專利名稱：一種新的青霉素g?；讣捌鋺?yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及新的黃桿菌青霉素G酰化酶及其編碼序列。本發(fā)明還涉及此青霉素G酰化酶的制法和用途。
背景技術(shù)：
青霉素G?；冈趬A性條件下催化青霉素G水解生成母核(6-APA)和側(cè)鏈苯乙酸，母核6-APA是半合成青霉素的原料；在酸性條件下催化母核6-APA和側(cè)鏈苯乙酸生成青霉素G。因此青霉素G?；甘前牒铣汕嗝顾毓I(yè)生產(chǎn)中一種非常重要的酶。
青霉素G?；付啻嬖谟诩?xì)菌，酵母甚至真菌中。青霉素G?；甘怯梢粋€(gè)無(wú)活性的前體肽經(jīng)過(guò)剪切加工，形成有活性的由大小不同的二個(gè)亞基組成的分子量在80KD左右的異源二聚體。
青霉素G?；富虻谋磉_(dá)無(wú)論是在原始菌株或者是重組的大腸桿菌中都受到許多因素的調(diào)節(jié)。青霉素G酰化酶基因的表達(dá)對(duì)溫度很敏感，在高于33℃條件下生長(zhǎng)時(shí)，表達(dá)的蛋白大多為沒(méi)有活力的前體，22-25℃是產(chǎn)酶的最好溫度。但是22℃情況下菌體的生長(zhǎng)量較低，因此總酶活不高。工業(yè)上為了提高總酶活，采取變溫處理，在28℃下培養(yǎng)菌體，然后在轉(zhuǎn)移到22℃產(chǎn)酶，這給工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)不便。另外，許多來(lái)源的青霉素G?；富虻谋磉_(dá)都必須有苯乙酸的誘導(dǎo)，在這些青霉素?；富虻膬?nèi)部存在調(diào)節(jié)基因，調(diào)節(jié)基因編碼阻遏蛋白抑制青霉素G?；富虻谋磉_(dá)。只有在培養(yǎng)基中加入苯乙酸，通過(guò)苯乙酸和阻遏蛋白結(jié)合，從而使得青霉素G?；富虻靡员磉_(dá)。由于苯乙酸有較強(qiáng)的酸性，對(duì)菌體的生長(zhǎng)存在抑制作用，苯乙酸也產(chǎn)生較強(qiáng)的氣味，因此給工業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)許多不便。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的青霉素G?；?，所述的青霉素G酰化酶的基因表達(dá)不依賴于苯乙酸的誘導(dǎo)和/或所述青霉素G?；傅幕虮磉_(dá)對(duì)低溫的依賴性也下降。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的青霉素G?；傅鞍滓约捌淦巍㈩愃莆锖脱苌铩Ｋ龅那嗝顾谿?；富虻谋磉_(dá)不依賴于苯乙酸的誘導(dǎo)，并且所述青霉素G?；富虮磉_(dá)對(duì)低溫的依賴性也下降。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼所述青霉素G?；傅亩嗪塑账帷?br> 本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)所述青霉素G?；傅姆椒ㄒ约霸摱嚯暮途幋a序列的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的青霉素G?；?，它包含α亞基和β亞基，其中所述的α亞基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；所述的β亞基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，所述的青霉素G?；?，所述的α亞基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；且所述的β亞基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核昔酸序列編碼本發(fā)明的青霉素G酰化酶。
較佳地，該多核苷酸編碼含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的α亞基和含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的β亞基。更佳地，該多核苷酸的序列含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種含有本發(fā)明上述的多核苷酸的載體。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明上述的載體，或者含有青霉素G?；傅木幋a序列。
在一優(yōu)選例中，上述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌(Escherichia coli.)JM109/pPGACGMCC No.0745。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種青霉素G?；傅闹苽浞椒?，該方法包含(a)在適合表達(dá)青霉素G?；傅臈l件下，培養(yǎng)本發(fā)明上述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出青霉素G?；?。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種生產(chǎn)青霉素G的方法，它包括步驟(a)在酸性條件下，在反應(yīng)體系中，用青霉素G酰化酶催化青霉素母核6-APA與側(cè)鏈苯乙酸形成青霉素G，所述的青霉素G?；赴羴喕挺聛喕?，其中所述的α亞基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的β亞基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(b)從反應(yīng)體系中分離出青霉素G。
在本發(fā)明的第七方面，提供了一種生產(chǎn)青霉素母核6-APA的方法，它包括步驟
(a)在堿性條件下，在反應(yīng)體系中，用青霉素G?；复呋嗝顾谿分解形成母核6-APA與側(cè)鏈苯乙酸，所述的青霉素G?；赴羴喕挺聛喕?，其中所述的α亞基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的β亞基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(b)從反應(yīng)體系中分離出青霉素母核6-APA。


