專利名稱：人生長(zhǎng)分化因子7、其編碼序列、制法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及一種新的人生長(zhǎng)分化因子(hGDF7)的cDNA序列，該蛋白是hGDF7的變異剪切體。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
TGF-β是該超家族中的代表者，對(duì)其的研究開展得十分廣泛和深入。對(duì)其功能的研究表明，TGF-β受傷組織修復(fù)的有力的內(nèi)源中介體，它通過在受傷組織中對(duì)趨化性、血管生成和胞外基質(zhì)(ECM)沉積的刺激作用而發(fā)揮功能(Clin lmmunol Immunopathol，1997，83(1)，25-30)。TGF-β還對(duì)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化有調(diào)節(jié)作用(Bioessays，1997，19(7)，581-591)，這種調(diào)節(jié)既可以是正調(diào)節(jié)，也可以是負(fù)調(diào)節(jié)?，F(xiàn)有的大多數(shù)證據(jù)顯示TGF-β是在細(xì)胞周期的G1期發(fā)揮其調(diào)控作用的。除此之外，還有報(bào)導(dǎo)稱TGF-β可以誘導(dǎo)某些敏感細(xì)胞的死亡，這些細(xì)胞包括肝癌細(xì)胞、髓系和骨系細(xì)胞等。體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，TGF-β對(duì)多種細(xì)胞株的分化有調(diào)控作用，雖然對(duì)其作用機(jī)理還不清楚。TGF-β對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)分化的調(diào)控作用很自然使人聯(lián)想到它在化療中的防護(hù)作用以及在腫瘤治療中可能的應(yīng)用，有關(guān)這些方面的報(bào)導(dǎo)已有相當(dāng)數(shù)量(Clin Immunol Immunopathol，1997，83(1)，25-30；Bioessays，1997，19(7)，581-591)。
在多種物種中(如非洲爪蛙、雞、鼠、豬、牛等)中都已發(fā)現(xiàn)了TGF-β家族成員。人的TGF-β(-1，-2，-3)都是在80年代后期被克隆的。其中，TGF-β1是由Derynck R等于1985年完成測(cè)序(Nature，1985，316(6030)，701-705)，通過對(duì)TGF-β1的編碼序列的分析，他們發(fā)現(xiàn)具有功能的TGF-β其實(shí)是由一個(gè)比成熟蛋白長(zhǎng)得多的前體經(jīng)剪切加工而成。這一特性后來被發(fā)現(xiàn)是TGF-β超家族的一個(gè)共性。TGF-β2和TGF-β3的核酸序列則是MadisenL等和ten Dijke P等人于1988年測(cè)得(Proc Natl Acad SciU S A，1988，85(13)，4715-4719；DNA，1988，7(1)，1-8)。通過同源比較發(fā)現(xiàn)，TGF-β2和TGF-β3與TGF-β1的氨基酸的同源度達(dá)到了70％-80％。
90年代以來，隨著基因克隆和測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展完善，越來越多TGF-β超家族成員被克隆。TGF-β超家族還有若干亞家族，GDF5，6，7亞家族就是其中之一。Storm EE等人報(bào)道了該亞家族中最初三個(gè)成員的從小鼠中被分離的結(jié)果(Nature 1994 Apr14；368(6472)639-43)。該亞家族成員在軟骨和關(guān)節(jié)中表達(dá)量高，可能與這類組織的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。2001年，Watakabe A等人用Northern印跡和定量PCR的方法發(fā)現(xiàn)GDF-7表達(dá)量在非洲綠猴的大腦主運(yùn)動(dòng)區(qū)中比在皮層中其它區(qū)域高十倍，在成熟和新生恒河猴相似部位也有類似的表達(dá)量分別，從而認(rèn)為，GDF7在靈長(zhǎng)類動(dòng)物新大腦皮層的主運(yùn)動(dòng)區(qū)發(fā)揮重要作用(J Neurochem，2001，77(5)1422)。
但在本發(fā)明之前，還沒有人分離出或公開過本發(fā)明所述的的人生長(zhǎng)分化因子7。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種蛋白，該蛋白被命名為人生長(zhǎng)分化因子7(hGDF7)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的人hGDF7蛋白的方法。
本發(fā)明還提供了這種人hGDF7核酸序列和蛋白的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人hGDF7蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸177-1529位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ IDNO.1中從核苷酸177-1529位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.1中從核苷酸177-1529位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的hGDF7蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有hGDF7蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有hGDF7蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hGDF7蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸177-1529位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hGDF7蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)hGDF7蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hGDF7蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長(zhǎng)為1594個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于177-1529位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“hGDF7蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有HGDF7蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中177-1529位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框177-1529位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ IDNO.1中177-1529位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.2所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸177-1529位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。此外，該術(shù)語還包括與SEQ IDNO.1中從核苷酸177-1529位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人HGDF7相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“hGDF7蛋白多肽”指具有hGDF7蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人hGDF7相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括hGDF7蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與hGDF7 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗hGDF7多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含hGDF7多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了hGDF7多肽的可溶性片段。通常，該片段具有hGDF7多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供hGDF7蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然hGDF7多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或個(gè)成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括hGDF7多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)hGDF7的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種探針分子，該分子通常具有hGDF7多肽編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼hGDF7的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測(cè)hGDF7核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于hGDF7多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為20-50個(gè)核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)hGDF7 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于hGDF7基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與hGDF7基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制hGDF7蛋白的分子，也包括那些并不影響hGDF7蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的hGDF7基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的hGDF7基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)hGDF7或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immuno1.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷hGDF7功能的抗體以及不影響hGDF7功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用hGDF7基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與hGDF7基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動(dòng)物而獲得。
在本發(fā)明中，人hGDF7的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人睪丸λgt10cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用A1A2和B1B2兩對(duì)寡核苷酸為引物A1-TTC AAA AGGCGC CGG GGG ACT TC和B1-ACG AAT CGG CAG CCG AAA CAG GC為正向引物；A2CCACCACCTCGTCTGCGTCGTTA和B2TCG CGC TAC CTG CAG CCG CAG為反向引物，進(jìn)行PCR。PCR條件為93℃ 4分鐘，隨之以93℃ 1分鐘、64℃ 1分鐘和72℃ 1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)得到的PCR片斷，大小分別為約五百五和一千個(gè)堿基對(duì)的目的片段。然后用限制性酶AflIII對(duì)兩者進(jìn)行酶切、連接，得到目的cDNA序列及雜帶，雜帶可用電泳等方法去除，從而得到濃度較高的目的cDNA序列。
