專利名稱：用于pcr擴(kuò)增的修飾引物，其應(yīng)用及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及PCR擴(kuò)增；尤其是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及其商品化的工具。
背景技術(shù)：
PCR(Polymerase Chain Reaction)是聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的英文縮寫，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大飛躍，該技術(shù)1985年由美國PE公司遺傳部的Kary B Mullis教授發(fā)明。PCR技術(shù)首先應(yīng)用于人β-珠蛋白DNA擴(kuò)增及鐮刀狀紅細(xì)胞貧血癥的產(chǎn)前診斷。由于此項技術(shù)可將極微量的靶DNA特異地擴(kuò)增上百萬倍，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測到單分子或每10萬個細(xì)胞中僅含1個靶DNA分的樣品，因而，此技術(shù)在短短的幾年內(nèi)就廣泛的應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)等領(lǐng)域。
PCR技術(shù)實際上是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶(如Tag酶等)的酶促合成反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板DNA結(jié)合的特異性。反應(yīng)分三步①變性(denaturation)通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。②退火(annealling)當(dāng)溫度突然降低時由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜的多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補(bǔ)復(fù)性的機(jī)會較少。③延伸(extension)在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷之磷酸底物及Mg2+存在的條件下，聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)。以上3步為一個循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個循環(huán)的模板，數(shù)小時之后，介于兩個引物之間的特異性DNA片段得到了大量復(fù)制。決定PCR擴(kuò)增特異性的引物是由人工合成的一段寡核苷酸。在反應(yīng)的最初階段，原來的DNA起著起始模板的作用，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增，由引物介異延伸的片段急劇地增多而成為主要模板。因此，絕大多數(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物將受到所加引物5′末端的限制，最終擴(kuò)增產(chǎn)物是介于兩種引物5′端之間的DNA片段。對于擴(kuò)增產(chǎn)物的分析通常采用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小來判斷擴(kuò)增結(jié)果，也有其它分析擴(kuò)增結(jié)果的方法。有關(guān)PCR技術(shù)及其應(yīng)用可參閱以下文獻(xiàn)①《聚合酶鏈反應(yīng)》；(美)穆里斯(K B Mullis)等著，陳受宜等譯。北京科學(xué)出版社，1997；②丁振若、蘇明權(quán)主編《臨床PCR基因診斷技術(shù)》，世界圖書出版西安公司，1998。
但在目前的PCR方法中，從樣品的擴(kuò)增到PCR產(chǎn)物的分析檢測，每個樣品都必須分別獨(dú)立進(jìn)行。這種模式使得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測效率低、操作繁鎖。為此，在專利申請CN01126922.7中，用5′端帶有線性標(biāo)示序列的修飾引物實現(xiàn)了在同一檢測體系中對來自不同樣品或來源的不同靶序列進(jìn)行檢測。但是，在該方法中，為了避免游離引物造成的假陽性，不論用何種檢測方法，都必需通過復(fù)雜的擴(kuò)增產(chǎn)物分離純化過程去除游離引物。
本發(fā)明可以解決上述問題，從而為PCR檢測提供更快捷、更方便的方法和工具。

發(fā)明內(nèi)容
一.發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供一種用于PCR擴(kuò)增的修飾引物。
本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的試劑盒。