下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1顯示了青霉素G?；复呋姆磻?yīng)。
圖2顯示了帶有本發(fā)明青霉素G?；富虻馁|(zhì)粒。
圖3A和3B分別顯示了本發(fā)明青霉素G?；傅腄NA和氨基酸序列，其中箭頭處為α亞基和β亞基的切割位點(diǎn)，切割后前半部分為α亞基，后半部分為β亞基。
圖4顯示了純化的本發(fā)明青霉素G酰化酶的電泳照片。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究，分離出了一種新型的青霉素G?；富颉Ｔ撉嗝顾谿?；富虺式M成型表達(dá)，不必苯乙酸誘導(dǎo)，而且，該青霉素G?；富虻谋磉_(dá)對(duì)低溫度的依賴也有所減弱，其最適的產(chǎn)酶溫度是28℃。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“青霉素G?；傅鞍住?、“青霉素G?；付嚯摹被颉扒嗝顾谿?；浮笨苫Q使用，都指由青霉素G?；甫羴喕?氨基酸序列如SEQ IDNO2所示)和β亞基(氨基酸序列如SEQ ID NO4所示)構(gòu)成的蛋白或多肽。它們可含有或不含起始甲硫氨酸。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的青霉素G酰化酶”是指青霉素G?；富旧喜缓烊慌c其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化青霉素G?；傅鞍?。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本發(fā)明還包括黃桿菌青霉素G?；傅鞍椎钠?、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然黃桿菌青霉素G?；傅鞍紫嗤纳飳W(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“黃桿菌青霉素G?；浮边€包括具有與黃桿菌青霉素G酰化酶蛋白相同功能的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括黃桿菌青霉素G酰化酶蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與黃桿菌青霉素G酰化酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗黃桿菌青霉素G酰化酶多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了黃桿菌青霉素G?；付嚯牡幕钚云?。通常，該片段具有黃桿菌青霉素G?；付嚯母鱽喕蛄械闹辽偌s30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供黃桿菌青霉素G?；傅鞍谆蚨嚯牡念愃莆?。這些類似物與天然黃桿菌青霉素G?；付嚯牡牟顒e可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“黃桿菌青霉素G酰化酶蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID N02的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。對(duì)于α和β亞基而言，編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ IDNO1和3所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，“簡(jiǎn)并的變異體”對(duì)于α亞基而言，在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。對(duì)于β亞基而言，在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO4的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO3所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼青霉素G?；傅鞍椎亩嗪塑账帷?br> 本發(fā)明的黃桿菌青霉素G?；负塑账崛L(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列(SEQ ID NO5)，尤其是開放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用按常規(guī)方法所提取的黃桿菌DNA或DNA文庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。一種引物例子是對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO5中5′端和3′端序列的引物。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或青霉素G?；傅鞍拙幋a序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的青霉素G?；付嚯?。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼黃桿菌青霉素G?；付嚯牡亩嗪塑账?或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，黃桿菌青霉素G?；付嗪塑账嵝蛄锌刹迦氲街亟M表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)的基于T7的表達(dá)載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)，和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來(lái)源于桿狀病毒的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含黃桿菌青霉素G?