專利名稱：胚胎造血干、祖細胞懸液及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明胚胎造血干、祖細胞懸液及其制備方法和應用，涉及的是利用現(xiàn)代生物技術分離提取制備胚胎優(yōu)質超劑量造血干、祖細胞及其方法，它可應用于臨床造血干、祖細胞移植，治療相關的血液病、遺傳病腫瘤以及放化療引起的免疫功能損傷等的一種生物制品。
胚胎發(fā)育的早期，胎骨髓尚無造血功能，在胚胎發(fā)育過程中逐漸形成造血功能，并逐漸增強最終代替肝臟造血，胎齡在22周前胎骨髓造血干、祖細胞的相對總數(shù)較少，其臨床意義不大，22周后隨著胎齡的增加，胎骨髓中造血干、祖細胞相對總數(shù)和胎肝中的造血干、祖細胞數(shù)都相應的增加。脾臟相對于肝臟而言重量較輕，體積較小，造血干、祖細胞相對總數(shù)較少，可分離提取，亦可忽略不記。
胚胎造血干、祖細胞懸液是由胎齡為22周以上的胎骨髓造血干、祖細胞懸液和胎肝造血干、祖細胞懸液兩部分構成。
胚胎造血干、祖細胞制備方法將孕婦水囊引產自愿捐贈并經公證的死胎娩出后，置于0°-10℃保存；1-16h內送至實驗室；在無菌條件下先從胎心中抗凝抽取胎血標本，供血型和HLA抗原檢測，然后分別解剖取出相關胎骨(股、肱、脛、腓、橈、尺等骨)、胎肝，置于培養(yǎng)液中，0-10℃保存。
A、胎骨髓造血干、祖細胞懸液的制備(1)用骨鉗、骨剪和解剖刀剪將胎骨去骨膜和兩端的軟骨；(2)用吸有抗凝劑的培養(yǎng)液注射器，將針頭分別插入兩端的骨疏松質中，加壓將骨髓沖至收集瓶中；(3)用骨剪從長骨的中段剪斷，并將注射器針頭插至骨髓腔中反向加壓沖洗，直至骨質中的骨髓細胞基本沖出為止，沖洗培養(yǎng)液約為20-80ml，視其胎齡大小而定；(4)將收集瓶中的骨髓細胞懸液，經300-500目篩網(wǎng)過濾；
(5)計量骨髓細胞懸液原液；(6)取上述適量骨髓細胞原液，經紅細胞裂解在顯微鏡下統(tǒng)計有核細胞相對總數(shù)；(7)經苔酚藍染色統(tǒng)計死活細胞比例；(8)將等量淋巴細胞分離液置于試管下層，等量胎骨髓細胞原液置于淋巴細胞分離液上層；(9)將上述試管置于離心機中進行密度梯度離心；(10)將試管界面層的單個核細胞(MNC)吸至另一試管中，力求吸盡為宜；(11)向試管中加培養(yǎng)液稀釋吹吸混勻；(12)經1000-1500r/15-10min離心，棄上清液收集細胞；(13)吹散細胞并加培養(yǎng)液稀釋混勻，重復上述過程，洗滌2-3次；(14)將全部細胞收集于一個試管中，制成濃縮的單個核細胞懸液；(15)取適量上述懸液，經梯度稀釋和紅細胞裂解，計算單個核細胞總數(shù)和死細胞百分率；(16)取適量單個核細胞置于培養(yǎng)液中，0-10℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原檢測；(17)取適量細胞懸液作生物污染檢測；(18)其余細胞根據(jù)臨床需要取出所需數(shù)量的細胞懸液置于細胞培養(yǎng)液中供臨床造血干、祖細胞移植；(19)剩余細胞懸液以適當體積濃度的細胞凍存液，混勻裝入冷凍管中；(20)以每分鐘下降2-3℃的速率將凍存管最終置于液氮中保存。為了避免造血干、祖細胞在制備單個核細胞懸液過程中的丟失，胎骨髓細胞懸液，可將紅細胞裂解后直接供臨床細胞移植使用或按上述比例進行液氮保存。