二.技術(shù)方案本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明提供了一種用于PCR擴(kuò)增的修飾引物，所述的修飾在于引物對中至少其一為基本引物的3′末端加有一段線性標(biāo)示序列，該線性標(biāo)示序列與模板形成錯配，但其中至少3′最末端2個連續(xù)堿基與模板互補(bǔ)。
本發(fā)明所述的“修飾引物”為3′末端加有含錯配的線性標(biāo)示序列的基本引物。所述的“基本引物”為根據(jù)模板DNA的序列按通用的引物設(shè)計原則所設(shè)計的引物(可參閱專著《聚合酶鏈反應(yīng)》；(美)穆里斯(K B Mullis)等著，陳受宜等譯。北京科學(xué)出版社，1997；)。基本引物還可以利用商業(yè)軟件或從Internet網(wǎng)上下載專用的軟件(如primer premier4.0)來設(shè)計。本發(fā)明的線性標(biāo)示序列是用來標(biāo)記不同樣品中不同目標(biāo)核酸片段的一段獨(dú)特的標(biāo)志性核苷酸序列。
迄今為止一直認(rèn)為，PCR引物3′端錯配是被禁止的，因為這種錯配被認(rèn)定會阻止引物延伸，從而導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。但是，本發(fā)明出人意料地發(fā)現(xiàn)，PCR的3′末端可以有條件地容許錯配，對PCR擴(kuò)增沒有影響，甚至不需要特殊的反應(yīng)條件?；谶@一發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明獲得了含有錯配線性標(biāo)示序列的本發(fā)明修飾引物。本發(fā)明線性標(biāo)示序列的長度與其中的錯配數(shù)取決于需要為多少不同來源不同序列的靶序列標(biāo)記，以及線性標(biāo)示序列所在完整的修飾引物的擴(kuò)增能力。通過4種脫氧核苷酸在給定長度內(nèi)的線性排列組合，所得的線性標(biāo)示序列完全可以滿足為大量不同片段的不同信息提供獨(dú)特標(biāo)志性序列所需，從而成為“核酸”的“核酸標(biāo)簽”。本發(fā)明的非限定性實施方式中，所述線性標(biāo)示序列包含4-8個堿基，與模板形成錯配，但其中至少3′最末端2個連續(xù)堿基與模板互補(bǔ)。在優(yōu)選實施方式中，錯配數(shù)不超過4個?；诒疚乃?，本領(lǐng)域技術(shù)人員按照本發(fā)明的構(gòu)思，采用常規(guī)試驗方法，通過例如試差法，不難將線性標(biāo)示序列進(jìn)一步延長，由此獲得與本發(fā)明差別僅在于長度而實際上等效的修飾引物。因此，這樣的改換理應(yīng)包含在本本發(fā)明還提供了一種基于本發(fā)明修飾引物的檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。該方法包括1)設(shè)計并制備m′×n對本發(fā)明修飾引物，其中m′為擴(kuò)增m段不同靶序列所需的引物對數(shù)量，n為樣品份數(shù)；各線性標(biāo)示序列彼此不同，且不相互雜交；2)用所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)或選的分離去除游離引物；4)混合擴(kuò)增產(chǎn)物再變性或先變性再混合擴(kuò)增產(chǎn)物；5)檢測線性標(biāo)示序列。
在本發(fā)明方法的實施中，線性標(biāo)示序列的設(shè)計取決于不同的靶序列數(shù)量m及其同源性，不同樣品或來源數(shù)量n，修飾引物距離靶序列差異位點(diǎn)的距離，和采用的檢測方法等因素。
如果檢測對象為來自n份樣品的m種不同靶序列片段，引物對中至少其一含有線性標(biāo)示序列，實施方式之一采用完全基于線性標(biāo)示序列本身的檢測方法，可以依據(jù)錯配排除模板引起的假陽性，但是不能排除游離引物引起的假陽性，因此必需在變性前分離去除游離引物。另一實施方式中采用基于線性標(biāo)示序列及其相鄰模板序列的檢測，這可以排除游離引物造成的假陽性，因而無需從擴(kuò)增產(chǎn)物混合物中分離去除游離引物的操作。
如果靶序列的同源性很高，以至于可用通用引物進(jìn)行不同靶序列的擴(kuò)增，此時，可將修飾引物設(shè)計成其中線性標(biāo)示序列的3′端靠近差異位點(diǎn)或與之相鄰，并用基于線性標(biāo)示序列及其相鄰模板序列的方法進(jìn)行檢測。此時，因為與線性標(biāo)示序列相鄰的模板序列包含差異位點(diǎn)而彼此不同，標(biāo)記信息中表征靶序列差異的信息m可以由模板上的相鄰序列本身提供，而線性標(biāo)示序列只需提供區(qū)分來源的信息n。因此，可以允許原先基于不同序列不同引物的m因通用引物而簡并為m′，m′顯然小于m，線性標(biāo)示序列的個數(shù)隨之減少至m′×n。
本發(fā)明方法中的PCR擴(kuò)增，或選的分離，和變性，均可完全按照常規(guī)方法進(jìn)行。在如本發(fā)明所述對于多樣品或多來源多目標(biāo)分析時，各份樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物可以先混合，然后一起變性，也可以先各自變性，然后再混合。