；妇幋aDNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、COS、293細(xì)胞等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)黃桿菌青霉素G?；妇哂刑禺愋缘亩嗫寺】贵w和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于黃桿菌青霉素G酰化酶基因產(chǎn)物或片段。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的黃桿菌青霉素G?；富虍a(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)黃桿菌青霉素G?；傅鞍谆蚱渚哂锌乖缘钠蔚募?xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
本發(fā)明的青霉素G?；傅鞍谆蚨嚯挠卸喾矫娴挠猛尽Ｒ环N直接用途是用于制備青霉素G，另一種直接用途是制備青霉素母核6-APA。由于本發(fā)明的該青霉素G?；富蚓哂幸韵聝?yōu)點(diǎn)(1)組成型表達(dá)，不必苯乙酸誘導(dǎo)；(2)對(duì)低溫度的依賴性低，最適的產(chǎn)酶溫度是28℃，
因此，本發(fā)明的青霉素G?；妇哂袕V闊的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1黃桿菌(Flavobacterium sp.650)的培養(yǎng)和總DNA的提取50毫升LB液體培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含10克酵母粉，5克蛋白胨和10克氯化鈉，pH 7.0)接種一個(gè)單菌落黃桿菌(Flavobacterium sp.650)，28℃培養(yǎng)24小時(shí)。5000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘以收集菌體，懸浮菌體于15毫升TE中，加入蛋白酶K和SDS使終濃度分別為100微克/毫升和0.5％。混勻后于37℃放置過(guò)夜至懸浮液變透明。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，緩慢的混勻后12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，用大口的移液管取出上清，再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇抽提，反復(fù)抽提直到離心后上下層間沒(méi)有白色的物質(zhì)。取出上清加入1/10體積的3摩爾/升的醋酸鈉，混勻，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻以使DNA析出。用干凈的玻璃鉤子鉤出DNA，將其放入70％乙醇中漂洗，取出DNA，室溫放置以使乙醇揮發(fā)干凈，將DNA溶于1毫升TE。于4℃保存。
實(shí)施例2黃桿菌(Flavobacterium sp.650)青霉素G酰化酶基因的克隆取2微克實(shí)施例1中提取的Flavobacterium sp總DNA，在40微升的反應(yīng)體系中，加入限制性內(nèi)切酶Sau 3AI和相應(yīng)的反應(yīng)緩沖液進(jìn)行部分酶切，反應(yīng)過(guò)程中每次取1微升樣用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切的程度，當(dāng)酶切的片段集中在4-10kb時(shí)終止反應(yīng)，將所有的反應(yīng)液加入瓊脂糖凝膠的加樣孔中進(jìn)行電泳，割下含有4-10kb的DNA片段的凝膠，利用華舜公司生產(chǎn)的凝膠回收柱將凝膠中的DNA片段回收到4微升的TE中。
按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中堿裂解法小量抽提質(zhì)粒的方法，提取質(zhì)粒載體pBSKS(-)(一種常用載體)并用氯化銫-溴化乙錠超離心純化超螺旋質(zhì)粒。將純化的超螺旋質(zhì)粒100納克在20微升的反應(yīng)體系中用過(guò)量的BamHI酶切完全后，用0.8％的瓊脂糖凝膠電泳分離，割下含有大小為3.4kb的線性化的載體的凝膠，利用華舜公司生產(chǎn)的凝膠回收柱將凝膠中的DNA片段回收到17微升的無(wú)菌的重蒸水中。在這17微升溶液中加1單位的小牛堿性去磷酸化酶和2微升的去磷酸化酶的緩沖液，37℃放置5分鐘，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇抽提二次，取出上清加入1/10體積的3M的醋酸鈉，混勻，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后冰上放置30分鐘，離心回收DNA，70％乙醇洗后，室溫放置以使乙醇揮發(fā)干凈，將DNA溶于1微升的TE。
按照Takara公司提供的連接酶的說(shuō)明，將回收的總?cè)旧w的sau3A I部分酶切片段和載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物加入1/10體積的3摩爾/升的醋酸鈉，混勻，再加入2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后冰上放置30分鐘，離心回收DNA，70％乙醇洗后，室溫放置以使乙醇揮發(fā)干凈后，加20微升制備的大腸桿菌JM109電擊感受態(tài)，將這20微升大腸桿菌JM109電擊感受態(tài)和連接產(chǎn)物的混合物轉(zhuǎn)移到特制的電擊杯中，在Bio-Rad公司的基因槍上進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，然后加入800微升的LB，并于37度培養(yǎng)45分鐘以復(fù)蘇細(xì)胞，然后將所有的培養(yǎng)液按每個(gè)平板100微升涂布于8個(gè)含有合適濃度的氯霉素，X-gal和IPTG的LB平板上，37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)，得到黃桿菌的基因組文庫(kù)。