本發(fā)明的hGDF7蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST軟件進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它具有TGFβ氨基端結(jié)構(gòu)域和TGFβ家族成員的典型特征序列。hGDF7與其他物種中的hGDF7也有較高的同源度，如與Cercopithecus aethiops和Macaca fascicularis中的hGDF7同源度分別為66％和65％。這說明本發(fā)明的hGDF7具有TGFb家族成員共性，如對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有調(diào)控作用，對(duì)組織生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用乃至對(duì)機(jī)體的生理活動(dòng)具有協(xié)調(diào)作用。
將本發(fā)明的hGDF7核酸、其反義鏈及片段制成探針，可檢測(cè)hGDF7基因異常；將hGDF7蛋白序列制成試劑盒或藥物，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，促進(jìn)燙傷燒傷、組織切除乃至器官摘除后的傷口愈合。將本發(fā)明的hGDF7核酸反義鏈或hGDF7抗體制成試劑盒可用于減輕或輔助治療由于hGDF7表達(dá)量過高而導(dǎo)致的疾病，也可輔助臨床上腫瘤和癌癥的診斷，預(yù)防及治療。此外，本發(fā)明hGDF7還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白，例如可將本發(fā)明hGDF7的N端與鼠GDF7的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。針對(duì)本發(fā)明hGDF7的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
2.PCR產(chǎn)物的測(cè)序?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-TTM載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprepPlasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對(duì)插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對(duì)缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測(cè)序試劑盒(Epicentre Technologies)對(duì)依次截短的缺失子進(jìn)行測(cè)序，最后獲得全長(zhǎng)cDNA序列，共1594bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于177-1529位核苷酸。
根據(jù)得到的全長(zhǎng)cDNA序列推導(dǎo)出hGDF7的氨基酸序列，共450個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.2。
實(shí)施例2hGDF7在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，將編碼hGDF7的cDNA序列，用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得hGDF7 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5’-CACGGTCGACATGG ACCTGAGCGCCGCCG，該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的hGDF7的部分編碼序列；3’端引物序列為5’-CCTCAAGCTTCCTGCAGCCGCAGGCCTCC，該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和hGDF7的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用SalI和HindIII消化pQE-9載體和插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，用AflIII酶切鑒定插入片段大小及方向，并測(cè)序驗(yàn)證hGDF7的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的hGDF7。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫hGDF7。可用幾種方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘呤褂猛肝霾襟E除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白，純化后的蛋白可以結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)對(duì)含PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
此外，用常規(guī)方法對(duì)表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.3的序列一致。該序列與SEQ ID NO.2的區(qū)別在于，它不含SEQ ID NO.2中1-20位氨基酸。這是因?yàn)镾EQ ID NO.2中1-20氨基酸是hGDF7的信號(hào)肽序列，在表達(dá)過程中該信號(hào)肽序列被切除。
實(shí)施例3hGDF7在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，將編碼hGDF7的cDNA序列下列寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得hGDF7cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-CACGAAGCTTATGG ACCTGAGCGCCGCCG該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的hGDF7的部分編碼序列；3’端引物序列為5’-CCTCGATATCCCTGCAGCCGCAGGCCTCC該引物含有EcoRV限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和hGDF7的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用HindIII及EcoRV消化pcDNA3載體和插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，用Af1III酶切鑒定插入片段大小及方向，并測(cè)序驗(yàn)證hGDF7的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測(cè)定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的SuperdexG-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