采用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治鰯U(kuò)增產(chǎn)物的線性標(biāo)示序列，就可以將各樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物混合后，在同一檢測系統(tǒng)中測知各個樣品中各種目標(biāo)核酸片段的存在情況。可用的分析方法有例如質(zhì)譜法(參見O’Donnell M.J.，Tang K，等，AnalyticalChemistry，1997，692438-2443)，SPR(參見Threil A.J.等，Analytical Chemistry，1997，694948-4956)以及固相雜交法。
本發(fā)明優(yōu)選實施方式中，所述“基于……序列的檢測”是固相雜交法，包括以下步驟制備識別探針，并有序固定在固相支持物上形成陣列；標(biāo)記所述擴(kuò)增產(chǎn)物；所述擴(kuò)增產(chǎn)物與識別探針固相雜交；檢測所述標(biāo)記的位置和/或強(qiáng)度。
所述識別探針至少包含與線性標(biāo)示序列或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的序列。本發(fā)明優(yōu)選實施方式中，所述識別探針由兩部分組成，第一部分含與線性標(biāo)示序列或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的序列，第二部分含與所述相鄰模板序列或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的序列，只有當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物包含作為模板的某特定靶序列時，才會通過同時與探針第一和第二部分互補(bǔ)而發(fā)生有效雜交，產(chǎn)生雜交信號。所述探針能夠基于錯配排除模板造成的假陽性。為了反映線性標(biāo)示序列所標(biāo)記的m×n個信息，探針序列的數(shù)量為m×n，并被固定在固相支持物的不同的位置。一優(yōu)選實施方式中，當(dāng)靶序列同源性很高時，所述識別探針的所述第二部分包含差異位點(diǎn)，且令其位于探針的近中心。
為了簡化過程，實現(xiàn)在統(tǒng)一的雜交系統(tǒng)中完成來自多份樣品的多種核酸擴(kuò)增產(chǎn)物與各自識別探針的固相雜交，同時提高檢測的準(zhǔn)確性，不同識別探針與其互補(bǔ)序列形成的雜交體在方法選定的雜交條件下應(yīng)具有相同或相近的解鏈溫度。
本發(fā)明還提供了一種用于實施本發(fā)明方法的試劑盒，其中包括分裝于容器內(nèi)的本發(fā)明修飾引物；固定于固相支持物上的識別探針列陣，所述的識別探針含有與線性標(biāo)示序列或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的序列?；蛘?，所述識別探針由兩部分組成，一部分含與線性標(biāo)示序列或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的序列，另一部分含與所述相鄰模板序列或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的序列。
為了進(jìn)行本發(fā)明的分析，可用本領(lǐng)域已知的各種標(biāo)記技術(shù)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記?？梢栽诒景l(fā)明所述引物的5′端連接標(biāo)記基團(tuán)，所述標(biāo)記基團(tuán)包括但不限于地高辛分子(DIG)，生物素分子(Bio)，熒光基團(tuán)(如Cy3 Cy5等)，堿性磷酸酶(AP)，辣根過氧化物酶(HRP)。這些標(biāo)記及其標(biāo)記方法都已是本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)技術(shù)。也可以在目標(biāo)核酸的擴(kuò)增過程中標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物。例如可以采用引物標(biāo)記法，也可以采用摻入法等，可參閱文獻(xiàn)(王申五主編《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊》一書)。所述的標(biāo)記包括但不限于同位素標(biāo)記，以及熒光物質(zhì)(如Cy3，Cy5，熒光素等)、地高辛、生物素、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶等非放射性物質(zhì)標(biāo)記。