將基因組文庫(kù)中的白色菌落轉(zhuǎn)接到含有1毫克/毫升的2-硝基-5-苯乙酰胺苯甲酸(NIPAB)的LB平板上，33℃培養(yǎng)24小時(shí)后，仔細(xì)觀察平板上菌落周圍有無(wú)黃顏色出現(xiàn)。青霉素G酰化酶陽(yáng)性克隆水解NIPAB，底物呈現(xiàn)易于觀察的黃顏色。
將篩選到的青霉素G?；戈?yáng)性克隆的重組質(zhì)粒提取出后，用限制性內(nèi)切酶分析其大小，選取插入片段最小的質(zhì)粒pPGA(圖2)用于測(cè)定外源DNA的序列，測(cè)序由上海聯(lián)合基因公司進(jìn)行。
測(cè)定的DNA序列用BioEdit和GCG軟件分析得到完整的青霉素G酰化酶的編碼序列，它有2589個(gè)核苷酸組成，編碼862個(gè)氨基酸(圖3)。它和來(lái)源于Providencia rettgeri，Escherichia coli，Kluyvera cryocrescens和Bacillusmegaterium的青霉素G?；傅陌被嵬葱苑謩e為52％，51％，52％和28％。
本發(fā)明的青霉素G?；赣搔羴喕挺聛喕鶚?gòu)成。其中，α亞基的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO1和2所示，β亞基的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO3和4所示。
MKQHVLSAAL VAACSCLPAM AQPVAQAAGQ ESAAVAAPAQ GAAGKVTIRR 50DAHGMPHVYA DTVYGIFYGY GYAVAQDRLF QMEMARRSTQ GRVAEVLGAS 100MVAFDKSIRG NFSPERIQRQ LAALPAADRQ VLDGYAAGMN AWLARIRAQP 150GQLMPKEFND LGFAPADWTA YDVAMIFIGT MANRFSDANS EIDNLALLTA 200LKDRHGEAEA MRIFNQLRWL TDSRAPTTVP PQEGSYQPAV FQPEGAEQLA 250
YALPRYDGTP PMLERVVRDP ATRGVVDGAP ATLRARLAEQ YAQSGQPGIA300GFPTT 305(α亞基，SEQ ID NO2)SNMWIVGRDH AKDARSILLN GPQFGWWNPA YTYGIGLHGA GFDVVGNTPF50AYPSILFGHN AHVAWGSTAG FGDDVDIYAE KLDPADRNRY FHDGQWKTLE100KRTDLILVKD AAPVTLDVYR SVHGLIVKFD DAQHVAYAKA RAWEGFELQS150LMAWTRKTQS ANWEQWKTQA ARHALTINWY YADDRGNIGY AHTGFYPRRR200PGHDPRLPVP GTGEMDWLGL LPFSTNPQVY NPGQGFIANW NNQPMRGYPS250TDLFAIVWGQ ADRYAEIETR LKAMTANGGK VSPQQMWDLI RTTSYADVNR300RHFLPFLQRA VQGLPADDPR VRLVAGLGGW DGMMTSEREP GYYDNAGPAV350MDAWLRAMLK RTLADEMPAD FFKWYSATGY PTPQAPATGS LNLTTGVKVL400FNALAGPAAG VPQRYDFFNG ARADDVILAA LDDALAALRQ AYGKDPAAWK450IPAPPMVFAP KNFLGVPQAD AKAVLSYPAT QNRGTENNMT VFDGKSVRAV500DVVAPGQSGF VAPDGTPSPH TRDQFDLYNS FGSKRVWFTA DEVRRNATSE550ETLRYRR 557(β亞基，SEQ ID NO4)實(shí)施例3帶有黃桿菌青霉素G?；富蚬こ叹鶭M109/pPGA的構(gòu)建取質(zhì)粒pPGA1微升(5納克)，加20微升制備的大腸桿菌JM109電擊感受態(tài)，將這20微升連接產(chǎn)物和大腸桿菌JM109(一種常用大腸桿菌宿主)電擊感受態(tài)的混合物轉(zhuǎn)移到特制的電擊杯中，在Bio-Rad公司的基因槍上進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，然后加入800微升的LB，并于37度培養(yǎng)45分鐘以復(fù)蘇細(xì)胞，然后將所有的培養(yǎng)液按每個(gè)平板100微升涂布于8個(gè)含有合適濃度的氯霉素，X-gal和IPTG的LB平板上，37℃培養(yǎng)，得到帶有青霉素G?；富蚬こ叹鶭M109/pPGA。
青霉素G?；富蚬こ叹竽c桿菌(Escherichia coli.)JM109/pPGA于2002年5月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國(guó)，北京)，保藏號(hào)為CGMCC No.0745。
實(shí)施例4苯乙酸對(duì)青霉素G?；富蚬こ叹鶭M109/pPGA中青霉素G酰化酶基因表達(dá)的影響在LB培養(yǎng)基中添加不同濃度的苯乙酸(濃度為0，0.05％，0.1％，0.2％，0.4％(W/V％)，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)使培養(yǎng)基最終的pH為7.0)，平行三份，都按1％的接種量接種后，分別在22℃、28℃、37℃培養(yǎng)，并在接種后的12，24，36，48小時(shí)從每個(gè)搖瓶中取樣測(cè)定菌體濃度和青霉素G酰化酶的活力，計(jì)算比活力。
結(jié)果在同一個(gè)溫度下，苯乙酸(PAA)的初始濃度越高，菌體的青霉素G酰化酶的比活力越低。比活最高的為在28℃培養(yǎng)且不加PAA的搖瓶。因此，該青霉素G?；富虺式M成型表達(dá)，不必苯乙酸的誘導(dǎo)；與其它來(lái)源的青霉素G?；富虻淖罴驯磉_(dá)溫度在22-25℃相比，該青霉素G酰化酶基因的表達(dá)對(duì)低溫度的依賴也有所減弱，其最適的產(chǎn)酶溫度是28℃。