此外，用常規(guī)方法對(duì)表達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.3的序列一致。該序列與SEQ ID NO.2的區(qū)別在于，它不含SEQ ID NO.2中1-20位氨基酸。這是因?yàn)镾EQ ID NO.2中1-20氨基酸是hGDF7的信號(hào)肽序列，在表達(dá)過程中該信號(hào)肽序列被切除。
實(shí)施例4同源比較用實(shí)施例2和實(shí)施例3得到的hGDF7蛋白(SEQ ID NO.3)在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST軟件進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它具有TGFβ氨基端結(jié)構(gòu)域和TGFβ家族成員的典型特征序列(http//smart.embl-heidelberg.de/)。
本發(fā)明的hGDF7具有TGFb家族成員氨基末端結(jié)構(gòu)域的典型特征。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B氨基端功能域存在與許多蛋白中，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子B、DPP細(xì)胞和骨巨噬細(xì)胞等等。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子具有多種功能，如控制細(xì)胞增長(zhǎng)、分化等等。DDP細(xì)胞作為胞外的成型素，主要負(fù)責(zé)胚胎脊下皮(dorsal hypoderm)的正常發(fā)育，幼蟲的發(fā)育和成蟲上皮細(xì)胞的發(fā)育。骨巨噬細(xì)胞則誘導(dǎo)軟骨和骨的形成并與某些物種的骨膜生長(zhǎng)有關(guān)(Saharinen J，Taipale J，Keski-Oia J.EMBO J 1996；15245-253；Munger JS，Harpel JG，Gleizes PE，Mazzieri R，NunesI，Rifkin DB.Kidney Int 1997；511376-1382)。在hGDF7中，符合該特征的序列為GGGGGRTLAQAAGAAAVPAAAVPRARAARRAAGSGFRNGSVVPHHFMMSLYRSLAGRAPAGAAAVSASGHGRADTITGFTDQATQDESAAETGQSFLFDVSSLNDADEVVGAELRVLRRGSPESGPGSWTSPPLLLLSTCPGAARAPRLLYSRAAEPLVGQRWEAFDVADAMRRHRREPRPPRAFCLLLRAVAGPVPSPLALRRLGFGWPGGGGSAAEERAVLVVSS(SEQID NO 3中26-252)。
此外，hGDF7的蛋白序列還中發(fā)現(xiàn)了TGF-β超家族的標(biāo)志性的保守序列(L/I/V/M)X2PX2(F/Y)X4CXGXC，其中(L/I/V/M)表示L、I、V、M中的任意一個(gè)氨基酸，X2表示2個(gè)任意氨基酸。在hGDF7中，符合該特征的序列為SRKPLHVDFKELGWDDWIIAPLDYEAYHCEGLCDFPLRSHLEPTNHAIIQTLLNSMAPDAAPASCCVPARLSFISILYIDAANNVVYKQYEDMVVEACGCR(SEQ ID NO 3中329-430)。
本發(fā)明的hGDF7與其他物種中的hGDF7也有較高的同源度，如與Cercopithecusaethiops和Macaca fascicularis中的hGDF7同源度分別為66％和65％。這進(jìn)一步證明本發(fā)明的hGDF7具有TGFb家族成員共性，如對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有調(diào)控作用，對(duì)組織生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用乃至對(duì)機(jī)體的生理活動(dòng)具有協(xié)調(diào)作用。
本發(fā)明的hGDF7除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明hGDF7還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白，例如可將本發(fā)明hGDF7的N端與鼠GDF7的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對(duì)本發(fā)明hGDF7的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例2或3獲得的重組蛋白用來免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀hGDF7基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評(píng)估。
實(shí)例6作為微矩陣的底物微矩陣，又稱為DNA芯片。通過使用一些著名的生物軟件(如LASERGENESOFTWARE(DNASTAR)，來選擇將hGDF7全長(zhǎng)cDNA、EST、或基因片段作為微矩陣的底物樣品。然后通過使用噴墨技術(shù)及一系列化學(xué)方法如射線、化學(xué)、熱力學(xué)、機(jī)械方法等把樣品固定在載體上，如玻璃上，得到芯片(Schena，M.et al.(1995)Science 270467-470；and Shalon，D.et al.(1996)Genome Res.6639-645.)，形成的元件有點(diǎn)狀、條形等等。塊典型的芯片通常含有一定數(shù)量的元件。雜交反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的探針，然后用掃描儀來檢測(cè)發(fā)生雜交反應(yīng)的元件及反應(yīng)的程度。探針與每一個(gè)芯片元件的互補(bǔ)性和結(jié)合量都可通過對(duì)掃描出的圖像的分析來判斷。