將分離出來的含線性標(biāo)示序列的擴(kuò)增產(chǎn)物混合物加至一定體積的預(yù)雜交緩沖液中，作為固相雜交緩沖液。固相雜交時，可先將識別探針組成的陣列與預(yù)雜交緩沖液在一定溫度下進(jìn)行一定時間的預(yù)雜交，當(dāng)然也可以根據(jù)情況不預(yù)雜交；然后在一定溫度下與固相雜交緩沖液進(jìn)行一次一定時間的固相雜交操作。然后，根據(jù)標(biāo)記信號在固相支持物上的位置、強(qiáng)度等信息獲取多份被測樣品中的多種目標(biāo)核酸片段有關(guān)序列、含量、來源等信息。
本發(fā)明所用的固相雜交操作都是本領(lǐng)域的經(jīng)典方法，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員依據(jù)經(jīng)驗很容易確定有關(guān)緩沖液、探針和樣品濃度、預(yù)雜交溫度、雜交溫度以及時間等的最適條件。或者，也可參照，王申五主編《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊》一書。
三.發(fā)明效果本發(fā)明用3′端含有一段線性標(biāo)示序列的修飾引物代替常規(guī)的基本擴(kuò)增引物來區(qū)別標(biāo)記待測的各種目標(biāo)核酸片段。這樣，通過一次PCR擴(kuò)增和一次固相雜交，使用一種檢測標(biāo)記，就可以實現(xiàn)一次性檢測多樣品中的多目標(biāo)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物，同時獲取核酸片段序列、來源、多態(tài)性和含量等多方面信息。此外，本發(fā)明的試劑盒極大地方便了方法的使用者。本發(fā)明方法還可以省略為避免假陽性而進(jìn)行的游離引物分離操作。因此，本發(fā)明推動PCR擴(kuò)增方法在多樣品多目標(biāo)核酸分析中的應(yīng)用，適合PCR在線實時分析，及其自動化。本發(fā)明方法，尤其適合生物芯片的開發(fā)與應(yīng)用。


圖1是實施例一的檢測結(jié)果。
圖2是實施例二的檢測結(jié)果。
圖3是實施例三的檢測結(jié)果。
具體實施例方式
以下實施例是對本發(fā)明更詳細(xì)的說明，但不是對本發(fā)明范圍的限定。
＿＿材料購自dNTP(N＝A，T，C，G) 上海生工生物工程公司Tag酶(包括10×buffer) 上海生工生物工程公司MgCl2(25mM) 上海生工生物工程公司DIG核酸檢測試劑盒(包括抗DIG-AP復(fù)合物，封閉劑，NBT/BCIP) Roche Inc尼龍膜Roche Inc417芯片點(diǎn)樣儀 Affymetrix公司生產(chǎn)自配20×SSC 88.2g/L檸檬酸鈉，175.3g/L NaCl，pH7.0(20℃)洗液I 0.1×SSC，0.1％SDS洗液II0.1M順丁烯二酸，1M NaCl，pH7.5(20℃)洗液III 100mM Tris-HCl，100mM NaCl，50mMMgCl2，pH9.5(20℃)實施例一三個樣品中兩種靶序列的擴(kuò)增分析本實施例的檢測對象為來自三種樣品的靶序列a和靶序列b。
靶序列aTATGCCTCATGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTAT ATGATGTGGTAAAGGGGGCCTTGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGG靶序列bTATGCCTCATGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCAT
TTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTAT ATGATGTGGTAAAGGGGGCCTTGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGG靶序列a與靶序列b的差異位點(diǎn)用方框表示，序列中下劃線部分為引物設(shè)計區(qū)，其中反向引物(Reverse primer，PR)靠近差異位點(diǎn)。上述靶序列由上海生工生物工程有限公司合成至5OD，PAGE純化。將合成好的靶序列加水溶解，使成50ng/ul的儲備液。
方法1.引物的設(shè)計與制備按照常規(guī)方法設(shè)計并合成引物，所不同的是反向引物PR的3′端增加一段6mer線性標(biāo)示序列。在本實施例中，靶序列數(shù)m＝2，樣品數(shù)n＝2，但是由于修飾引物靠近差異位點(diǎn)，且后文所采用的是基于線性標(biāo)示序列及其序列擴(kuò)增所得序列的固相雜交，線性標(biāo)示序列只需要標(biāo)記3種不同的來源樣品。而且，由于引物序列不覆蓋差異位點(diǎn)，本發(fā)明增加線性標(biāo)示序列前的基本引物可簡并為共同的一對通用基本引物，所以m′為1，線性標(biāo)示序列數(shù)即為m′×n得3。以下所示其中，X表示地高辛(DIG)標(biāo)記，序列中帶下劃線的是線性標(biāo)示序列樣品1的引物對PR15′XCAGACAAGGCCCCCTTTACCACAAAGTC 3′，PF 5′CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC 3′樣品2的引物對PR25′XCAGACAAGGCCCCCTTTACCACGTGATC3′，PF 5′CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC 3′樣品3的引物對PR35′XCAGACAAGGCCCCCTTTACCACAGCTTC3′PF 5′CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC 3′上述引物由上海生工生物工程有限公司合成，至5OD，PAGE純化。將合成好的引物加水溶解，使成10pmol/ul儲備液。