實(shí)施例5重組的青霉素G酰化酶的純化接種JM109/pPGA單菌落到含有34微克/毫升的50毫升LB液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24小時(shí)，即為種子培養(yǎng)液。然后按1％的接種量轉(zhuǎn)接到裝有1000毫升LB的5000毫升的三角瓶中，于28℃180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)48小時(shí)，然后8000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，以收集菌體。
將收集的重組大腸桿菌菌體經(jīng)磷酸緩沖液(0.1摩爾/升，pH 8.0)洗滌后再分散于100毫升磷酸緩沖液中，并于4℃條件下，用French Pressure Cell Press破碎細(xì)胞。破碎液經(jīng)12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘去除菌體碎片。上清液中的青霉素G?；赣?0％(NH3)2SO4沉淀，離心收集沉淀的蛋白。用少量的1摩爾/升(NH3)2SO4/0.01摩爾/升磷酸緩沖液溶解蛋白，離心20分鐘，棄去不溶物后，上清上Phenyl-Sepharose層析。流動(dòng)相A0.01摩爾/升磷酸緩沖液(pH 8.0)；流動(dòng)相B1摩爾/升(NH3)2SO4，0.01摩爾/升磷酸緩沖液，線性降落梯度洗脫，分步收集洗脫液。用NIPAB檢測(cè)洗脫液中青霉素G酰化酶的酶活。收集有活性的洗脫液，于4℃用PEG20000濃縮到體積足夠小，于4℃對(duì)0.01摩爾/升pH 8.0的磷酸緩沖液充分透析。充分透析后的蛋白溶液經(jīng)12000轉(zhuǎn)/分鐘離心去除不溶物，上清上Q Sepharaose層析。流動(dòng)相A0.01摩爾/升磷酸緩沖液(pH 8.0)，流動(dòng)相B0.5摩爾/升NaCl、0.01摩爾/升磷酸緩沖液，線性升梯度洗脫。收集有活性的洗脫液，于4℃用PEG20000濃縮到體積足夠小，離心去除不溶物，上分子篩Superdex 75(Ampharmacia)流動(dòng)相0.05摩爾/升磷酸緩沖液(pH 8.0)。活性洗脫液用PEG20000濃縮，SDS-PAGE檢測(cè)其純度和亞基組成。
結(jié)果表明，該青霉素G?；赣梢粋€(gè)62kD的大亞基和一個(gè)25kD的小亞基組成(圖4)。
實(shí)施例6
青霉素G?；赣糜谒馇嗝顾谿產(chǎn)生青霉素母核6-APA反應(yīng)式見圖1。反應(yīng)體系用0.1摩爾/升pH7.5磷酸鹽緩沖液，青霉素G(鉀鹽)為5毫克/毫升，酶濃度為0.5毫克/毫升，于37℃保溫5分鐘。取樣加入等體積反應(yīng)終止液(20％冰醋酸∶0.05MNaOH＝2∶1(體積比))和1/2體積的顯色劑(0.5％對(duì)-二甲氨基甲醛乙醇溶液)，于415nm比色。酶活力的計(jì)算方法按37℃ pH7.5每分鐘分解青霉素G產(chǎn)生1微摩爾的6-APA所需要的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。
結(jié)果表明，本發(fā)明實(shí)施例5中獲得的青霉素G?；傅拇呋钚詾?8.5活力單位/毫克蛋白。
實(shí)施例7青霉素G酰化酶利用青霉素母核6-APA和苯乙酸合成青霉素G反應(yīng)式見圖1。在45％PEG600的100毫摩爾/升pH 6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，青霉素G酰化酶1毫克，6-APA和苯乙酸初始濃度均為30毫摩爾/升。混勻后于20℃振搖。一小時(shí)后取樣測(cè)定6-APA減少的量。一個(gè)單位的酶活定義為20℃、pH 6.0每分鐘消耗微摩爾的6-APA所需要的酶量。比活定義為每毫克蛋白的酶活。
結(jié)果表明，本發(fā)明實(shí)施例5中獲得的青霉素G?；傅拇呋钚詾?.8單位/毫克蛋白。
菌種的保藏本發(fā)明的青霉素G?；富蚬こ叹竽c桿菌(Escherichia coli.)JM109/pPGA于2002年5月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國(guó)，北京)，保藏號(hào)為CGMCC No.0745。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所<120>一種新的青霉素G?；讣捌鋺?yīng)用<130>023316<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>915<212>DNA<213>黃桿菌(Flavobacterium sp.)<220><221>CDS<222>(1)..(915)<223><400>1atg aag cag cat gtg ttg tcg gcc gcc ctg gtg gcg gcc tgt tcc tgc 48Met Lys Gln His Val Leu Ser Ala Ala Leu Val Ala Ala Cys Ser Cys1 5 10 15ctg ccc gcg atg gcg caa ccc gtg gcg caa gcc gcg ggc cag gag tcc 96Leu Pro Ala Met Ala Gln Pro Val Ala Gln Ala Ala Gly Gln Glu Ser20 25 30gcg gcc gtc gcg gct ccg gcg caa ggc gcc gcc ggc aag gtc acg atc 144Ala Ala Val Ala Ala Pro Ala Gln Gly Ala Ala Gly Lys Val Thr Ile35 40 45cgg cgc gac gcc cat ggc atg ccg cac gtc tac gcc gac acg gtg tac 192Arg Arg Asp Ala His Gly Met Pro His Val Tyr Ala Asp Thr Val Tyr50 55 60ggc att ttc tac ggc tac ggt tac gcg gtg gcg cag gac cgg ctg ttc 240Gly lle Phe Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe65 70 75 80cag atg gag atg gcg cgg