雜交結(jié)果可用于檢測(cè)出hDGF7基因變異、突變及多態(tài)現(xiàn)象，理解由于hDGF7表達(dá)不正常引起的疾病的分子基礎(chǔ)，診斷疾病，并可改進(jìn)及監(jiān)測(cè)相關(guān)藥劑的活性。
實(shí)施例7試劑盒的制備試劑盒1它含有(1)特異性擴(kuò)增hDGF7的引物對(duì)和使用說明。該試劑盒還可含有或不含有將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的所需試劑。其中，該特異性引物的序列衍生自SEQ ID NO1的序列。對(duì)逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，以檢測(cè)樣品中是否含有hDGF7的核酸序列。該試劑盒還可含有進(jìn)行PCR反應(yīng)所需的其他試劑，例如緩沖液等。
此外，較佳地，至少一個(gè)所用的引物跨越了兩個(gè)外顯子，因?yàn)榇藭r(shí)對(duì)應(yīng)于hDGF7的基因組序列將不產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。
試劑盒2該試劑盒含有針對(duì)hDGF7的特異性的抗體(例如實(shí)施例5中制備的多克隆抗體，或者用標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗hDGF7的單克隆抗體)，和使用說明。該試劑盒用于直接檢測(cè)樣品中是否存在或缺失hDGF7蛋白。先通過特異性免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，然后用常規(guī)技術(shù)檢測(cè)免疫復(fù)合物。
試劑盒3該試劑盒含有可特異性地與hDGF7的mRNA雜交的探針。它還可含有或不含有雜交緩沖液。該試劑盒通過核酸分子與hDGF7特異性探針之間的雜交反應(yīng)來檢測(cè)樣品中是否存在hDGF7的核酸分子。
試劑盒也可用于檢測(cè)出基因變異、突變及多態(tài)現(xiàn)象，并檢測(cè)出一系列與本發(fā)明的hDGF7相關(guān)的基因，從而對(duì)相關(guān)疾病的診斷、治療起輔助作用。
實(shí)例8制成藥物本發(fā)明的hDGF7蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等可作為藥物，可促進(jìn)燙傷燒傷、組織切除乃至器官摘除后的傷口愈合。將本發(fā)明的hGDF7核酸反義鏈或hGDF7抗體制成試劑盒可用于減輕或輔助治療由于hGDF7表達(dá)量過高而導(dǎo)致的疾病，也可輔助臨床上腫瘤和癌癥的診斷，預(yù)防及治療。
本發(fā)明蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常為約5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
此外，本發(fā)明hDGF7核酸(編碼序列或反義序列)可以直接引入細(xì)胞，以提高h(yuǎn)DGF7的表達(dá)水平或者抑制hDGF7的過度表達(dá)。本發(fā)明的hDGF7蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因hDGF7缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
當(dāng)本發(fā)明的hDGF7蛋白多肽被用作藥物時(shí)，治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
序列表<210>1<211>1594<212>核苷酸<213>人類<220><221>編碼序列<222>(177)..(1529)<223><400>1ctttcagcag ggggcgctgc tccgggcgtt gggcgggggt ggggtgggcc aggagggggg 60gccgcgggct ggccgcgcac acttccccca ttattaaaca ctatgttcaa aaggcgccgg120gggacttccc ggagccacgg agcccgcgcc gcccgcccgc ccggcccacg gagccc atg179Met1gac ctg agc gcc gcc gcc gcg ctg tgc ctt tgg ctg ctg agc gcc tgc 227Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ala Leu Cys Leu Trp Leu Leu Ser Ala Cys5 10 15cgc ccc cgc gac ggg ctg gaa gcg gcc gcc gtg ctg cga gcg gcg ggg 275Arg Pro Arg Asp Gly Leu Glu Ala Ala Ala Val Leu Arg Ala Ala Gly20 25 30gct ggg ccg gtc cgg agc cca ggg ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc ggc 323Ala Gly Pro Val Arg Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly35 40 45ggg cgg act ctt gcc cag gct gcg ggc gcc gcg gct gtc ccg gcc gcc 371Gly Arg Thr Leu Ala Gln Ala Ala Gly Ala Ala Ala Val Pro Ala Ala50 55 60 65gcg gtt ccc cgg gcc cgc gcc gcg cgc cgc gcc gcg ggc tcc ggc ttc 419Ala Val Pro Arg Ala Arg Ala Ala Arg Arg Ala Ala Gly Ser Gly Phe70 75 80agg aac ggc tcg gtg gtg ccg cac cac ttc atg atg tcg ctt tac cgg 467Arg Asn Gly Ser Val Val Pro His His Phe Met Met Ser Leu Tyr Arg85 90 95agc ctg gcc ggg agg gct ccg gcc ggg gca gcc gct gtc tcc gcc tcg 515Ser Leu Ala Gly Arg Ala Pro Ala Gly Ala Ala Ala Val Ser Ala Ser100 105 110ggc cat ggt