2.識別探針的設(shè)計和制備基于線性標(biāo)示序列和與之相鄰的模板設(shè)計探針序列，并使差異位點(diǎn)位于探針的近中心。以下所示識別探針序列中，X表示5′氨基十六聚脫氧胸苷酸，帶下劃線的是與線性標(biāo)示序列互補(bǔ)的序列，斜體小寫部分是靶序列a和靶序列b的差異位點(diǎn)
識別探針1a5′XTTTCAGTTATatgGACTTTGTG 3′識別探針1b5′XCTTTCAGTTATtaaGACTTTGTG 3′識別探針2a5′XTTCAGTTATatgGATCACGTG 3′識別探針2b5′XTTTCAGTTATtaaGATCACGTG 3′識別探針3a5′XTCAGTTATatgGAAGCTGTG 3′識別探針3b5′XTTCAGTTATtaaGAAGCTGTG 3′上述探針由上海生工生物工程有限公司合成至5OD，PAGE純化。
3.模板樣品的配制按下表配制樣品1、樣品2和樣品3靶序列a溶液靶序列b溶液水(50ng/ul) (50ng/ul)樣品1 2ul2ul6ul樣品2 2ul0ul8ul樣品3 0ul2ul8ul4.PCR擴(kuò)增分別配制3份樣品的的PCR反應(yīng)系3份樣品各自的PR1μl(10pmol/μl)PF 1μl(10pmol/μl)dNTP(dATP，dCTP，dGTP，3/5dUTP+2/5dTTP)2.5μl(各2.5mM)10X緩沖液(100mMTris-HCl，500mMKCl) 2.5μlMg2+2.5μl(25mM)Taq酶 0.7μl(5U/μl)水 11.8μl模板樣品溶液 3μl總體積 25μl然后將三管放入PCR儀中，按下列條件擴(kuò)增94℃，5min；然后(94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，30sec)×35輪，最后72℃，5min。擴(kuò)增產(chǎn)物然后在98℃熱變性5分鐘，取出后迅速放入冰盒，-20℃放置。
5.識別探針的點(diǎn)樣將識別探針溶于100ul純水中，取該探針溶液3ul，8×SSC緩沖液24ul，純水21ul，制成點(diǎn)樣液。用基因芯片點(diǎn)樣儀按設(shè)定陣列模式點(diǎn)在醛基修飾的載玻片上，75％相對濕度固定16小時，70烘干。
6.固相雜交將載玻片在沸水中煮15秒，分別取樣品1、樣品2和樣品3變性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μl加入含15μl的8×SSC緩沖液的離心管中，振蕩混勻，吸取20μl，滴加到載玻片的點(diǎn)樣區(qū)，小心蓋上蓋玻片，置濕盒中42℃保溫60分鐘。取出載玻片，置42℃預(yù)熱的洗液I中，42℃洗3次。
7.顯色將載玻片浸入洗液II中室溫放置2分鐘，取出吹干，然后在雜交區(qū)滴加100μl含抗DIG-AP復(fù)合物溶液，室溫放置20分鐘，再用洗液II室溫洗兩次，洗液III平衡2分鐘，取出載玻片。將一塊大小適中的尼龍膜浸透顯色液小心蓋在載玻片的點(diǎn)樣區(qū)上(注意勿產(chǎn)生氣泡)。暗處放置1小時。
8.結(jié)果將顯色完的尼龍膜小心用水沖洗一下，42℃烘干，然后用平板掃描儀掃描顯色圖象，結(jié)果如附圖1。其中，第一排前3個點(diǎn)為識別探針1a，用于檢測樣品1中的靶序列a(差異位點(diǎn)為ATG)，第一排后3個點(diǎn)為識別探針1b，用于檢測樣品1中的靶序列b(差異位點(diǎn)為TAA)。此排6個點(diǎn)均為雜交陽性，說明樣品1同時含有靶序列a和靶序列b。第二排前3個點(diǎn)為識別探針2a，用于檢測樣品2中的靶序列a，第二排后3個點(diǎn)為識別探針2b，用于檢測樣品2中的靶序列b。此排前3個點(diǎn)為雜交陽性，后3個點(diǎn)雜交陰性，說明樣品2只含有靶序列a。第三排前3個點(diǎn)為識別探針3a，用于檢測樣品3中的靶序列a，第三排后3個點(diǎn)為識別探針3b，用于檢測樣品3中的靶序列b。此排后3個點(diǎn)為雜交陽性，前3個點(diǎn)雜交陰性，說明樣品2只含有靶序列b。以上試驗結(jié)果與實際情況完全吻合。
實施例二三個樣品中同一種靶序列的擴(kuò)增分析本發(fā)明的檢測對象為來自三種樣品的pGEM4Z質(zhì)粒(購自上海生工生物工程公司)。在本實施例中，前文所述的樣品份數(shù)n等于3，靶序列數(shù)m等于1。
1.樣品的配制取pGEM 4Z(1μg/μl)質(zhì)粒5μl置0.2ml微量離心管中，依次加入BamH I內(nèi)切酶的10×緩沖液5μl，乙?；疊SA5μl，H2O 34μl和BamH I內(nèi)切酶1μl混勻，37℃保溫2.5小時；然后在酶切產(chǎn)物中加5μl NaAc溶液(3mol/L，pH5.2)混勻，加入-20℃乙醇110μl混勻，-20℃放置1小時。12000g離心5min，棄去上清，晾干，加入H2O 100μl，得線性pGEM 4Z溶液。本實施例以此線性化的pGEM 4Z質(zhì)粒作為有待檢測的靶序列。