cgc agc acc cag ggc cgg gtg gcc gaa gtg 288Gln Met Glu Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala Glu Val85 90 95ctc ggc gcg tcg atg gtg gcg ttc gac aaa tcc atc cgc ggc aat ttc 336Leu Gly Ala Ser Met Val Ala Phe Asp Lys Ser Ile Arg Gly Asn Phe100 105 110tcg ccc gaa cgc atc cag cgc cag ctg gcg gcg ctg ccg gcc gcc gac 384Ser Pro Glu Arg Ile Gln Arg Gln Leu Ala Ala Leu Pro Ala Ala Asp115 120 125cgc cag gtg ctg gac ggc tac gcg gcc ggc atg aac gcc tgg ctg gcg 432Arg Gln Val Leu Asp Gly Tyr Ala Ala Gly Met Asn Ala Trp Leu Ala130 135 140cgg atc cgg gcg cag ccg ggg cag ttg atg ccc aag gaa ttc aac gac 480Arg Ile Arg Ala Gln Pro Gly Gln Leu Met Pro Lys Glu Phe Asn Asp145 150 155 160ctg ggc ttc gcg ccg gcc gac tgg acc gcc tac gac gtg gcg atg atc 528Leu Gly Phe Ala Pro Ala Asp Trp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Met Ile165 170 175ttc atc ggc acc atg gcg aac cgc ttc tct gac gcc aac agc gag atc 576Phe Ile Gly Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ala Asn Ser Glu Ile180 185 190gac aac ctg gcg ctg ctg acg gcg ctc aag gac agg cac ggc gag gcc624Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Arg His Gly Glu Ala195 200 205gag gcc atg cgc atc ttc aac cag ctg cgc tgg ctg acg gac agc cgc672Glu Ala Met Arg Ile Phe Asn Gln Leu Arg Trp Leu Thr Asp Ser Arg210 215 220gcg ccg acc acg gtg ccg ccc cag gag ggc agc tac cag ccg gcc gtg720Ala Pro Thr Thr Val Pro Pro Gin Glu Gly Ser Tyr Gln Pro Ala Val225 230 235 240ttc cag ccg gaa ggc gcg gaa cag ctg gcc tac gcg ctg ccg cgc tac768Phe Gln Pro Glu Gly Ala Glu Gln Leu Ala Tyr Ala Leu Pro Arg Tyr245 250 255gac ggc acg ccg ccg atg ctc gaa cgc gtg gtg cgc gat ccg gcc acg816Asp Gly Thr Pro Pro Met Leu Glu Arg Val Val Arg Asp Pro Ala Thr260 265 270cgc ggc gtg gtc gat ggc gcg ccc gcc acg ctg cgg gct cga ctg gcc864Arg Gly Val Val Asp Gly Ala Pro Ala Thr Leu Arg Ala Arg Leu Ala275 280 285gag caa tac gcg caa tcg ggc cag ccg ggc atc gca ggc ttc ccg acc912Glu Gln Tyr Ala Gln Ser Gly Gln Pro Gly Ile Ala Gly Phe Pro Thr290 295 300acc915Thr305<210>2<211>305<212>PRT<213>黃桿菌(Flavobacterium sp.)<400>2Met Lys Gln His Val Leu Ser Ala Ala Leu Val Ala Ala Cys Ser Cys1 5 10 15Leu Pro Ala Met Ala Gln Pro Val Ala Gln Ala Ala Gly Gln Glu Ser20 25 30Ala Ala Val Ala Ala Pro Ala Gln Gly Ala Ala Gly Lys Val Thr Ile35 40 45Arg Arg Asp Ala His Gly Met Pro His Val Tyr Ala Asp Thr Val Tyr50 55 60Gly Ile Phe Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe65 70 75 80Gln Met Glu Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala Glu Val85 90 95Leu Gly Ala Ser Met Val Ala Phe Asp Lys Ser Ile Arg Gly Asn Phe100 105 110Ser Pro Glu Arg Ile Gln Arg Gln Leu Ala Ala Leu Pro Ala Ala Asp115 120 125Arg Gln Val Leu Asp Gly Tyr Ala Ala Gly Met Asn Ala Trp Leu Ala130 135 140Arg Ile Arg Ala Gln Pro Gly Gln Leu Met Pro Lys Glu Phe Asn Asp145 