B、胎肝造血干、祖細胞懸液的制備(1)用解剖剪去除胎肝系膜組織和膽囊及大血管；(2)將胎肝置于200-300目不銹鋼濾網(wǎng)上，用機械解離法通過邊擠壓邊加培養(yǎng)液沖冼，將解離的細胞收集在燒杯中，胎肝和稀釋沖冼培養(yǎng)液重量之比要適當。
(3)將解離過濾的細胞懸液再經300-500目不銹鋼過濾網(wǎng)過濾；(4)將上述細胞懸液按等量淋巴細胞分離液置于試管下層，等量上述胎肝細胞懸液，小心輕放置于淋巴細胞分離液上層；(5)將上述試管置于離心機中進行密度梯度離心；(6)將經密度梯度離心試管中的單個核細胞層中細胞吸移至另一試管里混勻；(7)向試管中加培養(yǎng)液稀釋吹吸混勻；(8)經1000-1500r/15-10min離心棄上清液收集細胞制成懸液并向試管中加培養(yǎng)液稀釋，離心洗滌2-3次；(9)將全部細胞收集于一個試管中計算體積，制成濃縮的單個核細胞懸液；(10)取適量上述細胞懸液，經梯度稀釋和紅細胞裂解，計算單個核細胞總數(shù)和死細胞百分率；(11)取適量單個核細胞置于培養(yǎng)液中，0-10℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原檢測；(12)取適量細胞懸液作生物污染檢測；(13)其余細胞與適當體積濃度的細胞凍存液混勻，裝入冷凍管中；(14)以每分鐘下降2-3℃的速率將凍存管最終置于液氮中保存。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有的有益效果和優(yōu)點(1)從發(fā)育分化的概念上相比，本發(fā)明所提供的優(yōu)質超劑量造血干、祖細胞處于成骨髓、成外周血和臍血的前期，所以抗原分化較弱，因此移植排斥反應較輕；(2)以CD34+CD38-在CD34+細胞中的比例為造血干、祖細胞的質量標準，從表1可以看出，胚胎中的造血干、祖細胞質量最高；(3)以1000ml中的臍血中的造血干、祖細胞數(shù)為比較標準，從表2可以看出，22周后的胚胎中的造血干、祖細胞數(shù)量是相當巨大的；(4)近年許多研究表明CD34-細胞較CD34+細胞具有更強大的長期造血能力，可能為CD34+細胞的前體細胞，通過紅細胞裂解后的胎骨髓有核細胞(NC)懸液，能將胎骨髓中的CD34-保存下來，從分化發(fā)育的角度分析，胎骨髓中CD34-細胞數(shù)遠高于成骨髓、成外周血、或臍血中的CD34-
細胞數(shù)；(5)據(jù)報道，作為造血干細胞臨床移植物決非越純越好，近乎天然骨髓中各類造血和間質細胞可能是最佳的移植物，所以，本發(fā)現(xiàn)提供的22周以上胎骨髓，造血干、祖細胞及其它細胞易于在受體骨髓中歸巢，因為造血干細胞的生存必須依賴其周圍的祖細胞、淋巴、巨噬細胞、成纖維細胞、內皮細胞和其它各種間質細胞構成的微環(huán)境，胎骨髓的微環(huán)境與受體骨髓的微境相近；(6)胚胎骨髓細胞懸液中含有骨髓間質干細胞，間質干細胞具有多向分化潛能，它不僅具有向造血干細胞分化的潛能，而且還具有向神經、骨骼、肌肉等系統(tǒng)分化的潛能。
(7)通過胎骨髓造血干、祖細胞移植為先導，受體對供體的細胞產生一定的耐受以后，相繼進行多次胎肝同基因的造血干、祖細胞移植，當受體對供體移植耐受誘導完成后，供體造血干細胞具有強力骨髓清掃作用，最終有可能使受體轉為完全供者型造血嵌合體；(8)從可行性上相比，本發(fā)明提供的成品，所化費用最少，方法最易，成效最大。