取三支微量離心管分別記為樣品1，樣品2和樣品3。其中的組成分別為樣品號 組成樣品1 1μl線性pGEM 4Z溶液+9μlH2O樣品2 10μlH2O樣品3 0.5μl線性pGEM4Z溶液+9.5μlH2O2.引物的設(shè)計和制備以前文所述線性化pGEM 4Z質(zhì)粒為模板，按照常規(guī)設(shè)計基本正反擴(kuò)增引物對(P1和P2)。然后，如本發(fā)明前文所述，為每份樣品中的靶序列設(shè)計獨(dú)特的4mer線性標(biāo)示序列，共m×n即3段。將該線性標(biāo)示序列加到基本引物之一P1的3′端，構(gòu)成本發(fā)明的修飾擴(kuò)增引物對。其中，X表示地高辛(DIG)標(biāo)記，下標(biāo)表示不同樣品，序列中帶下劃線的是線性標(biāo)示序列引物1(P1)P115′Xagt tgc tct tgc ccg gcg tcaaaa c3′P125′Xagt tgc tct tgc ccg gcg tcatta c3′P135′Xagt tgc tct tgc ccg gcg tcataa c3′共同的引物2(P2)P2 5’gat gct gaa gat cag ttg ggt gc 3’將以上設(shè)計的引物用DNA合成儀分別合成至1OD，PAGE純化。向每種引物中加入適量水，使引物濃度為10pmol/ul。
3.識別探針的設(shè)計和制備基于線性標(biāo)示序列及與之相鄰的模板序列設(shè)計可與之雜交的識別探針如下。序列中X表示5`氨基十六聚脫氧胸苷酸，帶下劃線的是與線性標(biāo)示序列互補(bǔ)的序列。
T1 5′Xtta tcc cgt ttt gac gcc ggg 3’T2 5′Xtta tcc cgt aat gac gcc ggg 3’T3 5′Xtta tcc cgt tat gac gcc ggg 3’將設(shè)計好的識別探針分別用DNA合成儀合成5OD，PAGE純化。
4.靶序列的擴(kuò)增，識別探針的點(diǎn)樣，固相雜交，顯色等步驟同實施例一。
5.結(jié)果如附圖2所示，其中，第一排為識別探針T1，用于檢測樣品1中的靶序列。此排雜交陽性，說明樣品1的靶序列擴(kuò)增呈陽性。第二排為識別探針T2，用于檢測樣品2中的靶序列。此排雜交陰性，說明樣品2中靶序列未擴(kuò)增。第三排為識別探針T3，用于檢測樣品3中的靶序列。此排雜交陽性，說明樣品3中靶序列擴(kuò)增呈陽性。以上試驗結(jié)果與實際情況完全吻合。
實施例三十份樣品中三種靶序列的擴(kuò)增分析本實施例中的檢測對象為來自10份樣的3種靶序列，即，靶片段數(shù)量m等于3，樣品份數(shù)n等于10。
本發(fā)明的靶序列為靶序列aTATGCCTCATGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTAT ATGATGTGGTAAAGGGGGCCTTGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGG靶序列bTATGCCTCATGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTAT ATGATGTGGTAAAGGGGGCCTTGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGG靶序列cTATGCCTCATGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTAT ATGATGTGGTAAAGGGGGCCTTGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGG
靶序列a，b，c之間的差異位點(diǎn)用方框表示，序列中下劃線部分為引物設(shè)計區(qū)，其中反向引物(Reverse primer，PR)靠近差異位點(diǎn)。
1.引物的設(shè)計和制備以前文所述靶序列為模板，按照常規(guī)設(shè)計基本擴(kuò)增引物對。然后，如本發(fā)明前文所述，為每份樣品中的目標(biāo)核酸片段設(shè)計獨(dú)特的8mer線性標(biāo)示序列。與實施例1的情形相同，由于引物序列不覆蓋差異位點(diǎn)，本發(fā)明增加線性標(biāo)示序列前的基本引物可簡并為共同的一對通用基本引物，所以m′為1，線性標(biāo)示序列數(shù)為m′×n即10。將線性標(biāo)示序列加到基本引物之一反向引物PR的3′端，構(gòu)成本發(fā)明的修飾擴(kuò)增引物對。