150 155 160Leu Gly Phe Ala Pro Ala Asp Trp Thr Ala Tyr Asp Val Ala Met Ile165 170 175Phe Ile Gly Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ala Asn Ser Glu Ile180 185 190Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Arg His Gly Glu Ala195 200 205Glu Ala Met Arg Ile Phe Asn Gln Leu Arg Trp Leu Thr Asp Ser Arg210 215 220Ala Pro Thr Thr Val Pro Pro Gln Glu Gly Ser Tyr Gln Pro Ala Val225 230 235 240Phe Gln Pro Glu Gly Ala Glu Gln Leu Ala Tyr Ala Leu Pro Arg Tyr245 250 255Asp Gly Thr Pro Pro Met Leu Glu Arg Val Val Arg Asp Pro Ala Thr260 265 270Arg Gly Val Val Asp Gly Ala Pro Ala Thr Leu Arg Ala Arg Leu Ala275 280 285Glu Gln Tyr Ala Gln Ser Gly Gln Pro Gly Ile Ala Gly Phe Pro Thr290 295 300Thr305<210>3<21l>1674<212>DNA<213>黃桿菌(Flavobacterium sp.)<220><221>CDS<222>(1)..(1674)<223><400>3agc aac atg tgg atc gtg ggc cgt gac cat gcc aag gat gcc cgt tcg48Ser Asn Met Trp Ile Val Gly Arg Asp His Ala Lys Asp Ala Arg Ser1 5 10 15atc ctg ctg aac ggc ccg cag ttc ggc tgg tgg aat ccg gcc tac acc96Ile Leu Leu Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Trp Asn Pro Ala Tyr Thr20 25 30tac ggc atc ggc ctg cac ggc gcc ggc ttc gac gtg gtc ggc aac acg 144Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Phe Asp Val Val Gly Asn Thr35 40 45ccg ttc gcc tat ccc tcc atc ctg ttc ggc cac aat gcg cac gtg gcc192Pro Phe Ala Tyr Pro Ser Ile Leu Phe Gly His Asn Ala His Val Ala50 55 60tgg ggc tcg acc gcg ggc 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580 585 590gac ctg atc cgc acc acc agc tat gcc gac gtc aac cgc cgc cat ttc1824Asp Leu Ile Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Val Asn Arg Arg His Phe595 600 605ctg ccg ttc ctg caa cgc gcg gtg cag ggg ctg ccg gcc gac gat ccg1872Leu Pro Phe Leu Gln Arg Ala Val Gln Gly Leu Pro Ala Asp Asp Pro610 615 620cgc gtg cgg ctg gtg gcg ggg ctg ggg ggc tgg gac ggc atg atg acc1920Arg Val Arg Leu Val Ala Gly Leu Gly Gly Trp Asp Gly Met Met Thr625 630 635 640agc gag cgc gag ccg ggc tac tac gac aac gcc ggc ccg gcg gtg atg1968Ser Glu Arg Glu Pro Gly Tyr Tyr Asp Asn Ala Gly Pro Ala Val Met645 650 655gac gcc tgg ctg cgc gcg atg ctc aag cgc acc ctg gcc gac gag atg2016Asp Ala Trp Leu Arg Ala Met Leu Lys Arg Thr Leu Ala Asp Glu Met660 665 670ccg gcc gac ttc ttc aag tgg tac agc gct acc ggg tat ccc acg ccg2064Pro Ala Asp Phe Phe Lys Trp Tyr Ser Ala Thr Gly Tyr Pro Thr Pro675 680 685cag gcg cct gcc acc ggc tcg ctc aac ctg acc acc ggc gtg aag gtg2112Gln Ala Pro Ala Thr Gly Ser Leu Asn Leu Thr Thr Gly Val Lys Val690 695 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565 570 575Lys Ala Met Thr Ala Asn Gly Gly Lys Val Ser Pro Gln Gln Met Trp580 585 590Asp Leu Ile Arg Thr Thr Ser Tyr Ala Asp Val Asn Arg Arg His Phe595 600 605Leu Pro Phe Leu Gln Arg Ala Val Gln Gly Leu Pro Ala Asp Asp Pro610 615 620Arg Val Arg Leu Val Ala Gly Leu Gly