cgc gcg gac acg atc acc ggc ttc aca gac cag gcg acc 563Gly His Gly Arg Ala Asp Thr Ile Thr Gly Phe Thr Asp Gln Ala Thr115 120 125caa gac gaa tcg gca gcc gaa aca ggc cag agc ttc ctg ttc gac gtg 611Gln Asp Glu Ser Ala Ala Glu Thr Gly Gln Ser Phe Leu Phe Asp Val130 135 140 145tcc agc ctt aac gac gca gac gag gtg gtg ggt gcc gag ctg cgc gtg 659Ser Ser Leu Asn Asp Ala Asp Glu Val Val Gly Ala Glu Leu Arg Val150 155 160ctg cgc cgg gga tct cca gag tcg ggc cca ggc agc tgg act tct ccg 707Leu Arg Arg Gly Ser Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Trp Thr Ser Pro165 170 175ccg ttg ctg ctg ctg tcc acg tgc ccg ggc gcc gcc cga gcg cca cgc 755Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Cys Pro Gly Ala Ala Arg Ala Pro Arg180 185 190ctg ctg tac tcg cgg gca gct gag ccc cta gtc ggt cag cgc tgg gag 803Leu Leu Tyr Ser Arg Ala Ala Glu Pro Leu Val Gly Gln Arg Trp Glu195 200 205gcg ttc gac gtg gcg gac gcc atg agg cgc cac cgt cgt gaa ccg cgc 851Ala Phe Asp Val Ala Asp Ala Met Arg Arg His Arg Arg Glu Pro Arg210 215 220 225ccc ccc cgc gcg ttc tgc ctc ttg ctg cgc gca gtg gca ggc ccg gtg 899Pro Pro Arg Ala Phe Cys Leu Leu Leu Arg Ala Val Ala Gly Pro Val230 235 240ccg agc ccg ttg gca ctg cgg cgg ctg ggc ttc ggc tgg ccg ggc gga 947Pro Ser Pro Leu Ala Leu Arg Arg Leu Gly Phe Gly Trp Pro Gly Gly245 250 255ggg ggc tct gcg gca gag gag cgc gcg gtg cta gtc gtc tcc tcc cgc 995Gly Gly Ser Ala Ala Glu Glu Arg Ala Val Leu Val Val Ser Ser Arg260 265 270acg cag agg aaa gag agc tta ttc cgg gag atc cgc gcc cag gcc cgc 1043Thr Gln Arg Lys Glu Ser Leu Phe Arg Glu Ile Arg Ala Gln Ala Arg275 280 285gcg ctc ggg gcc gct ctg gcc tca gag ccg ctg ccc gac cca gga acc 1091Ala Leu Gly Ala Ala Leu Ala Ser Glu Pro Leu Pro Asp Pro Gly Thr290 295 300 305ggc acc gcg tcg cca agg gca gtc att ggc ggc cgc aga cgg agg agg 1139Gly Thr Ala Ser Pro Arg Ala Val Ile Gly Gly Arg Arg Arg Arg Arg310 315 320acg gcg ttg gcc ggg acg cgg aca gcg cag ggc agc ggc ggg ggc gcg1187Thr Ala Leu Ala Gly Thr Arg Thr Ala Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ala325 330 335ggc cgg ggc cac ggg cgc agg ggc cgg agc cgc tgc agc cgc aag ccg1235Gly Arg Gly His Gly Arg Arg Gly Arg Ser Arg Cys Ser Arg Lys Pro340 345 350ttg cac gtg gac ttc aag gag ctc ggc tgg gac gac tgg atc atc gcg1283Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala355 360 365ccg ctg gac tac gag gcg tac cac tgc gag ggc ctt tgc gac ttc cct1331Pro Leu Asp Tyr Glu Ala Tyr His Cys Glu Gly Leu Cys Asp Phe Pro370 375 380 385ttg cgt tcg cac ctc gag ccc acc aac cat gcc atc att cag acg ctg1379Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Ile Ile Gln Thr Leu390 395 400ctc aac tcc atg gca cca gac gcg gcg ccg gcc tcc tgc tgt gtg cca1427Leu Asn Ser Met Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala Ser Cys Cys Val Pro405 410 415gcg cgc ctc agc ccc atc agc atc ctc tac atc gac gcc gcc aac aac1475Ala Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Tyr Ile Asp Ala Ala Asn Asn420 425 430gtt gtc tac aag caa tac gag gac atg gtg gtg gag gcc tgc ggc tgc1523Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly Cys435 440 445agg tag cgcgagggcc ggggaggggg cagccacgcg gccgaggatc cccagctgat 1579Arg450gagcagcagc gggcc 1594<210>2<211>450<212>氨基酸<213>人類<400>2Met Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ala Leu Cys Leu Trp Leu Leu Ser Ala1 5 10 15Cys Arg Pro Arg Asp Gly Leu Glu Ala Ala Ala Val Leu Arg Ala Ala