A、胎骨髓造血干、祖細胞懸液的分離和制備(1)用骨鉗、骨剪和解剖刀剪將胎骨去骨膜和兩端的軟骨；(2)用吸有抗凝劑的培養(yǎng)液注射器，將針頭分別插入兩端的骨疏松質中，加壓將骨髓沖至收集瓶中；(3)用骨剪從長骨的中段剪斷，并將注射器針頭插至骨髓腔中反向加壓沖洗，直至骨質中的骨髓細胞基本沖出為止，沖洗培養(yǎng)液約為20-80ml，視其胎齡大小而定；(4)將收集瓶中的骨髓細胞懸液，經300目篩網(wǎng)過濾；(5)計量骨髓細胞懸液原液；(6)取適量骨髓細胞原液，經紅細胞裂解，在顯微鏡下統(tǒng)計有核細胞相對總數(shù)；(7)經苔酚藍染色統(tǒng)計死活細胞比例；(8)將等量淋巴細胞分離液置于試管下層，等量胎骨髓細胞原液置于淋巴細胞分離液上層；(9)將上述試管置離心機中2500r/30min密度梯度離心；(10)將試管中界面層的單個核細胞(MNC)吸至另一試管中，力求吸盡；(11)向試管中加培養(yǎng)液稀釋吹吸混勻；(12)經1500r/10min離心棄上清液收集細胞；(13)吹散細胞并加培養(yǎng)液稀釋混勻重復上述過程洗滌3次；
(14)將全部細胞收集于一個試管中制成濃縮的單個核細胞懸液；(15)取上述適量懸液經梯度稀釋和紅細胞裂解，計算單個核細胞總數(shù)和死細胞百分率；(16)取適量單個核細胞懸液置于培養(yǎng)液中4℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原檢測；(17)取適量細胞懸液作生物污染檢測；(18)其余細胞根據(jù)臨床需要取出所需數(shù)量的細胞懸液置于細胞培養(yǎng)液中供臨床造血干、祖細胞移植；(19)剩余細胞懸液與等體積細胞凍存液混勻，裝入冷凍管中；(凍存液配方羥乙基淀粉12％，二甲亞砜10％，O型臍血血清16％)(20)以每分鐘下降3℃的速率將凍存管的細胞最終置于液氮中保存，為了避免造血干、祖細胞在制備MNC懸液過程中的丟失，胎骨髓細胞懸液，可將紅細胞裂解后直接供臨床細胞移植使用或液氮保存。
B、胎肝造血干、祖細胞懸液的分離和制備(1)用解剖剪鉗去除胎肝系膜組織和膽囊及大血管；(2)將胎肝置于300目不銹鋼濾網(wǎng)上，用機械解離法通過邊擠壓邊加培養(yǎng)液沖冼，將解離過濾的細胞收集在燒杯中，胎肝和稀釋沖冼培養(yǎng)液重量之比為1∶4；(3)將解離過濾的細胞懸液再經500目不銹鋼過濾網(wǎng)過濾；(4)將上述細胞懸液按等量淋巴細胞分離液置于試管下層，等量上述胎肝細胞懸液小心輕放置于淋巴細胞分離液上層；
(5)將上述試管置于離心機中2500r/30min密度梯度離心；(6)將經密度梯度離心試管中的單個核細胞層中的細胞吸移至另一試管里混勻；(7)向試管中加培養(yǎng)液稀釋吹吸混勻；(8)經1200r/15min離心，棄上清液，收集細胞制成懸液，并向試管中加培養(yǎng)液稀釋離心洗滌3次；(9)將全部細胞收集于一個試管中計算體積，制成濃縮的單個核細胞懸液；(10)取適量上述細胞懸液經梯度稀釋和紅細胞裂解計算單個核細胞總數(shù)和死細胞百分率；(11)取適量MNC置于培養(yǎng)液中4℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原檢測；(12)取適量細胞懸液作生物污染檢測；(13)其余細胞懸液與等體積細胞凍存液混勻，裝入冷凍管中；(凍存液配方羥乙基淀粉12％，二甲亞砜10％，O型臍血血清16％)(14)以每分鐘下降3℃的速率將凍存管的細胞最終置于液氮中保存。