Gly Trp Asp Gly Met Met Thr625 630 635 640Ser Glu Arg Glu Pro Gly Tyr Tyr Asp Asn Ala Gly Pro Ala Val Met645 650 655Asp Ala Trp Leu Arg Ala Met Leu Lys Arg Thr Leu Ala Asp Glu Met660 665 670Pro Ala Asp Phe Phe Lys Trp Tyr Ser Ala Thr Gly Tyr Pro Thr Pro675 680 685Gln Ala Pro Ala Thr Gly Ser Leu Asn Leu Thr Thr Gly Val Lys Val690 695 700Leu Phe Asn Ala Leu Ala Gly Pro Ala Ala Gly Val Pro Gln Arg Tyr705 710 715 720Asp Phe Phe Asn Gly Ala Arg Ala Asp Asp Val Ile Leu Ala Ala Leu725 730 735Asp Asp Ala Leu Ala Ala Leu Arg Gln Ala Tyr Gly Lys Asp Pro Ala740 745 750Ala Trp Lys Ile Pro Ala Pro Pro Met Val Phe Ala Pro Lys Asn Phe755 760 765Leu Gly Val Pro Gln Ala Asp Ala Lys Ala Val Leu Ser Tyr Pro Ala770 775 780Thr Gln Asn Arg Gly Thr Glu Asn Asn Met Thr Val Phe Asp Gly Lys785 790 795 800Ser Val Arg Ala Val Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Val805 810 815Ala Pro Asp Gly Thr Pro Ser Pro His Thr Arg Asp Gln Phe Asp Leu820 825 830Tyr Asn Ser Phe Gly Ser Lys Arg Val Trp Phe Thr Ala Asp Glu Val835 840 845Arg Arg Asn Ala Thr Ser Glu Glu Thr Leu Arg Tyr Arg Arg850 855 860
權(quán)利要求
1.一種分離的青霉素G?；福涮卣髟谟?，它包含α亞基和β亞基，其中所述的α亞基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；所述的β亞基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的青霉素G?；?，其特征在于，所述的α亞基含有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列；且所述的β亞基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列編碼權(quán)利要求1所述青霉素G?；浮?br> 4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼含有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的α亞基和含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的β亞基。
5.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列含有SEQ IDNO1和SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.一種青霉素G酰化酶的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)青霉素G酰化酶的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出青霉素G酰化酶。
9.一種生產(chǎn)青霉素G的方法，其特征在于，它包括步驟(a)在酸性條件下，在反應(yīng)體系中，用青霉素G?；复呋嗝顾啬负?-APA與側(cè)鏈苯乙酸形成青霉素G，所述的青霉素G?；赴羴喕挺聛喕?，其中所述的α亞基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的β亞基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(b)從反應(yīng)體系中分離出青霉素G。
10.一種生產(chǎn)青霉素母核6-APA的方法，其特征在于，它包括步驟(a)在堿性條件下，在反應(yīng)體系中，用青霉素G?；复呋嗝顾谿分解形成母核6-APA與側(cè)鏈苯乙酸，所述的青霉素G?；赴羴喕挺聛喕渲兴龅摩羴喕蠸EQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的β亞基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(b)從反應(yīng)體系中分離出青霉素母核6-APA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型的青霉素G?；讣捌渚幋a序列。該青霉素G?；富蚪M成型表達(dá)，不必苯乙酸誘導(dǎo)，苯乙酸對(duì)該基因的表達(dá)有抑制作用；該青霉素G?；富虻谋磉_(dá)對(duì)低溫度的依賴也有所減弱，其最適的產(chǎn)酶溫度是28℃。本發(fā)明還提供了該青霉素G?；傅闹品ê陀猛?。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1464055SQ0211206
公開日2003年12月31日 申請(qǐng)日期2002年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月14日
發(fā)明者姜衛(wèi)紅, 趙國(guó)屏, 楊蘊(yùn)劉, 朱頌成 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所