20 25 30Gly Ala Gly Pro Val Arg Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly35 40 45Gly Gly Arg Thr Leu Ala Gln Ala Ala Gly Ala Ala Ala Val Pro Ala50 55 60Ala Ala Val Pro Arg Ala Arg Ala Ala Arg Arg Ala Ala Gly Ser Gly65 70 75 80Phe Arg Asn Gly Ser Val Val Pro His His Phe Met Met Ser Leu Tyr85 90 95Arg Ser Leu Ala Gly Arg Ala Pro Ala Gly Ala Ala Ala Val Ser Ala100 105 110Ser Gly His Gly Arg Ala Asp Thr Ile Thr Gly Phe Thr Asp Gln Ala115 120 125Thr Gln Asp Glu Ser Ala Ala Glu Thr Gly Gln Ser Phe Leu Phe Asp130 135 140Val Ser Ser Leu Asn Asp Ala Asp Glu Val Val Gly Ala Glu Leu Arg145 150 155 160Val Leu Arg Arg Gly Ser Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Trp Thr Ser165 170 175Pro Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Cys Pro Gly Ala Ala Arg Ala Pro180 185 190Arg Leu Leu Tyr Ser Arg Ala Ala Glu Pro Leu Val Gly Gln Arg Trp195 200 205Glu Ala Phe Asp Val Ala Asp Ala Met Arg Arg His Arg Arg Glu Pro210 215 220Arg Pro Pro Arg Ala Phc Cys Leu Leu Leu Arg Ala Val Ala Gly Pro225 230 235 240Val Pro Ser Pro Leu Ala Leu Arg Arg Leu Gly Phe Gly Trp Pro Gly245 250 255Gly Gly Gly Ser Ala Ala Glu Glu Arg Ala Val Leu Val Val Ser Ser260 265 270Arg Thr Gln Arg Lys Glu Ser Leu Phe Arg Glu Ile Arg Ala Gln Ala275 280 285Arg Ala Leu Gly Ala Ala Leu Ala Ser Glu Pro Leu Pro Asp Pro Gly290 295 300Thr Gly Thr Ala Ser Pro Arg Ala Val Ile Gly Gly Arg Arg Arg Arg305 310 315 320Arg Thr Ala Leu Ala Gly Thr Arg Thr Ala Gln Gly Ser Gly Gly Gly325 330 335Ala Gly Arg Gly His Gly Arg Arg Gly Arg Ser Arg Cys Ser Arg Lys340 345 350Pro Leu His Val Asp Phe Lys Glu Leu Gly Trp Asp Asp Trp Ile Ile355 360 365Ala Pro Leu Asp Tyr Glu Ala Tyr His Cys Glu Gly Leu Cys Asp Phe370 375 380Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Ile Ile Gln Thr385 390 395 400Leu Leu Asn Ser Met Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala Ser Cys Cys Val405 410 415Pro Ala Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Tyr Ile Asp Ala Ala Asn420 425 430Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly
435 440 445Cys Arg450<210>3<211>430<212>氨基酸<213>人類<400>1Asp Gly Leu Glu Ala Ala Ala Val Leu Arg Ala Ala Gly Ala Gly Pro1 5 10 15Val Arg Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Thr20 25 30Leu Ala Gln Ala Ala Gly Ala Ala Ala Val Pro Ala Ala Ala Val Pro35 40 45Arg Ala Arg Ala Ala Arg Arg Ala Ala Gly Ser Gly Phe Arg Asn Gly50 55 60Ser Val Val Pro His His Phe Met Met Ser Leu Tyr Arg Ser Leu Ala65 70 75 80Gly Arg Ala Pro Ala Gly Ala Ala Ala Val Ser Ala Ser Gly His Gly85 90 95Arg Ala Asp Thr Ile Thr Gly Phe Thr Asp Gln Ala Thr Gln Asp Glu100 105 110Ser Ala Ala Glu Thr Gly Gln Ser Phe Leu Phe Asp Val Ser Ser Leu115 120 125Asn Asp Ala Asp Glu Val Val