其中，X表示地高辛(DIG)標(biāo)記，序列中帶下劃線的是線性標(biāo)示序列樣品1的引物對PR15｀ XCAGACAAGGCCCCCTTTACCAAACGATC3｀，PF 5｀ CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC 3｀樣品2的引物對PR25｀ XCAGACAAGGCCCCCTTTACCTCAAAGTC3｀，PF 5｀ CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC 3｀樣品3的引物對PR35｀ XCAGACAAGGCCCCCTTTACCTTGTGATC3｀PF 5｀ CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC 3｀樣品4的引物對PR45｀ XCAGACAAGGCCCCCTTTACCAAAGCTTC3｀，PF 5｀ CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC 3｀樣品5的引物對PR55｀ XCAGACAAGGCCCCCTTTACCAGATTGTC3｀，PF 5｀ CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC 3｀樣品6的引物對PR65｀ XCAGACAAGGCCCCCTTTACCACTGAATC3｀PF 5｀ CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC 3`樣品7的引物對PR75｀ XCAGACAAGGCCCCCTTTACCATATGCTC3｀，PF 5｀ CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC 3｀樣品8的引物對PR85｀ XCAGACAAGGCCCCCTTTACCTGAAGATC3｀，PF 5｀ CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC 3｀
樣品9的引物對PR95｀ XCAGACAAGGCCCCCTTTACCAGTACATC3｀PF 5｀ CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC 3｀樣品10的引物對PR105｀ XCAGACAAGGCCCCCTTTACCAGGTAATC3｀，PF 5｀ CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC 3｀上述引物由上海生工生物工程有限公司合成至5OD，PAGE純化。將合成好的引物加水溶解，使成10pmol/ul。
2.識別探針的設(shè)計和制備基于線性標(biāo)示序列和與之相鄰的模板設(shè)計探針序列，并使差異位點(diǎn)位于探針的近中心。序列中X表示5｀氨基十六聚脫氧胸苷酸，帶下劃線的是與線性標(biāo)示序列互補(bǔ)的序列探針-1-a XTCAGTTATATGGATCGTTTG探針-1-b XTTCAGTTATTAAGATCGTTTG探針-1-c XTCAGTTATCTCGATCGTTT探針-2-a XTTCAGTTATATGGACTTTGAG探針-2-b XTTTCAGTTATTAAGACTTTGAG探針-2-c XTTCAGTTATCTCGACTTTGA探針-3-a XTTCAGTTATATGGATCACAAG探針-3-b XTTTCAGTTATTAAGATCACAAG探針-3-c XTTCAGTTATCTCGATCACAA探針-4-a XTCAGTTATATGGAAGCTTTG探針-4-b XTTCAGTTATTAAGAAGCTTTG探針-4-c XTCAGTTATCTCGAAGCTTT探針-5-a XTTCAGTTATATGGACAATCTG探針-5-b XTTTCAGTTATTAAGACAATCTG探針-5-c XTTCAGTTATCTCGACAATCT探針-6-a XTTCAGTTATATGGATTCAGTG探針-6-b XTTTCAGTTATTAAGATTCAGTG探針-6-c XTTCAGTTATCTCGATTCAGT探針-7-a XTTCAGTTATATGGAGCATATG探針-7-b XTTTCAGTTATTAAGAGCATATG
探針-7-c XTTCAGTTATCTCGAGCATAT探針-8-a XTTCAGTTATATGGATCTTCAG探針-8-b XTTTCAGTTATTAAGATCTTCAG探針-8-c XTTCAGTTATCTCGATCTTCA探針-9-a XTTTCAGTTATATGGATGTACTG探針-9-b XCTTTCAGTTATTAAGATGTACTG探針-9-c XTTTCAGTTATCTCGATGTACT探針-10-a XTTCAGTTATATGGATTACCTG探針-10-b XTTTCAGTTATTAAGATTACCTG探針-10-c XTTCAGTTATCTCGATTACCT上述探針由上海生工生物工程有限公司合成至5OD，PAGE純化。
3.樣品制備按下表制備樣品1到樣品10靶序列a溶液 靶序列b溶液 靶序列c溶液 水(50ng/ul)(50ng/ul)(50ng/ul)樣品1 0ul 0ul 0ul 10ul樣品2 2ul 0ul 0ul 8ul樣品3 0ul 2ul 0ul 8ul樣品4 0ul 0ul 2ul 8ul樣品5 2ul 0ul 0ul 8ul樣品6 0ul 2ul 0ul 8ul樣品7 0ul 0ul 2ul 8ul樣品8 2ul 0ul 0ul 8ul樣品9 0ul 2ul 0ul 8ul樣品100ul 0ul 0ul 10ul4.靶序列的擴(kuò)增，識別探針的點(diǎn)樣，固相雜交，顯色等步驟同實施例一。