采用本發(fā)明上述胚胎造血干、祖細胞制備方法從胎肝和四肢長骨中分離制備的造血干、祖細胞，其中CD34+細胞總數(shù)相當于5700ml臍血中的細胞總數(shù)，CD34+CD38-即造血干細胞總數(shù)相當于30000ml中的細胞總數(shù)。若以2×105/kg受體造血干、祖細胞移植量計算可供285kg受體需要。
實施例二胎重1601kg(胎肝重70g，脾重約5.4g)將胎齡在22周以上經水囊引產的死胎娩出后置于10℃保存，3h內送至實驗室，在無菌條件和20℃室溫中，先從胎心中抗凝抽取胎血標本供血型和HLA抗原檢測，然后分別解剖取出相關胎骨、胎肝、置于培養(yǎng)液中，4℃保存。
A、胎骨髓造血干、祖細胞懸液的分離和制備(1)用骨鉗、骨剪和解剖刀剪將胎骨去骨膜和兩端的軟骨；(2)用吸有抗凝劑的培養(yǎng)液注射器，將針頭分別插入兩端的骨疏松質中，加壓將骨髓沖至收集瓶中；(3)用骨剪從長骨的中段剪斷，并將注射器針頭插至骨髓腔中反向加壓沖洗，直至骨質中的骨髓細胞基本沖出為止，沖洗培養(yǎng)液約為50ml，視其胎齡大小而定；(4)將收集瓶中的骨髓細胞懸液，經300目篩網(wǎng)過濾；(5)計量骨髓細胞懸液原液；(6)取適量骨髓細胞原液，經紅細胞裂解，在顯微鏡下統(tǒng)計有核細胞相對總數(shù)；(7)經苔酚藍染色統(tǒng)計死活細胞比例；(8)將等量淋巴細胞分離液置于試管下層，等量胎骨髓細胞原液置于淋巴細胞分離液上層；(9)將上述試管置離心機中2500r/30min密度梯度離心；(10)將試管中界面層的單個核細胞(MNC)吸至另一試管中，力求吸盡；
(11)向試管中加培養(yǎng)液稀釋吹吸混勻；(12)經1000r/15min離心棄上清液收集細胞；(13)吹散細胞并加培養(yǎng)液稀釋混勻重復上述過程并洗滌3次；(14)將全部細胞收集于一個試管中制成濃縮的單個核細胞懸液；(15)取上述適量懸液經梯度稀釋和紅細胞裂解，計算單個核細胞總數(shù)和死細胞百分率；(16)取適量單個核細胞懸液置于培養(yǎng)液中0-℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原檢測；(17)取適量細胞懸液作生物污染檢測；(18)其余細胞根據(jù)臨床需要取出所需數(shù)量的細胞懸液置于細胞培養(yǎng)液中供臨床造血干、祖細胞移植；(19)剩余細胞懸液與等體積細胞凍存液混勻，裝入冷凍管中；(凍存液配方羥乙基淀粉12％，二甲亞砜10％，O型臍血血清16％)(20)以每分鐘下3℃的速率將凍存管的細胞最終置于液氮中保存，為了避免造血干、祖細胞在制備MNC懸液過程中的丟失，胎骨髓細胞懸液，可將紅細胞裂解后直接供臨床細胞移植使用或液氮保存。
B、胎肝造血干、祖細胞懸液的分離和制備(1)用解剖剪鉗去除胎肝系膜組織和膽囊及大血管；(2)將胎肝置于200目不銹鋼濾網(wǎng)上，用機械解離法通過邊擠壓邊加培養(yǎng)液沖冼，將解離過濾的細胞收集在燒杯中，胎肝和稀釋沖冼培養(yǎng)液重量之比要適當；