Gly Ala Glu Leu Arg Val Leu Arg Arg130 135 140Gly Ser Pro Glu Ser Gly Pro Gly Ser Trp Thr Ser Pro Pro Leu Leu145 150 155 160Leu Leu Ser Thr Cys Pro Gly Ala Ala Arg Ala Pro Arg Leu Leu Tyr165 170 175Ser Arg Ala Ala Glu Pro Leu Val Gly Gln Arg Trp Glu Ala Phe Asp180 185 190Val Ala Asp Ala Met Arg Arg His Arg Arg Glu Pro Arg Pro Pro Arg195 200 205Ala Phe Cys Leu Leu Leu Arg Ala Val Ala Gly Pro Val Pro Ser Pro210 215 220Leu Ala Leu Arg Arg Leu Gly Phe Gly Trp Pro Gly Gly Gly Gly Ser225 230 235 240Ala Ala Glu Glu Arg Ala Val Leu Val Val Ser Ser Arg Thr Gln Arg245 250 255Lys Glu Ser Leu Phe Arg Glu Ile Arg Ala Gln Ala Arg Ala Leu Gly260 265 270Ala Ala Leu Ala Ser Glu Pro Leu Pro Asp Pro Gly Thr Gly Thr Ala275 280 285Ser Pro Arg Ala Val Ile Gly Gly Arg Arg Arg Arg Arg Thr Ala Leu290 295 300Ala Gly Thr Arg Thr Ala Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ala Gly Arg Gly305 310 315 320His Gly Arg Arg Gly Arg Ser Arg Cys Ser Arg Lys Pro Leu His Val325 330 335Asp Phe Lys Glu Leu Gly Trp Asp Asp Trp Ile lle Ala Pro Leu Asp340 345 350Tyr Glu Ala Tyr His Cys Glu Gly Leu Cys Asp Phe Pro Leu Arg Ser355 360 365His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Ile Ile Gln Thr Leu Leu Asn Ser370 375 380Met Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala Ser Cys Cys Val Pro Ala Arg Leu385 390 395 400Ser Phe Ile Ser Ile Leu Tyr Ile Asp Ala Ala Asn Asn Val Val Tyr405 410 415Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ala Cys Gly Cys Arg420 425 430
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人hGDF7蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸177-1529位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸177-1529位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQID NO.2所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列是SEQ ID NO.1中核苷酸177-1529位的序列。
4.一種分離的hGDF7蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有hGDF7蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有hGDF7蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成hGDF7蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸177-1529位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成hGDF7蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)hGDF7蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有hGDF7蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸177-1529位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的hGDF7蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了人生長(zhǎng)分化因子7(hGDF7)，其編碼序列、制法及用途。hGDF7蛋白具有TGFβ氨基端結(jié)構(gòu)域和TGFβ家族成員的典型特征序列，與其他物種的hGDF7也有較高的同源度，是TGFβ亞家族的新成員，具有該家族成員的共性。將本發(fā)明的hGDF7核酸、其反義鏈及片段制成探針，可檢測(cè)由于hGDF7基因異常而導(dǎo)致的疾?。粚GDF7蛋白序列制成試劑盒或藥物，可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，促進(jìn)燙傷燒傷、組織切除乃至器官摘除后的傷口愈合。將本發(fā)明的hGDF7核酸反義鏈或hGDF7抗體制成試劑盒可用于減輕或輔助治療由于hGDF7表達(dá)量過高而導(dǎo)致的疾病，也可輔助臨床上腫瘤和癌癥的診斷，預(yù)防及治療。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1396261SQ0211237
公開日2003年2月12日 申請(qǐng)日期2002年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月4日
發(fā)明者余龍, 唐麗莎, 郭金虎 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)