(jīng)透析的膠原蛋白液可以0-16℃保存或干燥后于0-16℃保存。
3.如權(quán)利要求2所述的一種制備深海魚皮膠原蛋白方法，其特征在于1)中所述的清洗干凈的深海魚皮是將新鮮或冰凍保存的深海魚皮皮膚用0-16℃的自來水浸泡沖洗干凈，再用去離子水浸泡沖洗3-5次。
4.如權(quán)利要求2所述的一種制備深海魚皮膠原蛋白方法，其特征在于所述的深海魚皮是大馬哈魚、比目魚、馬鮫魚、鮭魚、鱈魚和鯊魚的魚皮。
5.如權(quán)利要求2所述一種制備深海魚皮膠原蛋白的方法，其特征在于使用的稀堿溶液是Ca(OH)2、Mg(OH)2和Na+、K+、Ca2+、Mg2+的弱酸鹽溶液。
6.如權(quán)利要求2所述制備深海魚皮膠原蛋白的方法，其特征在于所述的2)方法中緩沖液是醋酸-醋酸鈉鹽、磷酸鹽、鄰苯二甲酸鉀-氫氧化鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉、檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸或磷酸二氫鈉-檸檬酸的緩沖液。
7.按權(quán)利要求2所述一種制備深海魚皮膠原蛋白的方法，其特征在于使用的蛋白酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝血酶、纖溶酶或分散酶。
8.按權(quán)利要求2所述一種制備深海魚皮膠原蛋白的方法，其特征在于所述的方法2)中過濾殘?jiān)俅蜗拗菩悦附馓幚恚喜纱螢V液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種深海魚皮為原料的生物相容性好的膠原蛋白及其制備方法。通過堿溶液處理魚皮,再利用限制性酶解方法處理上述魚皮,凈化酶解上清液即得可降解生物相容性的魚皮膠原蛋白。該方法制得的魚皮膠原蛋白純度高,細(xì)胞相容性好,制備成本低,適合組織工程用材料。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1382806SQ0211168
公開日2002年12月4日 申請(qǐng)日期2002年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月15日
發(fā)明者王瑾曄, 董健 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所