(3)將解離過濾的細胞懸液再經500目不銹鋼過濾網(wǎng)過濾；(4)將上述細胞懸液按等量淋巴細胞分離液置于試管下層，等量上述胎肝細胞懸液小心輕放置于淋巴細胞分離液上層；(5)將上述試管置于離心機中2500r/30min密度梯度離心；(6)將經密度梯度離心試管中的單個核細胞層中的細胞吸移至另一試管里混勻；(7)向試管中加培養(yǎng)液稀釋吹吸混勻；(8)經1500r/10min離心，棄上清液，收集細胞制成懸液，并向試管中加培養(yǎng)液稀釋離心洗滌3次；(9)將全部細胞收集于一個試管中計算體積，制成濃縮的單個核細胞懸液；(10)取適量上述細胞懸液經梯度稀釋和紅細胞裂解計算單個核細胞總數(shù)和死細胞百分率；(11)取適量MNC置于培養(yǎng)液中10℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原檢測；(12)取適量細胞懸液作生物污染檢測；(13)其余細胞懸液與等體積細胞凍存液混勻，裝入冷凍管中；(凍存液配方羥乙基淀粉12％，二甲亞砜10％，O型臍血血清16％)(14)以每分鐘下降2℃的速率將凍存管的細胞最終置于液氮中保存。
采用本發(fā)明上述胚胎造血干、祖細胞制備方法從胎肝和四肢長骨中分離制備的造血干、祖細胞其中，CD34+細胞總數(shù)相當于6900ml臍血中的細胞總數(shù)，CD34+CD38-即造血干細胞總數(shù)相當于11000ml中的細胞總數(shù)。若以2×105/kg受體造血干、祖細胞移植量計算可供345kg受體需要。
表一胚胎造血干、祖細胞質量分析比較

*.引自中華血液學雜志1996 vol 17 P17表二胚胎造血干、祖細胞數(shù)量分析比較

*臍血1000ml中CD34-總細胞數(shù)為1×107CD34+38-總細胞數(shù)為1×106引自現(xiàn)代血液病輸血療法 上海醫(yī)科大學出版社2000P27權利要求
1.一種胚胎造血干、祖細胞懸液，其特征是一種胎齡為22周以上含有優(yōu)質超劑量的胚胎造血干、祖細胞，胚胎造血干、祖細胞懸液包括胎骨髓造血干、祖細胞懸液和胎肝造血干、祖細胞懸液。
2.一種胚胎造血干、祖細胞懸液的制備方法，其特征是將胎齡在22周以上經水囊引產的死胎娩出后置于0-10℃保存，1-16h內送至實驗室，在無菌條件和10-20℃室溫中，先從胎心中抗凝抽取胎血樣本供血型和HLA抗原檢測，然后分別解剖取出相關胎骨、胎肝、置于培養(yǎng)液中，0-10℃保存。A、胎骨髓造血干、祖細胞懸液的分離和制備(1)用骨鉗、骨剪和解剖刀剪將胎骨去骨膜和兩端的軟骨；(2)用吸有抗凝劑的培養(yǎng)液注射器，將針頭分別插入兩端的骨疏松質中，加壓將骨髓沖至收集瓶中；(3)用骨剪從長骨的中段剪斷，并將注射器針頭插至骨髓腔中反向加壓沖洗，直至骨質中的骨髓細胞基本沖出為止，沖洗培養(yǎng)液約為20-80ml，視其胎齡大小而定；(4)將收集瓶中的骨髓細胞懸液，經300-500目篩網(wǎng)過濾；(5)計量骨髓細胞懸液原液；(6)取適量骨髓細胞原液，經紅細胞裂解，在顯微鏡下統(tǒng)計有核細胞相對總數(shù)；(7)經苔酚藍染色統(tǒng)計死活細胞比例；(8)將等量淋巴細胞分離液置于試管下層，等量胎骨髓細胞原液置于淋巴細胞分離液上層；(9)將上述試管置離心機中進行密度梯度離心；(10)將試管中界面層的單個核細胞(MNC)吸至另一試管中，力求吸盡；(11)向試管中加培養(yǎng)液稀釋吹吸混勻；(12)經1000-1500r/15-10min離心棄上清液收集細胞；(13)吹散細胞并加培養(yǎng)液稀釋混勻重復上述過程洗滌2-3次；(14)將全部細胞收集于一個試管中制成濃縮的單個核細胞懸液；(15)取上述適