5.結(jié)果如附圖3所示，左起1-3列為探針-(1至10)-a，用于檢測個樣品中的靶序列a，第4-6列為探針-(1至10)-b，用于檢測個樣品中的靶序列b，第7-9列為探針-(1至10)-c，用于檢測個樣品中的靶序列c；行數(shù)對應(yīng)于個樣品編號。如圖所示，檢測結(jié)果與實際情況完全吻合。
權(quán)利要求
1.一種用于PCR擴(kuò)增的修飾引物，所述的修飾在于引物對中至少其一為基本引物的3′末端加有一段線性標(biāo)示序列，該線性標(biāo)示序列與模板形成錯配，但其中至少3′最末端2個連續(xù)堿基與模板互補(bǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾引物，所述線性標(biāo)示序列由4-8個堿基組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的修飾引物，所述線性標(biāo)示序列與模板的錯配數(shù)不超過4。
4.一種檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，該方法包括1)設(shè)計并制備m′×n對權(quán)利要求1所述的修飾引物，其中m′為擴(kuò)增m段不同靶序列所需的引物對數(shù)量，n為樣品份數(shù)；各線性標(biāo)示序列彼此不同，且不相互雜交；2)用所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)分離去除游離引物；4)混合擴(kuò)增產(chǎn)物再變性或先變性再混合擴(kuò)增產(chǎn)物；5)檢測線性標(biāo)示序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述檢測線性標(biāo)示序列的方法為基于線性標(biāo)示序列的固相雜交，另外還包括制備識別探針，并有序固定在固相支持物上形成陣列；標(biāo)記所述擴(kuò)增產(chǎn)物；所述擴(kuò)增產(chǎn)物與識別探針固相雜交；檢測所述標(biāo)記的位置和/或強(qiáng)度；所述識別探針包含與線性標(biāo)示序列或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的序列。
6.一種檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，該方法包括1)設(shè)計并制備m′×n對權(quán)利要求1所述的修飾引物，其中m′為擴(kuò)增m段不同靶序列所需的引物對數(shù)量，n為樣品份數(shù)；各線性標(biāo)示序列彼此不同，且不相互雜交；2)用所述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)混合擴(kuò)增產(chǎn)物再變性或先變性再混合擴(kuò)增產(chǎn)物；4)檢測線性標(biāo)示序列；所述檢測線性標(biāo)示序列的方法為基于線性標(biāo)示序列及相鄰模板序列的固相雜交，另外還包括制備識別探針，并有序固定在固相支持物上形成陣列；標(biāo)記所述擴(kuò)增產(chǎn)物；所述擴(kuò)增產(chǎn)物與識別探針固相雜交；檢測所述標(biāo)記的位置和/或強(qiáng)度；所述識別探針由兩部分組成，第一部分含與線性標(biāo)示序列或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的序列，第二部分含與所述相鄰模板序列或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述修飾引物對中至少其一的含線性標(biāo)示序列3′末端靠近不同靶序列的差異位點(diǎn)，其中的m′小于m。
8.一種試劑盒，其中包括分裝于容器內(nèi)的權(quán)利要求1所述的修飾引物；固定于固相支持物上的識別探針列陣，所述的識別探針為權(quán)利要求5或6中所述的識別探針。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于PCR擴(kuò)增的修飾引物，引物對至少其一在基本引物的3′末端增加了一段獨(dú)特線性標(biāo)示序列。本發(fā)明還提供了一種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法，該方法包括設(shè)計并制備m′×n對本發(fā)明修飾引物，m′為擴(kuò)增m段不同靶序列所需的引物對數(shù)量，n為樣品份數(shù)；然后，可在同一檢測系統(tǒng)中根據(jù)線性標(biāo)示序列檢測不同樣品中的不同擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明還提供了用于實施以上方法的試劑盒。
文檔編號C12P19/34GK1572880SQ02112359
公開日2005年2月2日 申請日期2002年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月3日
發(fā)明者邢軍芬 申請人:上海百傲科技有限公司