量懸液經梯度稀釋和紅細胞裂解，計算單個核細胞總數(shù)和死細胞百分率；(16)取適量單個核細胞懸液置于培養(yǎng)液中0-10℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原檢測；(17)取適量細胞懸液作生物污染檢測；(18)其余細胞根據(jù)臨床需要取出所需數(shù)量的細胞懸液置于細胞培養(yǎng)液中供臨床造血干、祖細胞移植；(19)剩余細胞懸液與適當濃度細胞凍存液混勻，裝入冷凍管中；(20)以每分鐘下降2-3℃的速率將凍存管的細胞最終置于液氮中保存，為了避免造血干、祖細胞在制備MNC懸液過程中的丟失，胎骨髓細胞懸液，可將紅細胞裂解后直接供臨床細胞移植使用或液氮保存。B、胎肝造血干、祖細胞懸液的分離和制備(1)用解剖剪鉗去除胎肝系膜組織和膽囊及大血管；(2)將胎肝置于200-300目不銹鋼濾網(wǎng)上，用機械解離法通過邊擠壓邊加培養(yǎng)液沖冼，將解離過濾的細胞收集在燒杯中，胎肝和稀釋沖冼培養(yǎng)液重量之比要適當；(3)將解離過濾的細胞懸液再經300-500目不銹鋼過濾網(wǎng)過濾；(4)將上述細胞懸液按等量淋巴細胞分離液置于試管下層，等量上述胎肝細胞懸液小心輕放置于淋巴細胞分離液上層；(5)將上述試管置于離心機中進行密度梯度離心；(6)將經密度梯度離心試管中的單個核細胞層中的細胞吸移至另一試管里混勻；(7)向試管中加培養(yǎng)液稀釋吹吸混勻；(8)經1000-1500r/15-10min離心，棄上清液，收集細胞制成懸液，并向試管中加培養(yǎng)液稀釋離心洗滌2-3次；(9)將全部細胞收集于一個試管中計算體積，制成濃縮的單個核細胞懸液；(10)取適量上述細胞懸液經梯度稀釋和紅細胞裂解計算單個核細胞總數(shù)和死細胞百分率；(11)取適量MNC置于培養(yǎng)液中0-10℃保存，作CD34+CD38+和CD34+CD38-抗原檢測；(12)取適量細胞懸液作生物污染檢測；(13)其余細胞以適當濃度與細胞凍存液混勻，裝入冷凍管中；(14)以每分鐘下降2-3℃的速率將凍存管的細胞最終置于液氮中保存。
3.根據(jù)權利要求1和2所述的胚胎造血干、祖細胞懸液在制備臨床造血干、祖細胞移植，治療相關的血液病、遺傳病、腫瘤以及放化療引起的免疫功能損傷生物制品中的應用。
全文摘要
本發(fā)明胚胎造血干、祖細胞懸液及其制備方法和應用,涉及的是利用現(xiàn)代生物技術分離提取制備胚胎優(yōu)質超劑量造血干、祖細胞懸液及其制備方法,它可應用于臨床造血干、祖細胞移植,治療相關的疾病和損傷。該生物制品是從健康孕婦自愿捐贈并經公證,胎齡在22周以上水囊引產的的死胎中分離提取的,它由胎骨髓造血干祖細胞懸液和胎肝造血干、祖細胞懸液兩部分構成,死胎娩出后,置于0－10℃環(huán)境中保存,在1－16內通過無菌操作,先從胎兒心臟中抽取胎血,供相關檢測,然后解剖取其胎骨和胎肝,分別置于0－10℃的培養(yǎng)液中保存,在1－12h內分別從中分離提取含有胚胎造血干祖細胞的懸液,調整細胞濃度,分別供相關檢測和臨床造血干祖細胞移植,其余,凍存?zhèn)溆谩?br> 文檔編號C12Q1/02GK1364874SQ0211266
公開日2002年8月21日 申請日期2002年2月9日 優(yōu)先權日2002年2月9日
發(fā)明者黃斌, 黃寧, 黃裕權, 付中苓, 潘欣, 彭蕾, 孫俊 申請人:黃斌, 黃寧, 黃裕權